專利名稱：生物衍生骨復(fù)合四環(huán)素緩釋體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及骨組織修復(fù)的材料，特別是含有四環(huán)素的骨組織修復(fù)的材料。
背景技術(shù)：
目前，用于促進(jìn)骨組織修復(fù)材料的成骨能力的主要方式是復(fù)合促進(jìn)骨生長的生長因子，其中研究最多的是骨形態(tài)發(fā)生蛋白系列(BMP2，4，7)和轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β，這些因子均為動物骨提取或經(jīng)基因重組獲得，除BMP2已被美國FDA批準(zhǔn)用于臨床外，其它均未被批準(zhǔn)用于臨床。因為促進(jìn)骨生長的生長因子體內(nèi)應(yīng)用的最大問題是如何控制其有效劑量及擔(dān)心過度表達(dá)帶來的全身及局部問題，比如骨形態(tài)發(fā)生蛋白系列(BMP)由于使用劑量過大，過度表達(dá)，易導(dǎo)致植入部位過度增生，形成骨肉瘤，臨床安全性受到質(zhì)疑。
申請?zhí)枮?0132082.3，名稱為“生物衍生組織工程骨及其制備方法”公開了三種生物衍生骨，為骨組織修復(fù)的材料，它們是將同種異體或異種(豬、牛)骨，經(jīng)過物理化學(xué)、生物等方法處理后，去掉細(xì)胞、脂肪，部分蛋白或無機(jī)成份制得的一種生物材料，它是組織工程骨的支架，復(fù)合細(xì)胞后構(gòu)建生物衍生組織工程骨，過去的研究已證實具有引導(dǎo)骨再生能力，臨床用于骨組織修復(fù)，修復(fù)骨缺損。
四環(huán)素作為抗生素，臨床應(yīng)用已有近60年歷史，1956年由Andro[1]發(fā)現(xiàn)了四環(huán)素的非抗生素作用。Lee(1988)[2]將四環(huán)素作為局部用藥，Masato(1989)[3]將四環(huán)素緩釋體置入牙周袋內(nèi)治療牙周??；20世紀(jì)中期發(fā)現(xiàn)了四環(huán)素對骨的作用，有研究者認(rèn)為四環(huán)素可抑制骨生長，但更多的研究認(rèn)為，僅在使用大劑量時才會出現(xiàn)骨生長抑制[4、5]。Sasaki(1974)[6]的研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類在體內(nèi)可防止骨密度的丟失、類骨質(zhì)的丟失以及成骨細(xì)胞形態(tài)的改變。Saskki等[7]報告四環(huán)素(TCs)及其無抗生素作用的化學(xué)異構(gòu)衍生物(CMTs)可完全恢復(fù)糖尿病鼠的成骨細(xì)胞形態(tài)和功能，并增加骨基質(zhì)中H-脯氨酸標(biāo)記的膠原合成。Aoyagi[8]等報告CMT治療卵巢切除術(shù)后小鼠骨質(zhì)疏松，可促進(jìn)小梁骨和皮質(zhì)骨內(nèi)膜的新骨形成。
TCs、CMTs可提高成骨細(xì)胞活性，具有促進(jìn)骨形成的作用[9]，這種作用是由于成骨細(xì)胞對四環(huán)素的明顯攝取刺激成骨細(xì)胞分泌膠原所致。更為重要的是，四環(huán)素類藥物在一系列的研究中證明其有明顯的抑制骨吸收作用。體外實驗發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素可有效抑制由甲狀旁腺激素(PTH)(Gomes et al 1984[10])、前列腺素E2(PGE E2)或脂多糖(LPS)(Golub et al 1984[11])刺激造成的骨吸收，并且降低成骨細(xì)胞來源的膠原酶活性[12、13]。體內(nèi)實驗中，四環(huán)素類也表明其抗骨質(zhì)吸收的特性，Golub[14]、Grevstad[15]等報告四環(huán)素類可抑制細(xì)菌所致和手術(shù)所致的牙冠骨丟失，恢復(fù)糖尿病所致的全身骨質(zhì)疏松。等等。
