專利名稱：一種預(yù)防和治療蜜蜂真菌病的中藥提取液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中成藥，具體地說是提供一種預(yù)防和治療蜜蜂真菌病的中藥提取液及其制備的工藝方法。
背景技術(shù)：
蜜蜂常見的白堊病(Chalkbrood Disease)又稱“石灰質(zhì)病”，是由蜂球囊菌(Pericystis apis)引起的蜜蜂幼蟲死亡，并使蟲體腫脹長出白色附著物的一種頑固性真菌傳染病。目前國內(nèi)對白堊病的防治主要采用抗生素制霉菌素，或化學(xué)合成藥物如優(yōu)白凈、殺白靈等，這些藥物的使用都存在著蜂產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留問題。如何解決因蜜蜂病防治過程中引起的抗生素等藥物殘留問題，提高蜂產(chǎn)品質(zhì)量和市場競爭力，成為當前的首要任務(wù)，使用中草藥等生物制劑防治蜜蜂傳染病是解決好這個問題的關(guān)鍵。但國內(nèi)用中草藥為主要原料的蜂藥的研制才剛剛開始，多數(shù)停留在開發(fā)試用階段，無大規(guī)模產(chǎn)品推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種預(yù)防和治療蜜蜂真菌病的中藥提取液及其制備的工藝方法，能對蜜蜂真菌病進行有效地預(yù)防和治療，并能解決蜂產(chǎn)品的抗生素藥物殘留問題。
根據(jù)中藥藥理，選擇51味具有殺菌功效的中藥進行抗蜂球囊菌的實驗室篩選，發(fā)現(xiàn)土荊皮提取液對蜂球囊菌有良好的抑制作用。土荊皮，松科植物金錢松Pseudolarix kaempferi Gor.的干燥根皮近根樹皮。根皮呈不規(guī)則的長條狀，扭曲而稍卷，大小不一，厚2～5mm。外表灰黃色，粗糙、有皺紋及灰白色橫向皮孔，粗皮常呈鱗片狀剝落，剝落處紅棕色。內(nèi)表面黃棕色至紅棕色，平坦，有細致的縱向紋理。質(zhì)韌，折斷面呈裂片狀，可層層剝離。氣微，味苦而澀。本品粉末淡棕色或紅棕色。石細胞多，類長方形、類圓形或不規(guī)則分枝狀，直徑30～96μm，含黃棕色塊狀物。篩胞大多成束，直徑20～40μm，側(cè)壁上有多數(shù)橢圓形篩域，黏液細胞類圓形，直徑100～300μm。樹脂細胞縱向連接成管狀，含紅棕色至黃棕色樹脂狀物，有的埋有草酸鈣方晶。木栓細胞壁稍厚，有的木化，并有紋孔。土荊皮性辛、溫，具有殺蟲止癢作用，常以外用為主，實驗證明具有抗真菌作用經(jīng)選擇試驗，選用土荊皮來制備預(yù)防和治療蜜蜂真菌病的中藥提取液，提取液是由土荊皮的水和/或醇提取物作活性成分和藥學(xué)上可接受的附加劑組成。
本發(fā)明所提供的制備預(yù)防和治療蜜蜂真菌病的中藥提取液的生產(chǎn)工藝如下取土荊皮作為原料，加8-12倍量水浸泡1小時，水煎煮1-2小時，過濾，得濾液I；取藥渣再加8-12倍量水煎煮1-2小時，過濾，得濾液II；合并濾液I、濾液II濃縮；將濃縮液攪拌20-30分鐘后取上清液，上清液加入苯甲酸鈉0.4％-0.5％重量份，攪拌水加至1.25g生藥/ml，灌裝，100℃，30分鐘蒸汽消毒，包裝、即得成品。
所述的濃縮液在30℃下相對密度為1.007-1.20g/ml。
本發(fā)明的中藥提取液在預(yù)防和治療蜜蜂真菌病中的應(yīng)用，抑菌使用濃度為62.5mg-1.25g生藥/ml；殺菌使用濃度為125mg-1.25g生藥/ml。
在本發(fā)明以純中草為原料，通過一定的工藝將土荊皮進行提取，提取液低濃度使用時對蜂球囊菌具有較強的抑制效果，高濃度使用時具有良好的殺菌效果，使用后蜂產(chǎn)品中無殘留，提高了蜂產(chǎn)品質(zhì)量。


