專利名稱：Mptp親和標(biāo)記物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了可用作線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔復(fù)合物的調(diào)制劑和親和標(biāo)記物的新化合物。
背景技術(shù)：
線粒體由于在能量代謝、細(xì)胞Ca2+內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和細(xì)胞程序死亡中的作用而在細(xì)胞存活和組織發(fā)育中扮演關(guān)鍵性角色。鑒于這些多方面的作用，細(xì)胞Ca2+調(diào)節(jié)、代謝和生物能學(xué)是作為一個(gè)整合體系發(fā)揮作用，因?yàn)轵?qū)動(dòng)每一個(gè)過程都需要使用能量守恒。線粒體能量守恒(ATP產(chǎn)生)要求呼吸驅(qū)動(dòng)形成的跨線粒體內(nèi)膜(IMM)質(zhì)子電化電位差(ΔμH)，其由呼吸復(fù)合物通過質(zhì)子泵而產(chǎn)生。梯度的維持要求IMM對(duì)質(zhì)子、帶電物質(zhì)和溶質(zhì)具有低通透性，它們的流出被特定載體系統(tǒng)牢牢控制，而所述特定載體系統(tǒng)是由ΔμH的兩個(gè)部分，即膜電位差(Δψm)和ΔpH供以動(dòng)力。然而，體外線粒體可容易地經(jīng)歷IMM對(duì)分子量約1,500Da或更低的溶質(zhì)的通透性增加。這種通透性的變化被稱為通透性轉(zhuǎn)換(PT)，其通過膜孔、即線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)的開啟調(diào)節(jié)。MPTP的長(zhǎng)期開啟可導(dǎo)致線粒體外膜(OMM)破裂和細(xì)胞色素c釋放，隨之對(duì)線粒體功能產(chǎn)生嚴(yán)重的后果(例如ΔμH瓦解，吡啶核苷酸耗竭)，從而導(dǎo)致呼吸抑制。因而，該過程作為體內(nèi)線粒體功能異常的標(biāo)志、特別是對(duì)于特定的人病理性事件如局部缺血-再灌注損傷和神經(jīng)變性而言，已經(jīng)過長(zhǎng)期研究。MPTP作為程序性細(xì)胞死亡(凋亡)的介體和BCL2家族成員通過釋放細(xì)胞色素c的作用靶點(diǎn)也引起人們的關(guān)注(Bernardi，P.，陽(yáng)離子的線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)通道、交換劑和通透性轉(zhuǎn)換，PhysiolRev，1999.79(4)1127-55頁(yè)；Nicholls，D.G.和S.L.Budd，線粒體和神經(jīng)元存活，Physiol Rev，2000.80(1)315-60頁(yè)；Bernardi.P.等人，線粒體和細(xì)胞死亡，機(jī)械論方面和方法學(xué)討論，Eur J Biochem，1999.264(3)687-701頁(yè)；Bernardi.P.等人，從線粒體視角論細(xì)胞死亡，Trends Biochem Sci，2001.26(2)112-7頁(yè))。
目前認(rèn)同的是線粒體在控制細(xì)胞存活和死亡方面起重要作用(細(xì)胞程序死亡；Kroemer G & Reed JC，細(xì)胞死亡的線粒體控制，Nat Med.2000，6(5)513-9)。涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子的數(shù)目增加以及很多代謝物和某些病毒效應(yīng)子似乎都對(duì)線粒體起作用并且影響線粒體膜的透化。細(xì)胞保護(hù)性分子由于能夠穩(wěn)定線粒體膜，可用于治療其中存在過量細(xì)胞程序死亡的疾病(神經(jīng)變性疾病、局部缺血、AIDS、暴發(fā)性肝炎等)。
線粒體膜通透性的變化是細(xì)胞程序死亡的關(guān)鍵事件，細(xì)胞程序死亡與半胱氨酸蛋白酶(caspase)激活劑和與半胱氨酸蛋白酶無關(guān)的死亡效應(yīng)子自膜間間隙的釋放、內(nèi)跨膜電位的耗散以及氧化磷酸化作用的紊亂相關(guān)(Kroemer G & Reed JC，細(xì)胞死亡的線粒體控制，Nat Med.2000，6(5)513-9；Vander Heiden MG & Thompson CB，Bcl-2蛋白質(zhì)細(xì)胞程序死亡或線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)劑？，Nat Cell Biol.(1999)1(8)E209-16；Wallace DC，人和小鼠中的線粒體疾病，Science(1999)；283(5407)，1482-8)。Bcl-2家族的促細(xì)胞程序死亡和抗細(xì)胞程序死亡成員通過與腺嘌呤核苷酸移位酶(ANT；在內(nèi)膜中)、電壓依賴型陰離子通道(VDAC；在外膜中)的相互作用和/或通過自主通道形成活性來調(diào)節(jié)內(nèi)和外線粒體膜的通透性(Kroemer G & Reed JC，2000；Marzo I、Brenner C、Zamzami N、Jurgensmeier JM、Susin SA、Vieira HL、Prevost MC、Xie Z、MatsuyamaS、Reed JC、Kroemer G.，Bax和腺嘌呤核苷酸易位體在細(xì)胞程序死亡的線粒體控制中的合作，Science(1998)，281(5385)2027-31；Shimizu S.、NaritaM.、Tsujimoto Y.，Nature(1999)，399，483-487；Vander Heiden &Thompson，1999)。ANT和VDAC據(jù)信是線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)復(fù)合物中的主要組分，所述復(fù)合物是在兩個(gè)線粒體膜非常接近的部位構(gòu)成的聚蛋白結(jié)構(gòu)(Crompton M.，Biochem J(1999)，341，233-249)。
線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔是在參與調(diào)節(jié)線粒體膜通透性的線粒體內(nèi)膜和線粒體外膜之間的接觸位點(diǎn)形成的聚蛋白質(zhì)復(fù)合物。它由一組蛋白質(zhì)組成，包括與線粒體有關(guān)的己糖激酶(HK)、孔蛋白(電壓依賴型陰離子通道或VDAC)、腺嘌呤核苷酸易位(ANT)、外周苯并二氮雜受體(PBR)、肌酸激酶(CK)和親環(huán)蛋白D以及Bcl-2家族成員。在生理?xiàng)l件下，MPTP通過調(diào)節(jié)電導(dǎo)率來控制線粒體的鈣內(nèi)穩(wěn)態(tài)，其中所述調(diào)節(jié)電導(dǎo)率是借助線粒體pH、線粒體膜電位Δψm、NAD/NAD(P)H氧化還原平衡和基質(zhì)蛋白巰基氧化而實(shí)現(xiàn)(Shimizu S.、Narita M.、Tsujimoto Y.，Nature(1999)，399，483-487；Crompton M.，Biochem J 341，233-249(1999)；Ichas F.、JouailleL.、Mazat J.，Cell(1997)，89，1145-53)。MPTP已牽涉到細(xì)胞程序死亡的很多實(shí)例，這是因?yàn)槠淠軌蛘隙鄠€(gè)促細(xì)胞程序死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并且因?yàn)槠涫艿絹碜訠cl-2/Bax家族的蛋白質(zhì)的控制。Bcl-2家族包括死亡抑制(Bcl-2樣)和死亡誘導(dǎo)(Bax樣)成員，它們分別防止或促使MPTP開啟。據(jù)報(bào)道Bax和Bcl-2可與MPTP內(nèi)的VDAC和ANT相互作用。
細(xì)胞程序死亡和相關(guān)形式的受控細(xì)胞死亡涉及眾多疾病。細(xì)胞死亡過程的過量或不足與自身免疫和神經(jīng)變性疾病、癌癥、局部缺血和病理性感染或疾病如病毒和細(xì)菌感染有關(guān)。在神經(jīng)變性疾病領(lǐng)域，很多觀測(cè)結(jié)果都提示與細(xì)胞程序死亡的線粒體控制密切相關(guān)(參見Kroemer G & Reed JC，細(xì)胞死亡的線粒體控制，Nat.Med.(2000)，6(5)513-9)。神經(jīng)毒素-甲基-4-苯基吡啶鎓可誘發(fā)線粒體通透性轉(zhuǎn)換和細(xì)胞色素c的釋放(Cassarino DS、Parks JK、Parker WD Jr、Bennett JP Jr.，帕金森病患者神經(jīng)毒素MPP+在分離的線粒體中借助氧化機(jī)理開啟線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔并釋放細(xì)胞色素c，Biochem Biophys Acta 1999，1453，49-62)。
線粒體毒素如硝基丙酸或魚藤酮中毒可在靈長(zhǎng)類動(dòng)物和嚙齒類動(dòng)物中引起亨廷頓氏舞蹈病類型的疾病(Brouillet E、Hantraye P、Ferrante RJ、Dolan R、Leroy-Willig A、Kowall NW、Beal MF.，慢性線粒體能量損傷在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中產(chǎn)生選擇性紋狀體變性和異常舞蹈病樣運(yùn)動(dòng)，Proc NatlAcad Sci USA.1995年7月18日，92(15)7105-9；Betarbet R、Sherer TB、MacKenzie G、Garcia-Osuna M、Panov AV、Greenamyre JT，長(zhǎng)期暴露于系統(tǒng)性殺蟲劑可再現(xiàn)帕金森病特點(diǎn)，Nat.Neurosci.2000，1301-6)。
