專利名稱：人胎兒胰腺干細(xì)胞系及其建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)學(xué)科人類和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(組織)工程領(lǐng)域，涉及體外分離、純化及快速擴(kuò)增人類和哺乳動(dòng)物胰腺干細(xì)胞，特別涉及一種人胎兒胰腺干細(xì)胞系及其建立方法。
背景技術(shù)：
糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是危害人類健康的重大疾病之一，而傳統(tǒng)的藥物及胰島素替代療法不能從根本上醫(yī)治該病。近年來，隨著胰島移植技術(shù)的不斷完善，根治I型和部分II型糖尿病已成為可能(Shapiro et al.N Engl J Med.2000，27(4)230～238.)，而胰島供體短缺的矛盾亦更為突出。體外分離、克隆人類和哺乳動(dòng)物胰腺干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，并定向誘導(dǎo)其分化為功能性胰島是解決胰島供體短缺的有效途徑，但目前該研究尚處于起始階段。如Ramiya等(Nat Med.2000，6(3)278～282.)報(bào)道，采用膠原酶消化NOD小鼠胰腺，手工分離胰導(dǎo)管，由胰導(dǎo)管獲得的細(xì)胞經(jīng)無糖、高氨基酸培養(yǎng)可擴(kuò)增形成單層。用高糖培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)，這些細(xì)胞能產(chǎn)生小而圓的胰島祖細(xì)胞(isletprogenitor cells，IPCs)，繼續(xù)培養(yǎng)，這些小細(xì)胞擴(kuò)增形成胰島(IPC-derived islets)。RT-PCR擴(kuò)增表明，IPCs和IPC-derived islet轉(zhuǎn)錄胰島素I、II，胰島素受體，胰高血糖素等因子，也表達(dá)與胰島發(fā)育、分化有關(guān)的因子胰腸同源域1(pancreatic and duodenalhomeobox factor 1，PDX1)、β-半乳糖苷酶、酪氨酸羥化酶等；葡萄糖刺激IPC-derivedislet釋放胰島素；將300個(gè)IPC-derived islet移植在NOD成年小鼠腎囊區(qū)，可降低NOD小鼠血糖，抗糖尿病。但是，這類存在于NOD小鼠胰導(dǎo)管，能分化為分泌insulin細(xì)胞的干細(xì)胞還沒有最后證實(shí)和定性(Andreas等，Am J Physinol Metab.2003，284E259-E266.)。Bonner-Weir等(Sci Med.2000，97(14)7999～8004.)報(bào)道采用Ricordi法，V型膠原酶消化成人胰腺，密度梯度離心，獲取含胰導(dǎo)管上皮細(xì)胞較多的組織碎片，CMRL1066+10％胎牛血清(FBS)貼壁培養(yǎng)。部分上皮樣細(xì)胞形成單層后，改用無血清DMEM/F12+1g/L ITS(5mg/L胰島素+5mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白+5mg/L硒)+2g/L牛血清白蛋白+10mM煙酰胺+10ng/ml角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子+100U/ml青霉素+100ug/ml鏈霉素?cái)U(kuò)增培養(yǎng)上皮細(xì)胞。免疫組化染色顯示上皮細(xì)胞表達(dá)角質(zhì)蛋白19(CK19)，少量散在細(xì)胞表達(dá)insulin和PDX1蛋白；誘導(dǎo)培養(yǎng)，上皮細(xì)胞分化為雙硫腙(dithizone，DTZ)染色陽性且分泌胰島素的胰島細(xì)胞團(tuán)。但該研究仍屬于體外胰腺組織擴(kuò)增培養(yǎng)，并未純化出胰腺干細(xì)胞(Andreas等，Am J Physinol Metab.2003，284E259-E266.)。Zulewski等(Diabetes.2001，50521-533.)采用膠原酶分離大鼠或成人胰島，手工挑取胰島，RPMI1640+10％FBS+1mmol/LNaHCO3+抗霉素+71.5umolβ-巰基乙醇懸浮培養(yǎng)，96h后挑出懸浮胰島，RPMI1640+10％FBS+1mmol/LNaHCO3+抗霉素+71.5umolβ-巰基乙醇+20ng/mlbFGF+20ng/mlEGF貼壁培養(yǎng)。單層細(xì)胞形成后，免疫染色巢蛋白(nestin)陽性，其中，大鼠來源的nestin陽性表達(dá)細(xì)胞8.5個(gè)月擴(kuò)增了10倍；人源性nestin陽性表達(dá)細(xì)胞8個(gè)月擴(kuò)增了7倍。檢測(cè)nestin陽性細(xì)胞，不表達(dá)insulin、glucagon、somatostatin及CK19。而添加類胰高血糖素肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)等因子后(Abraham，EJ，et al.Endocrinology.2002，1433152-3161.)，這類細(xì)胞則表達(dá)insulin、glucagon及PDX1，且分泌insulin。但是，考慮到神經(jīng)、肌肉、間充質(zhì)及成年胰腺衛(wèi)星細(xì)胞也表達(dá)nestin，Andreas等認(rèn)為(Am J Physinol Metab.2003，284E259-E266.)該類細(xì)胞并不是胰腺特有的細(xì)胞，來源于胰島的nestin陽性細(xì)胞可能具有轉(zhuǎn)分化為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的潛能。