上述報道僅僅在藥理機(jī)制上對四環(huán)素對骨的作用進(jìn)行了探討，并沒有說明四環(huán)素成骨的量效關(guān)系，更沒有將四環(huán)素實際應(yīng)用于制備和生產(chǎn)骨組織修復(fù)材料產(chǎn)品中的報道。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種骨組織修復(fù)的材料，它是生物衍生骨復(fù)合四環(huán)素緩釋體，其包括生物衍生骨支架，四環(huán)素和包被體，以及生物衍生骨復(fù)合四環(huán)素緩釋體的制備方法。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種生物衍生骨復(fù)合四環(huán)素緩釋體，其特征在于生物衍生骨中含有四環(huán)素。
所述的生物衍生骨，是專利申請?zhí)枮?0132082.3，名稱為“生物衍生組織工程骨及其制備方法”所稱的生物衍生骨支架，是用豬或異體骨采用物理化學(xué)方法制備三類衍生組織工程骨支架的任意一種，即部分脫蛋白生物衍生骨支架、完全脫蛋白生物衍生骨支架和部分脫鈣生物衍生骨支架。
所述的四環(huán)素為鹽酸四環(huán)素，其中每克生物衍生骨復(fù)合鹽酸四環(huán)素緩釋體含有62μg～122μg的鹽酸四環(huán)素，優(yōu)選為80μg～110μg的鹽酸四環(huán)素。
生物衍生骨復(fù)合四環(huán)素緩釋體的制備方法，它包含下列步驟先將已消毒滅菌的生物衍生骨支架在0～4℃浸漬于鹽酸四環(huán)素溶液中；再將該生物衍生骨支架冷凍干燥，即得。
當(dāng)所述的鹽酸四環(huán)素溶液的溶劑為水時，該生物衍生骨復(fù)合四環(huán)素緩釋體的制備方法，包括如下步驟a、將已消毒滅菌的生物衍生骨支架在0～4℃浸漬于鹽酸四環(huán)素水溶液中，鹽酸四環(huán)素的濃度為50μg/ml～100μg/ml，使每克生物衍生骨復(fù)合鹽酸四環(huán)素緩釋體含有62μg～122μg的鹽酸四環(huán)素；b、將a步驟的鹽酸四環(huán)素水溶液在負(fù)壓條件下浸泡；c、將b步驟浸泡的生物衍生骨支架冷凍干燥；d、包被將c步驟的冷凍干燥物放入包被的物質(zhì)中進(jìn)行包被；e、將d步驟已包被物質(zhì)冷凍干燥，消毒，即得。
所述方法步驟d中用于包被的物質(zhì)為藻酸鈉，pluronicF-127(氧化異丙烯，無毒、無粒子表面活性，水溶液可形成凝膠，4℃以下由凝膠變?yōu)橐簯B(tài)，高于15℃又轉(zhuǎn)變?yōu)槟z，體內(nèi)可完全降解)、或聚乳酸。進(jìn)一步地，d步驟用于包被的物質(zhì)為藻酸鈉，濃度為1％～2％w/v，pH7.2。
當(dāng)所述鹽酸四環(huán)素溶液的溶劑為pluronicF-127，濃度為25％w/v時，該生物衍生骨復(fù)合四環(huán)素緩釋體的制備方法，包括如下步驟a、將已消毒滅菌的生物衍生骨支架在0～4℃浸漬于鹽酸四環(huán)素pluronicF-127溶液中，鹽酸四環(huán)素的濃度為50μg/ml～100μg/ml；b、將a步驟的鹽酸四環(huán)素溶液在負(fù)壓條件下浸泡；c、將b步驟浸泡的生物衍生骨支架冷凍干燥；d、將c步驟已包被物質(zhì)冷凍干燥，消毒，即得。
