專利名稱：β－(3，4－二羥基苯基)－α－羥基丙酸異丙酯及其合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域，涉及一種藥，具體說是涉及一種防治心腦血管疾病的新藥β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸異丙酯及其合成方法。
背景技術(shù)：
丹參是一種療效明確的治療心腦血管疾病的中藥復(fù)方制劑，而其中真正起到治療效果的有效成分及結(jié)構(gòu)一直未能明確。目前普遍認(rèn)為丹參素是丹參中的有效成分，但是現(xiàn)有的文獻(xiàn)只是從臨床觀察和動物實驗的角度對其藥理及功效進(jìn)行了研究，而沒能從分子水平予以表達(dá)，在藥動學(xué)研究方面也僅僅給出了其血藥濃度關(guān)系曲線及參數(shù)，而沒能對主要代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、代謝機(jī)理及相應(yīng)的臨床功效進(jìn)行探討。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，篩選和明確丹參中真正起到治療效果的有效成分及結(jié)構(gòu)，進(jìn)行反合成，并將其用于對心腦血管疾病的預(yù)防和治療。
實現(xiàn)上述目的的技術(shù)解決方案是，從丹參在人血清中的主要代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)并篩選出具有治療效果的β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸異丙酯，設(shè)計了它的合成路線，并合成出了此化合物。
1)一種治療心腦血管疾病的藥物β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸異丙酯，其結(jié)構(gòu)為 2)β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸異丙酯是用于對心腦血管疾病的治療。
其合成方法包括以下步驟1)血清中丹參的代謝產(chǎn)物先在預(yù)柱中被富集除雜，再被反沖入分析柱進(jìn)行分離，流出物進(jìn)入質(zhì)譜，利用離子阱多級質(zhì)譜技術(shù)對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步確證；2)再按合成路線合成此化合物，配成溶液進(jìn)行質(zhì)譜分析，進(jìn)一步確證主要代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明合成出的β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸異丙酯純度可達(dá)98.0％，通過初步藥理試驗證明它具有較強(qiáng)的擴(kuò)張血管、抗腦缺血及體內(nèi)外抗氧化作用，具有降低糖尿病不穩(wěn)定性引起的心絞痛病人發(fā)病頻率、降低心肌梗塞發(fā)病率、保護(hù)心、腦和減輕癥狀的效果。


圖1是柱切換流路圖；圖2是合成路線圖；圖3為正常大鼠小腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)，蒲青野細(xì)胞層正常；圖4、圖5、圖6分別為對照組、衰老組、實驗組大鼠小腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)，其中蒲青野細(xì)胞層出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，衰老組最顯著。
具體實施例方式
以下結(jié)合附圖和藥效學(xué)試驗報告對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
血清中丹參的代謝產(chǎn)物按圖1所示流路圖，先在預(yù)柱中被富集除雜，然后被反沖入分析柱進(jìn)行分離，流出物進(jìn)入質(zhì)譜，利用離子阱多級質(zhì)譜技術(shù)對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步確證，再按圖2所示合成路線合成此兩類化合物，配成溶液進(jìn)行質(zhì)譜分析，進(jìn)一步確證主要代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。