綜上所述，目前哺乳動(dòng)物胰腺干細(xì)胞還沒有完全定性，胰腺干細(xì)胞的分離、純化及擴(kuò)增方法均處于探索中，獲得的胰腺干細(xì)胞鑒定結(jié)果也不盡一致，世界范圍內(nèi)還沒有已建立人胎兒胰腺干細(xì)胞系的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人胎兒胰腺干細(xì)胞系及其建立方法，為研究哺乳動(dòng)物胰腺發(fā)育、糖尿病的產(chǎn)生以及再造胰島微小器官治療糖尿病提供豐富的種子細(xì)胞，并為建立人和哺乳動(dòng)物胰腺干細(xì)胞系提供一種有效、可靠的方法。
發(fā)明內(nèi)容具體包括1.人胎兒胰腺干細(xì)胞系經(jīng)多種方法鑒定，本發(fā)明分離克隆的人胎兒胰腺干細(xì)胞系具有以下特征1.1形態(tài)特征H.E染色(圖1)，人胎兒胰腺干細(xì)胞完全貼壁后呈多角形上皮樣，核多為圓形。Giemsa染色(圖2)，為單核仁、雙核仁或多核仁細(xì)胞。電鏡顯示(圖3)，細(xì)胞核質(zhì)比大，胞質(zhì)無分泌顆粒，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器均不發(fā)達(dá)，屬發(fā)育早期胰腺上皮樣細(xì)胞。
1.2生長(zhǎng)特性細(xì)胞數(shù)較少時(shí)，可見典型的單克隆生長(zhǎng)方式；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至75％融合時(shí)，呈鋪路石樣。生長(zhǎng)曲線表明(圖4)，在該培養(yǎng)條件下，細(xì)胞接種1～2d生長(zhǎng)緩慢，3～5d為細(xì)胞數(shù)倍增期。從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及1年以上擴(kuò)增細(xì)胞生長(zhǎng)情況看，該細(xì)胞為永生化人胎兒胰腺干細(xì)胞。
1.3免疫組化特征人胎兒胰腺干細(xì)胞表達(dá)核增殖抗原(PCNA，圖5)、胰腸同源域1(PDX1，圖6)、胰高血糖素(glucagon，圖7)、胰島素(Insulin，圖8)、角蛋白19(CK19，圖9)及巢蛋白(nestin，圖10)，而不表達(dá)分化抗原CD34、CD44及CD45蛋白。對(duì)照(圖11)。從蛋白表達(dá)水平證實(shí)本研究分離克隆的人胎兒胰腺干細(xì)胞具有分化為胰島、上皮及神經(jīng)細(xì)胞的多潛能性。
1.4 RT-PCR檢測(cè)人胎兒胰腺干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄胰腸同源域1(PDX1)、胰高血糖素(glucagon)及巢蛋白(nestin)(圖12)。從基因轉(zhuǎn)錄水平證實(shí)該細(xì)胞確是胰腺干細(xì)胞。
1.5定向誘導(dǎo)分化定向誘導(dǎo)人胎兒胰腺干細(xì)胞可分化為雙硫腙(DTZ)染色陽性的細(xì)胞團(tuán)(圖13)，且分泌胰島素和胰高血糖素。
1.6染色體核型分析傳至47代的人胎兒胰腺干細(xì)胞染色體數(shù)目為2n＝46，其中，中部著絲粒染色體有5對(duì)，臂比值為1.33±0.02～1.07±0.03；亞中部著絲粒染色體有7對(duì)，臂比值為3.18±0.03～1.45±0.07；端部著絲粒染色體有6對(duì)，小染色體有4對(duì)，性染色體1對(duì)。染色體核型正常(圖14A、14B)。
1.7線粒體DNA序列測(cè)定及分析提取人胎兒胰腺干細(xì)胞總DNA，進(jìn)行線粒體DNA(mtDNA)D-loop的PCR擴(kuò)增、測(cè)序，結(jié)果見圖15。采用Clustal W(1.82)軟件對(duì)所測(cè)的人胎兒胰腺干細(xì)胞與正常人細(xì)胞的mtDNA D-loop區(qū)序列進(jìn)行同源序列比對(duì)分析，同源性為98％。證明人胎兒胰腺干細(xì)胞是人源性胰腺干細(xì)胞。
2.建立人胎兒胰腺干細(xì)胞系的方法2.1分離培養(yǎng)原代人胎兒胰腺干細(xì)胞無菌采取4～6月齡正常流產(chǎn)胎兒胰腺組織，剪碎組織塊，采用0.1％IV型膠原酶消化分離胰腺組織；DMEM+10％NBS+0.08mg/ml青霉素--0.1mg/ml鏈霉素為基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)，獲得原代呈單克隆性生長(zhǎng)的上皮樣人胎兒胰腺干細(xì)胞及成纖維細(xì)胞(圖16)。
2.2純化人胎兒胰腺干細(xì)胞0.25％胰酶+0.04％EDTA消化傳代，傳代中逐漸消除成纖維細(xì)胞，獲得純化的呈克隆性生長(zhǎng)的上皮樣人胎兒胰腺干細(xì)胞(圖17)。
2.3快速克隆人胎兒胰腺干細(xì)胞采用DMEM+10％NBS+10ng/mlEGF+0.08mg/ml青霉素+0.1mg/ml鏈霉素培養(yǎng)液，快速擴(kuò)增已純化的人胎兒胰腺干細(xì)胞，獲得呈鋪路石樣生長(zhǎng)的大量人胎兒胰腺上皮樣干細(xì)胞(圖18)。通常，細(xì)胞接種1～2d后，即進(jìn)入倍增期。
2.4冷凍保存人胎兒胰腺干細(xì)胞冷凍以80％DMEM+10％二甲基椏楓(DMSO)+10％犢牛血清(NBS)為細(xì)胞基礎(chǔ)冷凍液，稀釋細(xì)胞至1×105，分裝于冷凍管。4℃平衡30min，液氮面上懸浮2h，投入液氮冷凍保存。
解凍取出冷凍細(xì)胞管，迅速投入36～38℃水浴中解凍。用培養(yǎng)液清洗解凍細(xì)胞2～3遍，脫去冷凍液，進(jìn)行培養(yǎng)。取少量細(xì)胞，經(jīng)胎盤藍(lán)染色檢測(cè)，細(xì)胞成活率達(dá)95％以上。
采用以上分離、純化、快速克隆及冷凍保存的方法，已獲得大量純化的人胎兒胰腺干細(xì)胞。其中，1例男性胎兒來源的胰腺干細(xì)胞已穩(wěn)定擴(kuò)增1年以上，傳50代，冷凍保存細(xì)胞數(shù)為1×109。