在生理?xiàng)l件下，ANT是ADP和ATP的特異性反向轉(zhuǎn)運(yùn)劑。然而，ANT與不同的促細(xì)胞程序死亡劑相互作用時(shí)還可形成致死性的孔，所述促細(xì)胞程序死亡劑包括Ca2+、蒼術(shù)苷、HIV-Vpr衍生的肽和促氧化劑。線粒體膜的透化也可通過非特異性VDAC孔調(diào)節(jié)，所述非特異性VDAC孔由外膜中的Bcl-2/Bax樣蛋白質(zhì)和/或由線粒體基質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)之間的代謝性ATP/ADP梯度的變化調(diào)制。
盡管MPTP在壞死性細(xì)胞死亡和細(xì)胞程序死亡中所起的作用獲得了廣泛的認(rèn)同，但是關(guān)于其分子鑒定的許多信息仍然依賴于間接的證據(jù)。而且，其組分的特異性高度親和探針的缺乏阻礙了該領(lǐng)域的進(jìn)展。
更具體而言，本領(lǐng)域需要用于研究和調(diào)制線粒體透化和細(xì)胞程序死亡的方法和試劑。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明提供了一種新類型的化合物，用于標(biāo)記和調(diào)制μM以下范圍的MPTP。此外，本發(fā)明提供了作為MPTP組分和作為這些化合物的分子靶的VDAC(VDAC1)的同種型1的鑒定法。
本發(fā)明提供了通式I化合物和通式II化合物作為MPTP復(fù)合物的調(diào)制劑和親和標(biāo)記物的用途。此外，本發(fā)明提供了用于調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的方法、用于測(cè)定MPTP復(fù)合物組分存在的方法和用于鑒別調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的活性劑的方法，具體而言是鑒別通過與VDAC1組分相互作用而調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的活性劑的方法。此外，本發(fā)明還提供了新的通式I和通式II的化合物。
本發(fā)明提供了選自a)通式I和b)通式II的化合物作為MPTP復(fù)合物活性的調(diào)制劑的用途，所述a)通式I為
其中R1和R2選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，且R3選自H、D、T，所述b)通式II為 其中R選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基。優(yōu)選的是上述通式I化合物的用途。更優(yōu)選的是上述通式I化合物的用途，其中R1和R2是H且R3是H。優(yōu)選的是上述通式II化合物的用途，其中R選自H、Br、Cl和Cl2。
本發(fā)明的MPTP復(fù)合物活性的調(diào)制劑是可抑制、消除或增強(qiáng)MPTP活性的化合物。至于“MPTP活性”，應(yīng)當(dāng)理解為由于成孔單元從關(guān)閉狀態(tài)轉(zhuǎn)換至開啟狀態(tài)或反之所導(dǎo)致的線粒體內(nèi)膜的通透性變化。
此外，本發(fā)明提供了選自a)通式I和b)通式II的化合物作為親和標(biāo)記物的用途，所述通式I中，R1和R2選自H、T、鹵素、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T，并且其中至少殘基R1、R2和R3之一包含至少一個(gè)放射性同位素，所述通式II中，R選自T、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，其中R包含至少一個(gè)放射性同位素。優(yōu)選的是上述化合物作為MPTP復(fù)合物組分的親和標(biāo)記物的用途。甚至更優(yōu)選的是上述化合物作為MPTP復(fù)合物之VDAC1組分的親和標(biāo)記物的用途。對(duì)于上述用途，同樣優(yōu)選的是上述通式I化合物。更優(yōu)選的是上述通式I化合物，其中R1和R2是H且R3是T。同樣優(yōu)選的是上述通式II化合物，其中R是鹵素的放射性同位素，優(yōu)選Br、Cl或Cl2的放射性同位素。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的方法，該方法包括向生物樣品中的細(xì)胞或組織中添加化合物，并且測(cè)定與所述化合物不存在時(shí)的活性相比較的MPTP復(fù)合物的活性，所述化合物選自a)通式I，其中R1和R2選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T，和b)通式II，其中R選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基。
本文使用的“生物樣品”包括所有取自動(dòng)物或人體的組織、細(xì)胞和體液樣品，其包含具有MPTP復(fù)合物的線粒體。
測(cè)定或測(cè)量MPTP活性的方法是本領(lǐng)域已知的，包括測(cè)量由Ca2+或其它活性劑誘發(fā)的線粒體的膨脹和收縮、測(cè)量放射性標(biāo)記的蔗糖的攝取、測(cè)量線粒體的Ca2+-保留容量，或使用熒光探針或標(biāo)記或未標(biāo)記的親脂性陽(yáng)離子測(cè)量線粒體膜電位(Bernardi，P.等人，線粒體和細(xì)胞死亡，機(jī)械論方面和方法學(xué)討論，Eur J Biochem，1999.264(3)687-701頁(yè))。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了測(cè)定MPTP復(fù)合物組分存在的方法，該方法包括a)使所針對(duì)的生物樣品與化合物接觸，所述化合物選自a)通式I，其中R1和R2選自H、T、鹵素、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T，并且其中殘基R1、R2和R3中的至少一個(gè)包含至少一個(gè)放射性同位素，和b)通式II，其中R選自T、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，其中R包含至少一個(gè)放射性同位素，所述接觸在允許所述化合物與MPTP復(fù)合物組分結(jié)合的條件下進(jìn)行；和b)檢測(cè)化合物的結(jié)合；并且c)任選地對(duì)所檢測(cè)的化合物結(jié)合進(jìn)行定量。
化合物與線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔復(fù)合物組分的結(jié)合可在各種條件下測(cè)定，包括將培養(yǎng)的細(xì)胞或分離的線粒體在生理?xiàng)l件下暴露于標(biāo)記化合物，并通過本領(lǐng)域已知的方法將未結(jié)合的化合物與結(jié)合的化合物分離。優(yōu)選的是將自組織如腦或肝臟分離的線粒體與放射性標(biāo)記的化合物培育確定的一段時(shí)期。對(duì)于標(biāo)記反應(yīng)而言，線粒體可以處于去能狀態(tài)，即在不存在任何呼吸底物的條件下培育，或者當(dāng)存在呼吸底物如琥珀酸或谷氨酸/蘋果酸時(shí)呈能化狀態(tài)。化合物與MPTP復(fù)合物組分的結(jié)合可以通過測(cè)量與線粒體部分結(jié)合的放射活性進(jìn)行定量。通過自游離的標(biāo)記親和化合物分離有助于這種量化。分離方法包括但不限于洗滌、過濾和離心。分離方法還應(yīng)包括均化技術(shù)，例如閃爍親近測(cè)定法(SPA)，其中不將原位的游離標(biāo)記親和化合物與結(jié)合的標(biāo)記親和化合物分離?！盎衔锏慕Y(jié)合”是指化合物的總結(jié)合，包括特異性和非特異性結(jié)合。非特異性結(jié)合是通過與飽和濃度的相同或另一種已知化合物競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)行評(píng)估。然后親和化合物的特異性結(jié)合可通過自親和化合物的總結(jié)合中減去非特異性結(jié)合來確定。如果放射性標(biāo)記的化合物與線粒體轉(zhuǎn)換孔復(fù)合物的組分形成共價(jià)鍵，則可通過十二烷基硫酸鈉凝膠電泳首先分離線粒體蛋白，并且通過放射自顯影術(shù)測(cè)定與蛋白質(zhì)譜帶相關(guān)的放射活性。
進(jìn)一步的實(shí)施方案提供了用于鑒別調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的活性劑的方法，該方法包括a)在候選活性劑存在下使生物樣品與化合物接觸，所述生物樣品含有具有MPTP的細(xì)胞，所述化合物選自a)通式I，其中R1和R2選自H、T、鹵素、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T，且其中至少殘基R1、R2和R3之一包含至少一個(gè)放射性同位素，和b)通式II，其中R選自T、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，其中R包含至少一個(gè)放射性同位素；和b)比較候選活性劑存在時(shí)化合物與MPTP的結(jié)合與所述活性劑不存在時(shí)化合物與MPTP的結(jié)合；并且c)任選地測(cè)試所述選定活性劑對(duì)包含具有MPTP的亞細(xì)胞成分的細(xì)胞提取物配制物中的MPTP活性的作用。
所選活性劑對(duì)MPTP活性的作用可通過比較按上述方法所測(cè)量的所述活性劑存在和不存在時(shí)的MPTP活性而確定。
此外，本發(fā)明提供了鑒別通過與VDAC1相互作用而調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的活性劑的方法，該方法包括a)在候選活性劑存在下使生物樣品與化合物接觸，所述生物樣品含有具有MPTP之VDAC1的細(xì)胞，所述化合物選自a)通式I，其中R1和R2選自H、T、鹵素、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T，且其中至少殘基R1、R2和R3之一包含至少一個(gè)放射性同位素，和b)通式II，其中R選自T、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基，其中R包含至少一個(gè)放射性同位素；和b)比較候選活性劑存在時(shí)化合物與MPTP之VDAC1的結(jié)合與所述活性劑不存在時(shí)化合物與MPTP之VDAC1的結(jié)合；并且c)任選地在制備包含具有MPTP之VDAC1的亞細(xì)胞元素的細(xì)胞提取物時(shí)，測(cè)試所述選定活性劑對(duì)MPTP活性的作用。
