專利名稱：一種靶向防齲dna疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于口腔預(yù)防醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種編碼人細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4信號肽、胞外區(qū)的序列和Igγ1鉸鏈區(qū)、恒定區(qū)融合基因以及變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因的DNA防齲疫苗，本發(fā)明還涉及一種所述的靶向防齲DNA疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
齲病是一種嚴(yán)重危害人類口腔和全身健康的口腔常見病、多發(fā)病。因齲齒造成的功能喪失、炎癥、疼痛以及牙源性病灶所致臟器疾病可嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，降低人口健康素質(zhì)，給社會(huì)帶來巨大危害。齲病是細(xì)菌感染性疾病，而變形鏈球菌(下稱變鏈菌，Streptococcus mutans)是主要的致齲菌。變鏈菌能夠與牙面緊密粘附并定植于牙面，產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物，引起牙齒脫礦最終導(dǎo)致齲齒。葡糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyltransferaes GTFs)是變形鏈球菌的重要致齲毒力因子。GTFs合成葡聚糖并介導(dǎo)變形鏈球菌在牙面的葡聚糖依賴性粘附。GTFs包含有兩個(gè)免疫活性區(qū)和功能區(qū)催化功能區(qū)(catalytic region CAT)和葡聚糖結(jié)合區(qū)(glucan bindingregion GLU)。能夠合成葡聚糖，使變鏈菌憑借能夠與葡聚糖緊密結(jié)合的菌體表面結(jié)合型葡糖基轉(zhuǎn)移酶和葡聚糖結(jié)合蛋白與牙面更加緊密結(jié)合。變形鏈球菌主要合成三種GTFsGTF-I、GTF-SI、GTF-S，其中GTF-I主要合成以α-1，3糖苷鍵為主的水不溶性葡聚糖，其編碼基因?yàn)間tfB。
Taubman等人將根據(jù)Streptococcus downei的GTF-I催化功能區(qū)的448-457氨基酸序列合成的短肽CAT和葡聚糖結(jié)合功能區(qū)的1303-1324氨基酸序列合成的短肽GLU與完全弗氏佐劑混合后免疫SD大鼠能夠引起明顯的血清和唾液抗Streptococcus sobrinus葡糖基轉(zhuǎn)移酶抗體(Taubman，M.A.，D.J.Smith，C.J.Holmberg，and J.W.Eastcott.2000.Coimmunization with complementaryglucosyltransferase peptides results in enhanced immunogenicity and protectionagainst dental caries.Infect Immun 682698-703.)。宋長征等根據(jù)變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶的葡聚糖結(jié)合區(qū)和蔗糖結(jié)合區(qū)(催化區(qū))的保守氨基酸序列設(shè)計(jì)了27個(gè)氨基酸短肽，與弗氏佐劑混合后免疫機(jī)體后可有效誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，其免疫血清不僅拮抗GTF酶活性，而且明顯抑制了體外變鏈菌與試管壁的黏附能力(宋長征，趙建等，葡糖基轉(zhuǎn)移酶合成肽疫苗的免疫原性研究，中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2002，37(60)459-462)。Jespersgaard克隆表達(dá)了gtfB基因中的催化活性區(qū)(CAT)和葡聚糖結(jié)合區(qū)(GLU)，將CAT和GLU多肽以鼻內(nèi)滴注免疫小鼠誘導(dǎo)了明顯的粘膜IgA免疫反應(yīng)；分別免疫兔后，所獲得的抗CAT抗體能明顯抑制了變形鏈球菌和茸毛鏈球菌的GTFS合成水不溶性葡聚糖，而抗GLU抗體顯示了較抗CAT抗體更強(qiáng)的抑制變形鏈球菌的GTFS合成水不溶性葡聚糖的能力。(Jespersgaard，C.，G.Hajishengallis，T.E.Greenway，D.J.Smith，M.W.Russell，andS.M.Michalek.1999.Functional and immunogenic characterization of two clonedregions of Streptococcus mutans glucosyltransferase I.Infect Immun 67810-6.)。
然而以上的各種防齲多肽疫苗存在許多不足之處，首先是這些多肽制備純化困難，一般需耗時(shí)數(shù)周且費(fèi)用昂貴，保存需要特殊條件；其次，多肽防齲疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)的能力較差，常需添加各種對人體有害的免疫佐劑；多肽防齲疫苗與其它多肽疫苗一樣，誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間一般較短，需反復(fù)多次接種才能達(dá)到較滿意的效果；另外多肽疫苗一般不能誘導(dǎo)嬰幼兒產(chǎn)生免疫反應(yīng)。(Kowalczyk DW，Ertl HCJ.1999.Immune responses to DNA vaccines.Cell.Mol.Life Sci.，55751-770)。