本說明書共有18幅附圖，其中圖1人胎兒胰腺干細(xì)胞H.E染色形態(tài)特征(×100)圖2人胎兒胰腺干細(xì)胞Giemsa染色形態(tài)特征(×400)圖3人胎兒胰腺干細(xì)胞電鏡形態(tài)特征(×4000×1.45)圖4人胎兒胰腺干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖5人胎兒胰腺干細(xì)胞核增殖抗原(PCNA)免疫染色陽性(×50)圖6人胎兒胰腺干細(xì)胞胰腸同源域1(PDX1)免疫染色陽性(×200)圖7人胎兒胰腺干細(xì)胞胰高血糖素(glucagon)免疫染色陽性(×200)圖8人胎兒胰腺干細(xì)胞胰島素(insulin)免疫染色陽性(×100)圖9人胎兒胰腺干細(xì)胞角蛋白19(CK19)免疫染色陽性(×100)圖10人胎兒胰腺干細(xì)胞巢蛋白(nestin)免疫染色陽性(×200)圖11人胎兒胰腺干細(xì)胞免疫染色對(duì)照(×50)圖12 RT-PCR，人胎兒胰腺干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄胰腸同源域1(PDX1)、胰高血糖素(glucagon)和巢蛋白(nestin)圖13定向誘導(dǎo)人胎兒胰腺干細(xì)胞分化為雙硫腙(DTZ)染色陽性的胰島細(xì)胞團(tuán)(×200)圖14A 47代人胎兒胰腺干細(xì)胞染色體(×400)圖14B 47代人胎兒胰腺干細(xì)胞染色體核型圖15人胎兒胰腺干細(xì)胞線粒體DNA序列圖16原代人胎兒胰腺干細(xì)胞單克隆性擴(kuò)增(×50)圖17純化的人胎兒胰腺干細(xì)胞克隆性擴(kuò)增(×50)圖18人胎兒胰腺干細(xì)胞呈鋪路石樣生長(zhǎng)(×100)
具體實(shí)施例方式
為了更清楚的理解本發(fā)明，以下結(jié)合發(fā)明人依上述技術(shù)方案完成的具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
1.建立人胎兒胰腺干細(xì)胞系1.1分離、克隆原代人胎兒胰腺干細(xì)胞無菌采取4～6月齡正常流產(chǎn)胎兒胰腺組織，用含雙抗(青霉素8萬U/ml，10萬U/ml)0.1M PBS(-)反復(fù)清洗5～6遍，剪碎組織塊至1mm3。0.1％IV型膠原酶(collegenIV，sigma)消化15～40min，鏡下見大量單個(gè)細(xì)胞時(shí)，終止消化。消化懸液經(jīng)0.2mm孔徑濾紗過濾，離心(1000r.p.m，5min)。棄上清，離心管內(nèi)細(xì)胞稀釋后接種于培養(yǎng)皿，加DMEM+10％NBS+0.08mg/ml青霉素+0.1mg/ml鏈霉素(DMEM，Sigma；NBS，自制；青霉素，鏈霉素，國(guó)產(chǎn))基礎(chǔ)培養(yǎng)液，CO2培養(yǎng)箱(5％CO2，飽和濕度，37℃)中培養(yǎng)，每二天換液一次。24h后，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，3～5d，見克隆性生長(zhǎng)的上皮樣細(xì)胞及成纖維細(xì)胞(圖16)。
1.2純化人胎兒胰腺干細(xì)胞當(dāng)上皮樣細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)成片后，0.1M PBS(-)清洗，0.25％胰酶+0.04％EDTA(tripsin、EDTA，Sigma)消化原代貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代，以DMEM+10％NBS+0.08mg/ml青霉素+0.1mg/ml鏈霉素為基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)，在傳代中逐漸消除成纖維樣細(xì)胞及其它雜細(xì)胞，獲得純化的呈克隆性生長(zhǎng)的上皮樣人胎兒胰腺干細(xì)胞(圖17)。
1.3快速克隆人胎兒胰腺干細(xì)胞0.25％胰酶+0.04％EDTA消化細(xì)胞，DMEM+10％NBS+10ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(EGF)+0.08mg/ml青霉素+0.1mg/ml鏈霉素(EGF，Sigma)貼壁培養(yǎng)人胎兒胰腺干細(xì)胞。以1×105的細(xì)胞密度接種7.5cm培養(yǎng)皿，通常3～4d純化的細(xì)胞生長(zhǎng)至75％融合，呈鋪路石樣(圖18)。
1.4冷凍保存人胎兒胰腺干細(xì)胞冷凍待純化胰腺干細(xì)胞生長(zhǎng)至75％融合時(shí)，0.1M PBS(-)清洗，以0.25％胰酶+0.04％EDTA消化細(xì)胞，加含有血清的培養(yǎng)液終止消化，離心，收集細(xì)胞。以80％DMEM+10％DMSO+10％NBS(DMSO，sigma)為基礎(chǔ)冷凍液，稀釋細(xì)胞至1×105，并分裝于冷凍管(0.5毫升/管)。4℃平衡30min，液氮面上懸浮2h，投入液氮保存。
解凍取出冷凍細(xì)胞管，迅速投入36～38℃水域中解凍。用培養(yǎng)液清洗解凍細(xì)胞2～3遍，脫去冷凍液，進(jìn)行培養(yǎng)。取少量細(xì)胞，經(jīng)胎盤藍(lán)染色檢測(cè)成活率。
采取以上分離、純化、快速擴(kuò)增及冷凍保存方法，已獲得大量純化的人胎兒胰腺干細(xì)胞。其中，1例男性胎兒來源的胰腺干細(xì)胞已穩(wěn)定擴(kuò)增1年以上，傳50代，冷凍保存細(xì)胞數(shù)達(dá)1×109。
2.人胎兒胰腺干細(xì)胞系的鑒定經(jīng)多種方法鑒定，本發(fā)明分離克隆的人胎兒胰腺干細(xì)胞系具有以下特征2.1形態(tài)特征H.E染色人胎兒胰腺干細(xì)胞完全貼壁后呈多角形上皮樣，核多為圓形(圖1)。染色方法參照司徒振強(qiáng)，吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)[M].世界圖書出版公司，1996。略。
