專利名稱：雜交酵母艾滋病疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種治療和/或預(yù)防傳染性疾病艾滋病的方法及其組成成份。該發(fā)明由至少兩個(gè)基因表達(dá)單位經(jīng)雜交形成一個(gè)基因表達(dá)載體；其中一個(gè)基因表達(dá)單位表達(dá)細(xì)胞T細(xì)胞生長(zhǎng)因子和/或淋巴因子，另一個(gè)基因表達(dá)單位表達(dá)單個(gè)、融合和/或多個(gè)HIV病原體抗原基因；該發(fā)明主要應(yīng)用這個(gè)基因表達(dá)雜交載體研發(fā)治療和預(yù)防艾滋病的雜交酵母疫苗。
背景技術(shù)：
在疾病防治歷史上，疫苗一直是最有效、價(jià)廉和實(shí)用的方法。沒(méi)有任何一種措施包括抗生素在內(nèi)曾經(jīng)如此有效地降低人口的死亡率，疫苗對(duì)人類健康的影響之大是難以用語(yǔ)言做評(píng)價(jià)的。疫苗曾在世界上許多國(guó)家成功地控制了以下九種疾病天花、白喉、破傷風(fēng)、猩紅熱、百日咳、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、腮腺炎和風(fēng)疹。天花是在世界范圍內(nèi)得到最有效控制的疾病。一個(gè)疫苗的有效性是取決于它能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)的能力。
脊椎動(dòng)物尤其是鳥類和哺乳動(dòng)物戰(zhàn)勝微生物感染的機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。病原體侵入宿主后會(huì)激活機(jī)體多系統(tǒng)多種保護(hù)性反應(yīng)，如果病原體或其毒素成功地攻破機(jī)體的外層防線而進(jìn)入血循環(huán)，淋巴器官如脾、肝和骨髓將會(huì)分解和清除進(jìn)入血循環(huán)中的病原體或其毒素。淋巴組織是由一系列相互交織的細(xì)胞和纖維組成，這些細(xì)胞包括白細(xì)胞即淋巴細(xì)胞和處于不同分化階段的其它細(xì)胞，如漿細(xì)胞、淋巴纖維細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞和肥大細(xì)胞。淋巴細(xì)胞主要分為T和B淋巴細(xì)胞，它們?cè)跈C(jī)體的抗原特異性免疫反應(yīng)中起不同作用但又互補(bǔ)。
免疫系統(tǒng)通過(guò)識(shí)別外源性病原體而成為保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要防線。機(jī)體對(duì)外源性病原體的初步反應(yīng)稱為“先天性免疫”，先天性免疫的特征是自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和其它白細(xì)胞首先對(duì)病原體產(chǎn)生應(yīng)答，這些細(xì)胞通過(guò)吞噬、消化、裂解或分泌淋巴因子在短時(shí)間內(nèi)消滅病原體。先天性免疫是抗原非特異性的，它是機(jī)體產(chǎn)生“獲得性免疫”應(yīng)答之前的第一道抵御病原體的防線。T和B淋巴細(xì)胞是參于獲得性免疫反應(yīng)的主要細(xì)胞，獲得性免疫反應(yīng)的特征是B細(xì)胞識(shí)別抗原后被激活從而分泌抗原特異性抗體、T細(xì)胞的激活和抗原提呈。
B細(xì)胞識(shí)別抗原是指抗原與B細(xì)胞表面的免疫球蛋白受體結(jié)合，這些抗原包括細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)菌毒素或病毒表面糖蛋白，該結(jié)合促使信號(hào)傳導(dǎo)到B細(xì)胞內(nèi)，此過(guò)程稱為“第一信號(hào)”，在某些情況下，僅需要一個(gè)信號(hào)就能激活B細(xì)胞，這些無(wú)需輔助性T細(xì)胞就能激活B細(xì)胞的抗原稱為“不依賴T細(xì)胞抗原”(或不依賴胸腺抗原)；某些情況下，B細(xì)胞的激活需要“第二信號(hào)”，第二信號(hào)通常由輔助性T細(xì)胞提供，這類細(xì)胞抗原稱為“T細(xì)胞依賴性抗原”(或胸腺依賴性抗原)；結(jié)合到B細(xì)胞表面的抗原通過(guò)內(nèi)吞進(jìn)入B細(xì)胞并被消化為小片段，這些片段又與B細(xì)胞表面的MHC II分子結(jié)合形成“抗原多肽-MHC II分子復(fù)合物”，該復(fù)合物提供T細(xì)胞依賴性抗原激活B細(xì)胞所需的第二信號(hào)。激活B細(xì)胞的另一種方式是B細(xì)胞與淋巴結(jié)和脾臟生發(fā)中心的樹突狀細(xì)胞(DentriticCells，DC)結(jié)合。
