專利名稱：源自白斑綜合征病毒的蛋白質(zhì)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及源自白斑綜合征病毒的蛋白質(zhì)，編碼上述蛋白質(zhì)的核酸序列，以及所述蛋白質(zhì)在制備用于預(yù)防和/或治療甲殼動物白斑綜合征(White Spot Sydrone)的疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
白斑綜合征病毒(WSSV)在東南亞大部分地區(qū)的蝦中是一個主要的病毒性疾病。該病毒在甲殼動物中有很寬的宿主范圍(Flegel，1997)，而且在各個隔離群之間只有很小的遺傳變異(Lo等，1999)。電子顯微鏡術(shù)(EM)研究顯示病毒顆粒有包膜，呈桿狀到彈頭樣外觀，長度大約275nm，寬大約120nm，在一端有一個尾樣附件。失去包膜的核殼呈交叉網(wǎng)格型外觀，大小約300nm×70nm(Wongteerasupaya等，1995)。這個病毒顆粒的形態(tài)學(xué)，它的核定位和它的形態(tài)發(fā)生學(xué)令人想起昆蟲中的桿狀病毒(Durand等，1997)。本來白斑綜合征病毒被分類作為桿狀病毒科的一個未指定成員(Francki等，1991)，因此該病毒曾經(jīng)被稱做系統(tǒng)性外中胚層桿狀病毒(SEMBV)或白斑桿狀病毒(WSBV)。目前由于缺乏分子數(shù)據(jù)，白斑綜合征病毒不再被納入這個科(Murphy等，1995)。限制性核酸內(nèi)切酶分析顯示其病毒的雙鏈DNA大小超過200kb(Yang等，1997)。
白斑綜合征病毒的暴發(fā)在東南亞的養(yǎng)殖蝦中會引起蝦群的大規(guī)模死亡。該疾病的特征是蝦的甲殼、附肢和角皮出現(xiàn)白斑，肝胰腺呈淡紅色。被感染的蝦顯示嗜睡、進(jìn)食迅速減少等征候，在3到5天內(nèi)這些蝦就會死亡。白斑綜合征病毒的暴發(fā)導(dǎo)致蝦養(yǎng)殖工業(yè)的嚴(yán)重?fù)p失，因而強(qiáng)烈需要一種能對白斑綜合征病毒的感染具有保護(hù)作用的疫苗。能在這樣的疫苗中使用的白斑綜合征病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的鑒定和表征能夠為發(fā)展這種疫苗提供方法。
本發(fā)明的公開四種主要白斑綜合征病毒蛋白質(zhì)VP28(28kDa)、VP26(26kDa)、VP24(24kDa)和VP19(19kDa)已經(jīng)被鑒定出來，其分子量是根據(jù)它們在考馬斯亮藍(lán)染色的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中的遷移率來估計的。VP26和VP24是核殼蛋白質(zhì)，而VP28和Vp19是包膜蛋白質(zhì)。白斑綜合征病毒蛋白質(zhì)的氨基端(N端)氨基酸殘基已通過蛋白質(zhì)測序獲得，并用來鑒定白斑綜合征病毒基因組上的那些基因(分別是vp28，vp26，vp24，vp19)。如圖2b所述，vp26的可讀框(ORF)包含555個核苷酸(SEQ ID No1)，推導(dǎo)的VP26氨基酸序列含有184個氨基酸殘基(SEQ ID No3)，也一同描述在圖2b中。vp26的一個第二個可讀框包含612個核苷酸，顯示于SEQ ID No9，推導(dǎo)出其氨基酸序列含有204個氨基酸殘基，它被單獨描述為SEQ IDNo10。vp28的可讀框包含615個核苷酸(SEQ ID No2)，在圖2c中與被推導(dǎo)出的氨基酸序列(SEQ ID No4)一起被描述。被推導(dǎo)出的VP28的氨基酸序列含有204個氨基酸。VP26和VP28都含有一個位于N端的假定的穿膜區(qū)和許多假定的N-和O-糖基化位點。vp26和vp28基因的可讀框分別編碼理論大小為20kDa和22kDa的蛋白質(zhì)。VP26和VP28的理論上的氨基酸序列被直接的蛋白質(zhì)測序確認(rèn)。VP26和VP28理論上的大小與根據(jù)它們在考馬斯亮藍(lán)染色的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中的遷移率而測得的大小相差6kDa，這個大小差異可以被翻譯后修飾作用例如糖基化、磷酸化等來解釋。VP24的N末端氨基酸序列和VP19的部分氨基酸序列分別被描述為SEQ ID No5和6。vp24的完整可讀框包含627個核苷酸，描述于SEQ ID No11，與被推導(dǎo)出的VP24氨基酸序列一起被描述；推導(dǎo)出的VP24氨基酸序列有208個殘基，單獨描述于SEQ ID No12。四個蛋白質(zhì)和它們各自的核苷酸序列是白斑綜合征病毒所特有的。
本發(fā)明首次提供了構(gòu)建重組疫苗的方法，用于保護(hù)甲殼動物抵抗白斑綜合征病毒的感染。已經(jīng)被鑒定和定性描述過的四種白斑綜合征病毒主要蛋白質(zhì)VP28，VP26，VP24和VP19被發(fā)現(xiàn)很適合用來制備亞單位疫苗，用于保護(hù)甲殼動物抵抗白斑綜合征病毒的感染。通過使用重組工藝技術(shù)，本發(fā)明的核苷酸序列的克隆和特異性可以用于生產(chǎn)白斑綜合征病毒的這些結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。這樣，就能獲得重組的白斑綜合征病毒結(jié)構(gòu)蛋白，并基本上去除其他的白斑綜合征病毒蛋白質(zhì)。這種分離的白斑綜合征病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)能用來制造亞單位疫苗，以保護(hù)甲殼動物抵抗白斑綜合征病毒的感染?？晒┻x擇的是，將編碼白斑綜合征病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核苷酸序列用來制備載體疫苗，用于保護(hù)甲殼動物抵抗白斑綜合征病毒感染。而且，本發(fā)明的核苷酸序列也能用于診斷目的，例如檢測本地是否存在白斑綜合征病毒。此外，本發(fā)明的白斑綜合征病毒蛋白質(zhì)還能用來制備白斑綜合征病毒特異性抗體。這些抗體能用來制備白斑綜合征病毒疫苗，為甲殼動物提供被動免疫。該抗體也能用于診斷目的，例如檢測白斑綜合征病毒在甲殼動物中或在本地是否存在。
因此，本發(fā)明的第一目的是提供白斑綜合征病毒的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。更明確地說，本發(fā)明提供結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)VP24，VP26，VP28和VP19。本發(fā)明特別提供含有如圖2b(SEQ ID No3)所示氨基酸序列或其衍生序列(例如SEQ ID No10)的VP26蛋白質(zhì)，以及含有如圖2c(SEQ ID No4)所示的氨基酸序列或其衍生序列的VP28。本發(fā)明進(jìn)一步提供含有如SEQ ID No5所示的N末端氨基酸序列MHMWGVYAAILAGLTLILVVISIVVTNIELNKKLDKKDK或其衍生序列的VP24蛋白質(zhì)，以及含有SEQ IDNo6所示的部分氨基酸序列IVLISI(G/V)ILVLAVMNV(P/A/T)MGPKKDS或其衍生序列的VP19蛋白質(zhì)。優(yōu)選VP24蛋白質(zhì)具有如SEQID No12所示的氨基酸序列或由此衍生的序列。必須認(rèn)識到，那些含有SEQ ID No3，4，5，6，10或12中所述氨基酸序列的衍生序列的蛋白質(zhì)也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。為了本發(fā)明的目的，蛋白質(zhì)氨基酸序列的衍生物被理解為是與SEQ ID No3，4，10或12所描述的氨基酸序列或SEQ ID No5或6所描述的部分氨基酸序列相比，包含了變更的氨基酸序列，而上述的變更不影響該蛋白質(zhì)的抗原性或免疫原性。為了本發(fā)明的目的，本發(fā)明所說的蛋白質(zhì)抗原性應(yīng)被理解為是該蛋白質(zhì)誘發(fā)可以識別所述白斑綜合征病毒蛋白質(zhì)和/或與該蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體的能力。而免疫原性應(yīng)被理解為是該蛋白質(zhì)在甲殼動物中誘發(fā)保護(hù)反應(yīng)，對抗白斑綜合征病毒感染的能力。