上述兩種生物衍生骨復(fù)合四環(huán)素緩釋體的制備方法中，步驟b所述的生物衍生骨支架在負(fù)壓條件為負(fù)壓0.5mPa。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明通過將專利申請?zhí)枮?0132082.3，名稱為“生物衍生組織工程骨及其制備方法”所述的生物衍生骨支架與四環(huán)素(鹽酸四環(huán)素)制備成本發(fā)明生物衍生骨復(fù)合鹽酸四環(huán)素緩釋體，當(dāng)鹽酸四環(huán)素的用量為每克生物衍生骨復(fù)合鹽酸四環(huán)素緩釋體含有62μg～122μg的鹽酸四環(huán)素時，具有與促進(jìn)骨生長的生長因子rhBMP、TGF-β基本相同的成骨效應(yīng)，且克服了促進(jìn)骨生長的生長因子的副作用，通過生物衍生骨支架與鹽酸四環(huán)素組合使用，體外釋放鹽酸四環(huán)素有效濃度可維持2周，充分達(dá)到緩釋功效，臨床應(yīng)用安全，來源容易，價格低，易于推廣使用。
顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。


圖1生物衍生骨復(fù)合四環(huán)素緩釋體；圖2復(fù)合四環(huán)素生物衍生骨復(fù)合成骨細(xì)胞培養(yǎng)7天。
具體實施例方式
通過下面給出的本發(fā)明的實施例可以進(jìn)一步清楚地了解本發(fā)明。但它們不是對本發(fā)明的限制。
實施例1 本發(fā)明生物衍生骨復(fù)合四環(huán)素緩釋體的制備本發(fā)明生物衍生骨復(fù)合四環(huán)素緩釋體是由生物衍生骨支架與四環(huán)素(鹽酸四環(huán)素)制備而成。以下是詳細(xì)的制備方法①生物衍生骨(即專利申請?zhí)枮?0132082.3的在先申請中所稱的生物衍生骨支架)的制備三類生物衍生骨支架的制備a、制備部分脫蛋白生物衍生骨支架的方法是取新鮮豬骨或異體骨，去除其上所附軟組織、中心骨髓及軟骨部分，蒸餾水沖洗干凈，于38℃30％過氧化氫中脫脂72小時，每24小時換液一次；蒸餾水浸洗干凈，于75％酒精中去除殘余過氧化氫24小時，蒸餾水浸洗干凈；氯仿∶甲醇3∶1，于室溫下部分脫蛋白4小時，蒸餾水清洗；在-38℃，10-5Pa條件下冷凍干燥24小時；25KGYγ射線輻射處理消毒并清除剩余膠原蛋白的抗原性，最后獲得部分脫蛋白生物衍生骨支架；b、全脫蛋白生物衍生物骨支架的方法是取新鮮豬骨或異體骨，去除其上所附軟組織、中心骨髓及軟骨部分，蒸餾水沖洗干凈，于38℃30％過氧化氫中脫脂48小時，每24小時換液一次；蒸餾水浸洗干凈，氯仿∶甲醇3∶1，于室溫下部分脫蛋白4小時，蒸餾水清洗；入110℃乙二胺中循環(huán)提取24小時，蒸餾水浸洗干凈，于室溫下入乙醇中浸泡24小時除去殘余乙二胺，蒸餾水清洗；在-38℃，10-5Pa條件下冷凍干燥24小時；于20～50℃下經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌3～9小時，最后獲得完全脫蛋白生物衍生骨支架。
c、制備部分脫鈣生物骨支架的方法是取新鮮豬骨或異體骨，去除其上所附軟組織、中心骨髓及軟骨部分，蒸餾水沖洗干凈，于38℃30％過氧化氫中脫脂48小時，每24小時換液一次；蒸餾水浸洗干凈，入0.6M鹽酸在4℃下部分脫鈣72小時，每24小時換液一次；蒸餾水浸洗干凈，氯仿∶甲醇3∶1，于室溫下部分脫蛋白4小時，蒸餾水清洗；在-38℃，10-5Pa條件下冷凍干燥24小時；25KGYγ射線輻射處理消毒并清除剩余膠原蛋白的抗原性。最后獲得脫鈣生物衍生骨支架。