Giemsa染色人胎兒胰腺干細(xì)胞為單核仁、雙核仁或多核仁細(xì)胞(圖2)。染色方法參照司徒振強(qiáng)，吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)[M].世界圖書出版公司，1996。略。
電鏡細(xì)胞核質(zhì)比大，胞質(zhì)無分泌顆粒，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器均不發(fā)達(dá)，屬于發(fā)育早期胰腺細(xì)胞(圖3)。
電鏡制片方法當(dāng)胰腺干細(xì)胞生長(zhǎng)至75％融合時(shí)，0.1M PBS(-)清洗，用細(xì)胞刮刮下貼壁生長(zhǎng)上皮樣細(xì)胞，離心(1000r.p.m，10min)，棄上清，加2.5％戊二醛電鏡固定液，4℃過夜。0.1M PBS(-)淋洗，酒精脫水，環(huán)氧丙烷淋洗，環(huán)氧樹脂(Sigma)包埋，60℃聚合過夜。2μm切片，甲苯胺藍(lán)染色。80nm超薄切片，醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色，PhilipsCM10電鏡觀察。
2.2生長(zhǎng)曲線生長(zhǎng)曲線(圖4)測(cè)定結(jié)果表明，人胎兒胰腺干細(xì)胞接種1～2d生長(zhǎng)緩慢，3～5d為細(xì)胞數(shù)倍增期。從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及1年以上細(xì)胞擴(kuò)增生長(zhǎng)情況看，該細(xì)胞為永生化人胎兒胰腺干細(xì)胞。
生長(zhǎng)曲線測(cè)定方法參照司徒振強(qiáng)，吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)[M].世界圖書出版公司，1996。略。
2.3免疫組化染色免疫組化染色顯示人胎兒胰腺干細(xì)胞表達(dá)核增殖抗原(PCNA)(圖5)、胰腸同源域1(PDX1)(圖6)、胰高血糖素(glucagon)(圖7)、胰島素(Insulin)(圖8)、角蛋白19(CK19)(圖9)及巢蛋白(nestin)(圖10)，不表達(dá)分化抗原CD34、CD44、CD45蛋白。對(duì)照(圖11)。
采用SP(Streptavidin/Peroxidase，免疫組化染色試劑盒，北京中山生物技術(shù)有限公司)法檢測(cè)。人胎兒胰腺干細(xì)胞生長(zhǎng)至75％融合時(shí)，棄培養(yǎng)液，0.1M PBS(-)沖洗3遍，4％多聚甲醛固定10min。0.1M PBS(-)沖洗3遍，3％H2O2作用10min以消除內(nèi)源性過氧化物酶。蒸餾水沖洗1遍，0.1M PBS(-)浸泡5min，滴加正常山羊血清工作液(SP-9000)，室溫孵育15min封閉。加一抗(1∶500稀釋的兔多抗PDX1抗體，1∶2000稀釋的小鼠單抗glucagon抗體，1∶100稀釋的豚鼠抗牛insulin抗體，以及1∶50稀釋的小鼠抗人CK19抗體，Sigma；小鼠單抗PCNA抗體工作液，1∶100稀釋的兔抗小鼠nestin抗體，小鼠抗人CD34抗體工作液，小鼠抗人CD44抗體工作液，以及小鼠抗人CD45抗體工作液，武漢博士德生物工程有限公司)，4℃過夜。0.1M PBS(-)洗滌5min，3次，滴加通用型生物素標(biāo)記羊抗小鼠IgG(SP-9000)，37℃孵育15min。0.1M PBS(-)洗滌5min，3次，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37℃孵育15min。0.1M PBS(-)洗滌5min，3次，滴加顯色劑DAB(ZLI-9033)顯色，Leica鏡下觀察，照相。對(duì)照組一抗用0.1M PBS(-)代替。
2.4 RT-PCRRT-PCR法檢測(cè)，人胎兒胰腺干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄胰腸同源域1(Pd×1)、胰高血糖素(glucagon)及巢蛋白(nestin)(圖12)。RT-PCR方法如下提取細(xì)胞總RNA傳23代的人胎兒胰腺干細(xì)胞生長(zhǎng)至75％融合時(shí)，棄培養(yǎng)液，用0.1MPBS(-)洗滌1次，加1ml Trizol分離液(劑量為1ml/10cm2培養(yǎng)皿，Sigma)，吹打混勻，室溫下靜置5分鐘，使核蛋白完全裂解，移入2ml微量離心管。加200ul三氯甲烷(劑量為200ul三氯甲烷/1mlTrizol)，蓋好微量離心管，上下混勻15秒，室溫靜置培養(yǎng)2～3分鐘低溫離心(12000g，15min，4℃)，分層。將液層移入另一微量離心管，加0.5ml異丙醇(劑量為0.5ml異丙醇/1mlTrizol)，吹打混勻，室溫下靜置培養(yǎng)10分鐘，形成沉淀顆粒，低溫離心(12000g，10min，4℃)。離心管棄液，加75％乙醇1ml(無水乙醇750ul，無核酶水250ul，)，劇烈旋轉(zhuǎn)震蕩使沉淀浮起，洗RNA，低溫離心(7500g，5min，4℃)。棄液，室溫干燥10min。利用電泳儀分離RNA，成相儀上觀察其濃度和純度。
反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增 取1ug(2ul)已測(cè)定RNA放入微量離心管，70℃水浴10分鐘，短暫旋轉(zhuǎn)振蕩，置冰上。
反應(yīng)體系成分劑量Mgcl2，25mM4.0ulReverse Transcription 10×Buffer2.0uldNTP，10mM 2.0ulRecombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor 0.5ulAMV Reverse Transcriptase 0.3ulOligo(dT)15Primer 1.0ulTotal RNA 2.0ulNuclease-Free Water 8.2ul