依照本發(fā)明，可在序列中發(fā)生的變更可以是由于例如整個序列中一個或多個氨基酸的保守氨基酸替代，缺失，插入，倒位或添加所造成的。
被認(rèn)為并不改變免疫特性的氨基酸替代已經(jīng)被人描述過了。相關(guān)氨基酸之間的氨基酸置換或在進(jìn)化過程中頻繁發(fā)生的替代尤其是發(fā)生在絲氨酸/丙氨酸，絲氨酸/甘氨酸，天冬氨酸/甘氨酸，天冬氨酸/天冬酰胺，異亮氨酸/纈氨酸之間(見Dayhof，M.D.，蛋白質(zhì)序列與結(jié)構(gòu)圖譜(Atlas of protein sequence structure)，Nat.Biomed.Res.Found.，Washington D.C.，1978，vol.5，suppl.3)。以此信息為基礎(chǔ)，Lipman和Pearson發(fā)展出用于迅速和敏感的蛋白質(zhì)比較(Science，1985，第227卷，1435-1441)以及判定具有序列同源性的蛋白質(zhì)和多肽之間的功能相似性的方法。有幾個計算機(jī)程序，例如FASTA，TFASTA，BLAST以及一些類似程序，可用于判定具有給定氨基酸序列的蛋白質(zhì)或多肽和其衍生物之間的序列同源性。序列之間的最佳匹配區(qū)能自動地被這些程序確定。因此根據(jù)本發(fā)明的衍生蛋白質(zhì)仍然有能力誘生可識別白斑綜合征病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，并與之發(fā)生反應(yīng)的抗體；或有能力在接受過接種的甲殼動物中誘發(fā)保護(hù)性反應(yīng)，保護(hù)他們抵抗白斑綜合征病毒的感染。依照本發(fā)明，可以被使用的其他衍生蛋白質(zhì)是白斑綜合征病毒蛋白質(zhì)的片段，條件是所述片段仍然能誘生可識別白斑綜合征病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)并與之發(fā)生反應(yīng)的抗體，或能在接受過接種的甲殼動物中誘發(fā)保護(hù)性反應(yīng)，保護(hù)他們抵抗白斑綜合征病毒的感染。
第二方面，本發(fā)明提供編碼一個或多個白斑綜合征病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的核酸序列。更優(yōu)選本發(fā)明提供分別編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)VP24、VP26、VP28和/或VP19的核酸序列。本發(fā)明特別提供SEQ ID No1或9、SEQ ID No2或SEQ ID No11中描述的vp26，vp28和vp24的核酸序列，它們分別編碼VP26，VP28和VP24。這些各自的核苷酸序列起始于編碼推導(dǎo)出的氨基酸序列第一個甲硫氨酸殘基的密碼子ATG，直到編碼羧基端(C末端)氨基酸殘基的密碼子為止。為了本發(fā)明的目的，必須認(rèn)識到那些與SEQ ID No1，2，9或11中描述的核苷酸序列具有序列同源性的核苷酸序列也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。就本發(fā)明而言，本發(fā)明所指的序列同源性可考慮為至少70％，優(yōu)選75％，更優(yōu)選80％，甚至更優(yōu)選85％。高度優(yōu)選的序列是那些與SEQ ID No1，2，9或11所描述的序列的同源性為至少90％，更優(yōu)選95％的核酸序列。
就本發(fā)明而言，序列同源性是通過把目的核苷酸序列與SEQ IDNo1，SEQ ID No2或SEQ ID No11所述序列的相應(yīng)部分進(jìn)行比較而得出的。就本發(fā)明而言，這個序列同源性百分率被定義為被比較的序列之間的相同核苷酸的百分率。序列同源性可以由例如BLAST N等計算機(jī)程序確定，這些程序能自動地判定最佳的匹配區(qū)。
依照本發(fā)明具有序列同源性的核酸序列可以通過常規(guī)的克隆和雜交技術(shù)，使用SEQ ID No1，2，11或9描述的核酸序列之一或該序列的片段，很容易地從密切相關(guān)的白斑綜合征病毒株中分離出來。為此目的，雜交應(yīng)在嚴(yán)格的條件下完成，優(yōu)選在高度嚴(yán)格條件下完成。嚴(yán)格的雜交條件應(yīng)被理解為指的是洗滌條件為1xSSC溶液，0.1％SDS，溫度65℃；高度嚴(yán)格條件指的是洗滌條件中SSC濃度降低趨向0.3xSSC。這個具體信息不應(yīng)該被如此狹隘地解釋以致需要排除錯誤鑒定的堿基。本文公開的具體序列可以很容易地被用來分離來自其他毒株的同源核苷酸序列。
與SEQ ID No1，2或11所描述的核酸序列之一具有同源性的核酸序列可編碼如下蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列與SEQ ID No3，4，10，12所描述的氨基酸序列之一或SEQ ID No5或6所描述的部分氨基酸序列之一相比，包含了變更，然而所說的變更并不影響上述蛋白質(zhì)的抗原性和免疫原性。編碼VP26蛋白質(zhì)的一個同源核苷酸序列的例子就是SEQ ID No9所描述的核苷酸序列，它所編碼的VP26蛋白質(zhì)與SEQ ID No3所描述的氨基酸序列相比，包含有某些變更。
本發(fā)明的白斑綜合征病毒蛋白質(zhì)可以經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)的生物化學(xué)分離和純化方法獲得，或者它們也可經(jīng)由一般的重組技術(shù)而制備。本發(fā)明的核苷酸序列特別適合用于基本上沒有其他白斑綜合征病毒蛋白質(zhì)的白斑綜合征病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的重組生產(chǎn)。該核苷酸序列被整合進(jìn)能夠表達(dá)該蛋白質(zhì)的合適表達(dá)載體之內(nèi)，用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，在一種合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該宿主細(xì)胞。所表達(dá)的蛋白質(zhì)可以從細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離和純化。合適的表達(dá)載體是包含復(fù)制和表達(dá)必須的調(diào)控區(qū)的那些質(zhì)粒、粘粒、病毒、YAC’s(酵母人工染色體)及其他載體。表達(dá)載體能被帶到一種宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。合適的宿主細(xì)胞有，例如細(xì)菌，酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞。這種表達(dá)技術(shù)在本領(lǐng)域已經(jīng)廣為人知(Sambrooke等，分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloninga laboratory Manual)，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，1989；King和Possee，1992)。