所制備的上述三類生物衍生骨支架的任意一種，保存了原來骨組織的基本框架，具有一定的生物力學(xué)功能，基本去除抗原性；②生物衍生骨復(fù)合鹽酸四環(huán)素緩釋體的制備方法一取鹽酸四環(huán)素粉劑溶于蒸餾水中，使其濃度為0.05mg/ml。將已消毒滅菌的生物衍生骨材料放入溶液中，在4℃條件下放置48小時，取出后放入-80℃深低溫冰箱中，凍存30分鐘，或在4℃條件下保存48小時，再經(jīng)冷凍干燥機(jī)處理，形成含鹽酸四環(huán)素的復(fù)合物。取藻酸鈉干粉配制成1％～2％溶液，pH7.2，高壓滅菌備用。將已制備好的含鹽酸四環(huán)素的復(fù)合物置于藻酸鈉溶液中浸泡24～48小時，取出后經(jīng)-80℃深低溫冰箱保存30分鐘，然后再經(jīng)冷凍干燥處理，消毒備用。
方法二配制25％pluronic F-127溶液，在其中加入鹽酸四環(huán)素，在避光條件下溶解，使溶液中含鹽酸四環(huán)素的終濃度為0.05mg/ml。將已制備好的生物衍生骨置于上述溶液中浸泡1小時后取出，經(jīng)蒸餾水洗滌3次，-80℃深低溫冰箱冷凍30分鐘，然后經(jīng)冷凍干燥處理后，包裝、輻照(或環(huán)氧乙烷)消毒處理、保存。材料孔徑平均為522±16.7um，孔隙率為55％，含水量為5％。
體外釋放鹽酸四環(huán)素有效濃度可維持2周，第3周完全消失。
實施例2 比較四環(huán)素的給藥方式(口服、靜脈輸入和生物衍生骨復(fù)合鹽酸四環(huán)素緩釋體)對成骨的影響將靜脈注射用四環(huán)素粉劑(上海新亞制藥廠生產(chǎn))作為一種促進(jìn)骨生長的生長因子作為對照組。
在劑量為每克本發(fā)明實施例1制備的生物衍生骨復(fù)合鹽酸四環(huán)素緩釋體含有80μg～110μg的鹽酸四環(huán)素時，堿性磷酸酶(ALP)活力為1.758±0.127IU/ml，對照組為1.251±0.144IU/ml，ALP活性增強(qiáng)，I型膠原合成能力增強(qiáng)，I型膠原mRNA表達(dá)、骨鈣素及骨鈣素mRNA表達(dá)增加，對新骨形成進(jìn)行評分[16]8周時為3.67，對照組為1.33，統(tǒng)計學(xué)處理具有顯著性差異(P＜0.05)。評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。
表1 Lan-Sandhn X線評分標(biāo)準(zhǔn)

實施例3 生物衍生骨復(fù)合鹽酸四環(huán)素緩釋體與生物衍生骨復(fù)合rhBMP/TGF-β生長因子緩釋體成骨效果比較(1)在36只新西蘭兔雙后肢肌肉內(nèi)植入的體內(nèi)研究證實，將本發(fā)明實施例1制備的生物衍生骨復(fù)合鹽酸四環(huán)素緩釋體，與含rhBMP/TGF-β生長因子的復(fù)合物制成的緩釋體對照，促進(jìn)成骨的結(jié)果基本一致，從組織學(xué)看，植入后第8周，兩組均形成混合性新骨，12周時已有編織骨形成，支架材料已完全降解吸收。生物衍生骨復(fù)合鹽酸四環(huán)素緩釋體略優(yōu)于rhBMP/TGF-β組的成骨效果。單純支架材料在整個實驗過程中均未見到新骨形成。
(2)在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步接種相同數(shù)量的成骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)均有良好的細(xì)胞相容性。在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，這種緩釋體有較單純材料更多的細(xì)胞粘附率。經(jīng)體外培養(yǎng)后植入體內(nèi)，觀察其成骨能力，骨鈣素及I型膠原均有顯著增加。血清骨鈣素測定結(jié)果見表2表2血清骨鈣素測定結(jié)果(ng/ml)