共計(jì)20.0ul注所用試劑均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。置20ul反應(yīng)管于42℃培養(yǎng)1小時(shí)。95℃加熱5分鐘，4℃培養(yǎng)5分鐘，-20℃貯藏cDNA。
PCR擴(kuò)增(1)設(shè)計(jì)引物根據(jù)基因庫(kù)中人胰腸同源域1(Pd×l)、胰高血糖素(glucagon)及巢蛋白(nestin)序列設(shè)計(jì)引物。稀釋引物，-20℃貯藏。
胰腸同源域1(PDX1，441bp)引物正鏈引物L(fēng) 5’-TGGCGCACCTTCACCACCAC-3’反鏈引物H 5’-CCTGCTCAGGCTCCGCGACC-3’胰高血糖素(glucagon，353bp)引物正鏈引物L(fēng) 5’-AGCATTTACTTTGTGGCTGG-3’反鏈引物H 5’-ATGAATTCCTTGGCAGCTTG-3’巢蛋白(nestin，334bp)引物正鏈引物L(fēng) 5’-TTCTGTGAGTGTCAGTGTCC-3’反鏈引物H 5’-CTCAGAGACTAGCGGCATTC-3’(2)PCR反應(yīng)體系成分劑量first-strand cDNA reaction 5.0uldNTP，10mM 1.0ulMgcl2，25mM3.5ulReverse Transcription 10×Buffer5.0ul正鏈引物L(fēng) 0.5ul反鏈引物H 0.5ulTaq DNA Polymerase 1.0ul雙蒸水 33.5ul共計(jì)50.0ul注所用試劑均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。
加好后，每管滴1滴石蠟油(約10ul)，防于燥。稍作離心(1000r.p.m，5min)。
(3)PCR反應(yīng)條件胰腸同源域1(PDX1)，94℃變性2min，然后93℃變性1min，60℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，循環(huán)40次，最后，72℃再延伸10min。
胰高血糖素(glucagon)，94℃變性2min，然后93℃變性1min，50℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，循環(huán)40次，最后，72℃再延伸10min。
巢蛋白(nestin)，94℃變性2min，然后93℃變性1min，55℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，循環(huán)40次，最后，72℃再延伸10min。
1.0％瓊脂糖凝膠電泳利用電泳儀分離反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增片段，成相儀上觀察，照相。
2.5定向誘導(dǎo)分化為功能性胰島人胎兒胰腺干細(xì)胞可定向誘導(dǎo)分化為雙硫腙(DTZ)染色陽性的細(xì)胞團(tuán)(圖13)，且分泌glucagon和insulin。
定向誘導(dǎo)方法參照Ramiya等(Nat Med，2000，6(3)278-282.)的方法并加以改進(jìn)。人胎兒胰腺干細(xì)胞接種后擴(kuò)增培養(yǎng)2d，換用誘導(dǎo)液DMEM+10％NBS+10mM煙酰胺+0.08mg/ml青霉素+0.1mg/ml鏈霉素(煙酰胺，nicotinamide，Sigma)連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)25d。
雙硫腙染色方法參照Shiroi等(Stem Cells，200220284-292)。人胎兒胰腺干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)25d，見大量類胰島細(xì)胞團(tuán)時(shí)，進(jìn)行DTZ染色。稱0.01g DTZ(sigma)溶于1ml DMSO，-15℃保存，作為貯備液。取貯備液按1∶100稀釋入培養(yǎng)液作為工作液。誘導(dǎo)細(xì)胞棄原培養(yǎng)液，0.1M PBS(-)洗3遍，加入DTZ工作液，37℃，孵育15min。0.1MPBS(-)洗3遍，Leica鏡下觀察，照相。棄染色液，加原誘導(dǎo)培養(yǎng)液，24h后紅色消失。
采用放射免疫法(RIA)測(cè)定胰島素(insulin)和胰高血糖素(glucagon)(胰島素和胰高血糖素放射免疫分析藥盒，北京北方生物技術(shù)研究所)。
傳至19代的人胎兒胰腺干細(xì)胞接種6孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為3×104。細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)2d后換用誘導(dǎo)液DMEM+10％NBS+10mM煙酰胺+0.08mg/ml青霉素+0.1mg/ml鏈霉素連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)25d。棄誘導(dǎo)液，0.1M PBS(-)洗3遍，每孔加無血清DMEM 1ml，37℃，孵育2h。收集培養(yǎng)液，離心(2000r.p.m，10min)，收集上清液。-20℃保存，用于測(cè)定激素。測(cè)定結(jié)果計(jì)算平均數(shù)，insulin釋放量為7.27uIU/ml，glucagon釋放量為49.72pg/ml。
2.6染色體核型分析傳至47代的人胎兒胰腺干細(xì)胞染色體數(shù)目為2n＝46，其中，中部著絲粒染色體有5對(duì)，臂比值為1.33±0.02～1.07±0.03；亞中部著絲粒染色體有7對(duì)，臂比值為3.18±0.03～1.45±0.07；端部著絲粒染色體有6對(duì)，小染色體有4對(duì)，性染色體1對(duì)。染色體核型正常(圖14A、14B)。
核型分析方法參照高錦聲等編著.人類染色體方法學(xué)手冊(cè).江蘇省醫(yī)學(xué)情報(bào)研究所，1982.