第三方面，本發(fā)明提供疫苗，其含有白斑綜合征病毒毒粒的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)VP24、VP26、VP28或VP19中的一種或多種，以及藥學(xué)上可接受的載體。更明確地說，本發(fā)明的這種疫苗包含白斑綜合征病毒毒粒蛋白質(zhì)VP24、VP26、VP28或VP19，或二者或更多種上述蛋白質(zhì)的組合。優(yōu)選地，本發(fā)明的這種疫苗含有VP24，而這種VP24蛋白質(zhì)含有SEQ ID No12中描述的氨基酸序列，或者SEQ ID No5中描述的N末端氨基酸序列，或者上述兩種序列的衍生序列；或者這種疫苗含有VP26，而這種VP26蛋白質(zhì)含有SEQ ID No3或者SEQ ID No10中描述的氨基酸序列，或者上述任意一種序列的衍生序列；或者這種疫苗含有VP28，而這種VP28蛋白質(zhì)含有SEQ ID No4中描述的氨基酸序列或者該序列的衍生序列；或者這種疫苗含有VP19，而這種VP19蛋白質(zhì)含有SEQ ID No6中描述的N端氨基酸序列或者該序列的衍生序列；或者這種疫苗含有所述蛋白質(zhì)中二種或更多種蛋白的組合。更優(yōu)選的是本發(fā)明的這種疫苗包含白斑綜合征病毒蛋白質(zhì)VP26和VP28，以及任選的VP24。
除此之外，本發(fā)明的核酸序列可以被用來制造載體疫苗(vectorvaccine)，對甲殼動物進(jìn)行接種，以對抗白斑綜合征病毒的感染。載體疫苗應(yīng)被理解為是一種經(jīng)過改造的、活的減毒細(xì)菌或病毒疫苗，以致它們的遺傳物質(zhì)中含有一個或多個插入的異源核苷酸序列。這些所謂的載體細(xì)菌或病毒能夠共表達(dá)由被插入的核苷酸所編碼的異源蛋白質(zhì)。因此，第四方面，本發(fā)明提供一種含有活的減毒細(xì)菌或病毒，以及藥學(xué)上可接受的載體的載體疫苗，其中所說的細(xì)菌或者病毒已經(jīng)被改造過，以致它們的遺傳物質(zhì)中含有一個或多個本發(fā)明的核苷酸序列。
本發(fā)明的疫苗能用來保護(hù)甲殼動物，例如蝦包括但并不僅限于來自對蝦科(Penaeidae)的成員，例如斑節(jié)對蝦(P.monodon)、南美白對蝦(P.vannamei)，中國對蝦(P.chinensis)，墨吉對蝦(P.merguensis)、或新對蝦屬的種(Metapeaeus spp.)；對蝦包括但并不僅限于來自長臂蝦科(Palaemonidae)的成員，例如沼蝦屬的種(Macrobrachium spp.)，或長臂蝦屬的種(Palaemon spp.)；龍蝦包括但不僅限于來自龍蝦科(Palinuridae)和海螯蝦科(Nephropidae)的成員，舉例來說，如(Calinectes spp.)、Palinurusspp.，龍蝦屬的種(Panuliris spp.)，或螯龍蝦屬的種(Homarusspp.)；蝲蛄包括但并不僅限于來自河蝦科(Astacidae)的成員，例如Astacus spp.，Procambarus spp.，和Oronectes spp.；以及蟹包括但并不僅限于來自黃道蟹科(Cancridae)和梭子蟹科(Portuidae)的成員，例如黃道蟹屬的種(Cancerspp.)，Callinectes spp.，Carcinus spp.以及梭子蟹屬的種(Portunus spp.)。
本發(fā)明的疫苗可以依照那些對本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員而言已經(jīng)廣為人知的技術(shù)來制備，例如在下文中被描述過的技術(shù)Remington藥物科學(xué)(Remingtong′s Pharmaceutical Sciences)，第18版(1990)，編者A.R.Gennaro等，第72章，第1389-1404頁，費城藥劑學(xué)和科學(xué)學(xué)院。
本發(fā)明的疫苗含有有效量的一種或多種本發(fā)明蛋白質(zhì)、載體細(xì)菌或病毒，和藥學(xué)上可接受的載體。在此所使用的術(shù)語“有效”被定義為足以在甲殼動物中誘發(fā)保護(hù)性反應(yīng)的量。載體或蛋白質(zhì)的量將依賴于所使用載體或蛋白質(zhì)的類型、給藥途徑、給藥時間、接受接種的動物種類、以及年齡、一般健康狀況、溫度和飲食情況。
大體上，每只動物可以使用的劑量為0.01到1000μg蛋白質(zhì)，優(yōu)選0.5到500μg，更優(yōu)選0.1到100μg。如果使用病毒載體疫苗，大體上每只動物可以使用的劑量為103到108pfu(噬斑形成單位)。
本發(fā)明所指的適合在本發(fā)明的疫苗中使用的藥學(xué)上可接受的載體是無菌并且生理學(xué)上相容的，例如無菌水、鹽水、水性緩沖液例如堿金屬磷酸鹽(例如PBS)、醇、多元醇等。除此之外本發(fā)明的疫苗可能包含其它添加劑，例如佐劑，穩(wěn)定劑，抗氧化劑，防腐劑和其他添加劑。
合適的佐劑包括但并不僅限于鋁鹽或凝膠，卡波姆(carbomers)，非離子嵌段共聚物，維生素E，monophospheryllipid A，胞壁酰二肽，油乳劑，葡聚糖，細(xì)胞因子，皂角甙例如Quil A，以及其他類似物。佐劑的添加量依賴于該佐劑本身的性質(zhì)。
適合在本發(fā)明的疫苗中使用的穩(wěn)定劑包括但并不僅限于糖類例如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、糊精和葡萄糖；蛋白質(zhì)類例如白蛋白或酪蛋白；以及緩沖液如堿性磷酸鹽。
合適的防腐劑包括，硫柳汞和乙汞硫代水楊酸及其他。
本發(fā)明的疫苗可經(jīng)由注射，浸漬，浸浴，噴霧或氣溶膠，或口服給藥。對甲殼動物而言，優(yōu)選的方式是疫苗經(jīng)由浸漬或口服給藥，尤其是在商業(yè)性水產(chǎn)養(yǎng)殖場。
就口服給藥方式而言，疫苗優(yōu)選和合適的載體混合后口服給藥，例如，與纖維素、食物或可代謝的物質(zhì)，如α纖維素或蔬菜或動物來源的不同的油類混合。本發(fā)明的疫苗特別優(yōu)選的食物載體是活飼料生物，它們可以將疫苗裝入自己體內(nèi)，合適的活飼料生物包括但并不僅限于類似浮游生物的非選擇性濾食動物，優(yōu)選的是輪形動物、Artemia的成員等。高度優(yōu)選鹽水蝦Artemia sp.。
通過使用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的一般技術(shù)，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以用來制備抗體。優(yōu)選這些蛋白質(zhì)被用來生產(chǎn)特異性單克隆抗體。本發(fā)明抗體可以按照標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)制備。那些將蛋白質(zhì)免疫動物，例如老鼠，以及選擇產(chǎn)生該蛋白質(zhì)特異性單克隆抗體的雜交瘤的操作步驟在本領(lǐng)域中已經(jīng)廣為人知(見例如Cligan等(編輯)，免疫學(xué)當(dāng)前方法(current protocols in immunology)，1992；Kohler和Milstein，Nature256，第495-497頁，1975；Steenbakkers等，Mol.Biol.Rep.19，第125-134頁，1994)。獲得的抗體可以用于診斷學(xué)，在當(dāng)?shù)貦z測白斑綜合征病毒，或在甲殼動物中檢測白斑綜合征病毒的存在。本發(fā)明的核苷酸序列也適合用于診斷。上述的序列或其片段能用于例如PCR技術(shù)方面，在當(dāng)?shù)鼗蛟诩讱游镏袡z測白斑綜合征病毒的存在。因此，另一方面，本發(fā)明還提供診斷試劑盒，其中包含本發(fā)明的一種或多種核苷酸序列或抗體。
本發(fā)明所誘生的抗VP28，VP26，VP24和VP19蛋白質(zhì)的抗體可以進(jìn)一步用來為甲殼動物的被動免疫制造抗體疫苗。因此，在另一方面，本發(fā)明提供被動免疫疫苗以對抗白斑綜合征病毒，上述的疫苗含有抗VP28，VP26，VP24或VP19，或上述任意二種或多種蛋白質(zhì)的組合的抗體。這樣的疫苗可以使用如上所述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行制備。優(yōu)選制備通過口服給藥的抗體疫苗，其中，抗體和可食用的載體例如魚飼料混合。更優(yōu)選的是這種疫苗是由雞蛋中制備的抗體(IgY抗體)制備的。