本文使用的“活性劑”是指被篩選出用于調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的任何化合物?！罢{(diào)制”應(yīng)當(dāng)理解為MPTP復(fù)合物的活性可以受到抑制、可以被消除或者可以被增強(qiáng)。應(yīng)當(dāng)說明的是在本發(fā)明用于調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的方法中是活性的“活性劑”隨后可在用于治療神經(jīng)變性病癥或用于治療神經(jīng)系統(tǒng)病癥的藥物組合物中使用，所述神經(jīng)變性病癥選自肌萎縮性側(cè)索硬化、阿爾茨海默病、亨廷頓氏舞蹈病和帕金森??；所述神經(jīng)系統(tǒng)病癥選自糖尿病性神經(jīng)病、大腦低氧、腦炎和腦膜炎(meningitis)。
興奮毒性損傷過程中的鈣進(jìn)入是神經(jīng)元細(xì)胞死亡的必要介體。線粒體功能障礙在興奮毒性細(xì)胞死亡中扮演重要角色。據(jù)報(bào)道，MPTP的抑制劑是神經(jīng)保護(hù)性的已發(fā)現(xiàn)環(huán)孢菌素A可延遲/減少NMDA-誘發(fā)型線粒體膜去極化和細(xì)胞死亡，且在某些動(dòng)物模型中(局部缺血、低血糖和腦創(chuàng)傷)具有神經(jīng)保護(hù)作用。N-Me-Val4-CsA，即CsA非免疫抑制類似物，也已顯示具有神經(jīng)保護(hù)特性。因此，調(diào)制劑、特別是MPTP抑制劑可代表新的神經(jīng)保護(hù)治療策略(Mruphy AN、Fiskum G、Beal MF.，神經(jīng)變性中的線粒體細(xì)胞生存和死亡中的生物能功能，J Cereb Blood Flow Metab，1999 19，231-45；Tatton WG，Chalmers-Redman RM，神經(jīng)變性細(xì)胞程序死亡中的線粒體治療的機(jī)遇？Ann Neurol，1998 44(3 Suppl 1)S134-41)。
本發(fā)明還提供了通過如上所述的本發(fā)明方法鑒別的活性劑。
通式I化合物， 其中R1和R2選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D和T，是新化合物。
優(yōu)選的是通式I化合物，其中R1和R2是H且R3是H。所述的化合物可以用作MPTP活性的調(diào)制劑。
通式I化合物，其中R1和R2選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D和T，其中至少殘基R1、R2和R3之一包含至少一個(gè)放射性同位素，是新化合物。優(yōu)選的是通式I化合物，其中R1和R2是H且R3是T。所述化合物可以用作親和標(biāo)記物。優(yōu)選地，所述化合物可用作MPTP組分的親和標(biāo)記物。
通式I化合物可按照下述的合成路徑合成
通式I化合物可分3步自中間體IV中制備氫化、氘化或氚化，以得到飽和化合物III，然后與仲胺鹽酸鹽如吡咯烷鹽酸鹽縮合，得到Mannich加合物，最后在酸性條件下通過使用例如硅膠作為酸催化劑將其轉(zhuǎn)化成I。中間體IV可以使用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)轉(zhuǎn)化法自化合物VII制備，如Denmark等人，“有機(jī)合成”，74卷，33中所述用堿如二異丙氨基鋰和4-溴丁腈處理VII，得到VI，然后在堿性條件下環(huán)化得到V。將V酸性水解形成中間體IV。起始物質(zhì)VII可按照Regnier G.J.，J.Med.Chem.1992，35，2481-2496中描述的已知方法制備。其中R1、R2是放射性標(biāo)記(D，T)的通式I化合物可通過將其中R1和R2是鹵素的化合物III氘化或氚化而制備，得到其中R1和R2是D或T的化合物III。
通式II化合物已在EP 118685和EP 117412中被描述為植物生長(zhǎng)抑制劑，并且可按其中所述方法合成。通式Ⅱ化合物，其中R選自H、T、D、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，可以用作MPTP復(fù)合物活性的調(diào)制劑。優(yōu)選的是所述的式II化合物，其中R選自H、Br、Cl和Cl2。

通式II化合物，其中R選自T、D、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，其中R包含至少一個(gè)放射性同位素，是新化合物。優(yōu)選的是所述的其中R包含T的化合物。同樣優(yōu)選的是所述式II化合物，其中R是Cl、Cl2或Br的放射性同位素。這些化合物可用作親和標(biāo)記物。優(yōu)選地，這些化合物用作MPTP復(fù)合物組分的親和標(biāo)記物。
本文使用的“親和標(biāo)記物”是指對(duì)微摩爾級(jí)濃度或優(yōu)選更低濃度的MPTP的組分具有親和性的化合物，這些化合物被放射性同位素所標(biāo)記，所述放射性同位素在實(shí)驗(yàn)體系或當(dāng)施用于哺乳動(dòng)物時(shí)適合于檢測(cè)。適宜的放射性同位素對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的且包括例如鹵素(如氯、氟、溴和碘)的同位素，以及金屬，包括锝和銦的同位素。優(yōu)選的放射性同位素包括3H和14C。最優(yōu)選的是3H。放射性標(biāo)記的本發(fā)明化合物可以使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)放射性標(biāo)記方法制備。適宜的合成方法已有詳述。
這種放射性標(biāo)記還應(yīng)當(dāng)無論是化學(xué)上還是代謝學(xué)上是適度穩(wěn)定的，適用于本領(lǐng)域中的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)。而且，盡管本發(fā)明的化合物可以用各種不同放射性同位素以各種方式進(jìn)行標(biāo)記，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)同的，但這種放射性標(biāo)記應(yīng)當(dāng)以未標(biāo)記的親和化合物對(duì)MPTP組分的高度結(jié)合親和性及特異性不受到顯著影響的方式進(jìn)行?！安皇艿斤@著影響”是指結(jié)合親和性和特異性所受到的影響不大于約3個(gè)對(duì)數(shù)單位、優(yōu)選不大于約2個(gè)對(duì)數(shù)單位、更優(yōu)選不大于約1個(gè)對(duì)數(shù)單位、甚至更優(yōu)選不大于約500％且仍然甚至更優(yōu)選不大于約250％，且最優(yōu)選結(jié)合親和性和特異性完全不受影響。
MPTP組分的放射性標(biāo)記親和化合物可具有500mCi/mmole至100Ci/mmole的比活性。優(yōu)選地，它的比活性為65Ci/mmole。被結(jié)合的放射性標(biāo)記親和化合物可通過添加閃爍劑來測(cè)量。
以上對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了總體上的描述，通過參考具體的實(shí)施例，本發(fā)明將變得更易于理解，本文所包括的具體實(shí)施例連同以下附圖僅出于說明的目的，除非有具體說明，其并非旨在限制本發(fā)明。


圖1MPTP基本單元的建議示意圖。
圖2螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-對(duì)大鼠肝臟線粒體中Ca2+誘發(fā)型膨脹的影響。培養(yǎng)基含有0.2M蔗糖、10mM Tris-Mops pH7.4、1mM Pi-Tris、5μM EGTA和5mM谷氨酸/2.5mM蘋果酸，用Tris緩沖至pH7.4，作為CPI呼吸底物。在25℃、螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-存在下，經(jīng)短時(shí)(～5分鐘)預(yù)培育后，通過添加40μM CaCl2誘發(fā)線粒體膨脹，并且監(jiān)測(cè)MPTP的開啟，表現(xiàn)為540nm處的吸光度降低。
圖3螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-、其類似物6-溴-3-亞甲基-苯并二氫吡喃-4-酮和CsA對(duì)大鼠肝臟線粒體中Ca2+誘發(fā)型膨脹的影響。實(shí)驗(yàn)條件如圖2。添加40μM CaCl2后20分鐘，通過使用四參數(shù)邏輯斯諦方程、使用SigmaPlot計(jì)算機(jī)程序，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸分析擬合，確定EC50值，以540nm(AA540)處的吸光度相對(duì)基準(zhǔn)(無CaCl2)的百分比變化表示。所示的數(shù)值是使用不同的肝臟線粒體制品一式兩份進(jìn)行3至5次實(shí)驗(yàn)所得的均值±SEM。
圖4(A)螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-和CsA對(duì)大鼠腦線粒體的Ca2+保留容量的影響。培養(yǎng)基含有0.2M蔗糖、10mM Tris-Mops pH7.4、1mM Pi-Tris、5μM EGTA和5mM谷氨酸/2.5mM蘋果酸，用含有0.01％(w/v)牛血清白蛋白和1μM CalciumGreen-5N的Tris緩沖至pH7.4。終體積為2.5ml。跡線(a)對(duì)照，(b)1μMCsA，(c)1μM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-和(d)1μM CsA加1μM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-。每個(gè)熒光峰對(duì)應(yīng)于加入5μM Ca2+。(B)肝臟(a)和腦(b)線粒體的Ca2+保留容量比較。