獲得性免疫的一個(gè)重要機(jī)制是T細(xì)胞的激活，激活T細(xì)胞需要抗原提呈細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞與T細(xì)胞結(jié)合，巨噬細(xì)胞表面有多個(gè)識(shí)別病原體抗原的受體，如甘露糖和清道夫受體，巨噬細(xì)胞吞噬這些病原體后在內(nèi)體和溶酶體的作用下將其消化裂解為多肽片段，這些多肽片段與巨噬細(xì)胞表面的MHC II分子結(jié)合形成“抗原多肽-MHC II分子復(fù)合物”，當(dāng)T細(xì)胞與該復(fù)合物結(jié)合后被激活。DC細(xì)胞是既能形成“抗原多肽-MHC II分子復(fù)合物”又能形成“抗原多肽-MHC I分子復(fù)合物”的抗原提呈細(xì)胞。
當(dāng)B細(xì)胞與抗原結(jié)合后通過(guò)“同型轉(zhuǎn)換”使分泌普通IgM抗體的B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為分泌特異性的IgG抗體，這些細(xì)胞分為兩類一類不斷分裂稱為克隆擴(kuò)增，這類細(xì)胞成熟后每秒鐘可釋放2000個(gè)同樣的抗體，約2-3天后死亡；另一類細(xì)胞此時(shí)不分泌抗體而成為記憶細(xì)胞，這些記憶細(xì)胞可存活數(shù)月到數(shù)年，當(dāng)再次遇到同樣抗原時(shí)這類記憶細(xì)胞會(huì)迅速產(chǎn)生大量抗體，這種免疫反應(yīng)稱為次級(jí)免疫反應(yīng)。研發(fā)疫苗的目標(biāo)就是要誘導(dǎo)這種較初級(jí)免疫反應(yīng)更快更強(qiáng)的次級(jí)免疫反應(yīng)。
經(jīng)典的主動(dòng)疫苗分為亞單位和完整病原體疫苗，亞單位疫苗是完整病原體的一部分，其目的是避免應(yīng)用有致病性的完整病原體或避免應(yīng)用完整病原體的有毒組份。B型副流感病毒的脂多糖做為腦膜炎疫苗就是應(yīng)用抗原組份的一個(gè)亞單位疫苗例子；完整病原體疫苗通常是滅活或減毒的病原體，如滅活的百日咳疫苗。由于滅活或減毒過(guò)程有時(shí)會(huì)損害一些誘導(dǎo)免疫反應(yīng)所必需的抗原決定基，因此這類疫苗常需添加免疫增強(qiáng)劑。
傳統(tǒng)的預(yù)防性疫苗是通過(guò)接種疫苗后使機(jī)體在再次遇到相同病原體時(shí)能產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)，這種理論適用于病毒或細(xì)菌傳染性疾病，因病毒或細(xì)菌僅有有限數(shù)量的抗原；但抗癌疫苗并非如此，抗癌疫苗是必須能夠根除已經(jīng)存在的癌細(xì)胞，這樣就使我們必須更好地明白腫瘤抗原和宿主免疫的作用機(jī)制，當(dāng)代的疫苗理論是要誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)。
迄今為止沒(méi)有成功的艾滋病(AIDs)疫苗，在某些有癥狀和無(wú)癥狀的艾滋病患者體內(nèi)檢測(cè)到滴度很高的抗gp160/120抗體提示，這些抗體也許不僅不起保護(hù)作用，反而有可能促進(jìn)病毒顆粒與細(xì)胞的連接和穿入宿主細(xì)胞，更重要的是，現(xiàn)在還沒(méi)有疫苗能夠誘導(dǎo)足夠強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)來(lái)消滅已被HIV感染的并不斷釋放新病毒顆粒的被感染細(xì)胞。
盡管有許多基礎(chǔ)和臨床研究表明免疫系統(tǒng)有清除癌細(xì)胞的能力，但大多數(shù)情況下，免疫系統(tǒng)或者不能識(shí)別癌細(xì)胞或者所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)太弱而無(wú)明顯效果[Farzaneh，etal.，Immunol.Today，19294(1998)]，尤其是對(duì)已廣泛轉(zhuǎn)移的晚期腫瘤。癌癥治療中的手術(shù)、化療、放療及其聯(lián)合療法仍不能達(dá)到治愈的目的事實(shí)提醒我們，免疫和生物療法也許是新的希望[Ockert，et al.，Immunol.Today，2063(1999)]。目前，刺激機(jī)體免疫反應(yīng)來(lái)誘導(dǎo)腫瘤消退成為腫瘤免疫的目標(biāo)，為此，我們需要更好地明白腫瘤抗原基因和T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)與腫瘤逃避[Boon，et al.，Immunol.Today，18267(1998)；Chen，et al.，Immunol.Today，1927(1998)]。