下列實施例是用來舉例說明本發(fā)明而不應(yīng)該被解釋成是以任何方式限制本發(fā)明。


圖1白斑綜合征病毒蛋白質(zhì)。(A)負(fù)染的完整病毒顆粒的透射電子顯微鏡(TEM)照片。(B)負(fù)染的白斑綜合征病毒核殼的透射電子顯微鏡照片。(C)純化的白斑綜合征病毒15％考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。泳道1低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。泳道2來自未感染蝦的純化“白斑綜合征病毒顆?！?。泳道3純化的白斑綜合征病毒顆粒。泳道4純化的白斑綜合征病毒核殼。
圖2白斑綜合征病毒VP26和VP28的核苷酸序列。(A)VP26和VP28在白斑綜合征病毒基因組片段上的定位。(B)VP26和(C)VP28的核苷酸和蛋白質(zhì)序列。vp26和vp28各自的可讀框，從編碼推導(dǎo)出的氨基酸序列第一個甲硫氨酸殘基的ATG密碼子開始。N末端氨基酸序列用粗體字表示；推測的N-糖基化位點的位置被用下劃線表示，推測的O-糖基化位點用雙重的下劃線表示。VP28的簡并引物位置的核苷酸序列用斜體字表示。
圖3(A)VP26和(B)VP28的疏水圖。
圖4白斑綜合征病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)在昆蟲細(xì)胞中的桿狀病毒表達(dá)，15％SDS-PAGE凝膠和蛋白質(zhì)印跡法(Western印跡法)分析。(A)Sf21細(xì)胞提取物的考馬斯染色凝膠。泳道1低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。泳道2模擬感染。泳道3AcMNPV-wt(野生型)感染。泳道4AcMNPV-GFP感染。泳道5AcMNPV-WSSVvp26感染。泳道6AcMNPV-WSSVvp28感染。泳道7白斑綜合征病毒。(B)使用抗純化的白斑綜合征病毒的多克隆抗體的蛋白質(zhì)印跡。
圖5抗結(jié)構(gòu)蛋白VP28的抗血清對蝦體內(nèi)白斑綜合征病毒的中和。陰性對照接受NaCl溶液的蝦。陽性對照接受白斑綜合征病毒但未接受抗血清的蝦。免疫前血清接受白斑綜合征病毒和免疫前血清的蝦。VP28抗血清接受病毒和抗VP28抗血清的蝦。
圖6給蝦接種白斑綜合征病毒蛋白質(zhì)。陰性對照只接受NaCl溶液的蝦。陽性對照接受NaCl溶液和白斑綜合征病毒的蝦。組3用VP24進(jìn)行接種的蝦。組4用VP26c進(jìn)行接種的蝦。組5用VP28進(jìn)行接種的蝦。組6用VP24，VP26c和VP28的混合物進(jìn)行接種的蝦。
實施例方法白斑綜合征病毒的制備和純化在本研究中使用的病毒是從泰國的受感染的斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)中分離出來的。受感染組織在TN緩沖液(20mM Tris-HCl，400mM NaCl，PH值7.4)中被勻漿化，在以1,700xg離心沉淀10分鐘之后，過濾上清液(0.45μM過濾器)。濾液被肌肉注射進(jìn)健康的斑節(jié)對蝦體內(nèi)開始感染，注射部位在第四腹節(jié)外側(cè)區(qū)。4天后，從垂死的蝦體內(nèi)提取血淋巴，與作為抗凝劑的改良Alsever溶液(Rodriguez等，1995)混合。在用TNE(20mM Tris-HCL，400mM NaCl，5mM EDTA，PH值7.4)溶液稀釋之后，在4℃以1,700xg速度離心10分鐘，將血淋巴與血細(xì)胞相互分離。將病毒顆粒在4℃以45,000xg離心沉淀1小時，沉淀物用TN溶液重新懸浮。
用Nonidet P40(NP40)處理病毒顆粒，去除病毒包膜。在病毒溶液中加入1％的NP40，室溫下處理30分鐘并輕微振蕩。核殼在4℃以80,000xg離心沉淀30分鐘，沉淀物用TE(10mM Tris-HCl，1mMEDTA，PH值7.5)溶液溶解。
病毒顆粒的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)為進(jìn)行蛋白質(zhì)分析，在15％SDS-PAGE凝膠中對白斑綜合征病毒的病毒顆粒制品(有包膜的病毒顆粒，核殼和陰性對照)進(jìn)行分析。使用考馬斯亮藍(lán)染色法使蛋白質(zhì)在SDS-PAGE凝膠中顯色。
電子顯微鏡檢查為進(jìn)行透射電子顯微鏡檢查(TEM)，病毒懸液被負(fù)載在透明塑膠(Formvar)包被的，碳穩(wěn)定的鎳載網(wǎng)(400網(wǎng)孔)上，用磷鎢酸做負(fù)染(2％PTA)，樣本用Philips CM12電子顯微鏡觀察。
核酸純化將純化的病毒顆粒在45℃用蛋白酶K(0.2mg/ml)和十二烷基肌氨酸鈉(1％)處理3小時，分離病毒DNA。繼而用酚/氯仿抽提，用TE溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH值7.5)進(jìn)行透析。純化和濃縮后的DNA用帶有標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。
質(zhì)粒構(gòu)建白斑綜合征病毒亞基因組片段被克隆到pBluescript SK+(Stratagene公司)質(zhì)粒之內(nèi)，并被使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)(Sambrook等，1989)轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌(E.coli)DH5α體內(nèi)。DNA的分離，限制性內(nèi)切酶消化，瓊脂糖凝膠電泳和菌落轉(zhuǎn)移是依照標(biāo)準(zhǔn)的程序進(jìn)行的(Sambrook等，1989)。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是使用自設(shè)合成引物來進(jìn)行的。編碼VP28 N末端的DNA是從白斑綜合征病毒總DNA中用PCR方法擴(kuò)增出來的，使用的引物是以VP28的N末端氨基酸序列為基礎(chǔ)的簡并性引物。所使用的正向引物是5’CAGAATTCTCDATNGTYTTNGTNAC3’(SEQ ID No7)，反向引物是有EcoRI位點(斜體字)的5’CAGAATTCATGGAYYTNWSNTTYAC 3’(SEQ ID No8)(D＝A，T或G；N＝A，C，G或T；Y＝C或T；W＝A或T；S＝C或G)。VP24的N末端序列是從白斑綜合征病毒總DNA中用PCR方法擴(kuò)增出來的，使用的引物是一套以VP24的N末端氨基酸序列為基礎(chǔ)的簡并性引物。5’CAGAATTCATGCAYATGTGGGGNGT 3’(SEQ ID No13)被用做正向引物，而5’CAGAATTCYTTRTCYTTYTTRTCIARYTT 3’(SEQ ID No14)作為反向引物，兩者均包含EcoRI位點(斜體字)。
DNA測序和計算機(jī)分析要測序的質(zhì)粒DNA經(jīng)由QIAprep Miniprep系統(tǒng)或JETstar質(zhì)粒純化系統(tǒng)(Qiagen公司)被純化。測序采用通用的pBluescript正向和反向核苷酸引物，以及訂制合成的引物以兩條鏈進(jìn)行。使用AppliedBiosytems自動化DNA測序儀(Eurogentec，比利時)進(jìn)行自動測序。
讀出的序列用UWGCG計算機(jī)程序進(jìn)行分析(版本10.0)。使用FASTA，TFASTA(Pearson &Lipman，1988)和BLAST(Altschul等，1997)程序?qū)NA和推導(dǎo)出的氨基酸序列與更新過的GenBank/EMBL，SWISSPORT和PIR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。