圖5Ub5對(duì)螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-抑制MPTP的影響。(A)Ca2+-誘發(fā)型大鼠肝臟線粒體膨脹。實(shí)驗(yàn)條件如圖2，不同之處是加入60μM Ca2+以便誘發(fā)MPTP。在跡線a和b中，沒有添加Ca2+，b中存在50μM Ub5。對(duì)其它跡線而言，或者單獨(dú)添加60μM Ca2+，即c，或者在以下物質(zhì)存在下添加60μM Ca2+50μM Ub5，即d，300nM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-，即e，以及300nM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-和50μM Ub5，即f?；衔镌贑a2+之前～5分鐘添加。(B)大鼠腦線粒體的Ca2+誘發(fā)型去極化。所用的介質(zhì)如圖4中的說明，不同之處是添加0.5μM羅丹明-123代替Calcium Green-5N，并且通過添加20μM Ca2+誘發(fā)MPTP。跡線a對(duì)照(單獨(dú)添加Ca2+)，b；300nM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-，c300nM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-和50μM Ub5。
圖6分離的大鼠腦(A)和肝臟(B)線粒體的親和標(biāo)記。在10nM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基-存在下、在存在或不存在各種濃度的螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-(未標(biāo)記的)的條件下，于25℃將線粒體制品培育15分鐘。對(duì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE(細(xì)節(jié)參見實(shí)驗(yàn)過程部分)和熒光自顯影。圖中顯示了凝膠的熒光圖譜?？v坐標(biāo)顯示的是分子量分級(jí)(kDa)。
圖7螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基-標(biāo)記的32kDa蛋白質(zhì)的純化。將先前用20nM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基-標(biāo)記的、Triton X-100增溶的線粒體注射入hydrohyapatite FPLC柱中。以0.5ml/min的速率用磷酸鈉緩沖液pH6.8線性梯度進(jìn)行洗脫(25分鐘內(nèi)達(dá)250mM，然后在5分鐘內(nèi)達(dá)400mM)，自動(dòng)收集1分鐘的級(jí)分。直方圖顯示了計(jì)數(shù)級(jí)分的等分試樣(5μl)后得到的放射活性洗脫曲線。插圖顯示了Triton X-100增溶的線粒體的銀染色(起始物質(zhì)，a道)及柱流通物的銀染色(級(jí)分7-9，b道)。相應(yīng)的純化物質(zhì)的熒光圖譜示于c道。
圖8(A)在大鼠腦部線粒體中monobromobimano(MBBM)和氧化苯胂(PhAO)對(duì)螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11 ′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基-標(biāo)記VDAC1的影響。實(shí)驗(yàn)條件如圖5的說明。(B)各種MPTP抑制劑蒼術(shù)苷(ATR)和DIDS對(duì)大鼠腦線粒體中螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基-標(biāo)記VDAC1的影響。將線粒體暴露于DIDS達(dá)5分鐘，然后清洗除去游離的活性劑并用螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基-進(jìn)行標(biāo)記。
圖9存在或不存在不同濃度的螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-(未標(biāo)記的)的條件下，對(duì)缺乏YVDAC1的por1基因(Δpor1)的酵母線粒體和用YVDAC1轉(zhuǎn)染的Δpor1酵母線粒體進(jìn)行螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基親和標(biāo)記。圖中顯示了SDS-PAGE后的凝膠的熒光圖譜。將自酵母系中分離的線粒體在10nM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基存在下于25℃培育15分鐘。數(shù)字表示添加的各種化合物的濃度(μM)。
實(shí)施例除非另外說明，實(shí)施例中提及的市售可得的試劑按照制造商的指示使用。[3H]-四苯基鏻([3H]-TPP，24-29Ci/mmol)購(gòu)自AmershamBiosciences(瑞士)。CsA、TFP、泛醌0(Ub0)、泛醌5(Ub5)得自Sigma(瑞士)；蒼術(shù)苷(ATR)和米酵霉酸(BKA)得自BioMol(Anawa，瑞士)。Calcium-Green 5N(六鉀鹽)、羅丹明-123和4，4′-二異硫氰基均二苯代乙烯-2，2′-二磺酸(DIDS，二鈉鹽)得自Molecular Probes(Juro，瑞士)。
實(shí)施例1篩選試驗(yàn)在鑒定新的MPTP抑制劑的嘗試中，使用琥珀酸能化(在2μM魚藤酮存在下)的大鼠肝臟線粒體的Ca2+誘發(fā)型膨脹(在Pi存在下)篩選化合物庫(kù)，作為功能性試驗(yàn)。
自雄性Albino RoRo大鼠或MoRo小鼠(BRL，F(xiàn)üllinsdorf，瑞士)制備肝臟和腦線粒體。對(duì)于膨脹實(shí)驗(yàn)而言，按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Costantini，P.、Petronilli，V.、Colonna，R.& Bernardi，P.(1995)，Toxicology 99，77-88)、通過差速離心分離肝臟線粒體。將線粒體沉淀重新懸浮于用10mM TrisHCl緩沖至pH7.4的250mM蔗糖并保存于冰中直至使用。按照Sims，N.R.(1990)J.Neurochem.55，698-707中所述的方法、使用Percoll梯度得到來自大鼠和小鼠腦部的線粒體。對(duì)于肝臟線粒體中的親和標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，該組織的細(xì)胞器也是經(jīng)Percoll梯度進(jìn)行分離。使用Pierce bicichoninic acid蛋白質(zhì)分析試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量。
25℃下于96孔平板中，借助由SOFTmax PROTM軟件(MolecularDevices，瑞士)控制的SPECTRAMax 250分光光度計(jì)測(cè)量540nm處的吸光度變化，對(duì)能化線粒體中的Ca2+誘發(fā)型膨脹(蔗糖通透性)進(jìn)行分析。培養(yǎng)基含有0.2M蔗糖、10mM Tris-Mops pH7.4、1mM Pi-Tris、5μM EGTA。用Tris緩沖至pH7.4的琥珀酸(5mM，在2μM魚藤酮存在下)或5mM谷氨酸/2.5mM蘋果酸，被用作呼吸底物。在存在或不存在供試化合物下經(jīng)短時(shí)(～5分鐘)預(yù)培育后，通過添加20μl CaCl2誘發(fā)線粒體膨脹，使CaCl2的終濃度為40至80μM，這取決于呼吸底物以及線粒體制品的Ca2+敏感性。最終培育體積為0.2ml且線粒體濃度為～0.5mg線粒體蛋白質(zhì)ml-1。在25℃下監(jiān)測(cè)膨脹動(dòng)力學(xué)達(dá)30分鐘。每12秒取吸光度讀數(shù)，并在讀數(shù)之間將平板搖動(dòng)3s以確保實(shí)驗(yàn)過程中氧的擴(kuò)散并避免線粒體的沉積。膨脹實(shí)驗(yàn)也可按照Chernyak，B.V.& Bernardi，P.(1996)Eur.J.Biochem.238，623-630所述在完全去能的肝臟線粒體中進(jìn)行。
按分批方式將分離的肝臟線粒體(～0.5mg蛋白質(zhì)ml-1)在20nM[3H]TPP([3H]-四苯基鏻([3H]-TPP，24-29Ci/mmol)，來自AmershamBiosciences，瑞士)存在下于25℃培育15分鐘。然后，將混合物的等分試樣(100μl)分配至含有100μl供試化合物的96孔板中并于25℃下延長(zhǎng)培育15分鐘。然后，使用96通道細(xì)胞收集器，將樣品通過0.3％(v/v)聚乙烯亞胺處理的GF/B玻璃纖維濾器過濾，并用1ml緩沖液將濾器洗滌兩次。然后向每孔添加50μl的MICROSCINT 40(Packard)，然后于TopCount閃爍計(jì)數(shù)器(Packard)中計(jì)數(shù)放射活性。在1mM未標(biāo)記的TPP或1μM羰基氰-對(duì)-三氟甲氧基苯腙(FCCP)存在下測(cè)定非特異性吸收。使用Clark型電極、用極譜法于25℃下測(cè)定線粒體的氧消耗。