植入本發(fā)明實施例1制備的生物衍生骨復(fù)合鹽酸四環(huán)素緩釋體動物在術(shù)后8、12周骨鈣素含量顯著高于生物衍生骨組(p＜0.05)，植入復(fù)合成骨細(xì)胞的四環(huán)素生物衍生骨緩釋體動物在術(shù)后2、4、8周骨鈣素含量顯著高于復(fù)合成骨細(xì)胞的生物衍生骨組(p＜0.05)。表明復(fù)合鹽酸四環(huán)素的生物衍生骨比未復(fù)合鹽酸四環(huán)素的生物衍生骨具有更好的修復(fù)作用。
實施例4 本發(fā)明生物衍生骨復(fù)合鹽酸四環(huán)素緩釋體骨缺損修復(fù)實驗將pluronicF-127與鹽酸四環(huán)素復(fù)合后制成緩釋體，修復(fù)兔橈骨2cm缺損，發(fā)現(xiàn)其骨修復(fù)能力顯著優(yōu)于單純生物衍生骨支架。在36只新西蘭兔的實驗研究中證實，生物衍生骨復(fù)合鹽酸四環(huán)素緩釋體組較單純材料成骨的組織學(xué)表現(xiàn)提前7～14天，骨修復(fù)的生物力學(xué)強(qiáng)度表現(xiàn)出顯著性差異。
1、三點彎曲模量測定(表3)
表3三點彎曲模量(Mpa)

植入四環(huán)素生物衍生骨緩釋體動物在術(shù)后2、4、8周三點彎曲模量顯著高于生物衍生骨組(p＜0.05)，植入復(fù)合成骨細(xì)胞的四環(huán)素生物衍生骨緩釋體動物在術(shù)后2、8周三點彎曲模量顯著高于復(fù)合成骨細(xì)胞的生物衍生骨組(p＜0.05)。
2、抗壓強(qiáng)度、壓縮橫量測定(表4)表4抗壓強(qiáng)度、壓縮橫量

植入四環(huán)素生物衍生骨緩釋體動物在術(shù)后2、4、8、12周壓縮模量顯著高于生物衍生骨組(p＜0.05)，植入復(fù)合成骨細(xì)胞的四環(huán)素生物衍生骨緩釋體動物在術(shù)后4、8周壓縮模量顯著高于復(fù)合成骨細(xì)胞的生物衍生骨組(p＜0.05)。
上述實施例動物實驗說明復(fù)合鹽酸四環(huán)素的生物衍生骨比未復(fù)合鹽酸四環(huán)素的生物衍生骨具有更好的作用。
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1.一種生物衍生骨復(fù)合四環(huán)素緩釋體，其特征在于生物衍生骨中含有四環(huán)素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物衍生骨復(fù)合四環(huán)素緩釋體，其特征在于所述的四環(huán)素為鹽酸四環(huán)素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物衍生骨復(fù)合四環(huán)素緩釋體，其特征在于每克生物衍生骨復(fù)合鹽酸四環(huán)素緩釋體含有62μg～122μg的鹽酸四環(huán)素。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述生物衍生骨復(fù)合四環(huán)素緩釋體，其特征在于每克生物衍生骨復(fù)合鹽酸四環(huán)素緩釋體含有80μg～110μg的鹽酸四環(huán)素。
