專利名稱：石蓮花多糖抗凝血與抗血栓功能的制作方法
石蓮花多糖(參見中國專利申請?zhí)?0133666.5其縮寫號是EGP)提取方法參考原專利，現將實驗材料、方法、結果以及實施例列于后。
1.實驗材料1.1儀器體外血栓形成及血小板粘附兩用儀，NSN-R II型，自動電子計時粘度計，SDZ-3型。
1.2動物ICR種小鼠，體重20±2g；日本種大耳白兔，體重2.0±0.5kg；豚鼠，體重400±50g。均由北京大學動物學部供應。
2.方法與結果2.1抗凝血作用2.1.1對小鼠血凝的影響實施例1取小鼠，雌雄各半，隨機分成給藥組和對照組。灌胃后30min自內眥以毛細玻璃管取血，每隔30s折斷一次，直至出現血絲為止，記錄凝血時間。結果表明，灌胃給藥50mg/kgCPS，可使小鼠血凝時間延長319％。(表2.1-1)表2.1-1 EGP對小鼠血凝時間的影響(X±SD)
2.1.2體外抗凝血作用實施例2在混合人血漿中加入不同的EGP，37℃孵育10min，作復鈣時間測定。(混合血漿為枸櫞酸鈉抗凝的正常人新鮮血漿。)由表2可知，0.05mg的EGP即可延長復鈣時間，0.4mg可以完全抑制血漿凝固。(表2.1-2)表2.1-2 EGP對混合人血漿凝固時間的影響(X±SD)
*為10次測定平均值**表示觀察4h(下同)2.1.3對凝血酶元時間的影響實施例3給藥前自兔心臟取血1.8ml，以3000r/min離心10min，分離血漿，4℃冰箱保存。灌胃給藥后2.5h再自兔心臟取血1.8ml，按上法制備血漿。在放有凝血活酶和25mmol/L氯化鈣溶液各0.1ml的試管中加入血漿0.1ml，立刻計時，觀察凝固膜出現。結果表明灌胃EGP 37mg/kg，家兔凝血酶元時間由給藥前9.46±0.79延長到13.3±0.50(s)，延長40％(P＜0.01)。
2.1.4體外對凝血酶元時間的影響實施例4向混合人血漿中加入不同量的EGP，37℃孵育10min，作凝血酶元時間測定，表2.1-3表明0.1mgEGP能夠明顯延長凝血酶元時間；0.4mg能使血漿在4h內不凝固。
表2.1-3 EGP對混合人血漿凝血酶元時間的影響(X±SD)
2.1.5對部分凝血活酶時間的影響實施例5給藥前自兔心臟取血1.8ml，制備血漿。在已含有白陶土部分凝血活酶試液0.1ml的試管中加入血漿0.1ml，37℃水浴孵育3min后加入25mmol/L氯化鈣溶液0.1ml，立即計時，直至白陶土顆料聚集變粗。給藥后3h再取血制備血漿，測定部分凝血活酶時間。結果表明EGP對家兔部分凝血活酶時間給藥前為25.0±2.9，給藥后為28.7±2.9，作用不明顯(p＞0.05)。
3.抗血栓作用3.1對優(yōu)球蛋白溶解時間的影響實施例6取試管置于冰浴中，每管加入3.8％枸櫞酸鈉0.3ml，給藥前及給藥后30min，分別自豚鼠心臟取血2.7ml加入試管中，3000r/min離心10min，分離血漿。取血漿0.5ml，加入9.0ml蒸餾水和1％的醋酸溶液0.1ml，放入4℃冰箱。30min后再以3000r/min離心15min，沉淀物加入硼酸鈉緩沖液(pH9.0)0.5ml使之溶解，該時間為優(yōu)球蛋白溶解時間。實驗表明豚鼠口服CPS40mg/kg，其優(yōu)球蛋白溶解時間較給藥前縮短43.6％。按照Memon等人的方法由下式將優(yōu)球蛋白溶解時間換算成纖維蛋白溶解酶活力單位。纖維蛋白溶解酶活力(u)＝10000/優(yōu)溶期(min)。結果表明纖維蛋白溶解酶活力增加了77％。(表3.1-1)表3.1-1EGP對豚鼠優(yōu)球蛋白溶解時間及纖維蛋白溶解酶活力的影響(X±SD)
與給藥前比較，**p＜0.053.2對實驗性血栓形成的影響實施例7取家兔，按改良Chandler法給藥前及給藥后3h分別用硅化的注射器心臟取血1.8ml，立即注入血栓形成儀的旋轉環(huán)內(該過程應控制在90s內)，以17±1r/min轉動，恒溫37℃。