然后，對(duì)所發(fā)現(xiàn)的能夠抑制MPTP的化合物使用電勢(shì)探針[3H]-TPP攝入法(Hoek，J.B.、Nicholls，D.G.& Williamson，J.R.(1980)J.Biol.Chem.255，1458-1564)進(jìn)行計(jì)數(shù)器篩選，以便以半定量但快速的方式確定它們是否干擾線粒體呼吸(例如protonophore)。這樣可掘棄“假陽(yáng)性”結(jié)果，其例如通過降低線粒體膜電位可降低Ca2+向線粒體的流入，而這對(duì)于MPTP開啟是必要的。然后，選擇在抑制MPTP濃度下同樣不干擾線粒體呼吸(O2消耗)的化合物以進(jìn)一步表征。在篩選中已鑒別出通式I化合物和通式II化合物。許多EC50在μM以下范圍的活性化合物顯現(xiàn)具有常見的藥效成分，如作為Michael受體的烯酮。
實(shí)施例2螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基- 將螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-(0.3g，1.14mmol)、吡咯烷鹽酸鹽(0.146g，1.37mmol)和低聚甲醛(0.1g，4.42mmol)溶解于DMF(1ml)中。將反應(yīng)混合物浸入80℃油浴中，氬氣條件下攪拌2.5小時(shí)，然后在高真空下蒸發(fā)溶劑。將殘余物放入MeCl2中并加入1N NaOH。將水相用MeCl2萃取并將合并的有機(jī)相用水洗滌，用Na2SO4干燥，真空濃縮。將殘余物溶解于4ml CH2Cl2中并在SiO2(1.3g)存在下于室溫下攪拌20分鐘。過濾后，用CH2Cl2洗滌SiO2。將濾液濃縮并將殘余物在硅膠上進(jìn)行層析(己烷-乙酸乙酯48∶02)，得到螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-(0.138g，44％)，為白色固體，MSm/e＝274(M+)。
實(shí)施例3螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基- 將螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-(2.2Ci)、吡咯烷鹽酸鹽(3.5mg，0.033mmol)和低聚甲醛(3mg，0.1mmol)溶解于DMF(0.1ml)中。將反應(yīng)混合物浸入80℃油浴中，氬氣條件下攪拌2.5小時(shí)，然后在高真空下蒸發(fā)溶劑。將殘余物放入MeCl2中并加入1NNaOH。將水相用MeCl2萃取并將合并的有機(jī)相用水洗滌，用Na2SO4干燥，真空濃縮。將殘余物溶解于4ml CH2Cl2中并在SiO2(200mg)存在下于室溫下攪拌2小時(shí)。過濾后，將濾液在1g Lichroprep Si60 25-40μm上進(jìn)行層析(己烷-乙酸乙酯48∶02)。純化產(chǎn)物的總活性為1.376Ci并通過質(zhì)譜法測(cè)定比活性，放射化學(xué)純度分別為65.1Ci/mmole和98.4％。
實(shí)施例4螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫- 將螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮(0.02g，0.077mmol)溶解于乙酸乙酯(2ml)中，并在Pd/C(0.01g，10％于碳上)存在下于一個(gè)大氣壓的氫下回流36小時(shí)。過濾催化劑并將濾液蒸發(fā)。將殘余物在硅膠上層析(己烷-乙酸乙酯48∶02)，得到螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-(0.017g，84％)，為無色油狀物，MSm/e＝262(M+)。
實(shí)施例5螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫- 將螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮(0.01g，0.034mmol)溶解于DMF(0.8ml)中，并在Pd/C(6mg，10％于碳上)存在下于一個(gè)大氣壓的氚下于80℃加熱3小時(shí)。將粗產(chǎn)物(2.5Ci)在1g Lichroprep Si60，25-40μm的柱上進(jìn)行層析(己烷-乙酸乙酯48∶02)，得到螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-，總活性為2.2Ci。
實(shí)施例6螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮 將2′-氨基螺[5H-二苯并[a，d]環(huán)庚烯-5，1′-<2>-環(huán)戊烯]-3′-甲腈(0.96g，3.38mmol)溶解于二噁烷(33ml)中。加入水(16ml)和HCl(16ml，37％)。將反應(yīng)混合物在氬氣條件下回流18小時(shí)，然后冷卻至室溫并用水和乙酸乙酯使反應(yīng)中止。將水相用乙酸乙酯萃取并將合并的有機(jī)相用水洗滌，用Na2SO4干燥并真空濃縮。將所得的固體在己烷中攪拌1小時(shí)并過濾，得到螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮(0.324g，36％)，為白色固體，MSm/e＝260(M+)。
實(shí)施例72′-氨基螺[5H-二苯并[a，d]環(huán)庚烯-5，1′-<2>-環(huán)戊烯]-3′-甲腈 將5-(3-氰基-丙基)-5H-二苯并[a，d]環(huán)庚烯-5-甲腈(2g，7mmol)溶解于THF(8ml)和tBuOH(17ml)中，并用tBuOK(0.78g，7mmol)處理。將反應(yīng)混合物在65℃下加熱2小時(shí)，然后冷卻至室溫并用水和醚使反應(yīng)中止。將水相用醚萃取并將合并的有機(jī)相用水洗滌，用Na2SO4干燥并真空濃縮。將殘余物在0℃下于CH2Cl2中結(jié)晶，得到2′-氨基螺[5H-二苯并[a，d]環(huán)庚烯-5，1′-<2>-環(huán)戊烯]-3′-甲腈(0.47g，24％)，為白色固體，MSm/e＝284(M+)。
實(shí)施例85-(3-氰基-丙基)-5H-二苯并[a，d]環(huán)庚烯-5-甲腈 向-5℃的二異丙胺(0.143ml，1mmol)的THF(1ml)溶液滴加nBuLi(0.67ml，1.06mmol，1.6M于己烷中)。在-5℃下攪拌20分鐘后，滴加5H-二苯并[a，d]環(huán)庚烯-5-甲腈(按照Regnier G.J.等人，J.Med.Chem.1992，35，2481-2496制備)(0.2g，0.9mmol)的THF(1ml)溶液。在-5℃下15分鐘后，緩慢添加4-溴丁腈(0.1ml，1mmol)的THF(1ml)溶液。將反應(yīng)混合物緩慢溫?zé)嶂潦覝?，攪拌過夜并用水和醚使反應(yīng)中止。將水相用醚萃取并將合并的有機(jī)相用水洗滌，用Na2SO4干燥并真空濃縮。將殘余物在硅膠上層析(己烷-乙酸乙酯9∶1)，得到5-(3-氰基-丙基)-5H-二苯并[a，d]環(huán)庚烯-5-甲腈(0.2g，76％)，為無色油狀物，MSm/e＝284(M+)。
實(shí)施例9螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-對(duì)大鼠肝臟線粒體中Ca2+誘發(fā)型膨脹的影響。
培養(yǎng)基含有0.2M蔗糖、10mM Tris-Mops pH7.4、1mM Pi-Tris、5μMEGTA和5mM谷氨酸/2.5mM蘋果酸，用Tris緩沖至pH7.4，作為CPI呼吸底物。在螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-存在下于25℃經(jīng)短時(shí)(～5分鐘)預(yù)培育后，通過添加40μM CaCl2誘發(fā)線粒體膨脹，并監(jiān)測(cè)MPTP開啟，表現(xiàn)為540nm處的吸光度降低(圖2)。
實(shí)施例10螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-、6-溴-3-亞甲基-苯并二氫吡喃-4-酮和CsA對(duì)大鼠肝臟線粒體中Ca2+誘發(fā)型膨脹的影響。
實(shí)驗(yàn)條件如實(shí)施例9。添加40μM CaCl2后20分鐘，通過使用四參數(shù)邏輯斯諦方程、使用SigmaPlot計(jì)算機(jī)程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸分析擬合，確定EC50值，以540nm處的吸光度相對(duì)基準(zhǔn)(無CaCl2)的百分比變化(ΔA540)表示。所示的數(shù)值是使用不同肝臟線粒體制品一式兩份進(jìn)行3至5次實(shí)驗(yàn)所得的均值±SEM(圖3，表1)。
螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-有效地抑制了Ca2+誘發(fā)型線粒體膨脹(圖2)。因此，螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-抑制了用NADH-關(guān)聯(lián)底物(谷氨酸/蘋果酸)能化的肝臟線粒體中的MPTP開啟，其EC50為98±10(圖3)。在相似條件下，CsA和烯酮類似物6-溴-3-亞甲基-苯并二氫吡喃-4-酮所表現(xiàn)的EC50分別為169±9和930±30nM。表1顯示了在琥珀酸能化的線粒體中所獲得的螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-、6-溴-3-亞甲基-苯并二氫吡喃-4-酮、6-氯-3-亞甲基-苯并二氫吡喃-4-酮、6，8-二氯-3-亞甲基-苯并二氫吡喃-4-酮與那些已知MPTP抑制劑相比較的EC50。同樣在這些實(shí)驗(yàn)條件下，螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-似乎在抑制肝臟線粒體中的MPTP方面至少與CsA同樣有效，并且比所測(cè)試的其它MPTP抑制劑更為有效。然而，應(yīng)當(dāng)提醒的是所報(bào)道的EC50是相對(duì)值并且似乎取決于誘發(fā)膨脹所添加的Ca2+的量(以及呼吸底物)，參見Fontaine，E.、Ichas，F(xiàn).、Bernardi.P.(1998)J.Biol.Chem.273，25734-25740。但是改變Ca2+的加載量，各種抑制劑的相對(duì)效力仍然能夠保持。
螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-及其類似物6-溴-3-亞甲基-苯并二氫吡喃-4-酮在抑制去能化線粒體中的MPTP方面也是有效的，在這種條件下，應(yīng)當(dāng)排除與間接調(diào)制MPTP的位點(diǎn)的相互作用(Linder，M.D.、Morkunaite-Haimi，S.、Kinnunen，P.K.、Bernardi，P.& Eriksson，O.(2002)J.Biol.Chem.273，937-942)，其EC50值分別為0.37和2.8μM(n＝2，添加200μM Ca2+后30分鐘測(cè)定的數(shù)值)。作為比較，發(fā)現(xiàn)CsA和Ub0在此實(shí)驗(yàn)條件下的EC50為0.22和4.9μM。螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-還抑制由氧化苯胂(25μM)和由ATR(ATR)誘發(fā)的MPTP，因而證明了這種化合物能夠抑制各種誘發(fā)條件下的MPTP。
在完全阻斷MPTP的濃度下，螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-和6-溴-3-亞甲基-苯并二氫吡喃-4-酮并不抑制線粒體的呼吸(基礎(chǔ)的、ADP-誘發(fā)的和非偶聯(lián)的)或Cyp-D肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶的酶活性。
實(shí)施例11螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-和CsA對(duì)大鼠腦線粒體Ca2+保留容量的影響(圖4)。
使用由FL WinLab計(jì)算機(jī)程序控制的Perkin-Elmer LS-50B熒光計(jì)測(cè)定外線粒體Ca2+的量度。培養(yǎng)基含有0.2M蔗糖、1mM Pi-Tris、10mMTris-Mops、5μM谷氨酸-Tris、2.5mM蘋果酸-Tris pH7.4，含有0.01％(w/v)BSA和1μM低親和Ca2+指示劑Calcium Green-5N(Fontaine，E.、Eriksson，O.、Ichas，F(xiàn).& Bernardi.P.(1998)J.Biol.Chem.273，12662-12668)。終體積為2.5ml，將比色杯在25℃下恒溫。然后對(duì)腦線粒體系列添加5μM Ca2+(～150nmol mg蛋白質(zhì)-1)。在505-535的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)外線粒體Ca2+。根據(jù)制造商的指示進(jìn)行Ca2+信號(hào)的校準(zhǔn)，假定染料的Ca2+KD為14μM。還比較了肝臟(a)和腦線粒體(b)中的Ca2+-保留容量。
在自大鼠前腦中分離的線粒體中也研究了螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-在抑制MPTP方面的效果。盡管自該組織中獲得線粒體的得率低，使得膨脹實(shí)驗(yàn)難以進(jìn)行，但螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-仍可抑制通過添加80μM CaCl2誘發(fā)的腦線粒體膨脹，其效力位于在肝臟線粒體中所觀察的范圍內(nèi)。由于以上提及的困難，因而針對(duì)螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-對(duì)腦線粒體中MPTP的效果進(jìn)行了更精確地研究，通過對(duì)自大鼠前腦分離的線粒體進(jìn)行一系列Ca2+脈沖處理(5μM，～150nmol mg蛋白質(zhì)-1)并通過監(jiān)測(cè)外線粒體Ca2+，或使用熒光探針進(jìn)行。在這些條件下，線粒體吸收并且保留Ca2+直至加載量達(dá)到閾值，在此閾值下線粒體經(jīng)歷快速Ca2+釋放、伴隨去極化的過程，該效果已顯示應(yīng)當(dāng)歸因于MPTP的開啟。圖4顯示了CsA和螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-在這些實(shí)驗(yàn)中的效果。在1μM下(即所觀察到的化合物的最大有效濃度)，螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-和CsA都可增加線粒體緩沖Ca2+的能力，直至達(dá)到閾值，在此閾值下不再有Ca2+被吸收。兩種化合物均使腦線粒體吸收的Ca2+的量約加倍。由此，對(duì)照線粒體能夠蓄積530±70nmol Ca2+/mg蛋白質(zhì)，而在1μM CsA和螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-存在下，Ca2+緩沖容量分別增加至1130±80和1200±120nmol Ca2+/mg蛋白質(zhì)(3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值±SEM)。螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-和CsA的組合(各為1μM)具有加合效果，線粒體能夠積累至2050±450nmol Ca2+/mg蛋白質(zhì)。就螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11 ′-二氫-3-亞甲基-不抑制Cyp-D活性的事實(shí)而言，這說明螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-的作用位點(diǎn)不同與Cyp-D。正如所預(yù)料的，在螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-及其類似物6-溴-3-亞甲基-苯并二氫吡喃-4-酮存在下，沒有觀察到加合效果。從系列添加Ca2+(每次5μM)后監(jiān)測(cè)ΔΨm的實(shí)驗(yàn)中，獲得了事實(shí)上完全相同的結(jié)果。每次Ca2+的添加都引起ΔΨm可逆性降低，直至MPTP開啟完全使ΔΨm瓦解，并且在添加protonophore FCCP后不再能夠觀察到熒光增加。同樣在這些條件下，螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-和CsA都使誘發(fā)完全去極化所必需的添加Ca2+的次數(shù)增加，并且在將二種化合物組合后觀察到加合的效果。另一方面，采用相同的方法，對(duì)螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-與其它MPTP抑制劑的組合進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果顯示螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-與BKA、ADP、TFP和三苯氧胺具有加合效果，由此表明螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-具有不同的作用位點(diǎn)。唯一的例外是Ub0，這是一種以前表征過的MPTP阻斷劑，對(duì)其而言沒有看到這種加合效果。
與Ub0組合缺乏加合效果提示螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-的結(jié)合位點(diǎn)可能對(duì)應(yīng)于Fontaine及其合作者所報(bào)道的調(diào)制MPTP開啟的泛醌的位點(diǎn)(Walter，L.、Nogueira，V.、Leverve，X.、Heitz，M.P.、Bernardi.P.& Fontaine，E.(2000)J.Biol.Chem.275，29521-29527)。為進(jìn)一步證實(shí)之，研究了已顯示可減輕Ub0的抑制效果的泛醌衍生物Ub5是否也能夠拮抗螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-對(duì)MPTP的抑制。正如圖5A中針對(duì)大鼠肝臟線粒體所示，Ub5(50μM)能夠拮抗螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-的抑制作用，使螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-的EC50從290nM位移至2.4μM(n＝2，60μM Ca2+，谷氨酸/蘋果酸作為呼吸底物)。而且，在大鼠腦線粒體中(圖5B)，其中300nM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-可抑制Ca2+誘發(fā)的去極化，該抑制作用也因50μMUb5的存在而減弱。單獨(dú)的Ub5沒有效果。這些結(jié)果支持了以下觀點(diǎn)螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-和泛醌衍生物可能作用于MPTP的相同或功能性相關(guān)的位點(diǎn)。
實(shí)施例12使用螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10，11′-二氫-3-亞甲基-對(duì)線粒體進(jìn)行親和標(biāo)記將Percoll純化的線粒體(每樣品～30μg蛋白質(zhì))在10nM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10，11′-二氫-3-亞甲基-存在下培育，終體積為200μl。在25℃下培育15分鐘后，將樣品在25000xg下離心并將線粒體沉淀用緩沖液清洗兩次。然后將樣品增溶于含有β-巰基乙醇的樣品緩沖液中(37℃下1小時(shí))，并在Tris-甘氨酸Novex預(yù)制小型凝膠上(12％單體濃度，Invitrogen BV，荷蘭)進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)處理?？捡R斯藍(lán)染色后，對(duì)凝膠進(jìn)行處理以進(jìn)行熒光自顯影，將凝膠在AmplifyTM(Amersham Biosciences)中浸泡、干燥并在-80℃下曝光于X射線BioMax MS膠片持續(xù)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，同時(shí)使用BioMax MS增感屏(Kodak)。