隨著DNA疫苗的發(fā)展，樊明文等學(xué)者將編碼變形鏈球菌表面蛋白PAc的A區(qū)和P區(qū)基因克隆至真核表達(dá)載體pCI中，構(gòu)建了防齲DNA疫苗pCIA-P，免疫大鼠，可以在血清和唾液中檢測到特異性抗體，同時(shí)證明能有效防齲(樊明文，邊專，彭志翔等。編碼PAc結(jié)構(gòu)基因的DNA疫苗免疫動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)研究。中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2002；37(1))。其后，為了提高DNA疫苗的免疫效能，將擴(kuò)增出的編碼變形鏈球菌GS-5株葡糖基轉(zhuǎn)移酶GTF-I的基因gtfB的葡聚糖結(jié)合區(qū)的序列GLU克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pCIA-P中獲得pGLUA-P融合防齲DNA疫苗。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)防齲效果優(yōu)于pCIA-P(賈榮，樊明文，邊專等。GTF-PAc融合防齲D NA疫苗研究(III)pGLUA-P免疫定菌鼠防齲研究?？谇会t(yī)學(xué)縱橫雜志2002；18(1)3)。也有學(xué)者構(gòu)建了以pcDNA3為載體的編碼葡糖基轉(zhuǎn)移酶GTF-I的基因gtfB序列防齲DNA疫苗，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可以檢測到特異性抗體。(楊錦波，周學(xué)東，劉天佳，變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶真核表達(dá)質(zhì)粒PcDNA3-gtfB的構(gòu)建，華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2001；19(4)249-252)但是，防齲DNA疫苗和其他DNA疫苗一樣依舊面臨如何提高免疫效能的問題。
CTLA4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA4)，又稱CD152，是免疫球蛋白超家族的一員。它主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞表面，亦可表達(dá)于CTL細(xì)胞。CTLA4結(jié)構(gòu)基因包括四個(gè)外顯子，分別編碼先導(dǎo)序列、胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞漿區(qū)四個(gè)獨(dú)立的功能區(qū)，其胞外區(qū)包含一個(gè)Ig的V樣功能區(qū)，側(cè)翼與兩個(gè)疏水區(qū)相接，其中一個(gè)可以將CTLA4錨定在細(xì)胞膜上。研究表明CTLA4與表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞(APC)表面的CD80和CD86分子有很強(qiáng)的結(jié)合能力，是另一配體CD28的10～100倍(Ostrov DA，Shi W，Schwartz JCD，et al.Structure ofMurine CTLA-4 and its role in modulating T cell responsiveness.Science，2000，290(27)816～819)。1998年澳大利亞學(xué)者Boyle等研究了結(jié)合有CTLA4基因片段的DNA疫苗并免疫小鼠，2周后測得特異性抗體水平比對照組高達(dá)10000倍(Boyle JS，Brady JL，Lew AM.，Enhanced responses to a DNA vaccine encoding afusion antigen that is directed to sites of immune induction.Natrue，1998，392(26)408-411)。其原因可能為CTLA4定向引導(dǎo)抗原與APC表面的B7分子結(jié)合，促進(jìn)了APC攝取抗原，而APC在攝取抗原之后，自身被激活，表達(dá)了更多的B7分子，從而使更多的抗原被DC攝取、加工，起到了放大免疫反應(yīng)的作用。郭繼華等把人的細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen4，CTLA4)基因克隆到變形鏈球菌PAc和GTFs抗原基因的前端，構(gòu)建了靶向融合防齲DNA疫苗pGJA-P，使在體內(nèi)所翻譯的蛋白質(zhì)能夠在CTLA4的引導(dǎo)下，與誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞APC表面的配體分子B7分子結(jié)合從而提高免疫效能(郭繼華，樊明文，邊專等，靶向融合防齲DNA疫苗的構(gòu)建與細(xì)胞表達(dá)，中華口腔醫(yī)學(xué)雜志.2003，38282-284)。
但是該疫苗的載體pCI質(zhì)粒含有氨卞青霉素抗性基因，不符合DNA疫苗的載體骨架有關(guān)要求。pVAX1是美國Invitrogen公司根據(jù)美國藥品食品管理局(FDA)的要求，專門為DNA疫苗設(shè)計(jì)的真核表達(dá)載體。pVAX1是高拷貝質(zhì)粒，在大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可以高水平瞬時(shí)表達(dá)。它攜帶卡那霉素抗性基因，因此比較安全。本研究將以新型DNA疫苗載體pVAX1為骨架構(gòu)建新型靶向融合防齲DNA質(zhì)粒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種靶向防齲DNA疫苗，用真核表達(dá)載體pVAX1替代靶向防齲真核表達(dá)質(zhì)粒pGJGLU(專利申請?zhí)?2139123.8)中的疫苗載體pCI，構(gòu)建一種靶向防齲DNA疫苗pGJGLU/VAX。它用于人體安全性高，增強(qiáng)免疫效能。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供一種制備靶向防齲DNA疫苗的方法，生產(chǎn)成本低廉，方法簡單，純化簡單且產(chǎn)物純度高。