27代的人胎兒胰腺干細(xì)胞按3×105個(gè)/ml的密度接種于Φ6cm培養(yǎng)皿中，貼壁培養(yǎng)72h。用終濃度為0.2μg/ml的秋水仙素(Sigma)處理3h，使多數(shù)細(xì)胞染色體停于中期分裂相。0.25％胰酶消化細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)液中和，離心，收集細(xì)胞。加1～2ml 0.075M KCl，37℃恒溫水浴下低滲處理25min。加1ml甲醇-冰醋酸固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1，現(xiàn)用現(xiàn)配)，用吸管吹打混勻，再加入3ml固定液，靜置10min，離心(1000r.p.m，5min)。反復(fù)固定2～3次，時(shí)間控制在50分鐘左右。制片、染色、鏡檢。40倍鏡下選擇分散良好的染色體照相。核型分析，求出臂比值、相對(duì)長(zhǎng)度，并根據(jù)所測(cè)數(shù)據(jù)，結(jié)合目測(cè)，按染色體形態(tài)、大小、臂比值、長(zhǎng)度是否相等進(jìn)行同源染色體配對(duì)。掃描。
2.7線粒體DNA序列測(cè)定及分析提取人胎兒胰腺干細(xì)胞總DNA，進(jìn)行線粒體DNA(mtDNA)D-loop的PCR擴(kuò)增、測(cè)序，結(jié)果見圖15。采用Clustal W(1.82)軟件對(duì)所測(cè)的人胎兒胰腺干細(xì)胞與正常人細(xì)胞的mtDNA D-loop區(qū)序列進(jìn)行同源序列比對(duì)分析，同源性為98％。證明本研究分離克隆的人胎兒胰腺干細(xì)胞是人源性胎兒胰腺干細(xì)胞。具體方法如下提取人胎兒胰腺干細(xì)胞總DNA按照酚-氯仿法進(jìn)行DNA提取。傳26代的人胎兒胰腺干細(xì)胞生長(zhǎng)至75％融合時(shí)，0.25％胰酶+0.04％EDTA消化，收集細(xì)胞，加PBS(-)懸浮細(xì)胞于50ml離心管。室溫，3500g，離心15min。棄上清液。沉淀物中加入3.5ml提取液使其懸浮，37℃水浴1h。加入25μl 20mg/ml的蛋白酶K(Sigma)并混勻，60～65℃恒溫箱中溫育3h。加入1倍體積酚(pH 8.0)，置旋轉(zhuǎn)搖床口底晃動(dòng)10～30min。5000g，4℃，離心20min。移上面水相于另一離心管中，加0.5倍體積酚和0.5倍體積氯仿，口底搖動(dòng)10min。5000g，4℃，離心15min。移上面水相至另一離心管中，加1倍體積氯仿，口底搖動(dòng)10min。5000g，4℃，離心15min。移上面水相至另一離心管中。加0.2倍體積醋酸銨，置冰上。加2倍體積冰冷無水乙醇，輕輕口底上下晃動(dòng)多次，直到DNA析出。然后冰上放置10～30min。用一玻璃鉤將白色DNA團(tuán)鉤出，放進(jìn)一個(gè)1.5ml的離心管中，加入500μl 70％乙醇并晃動(dòng)。5000g，離心3～5min。傾倒出乙醇，空氣干燥4～5h。根據(jù)DNA的量，加入500～1000μl TE-緩沖液，保存于4℃過夜，使其完全溶解，-80℃保存。
瓊脂糖檢測(cè)總DNA取10μl總DNA，在含有EB(終濃度為0.5μg/ml)的1.0％瓊脂糖凝膠溶液中，55V，電泳1h，并經(jīng)熒光掃描儀檢測(cè)。
線粒體DNA(mtDNA)D-loop的PCR擴(kuò)增(1)引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物為人的特異性引物，引物設(shè)計(jì)參考(Vigilant L，et al.Proc Natl Acad Sci，USA.1989，869350-9354)。引物序列為
正鏈引物L(fēng)159965’-CTCCACCATTATCACCCAAAGC-3’反鏈引物H164015’-TGATTTCACGGAGGATGGTG-3’(2)PCR反應(yīng)體系成分 劑量10×Buffer 5.0μldNTPs，2.5mM 5.0μlMgcl2，25mM 5.0μlTaq酶(5U/μl)0.5μl引物L(fēng)15996(100ng/μl)2.0μl引物H16401(100ng/μl)2.0μlDNA(50ng/μl)4.0μl純水 26.5μl總體積 50.0μl注所用試劑均為上海生工生物工程公司產(chǎn)品。
(3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件94℃變性2min，然后93℃變性1min，58℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，循環(huán)7次，93℃變性1min，54℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，循環(huán)25次，最后，72℃再延伸10min。
純化與回收PCR產(chǎn)物1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小、純度及亮度。用Omega公司(美國(guó))回收試劑盒純化與回收PCR產(chǎn)物。
線粒體DNA的測(cè)序及分析純化與回收后的PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。引物序列為引物1，L159965’-CTCCACCATTATCACCCAAAGC-3’；引物2，H164015’-TGATTTCACGGAGGATGGTG-3’。結(jié)果見圖15。