將分離的線粒體(Percoll梯度，～5mg蛋白質(zhì))在20nM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10，11′-二氫-3-亞甲基-存在下于25℃標(biāo)記15分鐘。然后將線粒體沉淀用3ml 3％TritonX-100(Surfact-Amps X-100，Pierce)增溶于10mM NaPO4pH6.8中，其含有0.5mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、1μg/ml亮抑蛋白酶肽、1.8μg/ml抑蛋白酶肽和1μg/ml抑胃酶肽A。然后，將增溶膜注射到在含有0.3％TritonX-100的10mM NaPO4pH6.8中平衡的陶瓷hydroxyhapatite CHT-II1×5cm柱(Bio-Rad，瑞士)中。然后，用含有0.3％Triton X-100、不超過400mM的NaPO4pH6.8的梯度洗脫柱子，流速為0.5ml min-1。收集級(jí)分(1min)并計(jì)數(shù)等分試樣(5μl)的放射活性。然后對(duì)放射活性級(jí)分進(jìn)行SDS-PAGE處理，隨后進(jìn)行染色和/或熒光自顯影。
為鑒別螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10，11′-二氫-3-亞甲基-標(biāo)記的蛋白質(zhì)，將放射活性層析級(jí)分中的蛋白質(zhì)用三氯乙酸(終濃度20％)沉淀。待在SDS-PAGE樣品緩沖液中重構(gòu)且使用碘乙酰胺進(jìn)行酰胺基甲基化(carboxamidomethylation)后，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE處理。用膠體考馬斯藍(lán)(Novex)染色并脫色后，切除凝膠斑點(diǎn)并在使用改性胰蛋白酶(Promega)進(jìn)行凝膠內(nèi)消化后，通過如前所述的基質(zhì)輔助型激光解吸電離-質(zhì)譜法(MALDI-MS)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析(Fountoulakis，M.&Langen，H.(1997)Anal.Biochem.250，153-156；Yoo，B.C.、Fountoulakis，M.、Cairns，N.& Lubec，G.(2001)Electrophoresis 22，172-179)。在裝配有反射器的飛行時(shí)間PerSeptive Biosystems質(zhì)譜儀中對(duì)樣品進(jìn)行分析。獲得的肽質(zhì)量與SWISS-PROT和TrEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)(http//us.expasy.org/sprot/)中來自所有品種的所有蛋白質(zhì)的理論肽質(zhì)量相符。對(duì)于蛋白質(zhì)查找而言，使用單同位素質(zhì)量，并且質(zhì)量允許誤差可為0.0075％。不匹配的肽或錯(cuò)裂的部位沒有考慮。通過納電噴射串聯(lián)MS(Wilm，M.& Mann，M.(1996)Anal.Chem.68，1-8)、借助API 365三聯(lián)四極質(zhì)譜儀(Sciex，Toronto，加拿大)，也證實(shí)了一些胰蛋白酶片段的同一性，如前所述(Krafenbauer，K.、Berger，M.、Friedlein，A.、Lubec，G.& Fountoulakis，M.(2001)Eur JBiochem.268，3532-3537)。
圖6顯示了用10nM螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基-標(biāo)記自大鼠腦(圖A)和肝臟(圖B)中分離的完整線粒體后獲得的結(jié)果。有限數(shù)量的蛋白質(zhì)似乎被標(biāo)記，并且在兩種制品中，似乎主要標(biāo)記的是～32kDa的蛋白質(zhì)。增加未標(biāo)記螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-的濃度，抑制此譜帶的標(biāo)記。這種32kDa蛋白質(zhì)是膜蛋白，因?yàn)樵诰€粒體可溶性級(jí)分中沒有觀察到蛋白質(zhì)標(biāo)記。使用自小鼠腦和肝臟和自人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞中分離的線粒體，也似乎是～32kDa譜帶被主要標(biāo)記。呼吸底物(谷氨酸/蘋果酸或琥珀酸/魚藤酮)的存在并不改變這種標(biāo)記模式。
這種得自由上述組織制備的線粒體的蛋白質(zhì)可通過單一FPLC層析步驟、使用hydroxyhapatite柱進(jìn)行純化。如圖7所示，絕大多數(shù)放射活性沒有被柱子保留，而是洗脫在柱的前沿。對(duì)這些級(jí)分進(jìn)行SDS-PAGE處理，然后進(jìn)行銀染色和熒光自顯影，結(jié)果顯示存在主要的單一蛋白質(zhì)(圖7，插圖)。凝膠內(nèi)消化后的胰蛋白酶片段MALDI-MS分析和納電噴射串聯(lián)MS表明這些蛋白質(zhì)相當(dāng)于VDAC的同種型I(電壓依賴型陰離子選擇性通道蛋白質(zhì)I或線粒體外膜蛋白質(zhì)孔蛋白1，POR1_RAT，Q9Z2L0)。
實(shí)施例13在大鼠腦線粒體中monobromobimano(MBBM)和氧化苯胂(PhAO)對(duì)螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基-標(biāo)記VDAC1的影響。
實(shí)驗(yàn)條件如實(shí)施例12(圖8A)。研究了各種MPTP抑制劑蒼術(shù)苷(ATR)和DIDS在大鼠腦線粒體中對(duì)螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基-標(biāo)記VDAC1的影響。將線粒體暴露于DIDS達(dá)5分鐘，然后清洗除去游離的活性劑并用螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯0并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基-進(jìn)行標(biāo)記(圖8B)。
為了將螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基-對(duì)VDAC1的標(biāo)記與該化合物作為MPTP阻斷劑的功能性效果相聯(lián)系，研究了許多MPTP抑制劑和MPTP誘發(fā)劑ATR在大鼠腦線粒體中對(duì)螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基-標(biāo)記VDAC1的效果。如圖8B所示，螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-的類似物6-溴-3-亞甲基-苯并二氫吡喃-4-酮(以及β-氨基酮衍生物6-溴-3-二乙基氨基甲基-苯并二氫吡喃-4-酮)抑制了放射活性的摻入。在阻斷MPTP濃度的Ub0存在下，觀察到螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基標(biāo)記受到抑制。后一種發(fā)現(xiàn)與上述報(bào)道的功能性實(shí)驗(yàn)相一致(見圖5)，說明VDAC可能代表泛醌抑制劑的分子靶。CsA、AdNT配體(ADP、BKA和ATR)和TFP不影響放射活性的摻入。有趣的是，陰離子通道抑制劑DIDS，據(jù)顯示其可抑制超氧化物誘發(fā)型VDAC-依賴型細(xì)胞色素-c自線粒體的釋放(Madesh，M.& Hajnoczky，G.(2001)J.Cell.Biol.155，1003-1015)，也似乎可抑制螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基的摻入(圖8B)。使用肝臟線粒體在親和標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中也獲得了事實(shí)上完全相同的結(jié)果。
實(shí)施例14在酵母線粒體中的螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基標(biāo)記為進(jìn)一步證實(shí)VDAC1作為螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-的蛋白質(zhì)靶，研究了螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-t2-10′，11′-二氫-3-亞甲基對(duì)自酵母制備的線粒體中的蛋白質(zhì)的標(biāo)記。在其中酵母中主要VDAC同種型YVDAC1的表達(dá)已通過缺失por1(Δpor1)基因而消除的株系中，事實(shí)上沒有觀察到標(biāo)記。然而，自含有可介導(dǎo)YVDAC1表達(dá)的質(zhì)粒的Δpor1株系制備的酵母線粒體顯示出29kDa譜帶的突出標(biāo)記，29kDa為酵母VDAC分子量的預(yù)期大小，如使用針對(duì)YVDAC1所培育的抗體進(jìn)行的免疫印跡分析所證實(shí)。增加未標(biāo)記的螺[環(huán)戊烷-1，5′-[5H]二苯并[a，d]環(huán)庚烯]-2-酮，10′，11′-二氫-3-亞甲基-的濃度可抑制放射活性的摻入(圖9)。然而，令人驚訝的是，在自用介導(dǎo)人VDAC1表達(dá)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Δpor1品系制備的酵母線粒體中，沒有觀察到明顯的標(biāo)記。盡管免疫印跡分析顯示蛋白質(zhì)確實(shí)已被表達(dá)。