細(xì)胞和病毒草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf-AE-21)細(xì)胞(Vaughn等，1977)被培養(yǎng)在補(bǔ)充了10％胎牛血清(FCS)的Grace’s昆蟲培養(yǎng)基(GIBCO BR公司)中。苜蓿銀蚊夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)(Smith和Summers，1982)的E2-株被當(dāng)作野生型(wt)病毒使用。常規(guī)的細(xì)胞維持培養(yǎng)和病毒感染步驟是依照已經(jīng)出版的操作步驟進(jìn)行的(Smith和Summers，1987；King和Possee，1992)。
重組體改造Bac-to-Bac系統(tǒng)(GIBCO BRL公司)在昆蟲細(xì)胞中被用來過量表達(dá)白斑綜合征病毒VP24(SEQ ID No12)、VP26(SEQ ID No3)、VP26c(SEQID No10)和VP28(SEQ ID No4)。為了在昆蟲細(xì)胞感染后容易檢測和滴定Bac-to-Bac重組體，綠色熒光蛋白(GFP)基因被引入pFastBac-DUAL載體p10啟動子的下游。GFP基因來自pVL92GFP質(zhì)粒(Reilander等，1996)，是將該質(zhì)粒用Xba I和Kpn I消化之后得到的。700bp包含GFP的片段被瓊脂糖凝膠電泳和GlassMAX純化方法(GIBCOBRL)分離，使用DNA聚合酶鈍化其末端，插入pFastBac-DUAL質(zhì)粒p10啟動子的下游多克隆區(qū)II的Sma l位點。所得到的質(zhì)粒被命名為pFastBac-D/GFP，在它的多角體蛋白啟動子的下游有一個供外源基因插入的I區(qū)。只表達(dá)受p10啟動子調(diào)控的GFP的重組病毒依照Bac-to-Bac系統(tǒng)程序(GIBCO BRL)構(gòu)建完成，該病毒被稱為AcMNPV-GFP。
對含有據(jù)推測是完整的vp26(SEQ ID No1)和vp28(SEQ ID No2)可讀框(ORFs)的白斑綜合征病毒質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，在ORFs的3’端引進(jìn)一個BamH I位點，在ORFs的5’端引入一個Hind III位點。vp26(SEQ ID No1)和vp28(SEQ ID No2)首先被克隆到pET28a載體(Novagen公司)之內(nèi)，用BamHI和Not I酶切割，將其插入質(zhì)粒pFastBac-D/GFP的多角體蛋白啟動子的下游。獲得的質(zhì)粒被分別命名為pFastBac-D/G-vp26和pFastBac-D/G-vp28。vp26c(SEQ ID No9)和vp24(SEQ ID No11)也從含有推測的可讀框(ORFs)的質(zhì)粒中經(jīng)由PCR擴(kuò)增出來，并通過引物在ORFs的5’端引進(jìn)一個BamH I位點，在ORFs的3’端引入一個EcoR I位點。經(jīng)消化后，vp26c(SEQ ID No9)和vp24(SEQ ID No11)的可讀框被插入pFastBac-D/GFP質(zhì)粒多角體蛋白啟動子的下游，獲得質(zhì)粒pFastBac-D/G-vp26c和pFastBac-D/G-vp24。能從p10啟動子表達(dá)GFP和從多角體蛋白啟動子表達(dá)VP24(SEQ ID No12)，VP26(SEQ ID No3)，vp26c(SEQ ID No10)或VP28(SEQ ID No4)的重組病毒依照Bac-to-Bac系統(tǒng)程序(GIBCOBRL)構(gòu)建完成，分別被命名為AcMNPV-WSSVvp24，AcMNPV-WSSVvp26，AcMNPV-WSSVvp26c和AcMNPV-WSSVvp28。
SDS-PAGE，蛋白質(zhì)序列分析和免疫印跡法將受野生型苜蓿銀蚊夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)以及重組的表達(dá)異源性蛋白質(zhì)(GFP，VP26，VP28)的AcMNPV感染的昆蟲細(xì)胞在15％SDS-PAGE凝膠中分析。使用考馬斯亮藍(lán)染色法使蛋白質(zhì)著色而可見。半干印跡可以在聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride)(PVDF)膜(Bio-Rad公司)上進(jìn)行，使用的是CAPS緩沖液(10mM CAPS在10％甲醇中)；或在ImmobilonTM-P(Millipore公司)膜上進(jìn)行，使用Tris-甘氨酸緩沖液(25mM Tris堿，192mM甘氨酸，10％(v/v)甲醇，PH值8.3)。使用考馬斯亮藍(lán)染色法使蛋白質(zhì)在PVDF膜上顯色。來自白斑綜合征病毒病毒顆粒標(biāo)本的主要蛋白質(zhì)帶從濾膜上被切下并進(jìn)行N末端序列測定(ProSeq公司，麻薩諸塞州)。
Immobulon-P膜在TBS溶液(0.2M NaCl，50mM Tris-HCL，PH值7.4)中用2％低脂奶粉(Campina公司，荷蘭)封閉。免疫檢測是通過下面的步驟來進(jìn)行的室溫下，在含有0.2％低脂奶粉的TBS中將印跡與1∶2000稀釋的多克隆兔抗白斑綜合征病毒血清(來自P.C.Loh教授的惠贈，檀香山大學(xué)，夏威夷)一起孵育1小時。然后，用1∶2000稀釋的，結(jié)合了辣根過氧化物酶(Amersham公司)的抗兔抗體與之結(jié)合，使用“增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光-光檢測試劑盒”(Amersham公司)進(jìn)行檢測。
VP28多克隆抗體白斑綜合征病毒主要的包膜結(jié)構(gòu)蛋白VP28在昆蟲細(xì)胞中被桿狀病毒AcMNPV-WSSVvp28所表達(dá)，使用Prepcell(Biorad公司)和分段收集器進(jìn)行純化。包含VP28的部份被收集和濃縮。將純化的VP28蛋白質(zhì)注射進(jìn)兔子以制備多克隆抗體。用純化的白斑綜合征病毒顆粒對抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法測試，抗體對來自白斑綜合征病毒毒粒的VP28反應(yīng)良好。將這個VP28抗毒血清用于白斑綜合征病毒中和實驗中。
白斑綜合征病毒原種白斑綜合征病毒(WSSV)病毒原種是從蝲蛄Procambarus clarkii的血淋巴中提純出來的，它在一周以前被肌肉注射了低濃度的白斑綜合征病毒。血淋巴經(jīng)由連續(xù)蔗糖梯度離心而純化，吸出病毒條帶。病毒在被沉淀后，又在TE溶液(PH值7.5)中被重新溶解。病毒原種被保存在-70℃直到在實驗中使用。
蛋白質(zhì)接種白斑綜合征病毒主要的包膜結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)VP28(SEQ ID No4)和核殼蛋白質(zhì)VP26c(SEQ ID No10)和VP24(SEQ ID No12)在昆蟲細(xì)胞中用桿狀病毒AcMNPV-WSSVvp28、AcMNPV-WSSVvp26c和AcMNPV-WSSVvp24表達(dá)，這些病毒從P10啟動子表達(dá)GFP，從多角體蛋白啟動子表達(dá)白斑綜合征病毒結(jié)構(gòu)蛋白。感染3天后，收獲受感染的昆蟲細(xì)胞，并用超聲波打碎細(xì)胞。上清液用來接種斑節(jié)對蝦(P.monodon)。
實驗中使用6組蝦

在“混合物”中，等體積的VP28，VP26c和VP24溶液在注射之前混合。接種疫苗后5天，對這些蝦進(jìn)行加強(qiáng)注射。二天之后用白斑綜合征病毒(病毒原種，見中和實驗)注射攻擊。注射后，對這些蝦進(jìn)行6天的監(jiān)測，死蝦經(jīng)電子顯微鏡檢查白斑綜合征病毒是否存在。