腫瘤動(dòng)物模型的研究表明，細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Cytotoxicity T cells，CTL)在抗腫瘤免疫反應(yīng)中起著重要的作用[Denfeld，et al.，Int J.Cancer，62；259；Greten，etal.，J.Clin.Oncol.，171047(1998)；Sampson，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9310399(1996)]，但是誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)是研發(fā)腫瘤疫苗的最重要挑戰(zhàn)[Sampson，et al.]。激活淋巴細(xì)胞的雙信號(hào)模型被認(rèn)為是最理想的激活方式，它需要TCR提呈的抗原性特異性信號(hào)和抗原非特異性刺激信號(hào)的共同參與[Van Seventer，et al.，Curr.Opin.Immunol.，3294(1991)；Linsley，et al.，J.Exp.Med.，173721(1991)]。由此看來(lái)，腫瘤細(xì)胞侵潤(rùn)機(jī)體不僅涉及腫瘤細(xì)胞本身，而且損害宿主細(xì)胞的整體免疫功能，這些包括腫瘤細(xì)胞MHC復(fù)合物的表達(dá)缺陷、抗原提呈缺陷、T細(xì)胞識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原的缺陷、協(xié)同刺激信號(hào)的缺陷、粘附分子表達(dá)缺陷、Fas受體和配體的表達(dá)缺陷、腫瘤微環(huán)境免疫因子分泌缺陷等[Boon，et al.，1997]。因此，在病理狀態(tài)下常是因?yàn)槊庖叻磻?yīng)太弱而不能抵御疾病，而全面激活抗原特異性T細(xì)胞至少需要兩個(gè)刺激信號(hào)[Young，et al.，J.Clin.Invest.，90229(1992)；Allison，et al.，Science，270932(1995)]，一是由抗原提呈細(xì)胞(APC)提呈的與T細(xì)胞受體(TCR)偶聯(lián)的抗原多肽MHC復(fù)合物，二是由T細(xì)胞和APC細(xì)胞提呈的細(xì)胞因子，如CD28和B7-1，這兩個(gè)信號(hào)協(xié)同作用激活T細(xì)胞，被激活的T細(xì)胞通過(guò)克隆擴(kuò)增和分化而成為功能性T細(xì)胞[Lisley，et al.，1991；Young，et al.1992；Bluestone，Immunity，2555(1995)；Guerder，etal.，J.Immunol.，1555167(1995)；Webb，et al.Blood，863479(1995)；Thompson，Cell，81979(1995)]。功能性T細(xì)胞與天然性T細(xì)胞不同，功能性T細(xì)胞一旦被激活，它就不再需要協(xié)同刺激信號(hào)來(lái)識(shí)別和消滅帶有抗原的靶細(xì)胞，一旦免疫反應(yīng)被啟動(dòng)，一部分功能性T細(xì)胞就成為記憶細(xì)胞以備再次遇到相同抗原時(shí)產(chǎn)生更強(qiáng)更快的免疫反應(yīng)[Gray，Ann.Rev.Immunol.，1149(1993)；Ahmed，et al.，Science，27254(1996)]，而缺乏第二個(gè)刺激信號(hào)時(shí)常產(chǎn)生無(wú)功能性T細(xì)胞[Chen，1998；Van Gool，et al.，Res.Immunol.，146183(1994)]。
許多腫瘤細(xì)胞都表達(dá)靶抗原，但它們通常都不能刺激免疫反應(yīng)[Boon，et al.，1997；Boon，et al.，J.Exp.Med.，183725(1996)]，小鼠動(dòng)物模型中的研究已證明，CTL反應(yīng)能夠使已形成的腫瘤消退[Mogi，et al.，Clin.Cancer Res.，4713(1998)；Gong，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，972715(2000)]，誘導(dǎo)強(qiáng)有力的CTL反應(yīng)是目前抗癌疫苗的策略。