利用Clustal W(1.82)軟件對(duì)所測(cè)的mtDNA D-loop區(qū)序列進(jìn)行同源序列比對(duì)分析，人胎兒胰腺干細(xì)胞與正常人細(xì)胞的mtDNA D-loop區(qū)序列同源性為98％。
>人胎兒胰腺干細(xì)胞D-loop
CAGATTTGGGTACCACCCAAGTATTGACTCACCCATCAACAACCGCTATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATCGTACGGTACCATAAATACTTGACCACCTGTAGTACATAAAAACCCAATCCACATCAAAACCCCCTCCCCATGCTTACAAGCAAGTACAGCAATCAACCTTCAACTATCACACATCAACTGCAACTCCAAAGCCACCCCTCACCCACTAGGATATCAACAAACCTACCCACCCTTAACAGTACATAGTACATAAAGCCATTTACCGTACATAGCACATTACAGTCAAATCCCTTCTCGCCCCCATGGATGACCCCCCTCAGATAGGGGTCCCTTGACCACCATCCTCCG>正常人D-loopcagatttggg taccacccaa gtattgactc acccatcaac aaccgctatg tatttcgtac attactgccagccaccatga atattgtacg gtaccataaa tacttgacca cctgtagtac ataaaaaccc aacccacatcaaaccccccc cccccatgct tacaagcaag tacagcaatc aaccttcaac tatcacacat caactgcaactccaaagcca cccctcaccc actaggatac caacaaacct acccaccctt aacagtacat agtacataaagtcatttacc gtacatagca cattacagtc aaatcccttc tcgtccccat ggatgacccc cctcagataggggtcccttg accaccatcc tccgSequence 1人胎兒胰腺干細(xì)胞 373bp；Sequence 2正常人374bp；Sequences(1∶2)Aligned.Score98
權(quán)利要求
1.人胎兒胰腺干細(xì)胞系，其特征在于，人胎兒胰腺上皮樣干細(xì)胞來源于正常流產(chǎn)胎兒胰腺組織，體外培養(yǎng)能無限克隆，且具有多向分化潛能；具體包括1)形態(tài)特征H.E染色，人胎兒胰腺干細(xì)胞完全貼壁后呈多角形上皮樣，核多為圓形；Giemsa染色，為單核仁、雙核仁或多核仁細(xì)胞；電鏡，細(xì)胞核質(zhì)比大，胞質(zhì)無分泌顆粒，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器均不發(fā)達(dá)，屬發(fā)育早期胰腺細(xì)胞；2)生長(zhǎng)特性細(xì)胞數(shù)較少時(shí)，可見典型的單克隆生長(zhǎng)方式；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至75％融合時(shí)，呈鋪路石樣；在該培養(yǎng)條件下，細(xì)胞接種1～2d生長(zhǎng)緩慢，3～5d為細(xì)胞數(shù)倍增期；從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及1年以上細(xì)胞擴(kuò)增生長(zhǎng)情況看，該細(xì)胞系為永生化人胎兒胰腺干細(xì)胞系；3)免疫組化特征人胎兒胰腺干細(xì)胞表達(dá)核增殖抗原、胰腸同源域1、胰高血糖素、胰島素、角蛋白19及巢蛋白，不表達(dá)分化抗原CD34、CD44及CD45，從蛋白表達(dá)水平證實(shí)人胎兒胰腺干細(xì)胞具有分化為胰島、上皮及神經(jīng)細(xì)胞多潛能性；4)RT-PCR特征人胎兒胰腺干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表達(dá)胰腸同源域1、胰高血糖素及巢蛋白，從分子轉(zhuǎn)錄水平證實(shí)該細(xì)胞確是胰腺干細(xì)胞；5)定向誘導(dǎo)分化特征定向誘導(dǎo)人胎兒胰腺干細(xì)胞可分化為雙硫腙染色陽性，且分泌胰島素和胰高血糖素的功能性胰島細(xì)胞團(tuán)；6)染色體核型傳至47代的人胎兒胰腺干細(xì)胞染色體數(shù)目為2n＝46，其中，中部著絲粒染色體有5對(duì)，臂比值為1.33±0.02～1.07±0.03；亞中部著絲粒染色體有7對(duì)，臂比值為3.18±0.03～1.45±0.07；端部著絲粒染色體有6對(duì)，小染色體有4對(duì)，性染色體1對(duì)；染色體核型正常；7)DNA序列測(cè)定及分析提取人胎兒胰腺干細(xì)胞總DNA，進(jìn)行線粒體DNA D-loop的PCR擴(kuò)增、測(cè)序；采用Clustal W 1.82軟件對(duì)所測(cè)的人胎兒胰腺干細(xì)胞與正常人細(xì)胞的線粒體DNA D-loop區(qū)序列進(jìn)行同源序列比對(duì)分析，同源性為98％；證明該胎兒胰腺干細(xì)胞是人源性胎兒胰腺干細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的人胎兒胰腺干細(xì)胞系，其特征在于，所述定向誘導(dǎo)分化方法是將人胎兒胰腺干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)2d后，換用誘導(dǎo)液DMEM+10％NBS+10mM煙酰胺+0.08mg/ml青霉素+0.1mg/ml鏈霉素，連續(xù)定向誘導(dǎo)培養(yǎng)25d；檢測(cè)，形成雙硫腙染色陽性，且分泌胰島素和胰高血糖素的功能性胰島細(xì)胞團(tuán)。