β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸異丙酯合成方法(見圖3)。
(1)乙酰甘氨酸的合成
稱取氨基乙酸(甘氨酸)15克，于400毫升燒杯中，加入蒸餾水60毫升，攪拌微熱溶解，冷卻至室溫，加入乙酸酐43克，冷卻至室溫后，放入冰箱過夜，抽濾得白色晶體。
(2)Azlactone的合成在已固定的燒瓶中，加入醋酸鈉1.7g，加熱至熔融狀態(tài)微涼后，稱取苯甲醛0.8g和乙酰甘氨酸1.2g加入瓶中，安裝回流裝置并通水，再加入醋酸酐25ml混和，安裝干燥管，在100℃下攪拌反應(yīng)3h，溶液由黃色變?yōu)樽厣鋮s，放置，析出黃色針狀結(jié)晶；(3)β-(3，4-二乙酰氧基苯基)-α-乙酰氨基丙烯酸的合成在干燥的結(jié)晶中加入適量沸水100ml，反應(yīng)4h，再加入適量活性炭脫色，煮沸0.5h，熱過濾，除去活性炭，減壓蒸餾除去水，加入適量無水乙醇溶解，抽濾，殘渣為醋酸鈉，收集濾液，減壓蒸餾除去乙醇，得白色結(jié)晶為產(chǎn)品產(chǎn)率為61.67％。
(4)β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸的合成取結(jié)晶5.0g置于燒瓶中，加162mL水，18mL濃鹽酸和10克Zn-Hg齊，加熱沸騰反應(yīng)，維持浴溫使不斷有氫氣溢出，反應(yīng)7H，熱過濾，用7％NaHCO3(AR)溶液調(diào)節(jié)pH為5，減壓蒸餾至干，加入適量甲醇溶解，抽濾，濾液減壓蒸餾至干，沸水溶解，活性炭脫色后，在減壓蒸餾至干即得。
(5)β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸異丙酯的合成在燒瓶中加入β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸0.76g，苯20ml，對甲苯磺酸0.1g和異丙醇3ml，連接回流冷凝管和分水器，加熱回流(66.5攝氏度，6小時)到不再有水份蒸出為止，減壓蒸餾除去苯和異丙醇，加入碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH為中性，加入乙酸乙酯反復(fù)萃取(5×20ml)，減壓蒸餾除去乙酸乙酯得結(jié)晶。
藥效學(xué)試驗
1.對D-半乳糖致衰大鼠小腦的作用1.1實驗分組純系健康6月齡Wistar大鼠48只，雌雄各半，體重400g±10g，雌性300g±10g。自然條件下飼養(yǎng)，飲水、攝食任意。隨機(jī)分成3，每組雌雄各半，①衰老模型組每天腹腔注射D-半乳糖50mg/kg；②實驗組每天腹腔注射D-半乳糖50mg/kg的同時，腹腔注射β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸異丙酯4mg/L；③空白對照組每天腹腔注射等量0.85％生理鹽水。各組大鼠在連續(xù)注射8周后處死。
1.2實驗方法1.2.1總SOD測定3組大鼠每組隨機(jī)各取8只，雌雄各半。用1％戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉后，取出小腦，立即加入組織塊重量9倍的冷0.85％生理鹽水，制成10％小腦組織勻漿，然后3000～4000r/min離心15min，取適量上清液測SOD活力。按公式計算出各組大鼠小腦SOD活力，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，統(tǒng)計結(jié)果用方差分析。
1.2.2甲基綠哌洛寧染色①取材與制片3組大鼠每組隨機(jī)各取8只，雌雄各半。1％戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉下，按圖譜取小腦蚓部(VIII、IX區(qū))組織，組織塊厚度為1.5～2mm，立即置于Carnoy固定液中，4℃固定4h，然后直接轉(zhuǎn)入95％乙醇和無水乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚4μm。
②甲基綠純化新購買的甲基綠需用氯仿進(jìn)行純化處理，以去除甲基紫。方法是將2％甲基綠水溶液20ml傾入潔凈分液漏斗，加入氯仿20ml充分混勻，使其內(nèi)的甲基紫溶于氯仿中而呈現(xiàn)紫紅色。旋動分液漏斗下部的砂塞，慢慢把下沉帶紫紅色的氯仿移去，再加入新的氯仿10ml，如此反復(fù)更換氯仿，直到無紫紅色為止。該液作為貯存液，4℃保存。