圖1為本發(fā)明的制備工藝流程圖；具體實施方式
一、配方篩選(一)受試藥物大黃、黃柏、黃連、百部、蛇床子、大青葉、白頭翁、地錦草、車前草、苦參、魚腥草、威靈仙、大蒜、辛夷、桂枝、梔子、土荊皮、野菊花、燈籠草、蜈松、連翹、金銀花、蒲公英、丹皮、茵陳、龍葵、夏枯草、貫眾、細辛、馬錢子、艾、干姜、青蒿、云木香、柴胡、麻黃、莪術(shù)、黃精、半夏、側(cè)柏葉、龍膽、龍葵、金錢草、黃芪、防風、薄荷、蟬蛻、天花粉、滿山香、知母、四季青51味中藥材，50味中藥各取50g分別水煎二次(30分/次)，煎液合并濃縮成1g生藥/ml濃度，15磅20分鐘蒸汽消毒，備用，大蒜取新鮮榨汁。
(二)菌種蜂球囊菌(Pericystis apis)，由浙大農(nóng)學(xué)院提供，菌落呈白色棉絮狀，檢鏡為真菌。
(三)培養(yǎng)基采用SDA+Y培養(yǎng)基(由蛋白胨2g、葡萄糖8g、瓊脂3g、酵母浸膏0.4g、蒸餾水200ml配成)，自制。
(四)儀器數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱和凈化工作臺。
(五)紙片擴散法1.瓊脂平板制備SDA+Y瓊脂熔化后傾注平皿(直徑15cm)制備平板，待其凝固，取培養(yǎng)于瓊脂平板上72小時的真菌(Pericystis apis)用無菌生理鹽水混勻，均勻涂在SDA+Y瓊脂平皿上，待其干燥后備用。
2.藥液稀釋將1g生藥/ml的無菌中藥煎液，在無菌試管中作原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64倍比稀釋，備用。
3、藥敏試驗用無菌鑷子鑷紙片(直徑5.5mm)浸泡稀釋的藥液，放置在已接種真菌(Pericystis apis)的瓊脂平板上，輕壓紙片使其與瓊脂適當接觸，每一平皿接種8片紙片，其中7片為一味中藥的7種不同稀釋度藥片，1片為無菌生理鹽水浸片。另取平皿制霉菌素和0.4％苯甲酸鈉液作對照。
將平皿分別在30℃，60％濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時后，用塑料尺從平皿背面?zhèn)攘棵總€抑菌圈的直徑，試驗結(jié)果見表1。
表1 51味中藥對蜂球囊菌的抑制作用


注0表示直徑5.5mm。
由表1可見，51種中藥液中，只有土荊皮有抑制蜂球囊菌的作用，并呈良好的量效關(guān)系。將土荊皮平皿和制霉菌素平皿繼續(xù)培養(yǎng)72小時，土荊皮抑菌圈仍未長真菌，而制霉菌素抑菌圈長滿真菌絲。
(六)土荊皮煎液對蜜蜂的毒性試驗將土荊皮水煎煮60分鐘×2次的溶液，配成1.25g生藥/ml濃度，100ml裝/瓶，進行毒性試驗，以每蜂箱放一飼喂器10倍稀釋的土荊皮水煎液，觀察72小時，結(jié)果無蜜蜂死亡，初步表明該制劑對蜜蜂無毒性。
三、配方實施例取土荊皮加8倍量水浸泡1小時，水煎煮1小時，濾過，得濾液I。藥渣再加入8倍量水煎煮1小時，濾過，得濾液II。合并濾液I、II濃縮至相對密度為1.05g/ml(30℃測)液體，3000rpm條件下攪拌20分鐘，取上清液，棄沉淀物。上清液加入苯甲酸鈉，為0.4重量份，攪拌，水加至0.5g生藥/ml濃度，灌裝，100℃30分鐘蒸汽消毒，包裝，即得成品，臨用時用水稀釋4倍。
1、水提正交試驗以加水量(A)、煎煮時間(B)、煎煮次數(shù)(C)為主要影響因素，每個因素選3個水平，見表2。
表2水提因素水平表