CTL依賴性抗腫瘤免疫不僅需要CTL能識(shí)別的抗原而且需要有效的抗原導(dǎo)入方法，CTL能夠識(shí)別的靶抗原是MHC I分子與抗原多肽的復(fù)合物，為有效激活CTL，MHC I-抗原多肽復(fù)合物必須通過(guò)專業(yè)性APC細(xì)胞提呈給CTL，而將外源性抗原有效地導(dǎo)入MHC I限制性的APC細(xì)胞是設(shè)計(jì)癌癥疫苗的關(guān)鍵，目前正在研究階段的抗原導(dǎo)入方法有多肽、熱休克蛋白、負(fù)載抗原的APC細(xì)胞的被動(dòng)移植等。近來(lái)一些研究表明，應(yīng)用病毒或脂質(zhì)體載體導(dǎo)入DNA疫苗或裸體DNA疫苗都能誘導(dǎo)一定程度的抗腫瘤免疫。
研究表明，CTL的激活通常需要IL-2使CTL-P轉(zhuǎn)化為CTL，IL-2缺乏或不足時(shí)會(huì)使更被激活的CTL發(fā)生細(xì)胞凋亡，在這種情況下，已激活的免疫反應(yīng)又會(huì)被迅速終止。
為了克服通過(guò)激活CTL的方法來(lái)戰(zhàn)勝HIV和癌癥，目前急需新型有效的疫苗載體系統(tǒng)。最理想的莫過(guò)于載體本身具有免疫佐劑作用，這種載體能有效地將抗原導(dǎo)入巨噬細(xì)胞和DC，如果這個(gè)載體能攜帶多種抗原分子將更有利于全面激活所希望的獲得性免疫反應(yīng)，雙信號(hào)激活模型能提供有效和持久的T細(xì)胞活性，現(xiàn)代大多數(shù)疫苗都需要誘導(dǎo)強(qiáng)效的由細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(CMI)，包括CTL免疫反應(yīng)，但是，僅用蛋白很難誘導(dǎo)強(qiáng)效的CTL反應(yīng)，因此，如何有效地將蛋白或DNA導(dǎo)入體內(nèi)靶部位成為疫苗成功的關(guān)鍵。
本發(fā)明是一種雜交酵母艾滋病疫苗載體，它能誘導(dǎo)與MHC I和II分子偶聯(lián)的強(qiáng)效、持久的保護(hù)性CTL免疫反應(yīng)，也就是說(shuō)是能達(dá)到理想免疫效果的疫苗載體系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明第一部分是一個(gè)基因載體系統(tǒng)。該載體由兩個(gè)DNA質(zhì)粒組成，一個(gè)編碼協(xié)同刺激信號(hào)，由啟動(dòng)子操作的T細(xì)胞生長(zhǎng)因子；另一個(gè)DNA質(zhì)粒編碼由啟動(dòng)子操作的至少一個(gè)或多個(gè)HIV-1抗原基因。
本發(fā)明第二部分是一種誘導(dǎo)HIV-1特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)(CTL)對(duì)抗HIV-1病毒及其它病原微生物的方法。
本發(fā)明第三部分是一種基因表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)由獨(dú)立啟動(dòng)子分別表達(dá)T細(xì)胞生長(zhǎng)因子如IL-2和HIV-1病原體抗原基因。
本發(fā)明第四部分是一種誘導(dǎo)脊椎動(dòng)物免疫反應(yīng)的方法，所需免疫反應(yīng)通過(guò)該艾滋病疫苗載體及疫苗載體所攜帶的抗原基因或T細(xì)胞生長(zhǎng)因子來(lái)體現(xiàn)。


以下

是對(duì)本發(fā)明以圖表示時(shí)的一些部分的具體描述，同時(shí)也是對(duì)本發(fā)明原理的輔助性解釋。
圖1.本發(fā)明操作原理的圖解。
圖2.本發(fā)明應(yīng)用的艾滋病疫苗實(shí)例圖解。
圖3.應(yīng)用本發(fā)明所表達(dá)的hIL-2水平的線圖示。
圖4.應(yīng)用本發(fā)明所生產(chǎn)的疫苗免疫接種小鼠后所誘導(dǎo)的CTL反應(yīng)條形圖示。
圖5.應(yīng)用本發(fā)明所生產(chǎn)的疫苗對(duì)HIV-1.gag腫瘤B16-gag生長(zhǎng)的抑制作用條形6.應(yīng)用本發(fā)明所生產(chǎn)的疫苗不同劑量對(duì)HIV-1.gag腫瘤B16-gag生長(zhǎng)的抑制作用條形圖具體實(shí)施方式
本發(fā)明的艾滋病疫苗載體系統(tǒng)是一種誘導(dǎo)強(qiáng)效、持久的CTL免疫反應(yīng)的方法，它通過(guò)激活依賴MHC I和II的途徑來(lái)產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。圖1是對(duì)本發(fā)明操作原理的圖解，圖中的酵母質(zhì)粒α和a分別表達(dá)抗原基因和一個(gè)協(xié)同刺激信號(hào)，該協(xié)同刺激信號(hào)通常是促使抗原基因刺激最有效免疫反應(yīng)的相應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子，而且很可能若沒(méi)有同時(shí)將此細(xì)胞因子導(dǎo)入，其免疫反應(yīng)將不能達(dá)到其最佳狀態(tài)。