③染液配制(臨用前配制，濾紙過濾)2％甲基綠貯存液5ml，5％哌洛寧水溶液1ml，蒸餾水12ml，0.2mol/L醋酸緩沖液(pH4.8)18ml。
④染色步驟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化至蒸餾水，置染液中室溫下染片15min，取出切片，不經(jīng)水洗，用濾紙吸干多余染液，95％乙醇迅速分化，100％乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。
1.3實驗結(jié)果光學(xué)顯微鏡下凋亡細(xì)胞的體積變小，細(xì)胞核固縮，甲基綠使細(xì)胞核DNA特異性著色呈綠或綠藍(lán)色；細(xì)胞凋亡時常伴有蛋白質(zhì)合成增加，哌洛寧使胞漿RNA特異性著色呈紫紅色。觀察時計算凋亡指數(shù)，即隨機(jī)選擇約10～20個視野，計數(shù)凋亡細(xì)胞的百分率。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，統(tǒng)計結(jié)果用方差分析。
由于甲基綠和哌洛寧的特殊染色性質(zhì)，可見正常的蒲青野細(xì)胞(圖3)排列整齊、大小均一，細(xì)胞質(zhì)染成淡粉紅色，核呈淡綠色，核仁清晰；隨著年齡的增加，可見有的蒲肯野細(xì)胞體積明顯變小，細(xì)胞質(zhì)呈紫紅色，核固縮呈藍(lán)綠色，是為凋亡細(xì)胞，其在對照組(圖4)僅偶見，衰老組(圖5)即明顯增多，實驗組(圖6)介于二者之間。凋亡指數(shù)及SOD活力的具體結(jié)果見表1。
表1 β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸異丙酯對D-半乳糖致衰大鼠小腦SOD活力(NU·mg-1prot)、蒲肯野細(xì)胞凋亡指數(shù)的(％)影響組別 例數(shù) SOD活力凋亡指數(shù)衰老模型組 895.13±14.85 51.4±6.3正常對照組 8130.18±16.78※※13.1±9.2※※實驗組 8112.45±9.83※29.6±6.5※※※P＜0.05，※※P＜0.012.對離體大鼠缺氧/復(fù)氧心肌的保護(hù)作用
2.1實驗分組Wistar大鼠42只，體重250-280g，雌雄不限，隨機(jī)分為6組，每組均為7只。①正常對照組(control group)大鼠心臟離體后接在灌流裝置上持續(xù)灌流75min。②單純?nèi)毖?復(fù)氧組(A/R group)大鼠心臟離體后接在灌流裝置上先預(yù)灌15min，然后停止灌流，保持心臟溫度恒定在37℃，在無氧、無灌流液的條件下曠置40min，再恢復(fù)灌流20min。③復(fù)方丹參滴丸前保護(hù)組(Pre-DS group)及復(fù)方丹參滴丸后保護(hù)組(Post-DS group)分別在預(yù)灌時和再灌時加入復(fù)方丹參滴丸，其它處理同單純?nèi)毖?復(fù)氧組。④實驗前保護(hù)組(Pre-egroup)及實驗后保護(hù)組(Post-e group)分別在預(yù)灌時和再灌時加入β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸異丙酯，其它處理同單純?nèi)毖?復(fù)氧組，實驗時(3，4-二羥基)-苯基-α-羥基丙酸異丙酯溶解于灌流液中，濃度分別為4mg/L。
2.2實驗方法大鼠用0.6％戊巴比妥鈉(45mg/kg體重)腹腔注射麻醉，同時腹腔注入0.2％肝素20mg/kg。動物麻醉后按常規(guī)開胸取心，心臟取出后立即放入盛有預(yù)冷灌流液的平皿內(nèi)，用冷灌流液沖掉殘留血液，并迅速移到Langendorff灌流裝置上，灌流液為Krebs-Hanseleit磷酸緩沖液，灌流壓為88kPa。灌流前用95％氧氣和5％二氧化碳混合氣體向灌流液中平衡15min，在灌流過程中以1個大氣壓將上述混合氣體持續(xù)向儲液瓶灌流液內(nèi)補(bǔ)充。
①灌注結(jié)束時，取心臟左室立即用在液氮中預(yù)冷的金屬夾板將心肌組織夾成冰凍薄片，迅速稱取100mg心肌組織，加入預(yù)冷的0.42mol/L高氯酸制成勻漿，再加入1mol/L氫氧化鉀中和，然后用超聲波細(xì)胞粉碎器將線粒體膜打碎，使能量物質(zhì)全部釋放于溶液中(以上操作過程均在冰水中進(jìn)行)。然后3000r/min離心15min，上清液用0.2μm微孔濾膜過濾，取10μL濾液上柱分析。