根據(jù)因素水平表2，選擇L9(34)正交設(shè)計表進行試驗，將每1水平樣品配成0.5g生藥/ml濃度，再用無菌水稀釋成1∶4倍進行試驗，以抑菌試驗直徑作為考察指標，并分別對有關(guān)數(shù)據(jù)作分析，結(jié)果見表3。
表3水提正交試驗設(shè)計及結(jié)果

2、醇處理對抑菌效果的影響取上述水煎濃縮液，加95％乙醇，使乙醇終濃度達70％，冷置24h，3000rpm 20分鐘離心，棄沉淀物，上清液回收乙醇，加苯甲酸鈉(終濃度為0.4％)，攪拌，水加至0.5g生藥/ml濃度，100□30分鐘蒸汽消毒，備用。將上述水煎醇沉淀用生理鹽水倍比稀釋，用紙片擴散法進行抑菌實驗，同時設(shè)單純水煎液作對照，結(jié)果見表4。
表4醇處理對提取液抑菌作用的影響

由表4可見，醇處理后上述提取液同樣具有抑菌效果。
四、藥效測試1、抑菌作用試驗選取不同批次的土荊皮按實施例進行制備，取得3批提取液，抑菌作用采用紙片擴散法，抑菌環(huán)直徑作為考察指標，觀察提取液對蜂球囊菌的抑制作用，測試結(jié)果見表5
表5 不同批次的提取液的抑菌作用測試結(jié)果

2、最小抑菌試驗(MIC)將0.5g生藥/ml土荊皮提取液用無菌生理鹽水按原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32倍比稀釋，用紙片擴散法檢測各稀釋度對蜂球囊菌的抑制作用，結(jié)果見表6表6 最小抑菌試驗(MIC)測試結(jié)果

結(jié)論本發(fā)明提取液的最小抑菌濃度為62.5mg生藥/ml(即1∶8倍稀釋)。
3、最小殺菌試驗(MBC)將0.5g生藥/ml土荊皮提取液用無菌生理鹽水按原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32倍比稀釋，在各稀釋液中分別加入蜂球囊菌浸泡，各稀釋管置30℃、60％濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，再用無菌鑷子取蜂球囊菌接種于SDA+Y瓊脂平皿上，各平皿置30℃、60％濕度培養(yǎng)72小時，觀察有無蜂球囊菌生長，以無蜂球囊菌生長的土荊皮液濃度為最低殺菌濃度(MBC)。結(jié)果見表7。
表7 最小殺菌試驗結(jié)果

結(jié)論最小殺菌濃度為1∶4倍稀釋液，即125mg生藥/ml。
4、殺菌時間試驗將0.5g生藥/ml土荊皮提取液用無菌生理鹽水按1∶2、1∶4、1∶8、1∶6、1∶32倍稀釋，在各稀釋液中分別加入生長良好的蜂球囊菌浸泡。并分別于浸泡0、1、2、4、8、12、24h、72h后取真菌接種于SDA+Y培養(yǎng)基中，30℃60％濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，觀察是否有蜂球囊菌生長。結(jié)果見表8。
表8 殺菌時間試驗