這些抗原分子有如下所列但并不限于這些，如病毒、細(xì)菌、寄生蟲和腫瘤細(xì)胞組份、百喉毒素C片斷、霍亂毒素B亞單位、B型肝炎病毒表面抗原、HIV抗原、志賀氏桿菌脂多糖(LPS)等以及單個(gè)、多個(gè)或不同排列組合的抗原。另一些抗原可以是真菌、原蟲、蛔蟲和癌細(xì)胞抗原；HIV-1病毒抗原有如下所列但并不限于這些，如gag、pol、env等；細(xì)胞因子有如下所列但并不限于這些，IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、TNF-β和IFN-γ等。
本發(fā)明的疫苗載體系統(tǒng)首先是由兩個(gè)分離的質(zhì)粒通過(guò)真核生物基因交配的方法形成。該真核生物包括如下所列但并不限于這些，Saccharomyces，Schizosaccharomyces，Yarrowia，candida，hansenula。另外，這個(gè)載體系統(tǒng)也可由原核細(xì)胞組成，如大腸桿菌和病毒質(zhì)粒等但并不限于這些。因此，無(wú)論是真核或原核細(xì)胞所形成的最后產(chǎn)品是由一個(gè)啟動(dòng)子控制表達(dá)細(xì)胞因子，另一個(gè)多克隆位點(diǎn)供插入各種各樣的抗原基因，另有復(fù)制子、轉(zhuǎn)錄、翻譯元件的DNA序列、篩選標(biāo)記等通過(guò)連接子將其連成完整質(zhì)粒，真核細(xì)胞表達(dá)載體的篩選標(biāo)記有neo、leu2、ura3、trp1、ade1、his3等，該疫苗載體被用于需要治療的機(jī)體。
本發(fā)明疫苗載體的結(jié)構(gòu)原理如圖1所示，首先，構(gòu)建二個(gè)功能性的多核苷酸序列組成的DNA表達(dá)質(zhì)粒；這兩個(gè)質(zhì)粒的具體應(yīng)用本發(fā)明疫苗如圖2所示。其中的啟動(dòng)子是真核生物啟動(dòng)子但并不限于此，如酵母Sccharomyces cerevisine和Candida albicans。啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)性的或組成性的，誘導(dǎo)性啟動(dòng)子可以被調(diào)介，如營(yíng)養(yǎng)成份(carbonsouces，nitrogen souces和其它)、藥物(抗藥性等)、與感染過(guò)程有關(guān)的特殊試劑(血清等)和溫度(熱休克和冷休克等)。將所得到的兩個(gè)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化為真核微生物如單倍體酵母，轉(zhuǎn)化DNA的方法可以是多種多樣的，包括鈣磷沉淀法、顯微注射法、脂質(zhì)體法、電穿孔法和病毒載體法等，這里也包括各種各樣的含有載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明用酵母作為宿主微生物，酵母質(zhì)粒被成功地轉(zhuǎn)化為酵母時(shí)，可用氨基酸缺陷培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子，然后通過(guò)單倍體酵母基因交配而形成雙倍體雜交酵母，此時(shí)再用雙氨基酸缺陷培養(yǎng)基篩選雙倍體雜交轉(zhuǎn)化子[Guthrie Fink，Guide to Yeast Genetics &Molecular Biology，Methods in Enzymology，1943-231(1999)]，在這個(gè)過(guò)程中，非轉(zhuǎn)化子被自然淘汰。
本發(fā)明中的DNA質(zhì)粒的啟動(dòng)子可以是原核細(xì)胞啟動(dòng)子，在這種情況下，宿主可以是原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒，其目的也是誘導(dǎo)所需的免疫反應(yīng)，可用多種方法將此原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為真核微生物，如轉(zhuǎn)導(dǎo)、偶聯(lián)、轉(zhuǎn)化、電穿孔法和轉(zhuǎn)染等。
本發(fā)明艾滋病疫苗載體用于艾滋病治療性和/或預(yù)防疫苗。
應(yīng)用該疫苗的另一個(gè)方法是從HIV患者分離巨噬細(xì)胞或DC細(xì)胞，然后將該艾滋病疫苗導(dǎo)入被分離出的巨噬細(xì)胞或DC細(xì)胞，在體外培養(yǎng)這種細(xì)胞并加入一些淋巴因子，然后將該細(xì)胞輸回入患者。