②每組隨機(jī)取3只大鼠。于心臟灌流結(jié)束時，在心臟左室游離壁處取材，在冷的4％戊二醛-磷酸緩沖液中切成1mm×1mm×1mm的小塊預(yù)固定，經(jīng)脫水、包埋、超薄切片、染色后在H-600透射電鏡下對心肌細(xì)胞超微結(jié)果進(jìn)行觀察。
2.3實驗結(jié)果2.3.1.A/R組心肌組織中的一磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)及腺苷酸總量(AN)均明顯低于control組(P＜0.01)。
2.3.2.Pre-e組及Post-e組大鼠心肌組織內(nèi)的AMP、ADP、ATP、AN含量均高于A/R組(P＜0.01)，也相應(yīng)高于Pre-DS、Post-DS組(P＜0.01)，兩組心肌組織中的ATP含量均接近正常水平(P＞0.05)；2.3.3.Pre-e組及Post-e組之間AMP、ADP、ATP、AN含量比較均無明顯差異(P＞0.05)。見表2。
表2 實驗各組心肌組織中高能磷酸化合物的含量比較Group AMP ADPATPANControl36.30±15.31 38.75±15.10 43.62±10.71 118.68±12.02A/R3.56±1.29△2.97±1.07△12.47±3.76△18.99±4.88△Pre-DS 8.77±2.40△※9.21±0.49△※42.07±8.13※60.05±9.25※Post-DS8.10±2.92△※8.45±2.23△※30.84±10.89※47.39±10.24※Pre-e 12.58±2.05△□13.62±1.48△※□59.29±10.31※□85.48±11.27△※□Post-e 11.89±1.53△☆12.74±1.67△※☆49.72±11.85※☆74.34±13.86△※☆△P＜0.01 vs control group；※P＜0.01vsA/R group；□P＜0.01 vs Pre-DS group；☆P＜0.01vsPost-DS group3.對外源性自由基所致心律失常的影響3.1實驗分組健康Wistar大鼠，體重250～300g，雌雄不限，隨機(jī)分組。用2％戊巴比妥鈉(0.2ml/100g體重)和1％肝素鈉(0.5ml/100g體重)同時腹腔注射。動物麻醉后，取仰臥位固定，開胸，在距主動脈起始部3～4mm處取下心臟，迅速放入預(yù)冷0℃灌流液中停跳，沖洗心腔和血管內(nèi)的殘留血液后，將心臟迅速移置到Langendorff灌流裝置進(jìn)行非循環(huán)不作功灌流，灌流壓0.82kPa。灌流液為Krebs-Henseleit緩沖液，其組成為(mmol/L)NaCl 118，KCl 4.7，MgSO4·7H2O 1.2，KH2PO41.2，NaHCO325.0，CaCl222.5，Glucose 11.0，pH7.4，滲透壓300mOsm/L。灌流前以95％O2+5％CO2混合氣平衡15min，灌流中持續(xù)通氣。在整個灌流過程中，用501型超級恒溫水浴器使灌流液保持在37℃。
3.1.1對照組(7例)離體心臟預(yù)灌15min后，灌流液中加入硫酸亞鐵(0.25mmol/L)/抗壞血酸(1.0mmol/L)持續(xù)灌注30min，觀察心電圖變化。
3.1.2實驗組(8例)灌流液中以5mg/L濃度加入β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸異丙酯預(yù)灌15min后，灌流液中加入硫酸亞鐵(0.25mmol/L)/抗壞血酸(1.0mmol/L)持續(xù)灌注30min，觀察心電圖變化。
3.2實驗結(jié)果以硫酸亞鐵(0.25mmol/L)/抗壞血酸(1.0mmol/L)作為外源性自由基生成系統(tǒng)可導(dǎo)致離體灌流大鼠心臟發(fā)生心律失常，在灌流液中預(yù)先加入β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸異丙酯可使外源性自由基生成系統(tǒng)所致的心律失常發(fā)生率明顯降低(見表3)。
表3 丹參素對外源性自由基生成系統(tǒng)所致心律失常的作用房室分離室性早搏 室速 室顫總心率失常分組(mg/L) 例數(shù)例數(shù) ％ 例數(shù)％ 例數(shù)％ 例數(shù)％ 例數(shù) ％對照組7571.4571.4342.7342.77 100實驗組8112.500 00 00 1※※12.5(5mg/L)與自由基組相比※P＜0.05※※P＜0.0權(quán)利要求