結(jié)論提取液以1∶2倍稀釋，對蜂球囊菌作用2小時，即可殺死真菌；以1∶4倍稀釋液對該真菌作用4h即可殺死蜂球囊菌，以1∶8倍稀釋液對該真菌作用12小時即可殺滅蜂球囊菌。
5、制劑存放按《新藥審批方法》規(guī)定和中國藥典2000年版一部中的方法進行存放考察，本發(fā)明產(chǎn)品在37□～40□溫度和75％相對濕度條件下保溫3個月，結(jié)果無明顯變化，質(zhì)量穩(wěn)定。
6、蜂群防治試驗報告由于2004年春季出現(xiàn)了近年來少有的蜂群春繁好氣候，陰雨天氣少，氣溫比常年偏高，無“倒春寒”情況，因而白堊病在浙江及周遍地區(qū)的蜂場幾乎沒有爆發(fā)和流行。為了檢測防治效果，不得不采用人工接種發(fā)病的方法，使蜂群發(fā)病，然后采用本發(fā)明提取液進行防治，同時以農(nóng)業(yè)部《蜜蜂病蟲害綜合防治規(guī)范》中規(guī)定使用的蜂病防治藥物(西藥)為陽性對照，以檢測其防治效果。
(一)試驗材料(1)、意大利蜂60群，蜂群健康無病害，群勢中等。
(2)、人工發(fā)病用真菌菌種(蜂球囊菌)由浙江省中醫(yī)藥研究院提供。
(3)、本發(fā)明0.5g生藥/ml土荊皮提取液。
(4)、致霉菌素從藥店購入。
(5)、試驗用具量筒、燒杯、噴霧器等。
(二)試驗方法(1)、試驗時間從2004年6月12日開始至7月6日結(jié)束。此時，蜂場周圍沒有蜜粉源；氣候處于“梅雨”季節(jié)，濕度高，溫度較高，多雨。
(2)、試驗方法(a)將60群蜂均衡群勢，隨機分為3組，每組10群。這3組分別為本發(fā)明提取液(D組)、致霉菌素組(E組)和空白對照2組(F組)。
(b)本發(fā)明提取液組、致霉菌素組和空白對照2組這三組的30群蜂全部接種真菌菌種(蜂球囊菌)，使蜂群發(fā)生白堊病。
(c)在蜂群發(fā)病后的6月27日、6月30日和7月3日分別用本發(fā)明提取液按1∶4稀釋后，噴霧蜜蜂和巢脾，用致霉菌素噴霧致霉菌素組的蜜蜂和巢脾；空白對照2組的蜂群則未作任何處理。
(4)在防治前后對每群蜂的發(fā)病率(指患病幼蟲房占子脾總數(shù)的百分比)進行詳細的檢查，根據(jù)防治前后的發(fā)病率，計算出防治效果。
(三)試驗結(jié)果(a)D組

(b)E組

(c)F組

上述結(jié)果表明，本發(fā)明的提取液對白堊病具有很好的防治效果，平均達98.20％，與陽性對照(致霉菌素)組的防治效果(95.99％)相比，無顯著差異(P＞0.05)。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防和治療蜜蜂真菌病的中藥提取液，其特征在于它是由土荊皮水和/或醇提取物作活性成分和藥學(xué)上可接受的附加劑組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥提取液，其特征在于所述的醇為乙醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥組合物，其特征在于所述的組合物中還加有苯甲酸鈉0.4％-0.5％重量份。
4.一種預(yù)防和治療蜜蜂真菌病的中藥提取液的制備方法，取土荊皮作為原料，加8-12倍量水浸泡1小時，水煎煮1-2小時，過濾，得濾液I；取藥渣再加8-12倍量水煎煮1-2小時，過濾，得濾液II；合并濾液I、濾液II濃縮；將濃縮液攪拌20-30分鐘后取上清液，上清液加入苯甲酸鈉0.4％-0.5％重量份，攪拌，加水至足量，灌裝，100℃，30分鐘蒸汽消毒，包裝、即得成品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的中藥組合物的制備方法，其特征在于所述的濃縮液在30℃下相對密度為1.007-1.20g/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥提取液在預(yù)防和治療蜜蜂真菌病中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的中藥提取液在預(yù)防和治療蜜蜂真菌病中的應(yīng)用，其特征在于所述的中藥提取液在蜜蜂中的抑菌使用濃度為62.5mg-1.25g生藥/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的中藥組提取液在預(yù)防和治療蜜蜂真菌病中的應(yīng)用，其特征在于所述的中藥提取液在蜜蜂中的殺菌使用濃度為125mg-1.25g生藥/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預(yù)防和治療蜜蜂真菌病的中藥提取液，由土荊皮的水和/或醇提取物作活性成分和藥學(xué)上可接受的附加劑組成。本發(fā)明還公開了該中藥提取液的生產(chǎn)工藝及在預(yù)防和治療蜜蜂真菌病中的應(yīng)用濃度。本發(fā)明以純中草為原料，通過一定的工藝將土荊皮進行提取，提取液低濃度使用時對蜂球囊菌具有較強的抑制效果，高濃度使用時具有良好的殺菌效果，使用后蜂產(chǎn)品中無殘留，提高了蜂產(chǎn)品質(zhì)量。
文檔編號A61P31/00GK1748721SQ20041006639
公開日2006年3月22日 申請日期2004年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月15日
發(fā)明者楊鋒, 戴關(guān)海, 胡福良, 王超敏, 南建博 申請人:浙江省中醫(yī)藥研究院, 江山天寶蜂業(yè)科技開發(fā)有限公司