結(jié)果分離白斑綜合征病毒蛋白質(zhì)用于測序使用純化的病毒制劑并以肌內(nèi)注射的方式感染斑節(jié)對蝦。在感染后四天，從受白斑綜合征病毒感染的動物的血淋巴中分離病毒。從未受感染的蝦體內(nèi)提取血淋巴作為陰性對照。這些標(biāo)本被用來進(jìn)行電子顯微鏡檢查，分析白斑綜合征病毒毒粒的存在和純度。在未受感染動物的樣品中，沒有觀察到病毒顆粒，但是在受感染動物的樣品中，觀察到許多主要包膜的病毒顆粒(圖1a)。用NP40處理后，病毒的包膜被從病毒顆粒上去除，剩下純的核殼(圖1b)。該核殼具有白斑綜合征病毒核殼所特有的表面分節(jié)的外觀特性(Durand等，1997)。有包膜的病毒顆粒的蛋白質(zhì)和核殼蛋白質(zhì)可以被SDS-PAGE分開(圖1c)。病毒顆粒中的四個主要的多肽可以根據(jù)它們的表觀分子量而識別出來，它們的表觀分子量分別是28(VP28)，26(VP26)，24(VP24)，和19kDa(VP19)。數(shù)個較不明顯的帶也被觀察到，其中大約六個帶位于30到65kDa之間，至少七個弱的蛋白質(zhì)帶位于86kDa到130kDa的范圍之內(nèi)。來自血淋巴的三個主要的蛋白質(zhì)帶也與病毒顆粒一起被純化，位于67kDa到78kDa之間。在這個區(qū)域中的較小的蛋白質(zhì)帶不能在這個凝膠中被觀察到(圖1)。其大小代表著主要的白斑綜合征病毒蛋白質(zhì)VP28和VP19的蛋白條帶在包含純化核殼的泳道(圖1c)中并不存在，如此看來它們像是起源于病毒的包膜或間層。VP26和VP24在核殼和病毒顆粒的泳道上都存在，表示它們起源于核殼。
SDS-PAGE凝膠上的內(nèi)容物通過半干印跡的方法被轉(zhuǎn)移到一個聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，主要的病毒蛋白質(zhì)帶被切下和測序。VP28和VP26中有超過40個氨基酸被從N端測序(分別顯示在圖2b和2c中，用粗體字顯示)。VP26的N末端序列包含了MEFGNLTNLDVAIIAILSIAIIALIVIMVIMIVFNTRVGRSVVAN。VP28 N末端測序得出的氨基酸序列是MDLSFTLSVVSAILAITAVIAVFIVIFRYHNTVTKTIEtHsD，其中39位的蘇氨酸和41位的絲氨酸是不確定的。這兩個N末端序列都是疏水的(圖3)。經(jīng)由N末端肽測序所獲得的VP24 N末端氨基酸序列是MHMWGVYAAILAGLTLILVVISIVVTNIELNKKLDKKDK(SEQ ID No5)。VP19的N末端被發(fā)現(xiàn)是封閉的，由CNBr消化N末端封閉肽所獲得的VP19的部分內(nèi)部序列是IVLISI(G/V)ILVLAVMNV(P/A/T)MGPKKDS(SEQ ID No6)。在VP19不完全的序列中，第7位氨基酸殘基可能是G或V，第17位可能是P，A或T殘基。
24kDa蛋白質(zhì)基因的定位和序列根據(jù)VP24 N末端蛋白質(zhì)序列，發(fā)展出了一組簡并的PCR引物，正向引物是5’CAGAATTCATGCAYATGTGGGGNGT 3’(SEQ ID No13)，而反向引物則是5’CAGAATTCYTTRTCYTTYTTRTCIARYTT 3’(SEQ ID No14)，兩者都包含EcoRI位點(斜體字)。使用白斑綜合征病毒基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。獲得了一個133bp長的片段，并經(jīng)由2％瓊脂糖凝膠純化之后，插入pBluescript SK+質(zhì)粒中并測序。這種PCR產(chǎn)品的序列與白斑綜合征病毒VP24的N末端蛋白質(zhì)序列(SEQ ID No5)相吻合，從而在白斑綜合征病毒質(zhì)粒文庫篩選實驗中被作為探針使用(Sambrook等，1989)，用來識別VP24完整的可讀框。一個能與這個片段進(jìn)行雜交的18kbp BamHI片段被挑選出來進(jìn)行進(jìn)一步的分析。
包含627個核苷酸的完整vp24可讀框和這個基因的啟動子區(qū)域在18kbp BamHI片段上被發(fā)現(xiàn)。翻譯的起始密碼子處于有利的區(qū)域(AAAATGC)中，可以有效地起始真核翻譯(Kozak，1989)。在啟動子區(qū)域中，排列著一段A/T富集序列，但是沒有發(fā)現(xiàn)共有序列TATA盒。polyA信號與翻譯中止密碼子重疊。vp24可讀框(SEQ ID No11)編碼一段208個氨基酸(SEQ ID No12)的推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)，其中氨基酸序列包含經(jīng)實驗證實的VP24 N末端序列(SEQ ID No5)。VP24的理論大小有23kDa，等電點8.7。在VP24里面發(fā)現(xiàn)有四個可能的N-糖基化位點(N-{P}-[ST]-{P})，一個O-糖基化位點(Hansen等，1998)和9個可能的磷酸化位點([ST]-X-X-[DE]或[ST-X-[RK])。但是不知道是否其中任何一個修飾確實發(fā)生過。在VP24中沒有發(fā)現(xiàn)其他存在于PROSITE據(jù)庫中的基序。208個氨基酸的計算機(jī)分析顯示在VP24的N末端存在一個強(qiáng)疏水區(qū)，包括一段推測的由第6到第25個氨基酸形成的跨膜α-螺旋。Gamier等人(1978)的算法還預(yù)測在該蛋白質(zhì)中存在數(shù)個其他的α-螺旋和β-片層。
26kDa蛋白質(zhì)基因的定位和序列部分Hind III和BamH I白斑綜合征病毒基因組文庫被構(gòu)建于pBluescript-SK+質(zhì)粒中(van Hulten等，2000)，從許多白斑綜合征病毒片段中獲得末端的核苷酸序列。編碼VP26的N末端序列的核苷酸序列存在于6kb BamHI片段的近末端(圖2a)。圍繞甲硫氨酸起始密碼子的序列(AAAATGG)與Kozak規(guī)則中有關(guān)真核翻譯的有效起始的描述相吻合(Kozak，1989)。VP26的非翻譯引導(dǎo)序列只有49個核苷酸可以被判定，一直伸展到末端BamH I位點(圖2a)。
6kb BamHI片段包含了一個555nt的可讀框，包括那些編碼VP26N末端氨基酸的序列(圖2b)，polyA信號存在于VP26的翻譯終止密碼子下游94個核苷酸(nt)處。此可讀框(VP26)編碼一個含有184個氨基酸的蛋白質(zhì)，理論大小為20kDa。這個推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)是堿性的，等電點為9.4。存在三個可能的N-糖基化位點(N-{P}-[ST]-{P})，以及三個使用NetOglyc程序推測出的O-糖基化位點(圖2b)(Hansen等，1998)。發(fā)現(xiàn)了十三個可能的磷酸化位點([ST]-X-X-[DE]或[ST]-X-[RK])，但是沒有發(fā)現(xiàn)其他存在于PROSITE數(shù)據(jù)庫中的基序。VP26的184氨基酸的疏水性分析顯示一個強(qiáng)的疏水區(qū)域存在于該蛋白質(zhì)的N端(圖3a)。這個區(qū)域包含了一個推測的、由第12到第34位氨基酸構(gòu)成的、呈α-螺旋形式的跨膜錨鉤。錨鉤的后面是一個含有兩個精氨酸的帶正電荷區(qū)，這暗示其羧基端是朝向細(xì)胞質(zhì)一側(cè)的(Sonnhammer等，1998)。除α-螺旋外，在這個跨膜區(qū)內(nèi)，根據(jù)Gamier等(1978)發(fā)現(xiàn)的法則，發(fā)現(xiàn)從第127位到第141位有一個潛在的β-片層。在該蛋白質(zhì)中只有一個半胱氨酸，顯示其不能在內(nèi)部蛋白質(zhì)之間形成二硫鍵交聯(lián)。這個半胱氨酸位于蛋白質(zhì)的C末端部分，在VP28中也是如此。