1.一種預(yù)防和治療心腦血管疾病的藥物，其特征在于，從丹參在人血清中的主要代謝產(chǎn)物中篩選出β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸異丙酯，其結(jié)構(gòu)為
2.一種預(yù)防和治療心腦血管疾病藥物β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸異丙酯的合成方法，其特征在于，合成方法包括以下步驟1)血清中丹參的代謝產(chǎn)物先在預(yù)柱中被富集除雜，再被反沖入分析柱進(jìn)行分離，流出物進(jìn)入質(zhì)譜，利用離子阱多級質(zhì)譜技術(shù)對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步確證；2)再按合成路線合成此化合物，配成溶液進(jìn)行質(zhì)譜分析，進(jìn)一步確證主要代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)；β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸異丙酯的合成方法 (1)乙酰甘氨酸的合成稱取氨基乙酸即甘氨酸15克，于400毫升燒杯中，加入蒸餾水60毫升，攪拌微熱溶解，冷卻至室溫，加入乙酸酐43克，冷卻至室溫后，放入冰箱過夜，抽濾得白色晶體；(2)Azlactone的合成在已固定的燒瓶中，加入醋酸鈉1.7g，加熱至熔融狀態(tài)微涼后，稱取苯甲醛0.8g和乙酰甘氨酸1.2g加入瓶中，安裝回流裝置并通水，再加入醋酸酐25ml混和，安裝干燥管，在100℃下攪拌反應(yīng)3h，溶液由黃色變?yōu)樽厣?，冷卻，放置，析出黃色針狀結(jié)晶；(3)β-(3，4-二乙酰氧基苯基)-α-乙酰氨基丙烯酸的合成在干燥的結(jié)晶中加入適量沸水100ml反應(yīng)4h，再加入適量活性炭脫色，煮沸0.5h，熱過濾，除去活性炭，減壓蒸餾除去水，加入適量無水乙醇溶解，抽濾，殘渣為醋酸鈉，收集濾液，減壓蒸餾除去乙醇，得白色結(jié)晶即為產(chǎn)品；(4)β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸的合成取結(jié)晶5.0g置于燒瓶中，加162mL水，18mL濃鹽酸和10克Zn-Hg齊，加熱沸騰反應(yīng)，維持浴溫使不斷有氫氣溢出，反應(yīng)7H，熱過濾，用7％NaHCO3(AR)溶液調(diào)節(jié)pH為5，減壓蒸餾至干，加入適量甲醇溶解，抽濾，濾液減壓蒸餾至干，沸水溶解，活性炭脫色后，在減壓蒸餾至干即得；(5)β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸異丙酯的合成在燒瓶中加入β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸0.76g，苯20ml，對甲苯磺酸0.1g和異丙醇3ml，連接回流冷凝管和分水器，加熱回流(66.5攝氏度，6小時)到不再有水份蒸出為止，減壓蒸餾除去苯和異丙醇，加入碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH為中性，加入乙酸乙酯反復(fù)萃取，減壓蒸餾除去乙酸乙酯得結(jié)晶。
3.β-(3，4-二羥基苯基)-α-羥基丙酸異丙酯用于預(yù)防和治療心腦血管疾病的藥物用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了丹參內(nèi)真正起到治療效果的有效成分及結(jié)構(gòu)及其合成，并用于治療心腦血管疾病。從丹參在人血清中的主要代謝產(chǎn)物中篩選出的β－(3，4－二羥基苯基)－α羥基丙酸異丙酯的結(jié)構(gòu)為上式，其合成純度達(dá)98.0％，研究結(jié)果證明該藥物具有較強(qiáng)的擴(kuò)張血管、抗腦缺血及體內(nèi)外抗氧化、保護(hù)心、腦及治療糖尿病所引起的缺血性心肌梗塞等生理作用。
文檔編號A61K31/216GK1583710SQ20041002620
公開日2005年2月23日 申請日期2004年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月3日
發(fā)明者鄭曉暉, 張延長, 王世祥, 趙新鋒 申請人:西安交通大學(xué)