為構(gòu)建艾滋病疫苗，將T細(xì)胞生長(zhǎng)因子IL-2、IL-4、IL-6等克隆到在組成性酵母啟動(dòng)子控制下的酵母質(zhì)粒α上，將HIV-1病毒抗原gag、pol、env等克隆到酵母質(zhì)粒a，將所得到的兩個(gè)單倍體酵母質(zhì)粒α和a分別轉(zhuǎn)化到宿主酵母W303α和a上，將所得到的轉(zhuǎn)化子交配形成雙倍體，通過(guò)leu2/ura3氨基酸缺陷培養(yǎng)基篩選終末疫苗產(chǎn)品。
本發(fā)明中的疫苗通常通過(guò)注射，如皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔使用，也可通過(guò)胃腸道使用等；也可通過(guò)鼻腔滴入、噴霧吸入和口服；本發(fā)明也包括該艾滋病疫苗的其它配方，如栓劑或應(yīng)用納米技術(shù)；使用疫苗的途經(jīng)可根據(jù)個(gè)體情況選擇以達(dá)到最佳臨床效果；本疫苗可通過(guò)計(jì)算活性單位來(lái)定量，可以是無(wú)菌胃腸道型和非胃腸道型的，也可以是普通胃腸道型和非胃腸道型的；可以是油水或水油乳劑；使用該疫苗的療程可以是2-3周內(nèi)2次或視具體情況決定。
以下舉例說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施例，當(dāng)然本發(fā)明的應(yīng)用并不局限于此，另外，用同樣方式同樣性質(zhì)組分但又作些修改仍顯而易見(jiàn)屬于本發(fā)明之范疇。
例1.構(gòu)建酵母表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)hIL-2和構(gòu)建表達(dá)HIV-1抗原基因的廣譜質(zhì)粒載體圖2中的質(zhì)粒pcDNA3.IL-2由上海醫(yī)科大學(xué)何博士贈(zèng)送，將該質(zhì)粒中的hIL-2用限制性內(nèi)切酶smalI/NotI消化后克隆到pYES3/CT(Invitrogen)的多克隆位點(diǎn)區(qū)(MCS)smalI/NotI，將質(zhì)粒pYEX-BX(Clontech)的MCS區(qū)域修飾即增加多個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)使其容易克隆，由此構(gòu)建成表達(dá)抗原基因的廣譜質(zhì)粒載體pYEX.UIG。
所得到的質(zhì)粒pYEX.UIG可用于克隆表達(dá)HIV-1抗原基因，在此實(shí)施例中為HIV-1融合抗原基因(gag基因，由中國(guó)AIDS協(xié)會(huì)何敏博士贈(zèng)送)，用EcoRI/XhoI內(nèi)切酶將其抗原基因克隆到pYEX.UIG載體。
例2.雜交酵母艾滋病疫苗載體的構(gòu)建如圖2所示，將例1中所得質(zhì)粒pYES3/CT.IL-2用TE/LiOAc方法轉(zhuǎn)化為酵母W303-1Aα(ATCC)，用Leu營(yíng)養(yǎng)缺陷瓊脂培養(yǎng)基平板篩選轉(zhuǎn)化子；將例1中所得質(zhì)粒pYEX.UIG.gp41.36用TE/LiOAc方法轉(zhuǎn)化為酵母W303-1Aa(ATCC)，用Ura3營(yíng)養(yǎng)缺陷瓊脂培養(yǎng)基平板篩選轉(zhuǎn)化子；將所得兩個(gè)轉(zhuǎn)化子IGV.IL-2(α)和IGV.gp41.36(a)通過(guò)基因配型雜交生成終末疫苗產(chǎn)品，該疫苗具有表達(dá)T細(xì)胞生長(zhǎng)因子IL-2和HIV-1.gag蛋白的能力。
例3.hIL-2的測(cè)定向8月齡雌性DBA/J小鼠腹腔注射1ml礦物油，24小時(shí)后用無(wú)血清的PBS液清洗出腹腔滲出液，收集滲出液中的巨噬細(xì)胞，將1-6×106個(gè)巨噬細(xì)胞分為二組并分別與IGV.IL-2和IGV.gp41.36共同孵育，在不同時(shí)間時(shí)，取出200μl培養(yǎng)上清液儲(chǔ)存于-70C°待作IL-2定量測(cè)定，用hIL-2測(cè)定試劑盒(DuoSet Kit)(Genzyme Diagnostics，Cambridge，MA)定量測(cè)定IL-2。如圖3所示，接種表達(dá)IL-2和gag的疫苗IGV.Factor的IL-2水平為6-67ng/ml，而接種有g(shù)ag但無(wú)IL-2的疫苗的IL-2水平為僅為1-3ng/ml，該結(jié)果表明用本發(fā)明所生產(chǎn)的疫苗能有效地激活機(jī)體APC細(xì)胞分泌足夠量的淋巴因子，它有利于進(jìn)一步激活CTL免疫反應(yīng)。