當血栓開始形成時，血栓由于遇到阻力而形成一定的角度，當血栓的阻力增大到隨環(huán)運動時，該時間稱為纖維蛋白血栓形成時間(TFT)。15min后停止轉動，傾出血栓，量其長度，結果(表3.1-2)EGP可縮短家兔實驗性血栓長度，明顯延長TFT。
3.3對血小板數的影響實施例8給藥前和給藥后3h分別自兔心臟取血，用血色素吸管吸血10μl于放有2.0ml稀釋液(尿素10.0g、枸櫞酸鈉0.5、甲醛0.1ml、蒸餾水加至100ml)的試管中混勻后觀察并計算血小板數，結果(表3.1-2)血小板數減少20％。
3.4對血小板粘附率的影響實施例9取家兔，給藥前及給藥后3h分別用硅化注射器心臟取血1.8ml，立即注入已有38％枸櫞酸鈉溶液0.2ml的硅烷化試管中，搖勻。取出1.0ml至容量為8.0ml的長頸圓瓶中，置于NSN-RII型體外血栓形成儀及血小板粘附兩用儀的轉盤上，在37±1℃下以3.7r/min的速率旋轉15min，血小板計數。計算血小板粘附率，結果(表3.1-2)灌胃37mg/kg，可使家兔血小板粘附率顯著降低。
3.5對血液粘度的影響實施例10給藥前及給藥后3h各自健康家兔心臟血2.0ml，加至放有3.8％枸櫞酸鈉0.2ml的試管中混勻，置25℃水浴供測定用。
全血比粘度取抗凝血液，以3000r/min離心10min，取血漿同上法測定血漿比粘度。
血球沉降率采用Wintrobe法，取全血于壓積管中以3000r/min離心20min后測定。結果(表3.1-2)灌胃37mg/kg，可使家兔全血比粘度、血漿比粘度分別降低16％和11％，紅細胞壓積降低20％、血沉增加75％。
表3.1-2 EGP對家兔實驗性血栓長度、血栓形成時間、血小板數、血小板粘附率、全血比粘度、血漿比粘度、紅細胞壓積和血沉的影響(X±SD)
動物數為6，Po給藥，劑量37mg/kg，與給藥前值比較**p＜0.05***p＜0.01，以上抗血栓部分兔子試驗均同時進行。
4.實驗結果本發(fā)明EGP具有抗凝血及抗血栓作用。EGP體內、體外均可顯著延長血凝時間，并延長凝血酶元時間，但不影響部分凝血活酶時間，推測其主要是通過外源性凝血系統起作用。
用Chandler法形成的血栓，組織學上類似于人體動脈血栓，實驗表明，EGP可顯著延長血栓形成時間，縮短血栓長度，從而起到抗血栓的藥理作用。血栓形成主要包括三個階段(1)血小板粘附和聚集(2)血液凝固(3)維纖蛋白溶解。EGP能明顯抑制血小板的粘附作用，并降低血液粘度，后者也直接影響到血栓形成的第一階段；EGP在體內、體外均有顯著的抗凝作用，并能減少血小板數。血小板的減少將延長血凝時間，從而也影響到血栓的形成。但對正常人來說，血小板過多的下降將會影響到傷口血凝時間，在正常的給藥劑量下(見權利要求3)不會出現上述情況。另外，EGP能提高纖維蛋白溶解酶活力。由此可見，EGP可能作用于血栓形成的所有環(huán)節(jié)。
權利要求
1.本發(fā)明發(fā)現石蓮花多糖(EGP)具有抗凝血、抗血栓功能，同時具有預防與治療心腦血管疾病的用途。
2.根據權利要求1所述成人抗凝血劑量范圍2.5-20mg/kg，即正常人口服劑量為150-1200mg/日。
3.根據權利要求1所述，正常人用于抗血栓的劑量范圍為22mg-220mg/日。
全文摘要
本發(fā)明的石蓮花多糖(EGP)具有抗凝血、抗血栓的功能。①抗凝作用。體外可顯著延長混合人血漿的凝血時間和凝血酶元時間，灌胃給藥50mg/kg，小鼠凝血時間延長31g％；37mg/kg，家兔凝血酶元時間延長40％。②抗血栓作用灌胃給藥37mg/kg，可抑制家兔實驗性血栓形成，血栓形成時間明顯延長，血栓長度縮短，血小板數減少20％，血小板粘附率降低43％，全血粘度及血漿粘度分別降低16％和11％，紅細胞壓積降低20％，血沉增加75％，灌胃給藥40mg/kg，豚鼠纖維蛋白溶解酶活動增加77％。由此可見，本發(fā)明產品具有予防與治療心腦血管疾病的功能，適用于中藥與保健食品廠家生產。
文檔編號A61P7/00GK1657053SQ20041003958
公開日2005年8月24日 申請日期2004年2月18日 優(yōu)先權日2004年2月18日
發(fā)明者丁慶 申請人:丁慶