3.如權(quán)利要求1所述的人胎兒胰腺干細(xì)胞系，其特征在于，通過設(shè)計(jì)以下PCR引物片段及反應(yīng)條件，RT-PCR檢測(cè)到該胰腺干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表達(dá)胰腸同源域1、胰高血糖素及巢蛋白；1)胰腸同源域1(PDX1，441bp)引物正鏈引物L(fēng) 5’-TGGCGCACCTTCACCACCAC-3’反鏈引物H 5’-CCTGCTCAGGCTCCGCGACC-3’PCR反應(yīng)條件94℃變性2min，然后93℃變性1min，60℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，循環(huán)40次，最后，72℃再延伸10min；2)胰高血糖素(glucagon，353bp)引物正鏈引物L(fēng) 5’-AGCATTTACTTTGTGGCTGG-3’反鏈引物H 5’-ATGAATTCCTTGGCAGCTTG-3’PCR反應(yīng)條件94℃變性2min，然后93℃變性1min，50℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，循環(huán)40次，最后，72℃再延伸10min；3)巢蛋白(nestin，334bp)引物正鏈引物L(fēng) 5’-TTCTGTGAGTGTCAGTGTCC-3’反鏈引物H 5’-CTCAGAGACTAGCGGCATTC-3’PCR反應(yīng)條件94℃變性2min，然后93℃變性1min，55℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，循環(huán)40次，最后，72℃再延伸10min。
4.一種如權(quán)利要求1所述的人胎兒胰腺干細(xì)胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步驟1)分離培養(yǎng)原代人胎兒胰腺干細(xì)胞無菌采取4～6月齡正常流產(chǎn)胎兒胰腺組織，剪碎組織塊，采用0.1％IV型膠原酶消化分離胰腺組織；DMEM+10％NBS+0.08mg/ml青霉素+0.1mg/ml鏈霉素為基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)，獲得原代呈單克隆性生長(zhǎng)的上皮樣人胎兒胰腺干細(xì)胞及成纖維細(xì)胞；2)純化人胎兒胰腺干細(xì)胞0.25％胰酶+0.04％EDTA消化傳代，傳代中逐漸消除成纖維細(xì)胞，獲得純化的呈克隆性生長(zhǎng)的上皮樣人胎兒胰腺干細(xì)胞；3)快速克隆人胎兒胰腺干細(xì)胞采用DMEM+10％NBS+10ng/mlEGF+0.08mg/ml青霉素+0.1mg/ml鏈霉素培養(yǎng)液，快速擴(kuò)增已純化的人胎兒胰腺干細(xì)胞，獲得呈鋪路石樣生長(zhǎng)的大量人胎兒胰腺上皮樣干細(xì)胞；通常，細(xì)胞接種1～2d后，即進(jìn)入倍增期；4)冷凍保存人胎兒胰腺干細(xì)胞冷凍以80％DMEM+10％DMSO+10％NBS為細(xì)胞基礎(chǔ)冷凍液，稀釋細(xì)胞至1×105，并分裝于冷凍管。4℃平衡30min，液氮面上懸浮2h，投入液氮冷凍保存；解凍取出冷凍細(xì)胞管，迅速投入36～38℃水浴中解凍，用培養(yǎng)液清洗解凍細(xì)胞2～3遍，脫去冷凍液，進(jìn)行培養(yǎng)；取少量細(xì)胞，經(jīng)胎盤藍(lán)染色檢測(cè)，細(xì)胞成活率達(dá)95％以上。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人胎兒胰腺干細(xì)胞系及其建立方法，人胎兒胰腺上皮樣干細(xì)胞來源于正常流產(chǎn)胎兒胰腺組織，體外培養(yǎng)能無限克隆，且具有多向分化潛能；經(jīng)形態(tài)特征、生長(zhǎng)特性、免疫組化特征、RT－PCR特征、定向誘導(dǎo)分化特征、染色體核型、DNA序列測(cè)定及分析，證明該胎兒胰腺干細(xì)胞是人源性胎兒胰腺干細(xì)胞；本發(fā)明可為研究哺乳動(dòng)物胰腺發(fā)育、糖尿病的產(chǎn)生以及再造胰島微小器官治療糖尿病提供豐富的種子細(xì)胞，為建立人和哺乳動(dòng)物胰腺干細(xì)胞系提供了一種有效可靠的方法。
文檔編號(hào)A61K35/39GK1611598SQ20041002613
公開日2005年5月4日 申請(qǐng)日期2004年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月17日
發(fā)明者效梅, 竇忠英, 安立龍 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)