例4.CTL活性的測(cè)定將4-6周齡雌性C57BL/6小鼠(H-2b)(Jackson Lab，Bar Harbor，Maine)分為4組，每組10只，向小鼠皮下注射1×106穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HIV-1 gag基因的黑色素瘤細(xì)胞(B16)，接種腫瘤后第1和7天時(shí)向小鼠接種疫苗產(chǎn)品(IGV.Factor)和對(duì)照疫苗IGV.gag，接種劑量為2mg/200μl/次，對(duì)照組注射200μl PBS，在第28天時(shí)用數(shù)字測(cè)量?jī)x測(cè)量腫瘤體積。在第120天時(shí)用CO2安樂(lè)死法殺死小鼠，取出脾臟，以51Cr標(biāo)記的B16.gag細(xì)胞為靶細(xì)胞，以取出的脾臟細(xì)胞為功能性T細(xì)胞，按照40∶1的E∶T比例測(cè)定CTL活性，百分裂解率(lysis％)實(shí)驗(yàn)CPM減去自發(fā)CPM的百分比。圖4結(jié)果表明，疫苗產(chǎn)品(IGV.Factor)的CTL活性為85％，而對(duì)照疫苗IGV.gag和IGV.IL-2的活性分別為34％和16％，而PBS組僅為4％。
例5.疫苗在C57BL/6小鼠AIDS模擬模型體內(nèi)誘導(dǎo)的的保護(hù)性免疫反應(yīng)用HIV-1.gag表達(dá)腫瘤B16-gag模擬疾病，觀察HYV-AIDS和HYV-GAG對(duì)表達(dá)腫瘤B16-gag特異性生長(zhǎng)的抑制作用及不同劑量的HYV-AIDS對(duì)表達(dá)腫瘤B16-gag特異性生長(zhǎng)抑制作用的劑量-效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果HYV-AIDS疫苗和HYV-GAG疫苗均誘導(dǎo)了HIV-1.gag表達(dá)腫瘤的特異性生長(zhǎng)抑制作用，含有IL-2基因的HYV-AIDS疫苗治療效果更為顯著且在一定的劑量范圍內(nèi)有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，如下圖1、2所示例6.疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫反應(yīng)如前所述向小鼠接種腫瘤和疫苗，當(dāng)腫瘤長(zhǎng)到約50-70mm3時(shí)開始測(cè)量，追蹤測(cè)量至120天，腫瘤完全消退后長(zhǎng)達(dá)21天以上定義為治愈，否則為無(wú)效，用疫苗產(chǎn)品(IGV.Factor)接種的小鼠達(dá)到92％的治愈率，如表1所示，這是迄今為止艾滋病疫苗臨床前期試驗(yàn)很少能達(dá)到的治愈率。
表1.IGV.Factor疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫反應(yīng)疫苗 治愈率(治愈數(shù)/感染數(shù))試驗(yàn)1 試驗(yàn)2 試驗(yàn)3 總平均IGV.Factor 9/10 10/10 9/10 92％IGV.gp41.36 6/10 4/10 5/10 50％IGV.IL-22/10 4/10 3/10 30％PBS(對(duì)照) 0/10 0/10 0/10 0％例7.疫苗動(dòng)物模型體內(nèi)的抗原性試驗(yàn)通過(guò)間接ELISA方法測(cè)定雜交酵母艾滋病疫苗免疫C57BL/6小鼠后HIV-1.p55特異性抗體的出現(xiàn)時(shí)間和HIV-1.p55特異性抗體的滴度，評(píng)價(jià)雜交酵母艾滋病疫苗的抗原性。結(jié)果艾滋明克斯疫苗在免疫小鼠第35天可見(jiàn)有明顯的HIV-1.p55特異性抗體出現(xiàn)，至免疫小鼠65天HIV-1.p55特異性抗體滴度較高可達(dá)1∶56000。顯示疫苗的抗原性較強(qiáng)，能夠在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)模型動(dòng)物產(chǎn)生高滴度的HIV-1.p55特異性抗體，如表2所示，表2 雜交酵母艾滋病疫苗誘導(dǎo)57BL/6小鼠產(chǎn)生HIV-1.p55抗體的滴度時(shí)間(天)組別 D0 D35D65艾滋明克斯 ＜1∶501∶46001∶56000酵母載體 ＜1∶501∶22002600無(wú)菌注射用水 ＜1∶50＜1∶50＜1∶50例8.恒河猴的T細(xì)胞增殖免疫反應(yīng)試驗(yàn)選取8只恒河猴前臂皮下注射常用劑量的雜交酵母艾滋病疫苗，另一只注射等體積的無(wú)菌注射用水為對(duì)照，同前方法恒河猴共免疫三次，每次疫苗注射時(shí)采血，最后一次疫苗注射后69天CO2吸入法安樂(lè)死并采血7ml，同時(shí)收集脾臟、淋巴結(jié)用于T細(xì)胞增殖免疫反應(yīng)分析，其中以刀豆蛋白A(ConA)作為陽(yáng)性對(duì)照有絲分裂原，以雜交酵母艾滋病疫苗作為特異性的刺激原，測(cè)定艾滋明克斯疫苗對(duì)恒河猴的抗原特異性T細(xì)胞的增殖反應(yīng)。