28kDa蛋白質(zhì)基因的定位和序列從白斑綜合征病毒末端片段序列翻譯得不到VP28的氨基酸序列。根據(jù)這個多肽的N末端序列發(fā)展出一套簡并引物。正向引物是5’CAGAATTCTCDATNGTYTTNGTNAC 3’(SEQ ID No7)，而反向引物是有EcoRI位點(斜體字)的5’CAGAATTCATGGAYYTNWSNTTYAC 3’(SEQ IDNo8)。序列上的引物定位如圖2c所示。使用白斑綜合征病毒DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。獲得一個128bp長的片段，并且該序列經(jīng)過2.5％瓊脂糖凝膠純化以后，被克隆到pBluescript SK+質(zhì)粒之內(nèi)并進(jìn)行測序。該核苷酸序列編碼白斑綜合征病毒VP28的N末端蛋白質(zhì)序列，這個128bp片段還被用在菌落篩選實驗中，作為探針來對數(shù)個白斑綜合征病毒質(zhì)粒文庫進(jìn)行鑒定(Sambrook等，1989)。一個3kb Hind III片段由于能與這個片段進(jìn)行雜交而被留做進(jìn)一步分析。
612nt的完整可讀框(vp28)和這個基因的啟動子區(qū)域在這個3kb Hind III片段上被發(fā)現(xiàn)(圖2c)。甲硫氨酸起始密碼子(GTCATGG)處于有利的環(huán)境中，可以有效地起始真核翻譯(Kozak，1989)。在啟動子區(qū)域中，排列著一段A/T富集序列，但是沒有發(fā)現(xiàn)共有的TATA盒。polyA信號位于翻譯終止密碼子下游55核苷酸處。這個可讀框編碼一個含有204個氨基酸的推測蛋白質(zhì)，包括N末端測序的氨基酸在內(nèi)。這個酸性的蛋白質(zhì)的理論上的大小是22kDa，等電點4.6。發(fā)現(xiàn)有五個潛在的N-糖基化位點(N-{P}-[ST]-{P})，二個O-糖基化位點(Hansen等，1998)(圖2c)和9個潛在的磷酸化位點([ST]-X-X-[Pe]或[ST]-X-[RK])。(在VP28中沒有發(fā)現(xiàn)其他存在于PROSITE數(shù)據(jù)庫中的基序。
計算機(jī)分析顯示這個204個氨基酸的蛋白質(zhì)在其N端有一個強(qiáng)疏水區(qū)(圖3b)，包括一個推測的、由第9到第27位氨基酸形成的穿膜α-螺旋序列。和VP26一樣，穿膜錨鉤的后面是一個帶正電荷區(qū)，這暗示該蛋白質(zhì)可能具有由外向內(nèi)的方向。在序列的C末端部分發(fā)現(xiàn)了另外的一個疏水區(qū)，它可能組成一個穿膜序列。然而，Gamier等的算法(1978)沒有預(yù)測出在VP28的這個位置存在α-螺旋。該算法預(yù)測在89到99位氨基酸處存在另一個α-螺旋，但是該蛋白沒有β-片層。和VP26一樣，在VP28中也只有一個半胱氨酸，這個半胱氨酸位于蛋白質(zhì)的C末端部分。
重組的vp24，vp26和vp28的表達(dá)和分析。
采用Bac-to-Bac系統(tǒng)(GIBCO BRL)在昆蟲的細(xì)胞中制備能夠表達(dá)推導(dǎo)的白斑綜合征病毒顆粒蛋白質(zhì)VP24，VP26，VP26c和VP28的重組桿狀病毒。vp24，vp26，vp26c和vp28基因(分別是SEQ ID No11，SEQ ID No1，SEQ ID No9和SEQ ID No2)被克隆到pFastBac-D/GFP質(zhì)粒的多角體蛋白啟動子的下游，該質(zhì)粒包含一個位于p10啟動子的下游的GFP基因。從pFastBac-D/GFP(對照)質(zhì)粒以及分別帶有vp24，vp26，vp26c和vp28基因的質(zhì)粒中產(chǎn)生重組病毒，這些重組病毒分別被命名為AcMNPV-GFP，AcMNPV-WSSVvp24，AcMNPV-WSSVvp26，AcMNPV-WSSVvp26c和AcMNPV-WSSVvp28。所有的重組病毒都受p10啟動子調(diào)控表達(dá)GFP；后四者還在多角體蛋白啟動子的調(diào)控下分別表達(dá)VP24(SEQ ID No12)，VP26(SEQ ID No3)，VP26c(SEQ ID No10)和VP28(SEQ ID No4)。
受AcMNPV-wt，AcMNPV-GFP，AcMNPV-WSSVvp26和AcMNPV-WSSVvp28感染的Sf21細(xì)胞的提取物在15％SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行分析。在受野生型AcMNPV感染的細(xì)胞中(圖4a，泳道3)可見一條32kDa的帶，它代表多角體蛋白。在那些含有被AcMNPV-GFP感染的細(xì)胞的提取物(泳道4)，以及被表達(dá)白斑綜合征病毒蛋白質(zhì)的重組病毒感染的細(xì)胞的提取物(泳道5和6)的泳道中，可以觀察到一個大約29kDa的GFP蛋白質(zhì)帶。受AcMNPV-GFP感染的細(xì)胞中的GFP的表達(dá)，比那些受同時從多角體蛋白啟動子表達(dá)白斑綜合征病毒蛋白質(zhì)(泳道5和6)的桿狀病毒感染的細(xì)胞中的GFP表達(dá)要高。用紫外線照射那些受不同的AcMNPV重組病毒感染的細(xì)胞后，這很容易觀察到，其中受AcMNPV-GFP感染的細(xì)胞的GFP螢光是最強(qiáng)的(資料未顯示)。由多角體蛋白啟動子調(diào)控的白斑綜合征病毒蛋白質(zhì)的表達(dá)與由p10啟動子調(diào)控的GFP的表達(dá)相比，前者明要高(泳道5和6)。在受AcMNPV-WSSVvp26感染的細(xì)胞提取物中，可以觀察到一個21kDa蛋白質(zhì)的強(qiáng)表達(dá)，它很有可能代表白斑綜合征病毒的VP26(泳道5)。在受AcMNPV-WSSVvp28感染的細(xì)胞中可觀察到28kDa蛋白質(zhì)的強(qiáng)表達(dá)(泳道6)。在這些凝膠中，通過使用抗GFP抗血清，GFP的位置被蛋白質(zhì)印跡分析所確認(rèn)(數(shù)據(jù)未顯示)。
用野生型和重組的AcMNPV感染Sf21細(xì)胞，取樣在SDS-PAGE凝膠中電泳，然后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。一種抗白斑綜合征病毒毒粒的多克隆抗體被用來檢測重組的VP26和VP28(圖4b)。VP26和VP28都在這些細(xì)胞提取物中被很好地檢測到。VP26在分子量為21kDa的位置處被檢測到，這與考馬斯亮藍(lán)染色凝膠結(jié)果相符(圖4a，泳道5；圖4b，泳道5)。重組VP28與來自白斑綜合征病毒顆粒的VP28在凝膠上移動到同一位置，該位置所代表的分子量明顯高于這個蛋白質(zhì)的理論大小22kDa。就象從這些樣品的非常低的本底反應(yīng)所能觀察出來的那樣，該多克隆抗體沒有與昆蟲細(xì)胞(泳道2)或桿狀病毒(泳道3和4)的蛋白質(zhì)發(fā)生較多的交叉反應(yīng)。
將受AcMNPV-WSSVvp26c以及AcMNPV-WSSVvp24感染的Sf21細(xì)胞的提取物在15％SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行分析。一個低分子量標(biāo)準(zhǔn)和純化的白斑綜合征病毒顆粒也在相同的凝膠中分析。在含有受AcMNPV-WSSVvp26c以及AcMNPV-WSSVvp24感染的細(xì)胞的泳道中，可以觀察到一個29kDa的弱帶，它代表GFP，在受感染的細(xì)胞經(jīng)紫外線照射之后可以很清楚地被觀察到。此外在含有受AcMNPV-WSSVvp26c感染的細(xì)胞的泳道中，可以觀察到一個26kDa的強(qiáng)表達(dá)帶，與在白斑綜合征病毒顆粒中的26kDa帶出現(xiàn)在凝膠中的相同位置。在包含受AcMNPV-WSSVvp24感染的細(xì)胞的泳道，可以觀察到一個清晰的24kDa帶，與白斑綜合征病毒顆粒所具有的24kDa蛋白質(zhì)的位置相一致。為了證明在受AcMNPV-WSSVvp26c感染的細(xì)胞中的26kDa帶，和在受AcMNPV-WSSVvp24感染的細(xì)胞中的24kDa帶，與在白斑綜合征病毒顆粒中的26kDa和24kDa蛋白質(zhì)相一致，使用抗白斑綜合征病毒顆粒的一個多克隆抗體對這個凝膠進(jìn)行蛋白印跡分析。在受AcMNPV-WSSVvp26c感染的細(xì)胞中的26kDa帶，以及在受AcMNPV-WSSVvp24感染的細(xì)胞中的24kDa帶都被很好地檢測到了。