5.權(quán)利要求1、2、3或4所述的生物衍生骨復(fù)合四環(huán)素緩釋體的制備方法，它包含下列步驟先將已消毒滅菌的生物衍生骨支架在0～4℃浸漬于鹽酸四環(huán)素溶液中；再將該生物衍生骨支架冷凍干燥，即得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物衍生骨復(fù)合四環(huán)素緩釋體的制備方法，其特征在于所述的鹽酸四環(huán)素溶液的溶劑為水。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生物衍生骨復(fù)合四環(huán)素緩釋體的制備方法，其特征在于它包括如下步驟a、將已消毒滅菌的生物衍生骨支架在0～4℃浸漬于鹽酸四環(huán)素水溶液中，鹽酸四環(huán)素的濃度為50μg/ml～100μg/ml，使每克生物衍生骨復(fù)合鹽酸四環(huán)素緩釋體含有62μg～122μg的鹽酸四環(huán)素；b、將a步驟的鹽酸四環(huán)素水溶液在負(fù)壓條件下浸泡；c、將b步驟浸泡的生物衍生骨支架冷凍干燥；d、包被將c步驟的冷凍干燥物放入包被的物質(zhì)中進(jìn)行包被；e、將d步驟已包被物質(zhì)冷凍干燥，消毒，即得。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生物衍生骨復(fù)合四環(huán)素緩釋體的制備方法，其特征在于所述方法步驟d中用于包被的物質(zhì)為藻酸鈉，pluronicF-127、或聚乳酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的生物衍生骨復(fù)合四環(huán)素緩釋體的制備方法，其特征在于d步驟用于包被的物質(zhì)為藻酸鈉，濃度為1％～2％w/v，pH7.2。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物衍生骨復(fù)合四環(huán)素緩釋體的制備方法，其特征在于所述鹽酸四環(huán)素溶液的溶劑為pluronicF-127，濃度為25％w/v。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的生物衍生骨復(fù)合四環(huán)素緩釋體的制備方法，其特征在于它包括如下步驟a、將已消毒滅菌的生物衍生骨支架在0～4℃浸漬于鹽酸四環(huán)素pluronicF-127溶液中，鹽酸四環(huán)素的濃度為50μg/ml～100μg/ml，使每克生物衍生骨復(fù)合鹽酸四環(huán)素緩釋體含有62μg～122μg的鹽酸四環(huán)素；b、將a步驟的鹽酸四環(huán)素溶液在負(fù)壓條件下浸泡；c、將b步驟浸泡的生物衍生骨支架冷凍干燥；d、將c步驟已包被物質(zhì)冷凍干燥，消毒，即得。
12.根據(jù)權(quán)利要求7、11所述的生物衍生骨復(fù)合四環(huán)素緩釋體的制備方法，其特征在于步驟b所述的生物衍生骨支架在負(fù)壓條件為負(fù)壓0.5mPa。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物衍生骨復(fù)合四環(huán)素緩釋體及制備方法，該緩釋體包括生物衍生骨支架、四環(huán)素和包被體，其特征是每克該緩釋體含有62μg～122μg的四環(huán)素；生物衍生骨經(jīng)四環(huán)素溶液浸泡，冷凍，干燥，包被，再冷凍干燥，消毒，即可制得生物衍生骨復(fù)合四環(huán)素緩釋體，該緩釋體具有比生物衍生骨具有更明顯的成骨效應(yīng)。體外釋放鹽酸四環(huán)素有效濃度可維持2周，臨床應(yīng)用安全，來源容易，價格低，易于推廣使用。
文檔編號A61L27/54GK1550238SQ20041003679
公開日2004年12月1日 申請日期2004年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月1日
發(fā)明者張新民, 楊志明 申請人:楊志明