結(jié)果見(jiàn)以疫苗作為特異性刺激原T細(xì)胞的增殖反應(yīng)較高，與生理鹽水對(duì)照組比較P＜0.01，差異有顯著性的意義。見(jiàn)表3表明苗誘導(dǎo)了恒河猴顯著的抗原特異性T細(xì)胞增殖免疫反應(yīng)表3艾滋明克斯疫苗誘導(dǎo)恒河猴的T細(xì)胞增殖免疫反應(yīng)(n＝9)分組 無(wú)菌注射用水 酵母載體 艾滋明克斯疫苗第一次免疫 3.1±0.6 1.9±0.9 2.0±0.6第二次免疫 2.0±0.5 3.5±0.6 2.3±1.3第三次免疫 1.5±1.0 12.5±3.06.8±1.0D83天 1.8±1.1 9.5±2.5 9.7±1.5新一代的艾滋病重組蛋白疫苗和DNA疫苗比傳統(tǒng)的疫苗免疫原性弱，且艾滋病患者自身的免疫系統(tǒng)遭到破壞，有一定的免疫耐受性，因此我們急需具有免疫佐劑作用的艾滋病疫苗和艾滋病疫苗載體，當(dāng)今以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫為主的疫苗通常缺乏有效的導(dǎo)入刺激T細(xì)胞活性的協(xié)同刺激淋巴因子的方法，本發(fā)明為最有效地刺激機(jī)體的免疫反應(yīng)提供了一個(gè)理想的方法，該理論可延伸到基因治療的所有領(lǐng)域，因?yàn)樽钣行У卮碳C(jī)體的免疫反應(yīng)常需要合適的協(xié)同因子的配合。
本發(fā)明是一個(gè)創(chuàng)新性的疫苗平臺(tái)技術(shù)，不僅僅可用于艾滋病的治療和預(yù)防，可用于研發(fā)多種以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫為主的治療性和預(yù)防性疫苗。
權(quán)利要求
1.刺激艾滋病感染者產(chǎn)生HIV-1特異性殺傷性CTL免疫反應(yīng)和特異性抗HIV-1病毒的疫苗，該疫苗由一個(gè)DNA質(zhì)粒通過(guò)啟動(dòng)子控制表達(dá)協(xié)同刺激信號(hào)的T細(xì)胞生長(zhǎng)因子和第二個(gè)DNA質(zhì)粒通過(guò)啟動(dòng)子控制表達(dá)多個(gè)HIV-1的抗原基因組成，這兩個(gè)質(zhì)粒都由一個(gè)宿主微生物作為載體來(lái)攜帶。
2.1中所說(shuō)的CTL免疫反應(yīng)是CD8+殺傷性T細(xì)胞免疫反應(yīng)。
3.1中所說(shuō)的T細(xì)胞生長(zhǎng)因子包括如下IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-β等。
4.1中所說(shuō)的HIV-1抗原來(lái)源于HIV-1病毒。
5.1中所說(shuō)的艾滋病感染者是人免疫缺陷病毒感染/AIDs。
6.1中所說(shuō)的宿主微生物載體是真核細(xì)胞。
7.6中所說(shuō)的真核細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
8.將1中所說(shuō)的疫苗配以賦形劑或與其它藥物聯(lián)合應(yīng)用。
9.4中所說(shuō)的病原體抗原是HIV-1的gag、pol和env等HIV-1相關(guān)抗原。
10.應(yīng)用該疫苗載體轉(zhuǎn)染APC細(xì)胞使其成為細(xì)胞疫苗而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生HIV-1中和性抗體和強(qiáng)效持久的CTL免疫反應(yīng)。
全文摘要
該雜交酵母艾滋病疫苗由基因重組雜交酵母組成。艾滋病疫苗雜交載體產(chǎn)物來(lái)源于兩個(gè)分別表達(dá)不同目的基因的酵母質(zhì)粒，其中一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，另一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)HIV－1的抗原基因；由此產(chǎn)生的重組雜交酵母載體本身是一種無(wú)致病性的基因治療艾滋病的載體，該載體本身具有免疫增強(qiáng)活力，即免疫佐劑作用；該基因工程艾滋病疫苗主要用于艾滋病感染的治療和艾滋病的預(yù)防。
文檔編號(hào)A61K39/12GK1602957SQ200410055579
公開日2005年4月6日 申請(qǐng)日期2004年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月5日
發(fā)明者孫娟 申請(qǐng)人:孫娟