表1各種抑制劑在用琥珀酸能化的大鼠肝臟線粒體中對(duì)Ca2+誘發(fā)型MPTP的影響

*使用ADP的實(shí)驗(yàn)在1μg/ml寡霉素存在下進(jìn)行培養(yǎng)基含有0.2M蔗糖、10mM Tris-Mops pH7.4、1mM Pi-Tris、5μMEGTA。使用琥珀酸(5mM，在2μM魚藤酮存在下)作為呼吸底物。用各種化合物進(jìn)行～5分鐘的培育后，通過添加80μM Ca2+誘發(fā)膨脹，并監(jiān)測(cè)A540。在添加CaCl2后20分鐘，通過使用四參數(shù)邏輯斯諦方程、使用SigmaPlot計(jì)算機(jī)程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸分析擬合，確定EC50值，以540nm處的吸光度相對(duì)基準(zhǔn)(無CaCl2)的百分比變化(ΔA540)表示。
權(quán)利要求
1.選自a)通式I和b)通式II的化合物作為MPTP復(fù)合物的活性調(diào)制劑的用途，其中所述a)通式I為 其中R1和R2選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T，所述b)通式II為 其中R選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基。
2.權(quán)利要求1的用途，其中化合物選自上述通式I化合物，其中R1和R2選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T。
3.權(quán)利要求2的用途，其中化合物是上述通式I化合物，其中R1和R2是氫且R3是H。
4.權(quán)利要求1的用途，其中化合物選自上述通式II化合物，其中R選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基和烷氧基。
5.權(quán)利要求4的用途，其中化合物是上述通式II化合物，其中R選自H、Br、Cl和Cl2。
6.選自a)上述通式I和b)上述通式II的化合物作為親和標(biāo)記物的用途，所述通式I中，R1和R2選自H、T、鹵素、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T，并且其中至少殘基R1、R2和R3之一包含至少一個(gè)放射性同位素；所述通式II中，R選自T、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，其中R包含至少一個(gè)放射性同位素。
7.權(quán)利要求6的化合物的用途，其中所述化合物是MPTP復(fù)合物組分的親和標(biāo)記物。
8.權(quán)利要求6和7的化合物的用途，其中所述化合物選自上述通式I化合物，其中R1和R2選自H、T、鹵素、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T，并且其中至少殘基R1、R2和R3之一包含至少一個(gè)放射性同位素。
9.權(quán)利要求8的化合物的用途，其中所述化合物是上述式I化合物，其中R1和R2是H且R3是T。
10.權(quán)利要求6和7的化合物的用途，其中所述化合物選自上述通式II化合物，其中R選自T、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，其中R包含至少一個(gè)放射性同位素。
11.權(quán)利要求10的化合物的用途，其中所述化合物選自上述式II化合物，其中R選自Br、Cl和Cl2的放射性同位素。
12.用于調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的方法，該方法包括向生物樣品的細(xì)胞或組織中添加化合物并測(cè)量與所述化合物不存在時(shí)的活性相比較的MPTP復(fù)合物的活性，所述化合物選自a)上述通式I，其中R1和R2選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T，和b)上述通式II，其中R選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基。
13.用于測(cè)定MPTP復(fù)合物組分存在的方法，該方法包括a)使所針對(duì)的生物樣品與化合物接觸，所述化合物選自a)通式I，其中R1和R2選自H、T、鹵素、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T，并且其中至少殘基R1、R2和R3之一含有至少一個(gè)放射性同位素，和b)通式II，其中R選自T、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，其中R包含至少一個(gè)放射性同位素，所述接觸在允許所述化合物與MPTP復(fù)合物的組分結(jié)合的條件下進(jìn)行；和b)檢測(cè)化合物的結(jié)合；和c)任選地對(duì)所檢測(cè)的化合物的結(jié)合進(jìn)行定量。
14.用于鑒別調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的活性劑的方法，該方法包括a)在候選活性劑存在下使生物樣品與化合物接觸，所述生物樣品含有具有MPTP的細(xì)胞，所述化合物選自a)通式I，其中R1和R2選自H、T、鹵素、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T，并且其中至少殘基R1、R2和R3之一包含至少一個(gè)放射性同位素，和b)通式II，其中R選自T、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，其中R包含至少一個(gè)放射性同位素；和b)比較候選活性劑存在時(shí)化合物與MPTP的結(jié)合與所述活性劑不存在時(shí)化合物與MPTP的結(jié)合；和c)任選地測(cè)試所述被選活性劑對(duì)包含具有MPTP的亞細(xì)胞成分的細(xì)胞提取物配制物中的MPTP活性的作用。
15.用于鑒別通過與VDAC1相互作用而調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的活性劑的方法，該方法包括a)在候選活性劑存在下使生物樣品與化合物接觸，所述生物樣品含有具有MPTP之VDAC1的細(xì)胞，所述化合物選自a)通式I，其中R1和R2選自H、T、鹵素、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T，并且其中至少殘基R1、R2和R3之一包含至少一個(gè)放射性同位素，和b)通式II，其中R選自T、鹵素的放射性同位素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，其中R包含至少一個(gè)放射性同位素；和b)比較候選活性劑存在時(shí)化合物與MPTP之VDAC1的結(jié)合與所述活性劑不存在時(shí)化合物與MPTP之VDAC1的結(jié)合；和c)任選地測(cè)試所述被選活性劑對(duì)包含具有MPTP之VDAC1的亞細(xì)胞成分的細(xì)胞提取物配制物中的MPTP活性的作用。
16.通過權(quán)利要求14和15的任一項(xiàng)的方法鑒別的活性劑。
17.通式I化合物， 其中R1和R2選自H、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基且R3選自H、D、T。
18.權(quán)利要求17的化合物，其中所述化合物是通式I化合物，其中R1和R2是H且R3是H。
19.權(quán)利要求17的化合物，其中至少殘基R1、R2和R3之一包含至少一個(gè)放射性同位素。
20.權(quán)利要求17的化合物，其中所述化合物是通式I化合物，其中R1和R2是H且R3是T。
21.權(quán)利要求17至20的化合物，其作為MPTP復(fù)合物活性的調(diào)制劑。
22.權(quán)利要求19和20的化合物，其作為親和標(biāo)記物。
23.權(quán)利要求19和20的化合物，其作為用于MPTP復(fù)合物組分的親和標(biāo)記物。
24.通式II化合物， 其中R選自H、T、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，其中R包含至少一個(gè)放射性同位素，其中所述化合物是親和標(biāo)記物。
25.權(quán)利要求24的化合物，其中所述化合物是用于MPTP復(fù)合物組分的親和標(biāo)記物。
26.權(quán)利要求24和25的化合物，其中R包含至少一個(gè)T。
27.權(quán)利要求24和25的化合物，其中R選自Br、Cl和Cl2的放射性同位素。
28.通式II化合物， 其中R選自H、T、鹵素、烷基、環(huán)烷基、烷氧基，其中所述化合物是MPTP復(fù)合物活性的調(diào)制劑。
29.權(quán)利要求28的化合物，其中R選自H、Br、Cl和Cl2。
全文摘要
本發(fā)明提供了通式I化合物和通式II化合物作為MPTP復(fù)合物的調(diào)制劑和親和標(biāo)記物的用途。此外，本發(fā)明提供了用于調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的方法、用于測(cè)定MPTP復(fù)合物組分存在的方法及用于鑒別調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的活性劑的方法，具體地為鑒別通過與VDAC1相互作用而調(diào)制MPTP復(fù)合物活性的活性劑的方法。此外，本發(fā)明提供了新的通式I化合物。
文檔編號(hào)A61P25/28GK1609086SQ20041003380
公開日2005年4月27日 申請(qǐng)日期2004年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月14日
發(fā)明者A·塞蘇爾, E·皮那德 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司