VP26和VP28的相關(guān)性以GenBank/EMBL，SWISSPORT和PIR數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，使用FASTA，TFASTA和BLAST程序，對白斑綜合征病毒的VP24，VP26，VP26c和VP28進(jìn)行了同源性搜索。沒有發(fā)現(xiàn)它們與存儲在GenBank中的序列有明顯的同源關(guān)系，它們既不與桿狀病毒包膜或衣殼蛋白質(zhì)有同源關(guān)系，也不與來自其他的大的DNA病毒的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)有同源關(guān)系。
中和實驗病毒原種的滴度從滴定實驗中獲得。病毒原種被稀釋1×107到5×1011倍，在每個稀釋度，都要取該稀釋度的病毒液給10只蝦(斑節(jié)對蝦，3-4個月大)進(jìn)行肌內(nèi)注射，每只注射10μl。白斑綜合征病毒原種的1×108倍稀釋液在7到12天后可引起50％的蝦死亡。在進(jìn)一步的實驗中將會用到這個稀釋度。
4群蝦用于中和實驗

給每只蝦注射的病毒的總量在所有的組中都是恒定不變的，都等于10μl的病毒原種的1×108倍稀釋液。組3中的血清濃度和組4是相同的(每次注射都含有1ul的白斑綜合征病毒和9ul血清)。在注射之后，蝦被監(jiān)視4個星期，死蝦要經(jīng)過電子顯微鏡檢查以確定白斑綜合征病毒的存在。結(jié)果如圖5所示。
在組1，即陰性對照組中，沒有一只蝦因感染白斑綜合征病毒而死亡，因此死亡率是0％。在陽性對照(組2)中，在23天之后，死亡率達(dá)到100％。免疫前血清(在兔子被注射VP28蛋白質(zhì)之前采集的血清)加入白斑綜合征病毒的組(組3)，在25天內(nèi)死亡率達(dá)到100％。VP28抗毒血清加入白斑綜合征病毒的組(組4)，所有的蝦都活著，死亡率為0％。這些結(jié)果顯示VP28抗毒血清在斑節(jié)對蝦中能夠中和白斑綜合征病毒的感染。
蛋白質(zhì)免疫接種用5μl(初次接種)和10ul(加強(qiáng)免疫)不同的蛋白質(zhì)溶液對組3-6進(jìn)行免疫接種。免疫接種時，組3接受了2.5μg VP28蛋白質(zhì)，組4接受了3.6μg VP26c蛋白質(zhì)，組5接受了0.7μg VP24蛋白質(zhì)。組6接受了由等體積的VP28，VP26c以及VP24溶液所組成的混合物，總共2.7ug蛋白質(zhì)。加強(qiáng)免疫時，這些蝦所接受的蛋白質(zhì)的量就更高了組3為9.6ug VP28蛋白質(zhì)，組4為5.7ug VP26c蛋白質(zhì)，組5為5.9ug VP24蛋白質(zhì)，組6為合計7.1ug的混合蛋白質(zhì)。所有這些組里的蝦都被注射了10ul 1×108倍稀釋的白斑綜合征病毒原種溶液。
免疫接種的結(jié)果如圖6所示。在組1，即陰性對照組中，沒有一只蝦因感染白斑綜合征病毒而死亡，因此死亡率是0％。在組2中，在注射后1天，蝦就因為感染白斑綜合征病毒而開始死亡，并且死亡率在不斷增加。雖然這些蝦所接受的白斑綜合征病毒的劑量與中和實驗中的蝦所接受的劑量完全相同，但是組2中的蝦更早地開始死亡。這或許是由于本實驗進(jìn)行多次注射而引起對蝦的壓力所造成的結(jié)果。在組3-5(蝦分別被接種了VP24，VP26c和VP28)中的死亡率被延遲，在組6(蝦被接種了VP24，VP26c和VP28的混合物)中，沒有一只蝦因為感染白斑綜合征病毒而死亡，因此死亡率是0％。對在接種中使用的各蛋白質(zhì)的劑量進(jìn)行優(yōu)化也會增強(qiáng)抗白斑綜合征病毒感染的保護(hù)效果。
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<223>人工序列描述引物<400>13cagaattcat gcayatgtgg ggngt25<210>14<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物；n是脫氧肌苷<400>14cagaattcyt trtcyttytt rtcnarytt29
權(quán)利要求
1.用于在甲殼動物中預(yù)防和/或治療白斑綜合征的疫苗，其包含藥學(xué)上可接受的載體和蛋白質(zhì)，所說的蛋白質(zhì)含有SEQ ID NO6所示的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗，其特征在于該疫苗包含具有SEQ ID NO3或10所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)、具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)、和具有SEQ ID NO12所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的混合物。
3.用于在甲殼動物中預(yù)防或治療白斑綜合征的載體疫苗，其特征在于所述疫苗含有減毒的細(xì)菌或病毒，所述的細(xì)菌或病毒在它的基因組中包含編碼白斑綜合征病毒蛋白質(zhì)的異源核酸序列，所說的白斑綜合征病毒蛋白質(zhì)包含SEQ ID NO6所示的氨基酸序列。
4.來源于白斑綜合征病毒的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，其特征在于所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列是SEQ ID NO6中描述的氨基酸序列。
5.編碼白斑綜合征病毒的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的核酸序列，其特征在于所述結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO6中所描述的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)用作藥物的用途。
7.藥物組合物，其含有藥學(xué)上可接受的載體和至少一種根據(jù)權(quán)利要求4的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)或至少一種根據(jù)權(quán)利要求5的核酸序列。
8.抗根據(jù)權(quán)利要求4的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的抗體。
9.疫苗或藥物制劑，含有藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑以及至少一種根據(jù)權(quán)利要求8的抗體。
10.用于檢測白斑綜合征病毒的診斷試劑盒，其特征在于所述試劑盒包含根據(jù)權(quán)利要求5的核酸序列或根據(jù)權(quán)利要求8的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及源自白斑綜合征病毒的四種估計大小為28kDa(VP28)、26kDa(VP26)、24kDa(VP24)和19kDa(VP19)的主要蛋白質(zhì)的分離和特性鑒定，以及它們在疫苗的制備中的應(yīng)用，這種疫苗是被用來保護(hù)甲殼動物抵抗白斑綜合征病毒感染的。本發(fā)明進(jìn)一步提供編碼上述蛋白質(zhì)的核酸序列以及它們在上述蛋白質(zhì)的重組制備中的應(yīng)用。另外，本發(fā)明還提供對抗上述蛋白質(zhì)的抗體，和這些抗體在被動免疫接種中的應(yīng)用，以及包含上述核酸或抗體的診斷試劑盒。
文檔編號A61K39/00GK1626241SQ20041005600
公開日2005年6月15日 申請日期2000年7月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月3日
發(fā)明者M·C·W·范霍爾藤, J·M·福拉克 申請人:阿克佐諾貝爾公司