本發(fā)明所提供的靶向防齲DNA疫苗為大腸桿菌Escherichia coliJM109/pGJGLU/VAX，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2004年3月23日，保藏編號CCTCC NOM204027。其步驟如下A.用限制性酶NheI和NotI酶切處理靶向防齲真核表達(dá)質(zhì)粒pGJGLU切下細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4信號肽、胞外區(qū)的序列和Igγ1鉸鏈區(qū)、恒定區(qū)融合基因(CTLA4-Ig目的基因)，變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶的GLU區(qū)序列(GLU片段)，用相同限制性酶處理pVAX1載體；B.電泳膠回收純化CTLA-4-Ig目的基因、GLU片段和NheI和NotI酶切處理的pVAX1載體片段；C.將上述兩種純化的目的片段在T4DNA連接酶作用下連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，接種在卡那霉素陽性LB平板上；D.篩選重組陽性克隆，接種在卡那霉素陽性的LB培養(yǎng)基中，搖菌，提取質(zhì)粒，酶切證實(shí)構(gòu)建的正確性，并命名為pGJGLU/VAX。
pGJGLU/VAX靶向融合防齲DNA疫苗的基因序列為SEQUENCE LISTING。
與其它DNA疫苗相比，pGJGLU/VAX具有巨細(xì)胞病毒CMV的早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(CMV immediate-early ehancer/promoter)，該啟動(dòng)子增強(qiáng)表達(dá)的能力顯著高于其它如勞斯肉瘤病毒啟動(dòng)子LTR、猴病毒40(SV40)等啟動(dòng)子；pGJGLU/VAX具有牛生長激素(BGH)多聚腺苷酰化信號，允許高效轉(zhuǎn)錄終止以及mRNA的多聚腺苷酰化作用；pGJGLU/VAX具有卡那霉素抗性基因，用于人可以避免不必要的過敏反應(yīng)；pGJGLU/VAX攜帶人CTLA4信號肽、胞外區(qū)的序列和Igγ1鉸鏈區(qū)、恒定區(qū)融合基因，因此可以利用CTLA4與其配體牢固結(jié)合的特性將宿主表達(dá)出的抗原蛋白引導(dǎo)至APC表面，大幅度增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效能，同時(shí)由于Igγ1部分功能區(qū)的存在使使重組蛋白在體內(nèi)更加穩(wěn)定，半衰期延長，利于體內(nèi)應(yīng)用。
與多肽防齲疫苗相比，pGJGLU/VAX DNA防齲疫苗具有以下優(yōu)點(diǎn)①pGJGLU/VAX質(zhì)粒物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，20-25℃下即可保存，便于運(yùn)輸使用，而多肽疫苗一般需要冷藏保存等特殊條件；②pGJGLU/VAX簡化了疫苗的生產(chǎn)步驟，僅需完成基因工程的上游部分，省卻了下游重組多肽的表達(dá)和純化過程，短時(shí)間內(nèi)可以得到大量的質(zhì)粒，而且pGJGLU/VAX質(zhì)粒的純化方法較為簡單且產(chǎn)物純度很高，而多肽疫苗制備純化相對困難復(fù)雜，一般需耗時(shí)數(shù)周；③多肽防齲疫苗激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力較差，需要添加各種免疫佐劑，但這些佐劑經(jīng)常引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，大大限制了多肽疫苗的應(yīng)用；pGJGLU/VAX同時(shí)攜帶人CTLA4信號肽、胞外區(qū)的序列和Igγ1鉸鏈區(qū)、恒定區(qū)融合基因，因此可以利用CTLA4與其配體牢固結(jié)合的特性將宿主表達(dá)出的抗原蛋白引導(dǎo)至APC表面，大幅度增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效能，避免使用各種對人體有害的佐劑；④pGJGLU/VAX如同其它DNA疫苗一樣少量接種可能誘導(dǎo)長時(shí)間的免疫反應(yīng)。相反多肽疫苗在體內(nèi)很不穩(wěn)定易被蛋白酶降解，因而要接種較大量才能引起明顯的免疫反應(yīng)，且要多次接種以維持效果。另外比不含CTLA4信號肽、胞外區(qū)的序列和Igγ1鉸鏈區(qū)、恒定區(qū)融合基因的其他防齲DNA疫苗效果要佳。


圖1 pGJGLU/VAX防齲DNA疫苗結(jié)構(gòu)示意圖CMV promoter 巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子CTLA4-IgGLU片段 CTLA4-Ig、GLU重組DNA片段BGH polyA signal 牛生長激素多聚腺苷?；盘朜heI(696) 限制性內(nèi)切酶NheI的酶切位點(diǎn)BclI(1181)限制性內(nèi)切酶BclI的酶切位點(diǎn)KpnI(1884)限制性內(nèi)切酶KpnI的酶切位點(diǎn)
NotI(2781) 限制性內(nèi)切酶SmaI的酶切位點(diǎn)Kan卡那霉素抗性基因pGJGLU/VAX攜帶人CTLA4信號肽、胞外區(qū)的序列和Igγ1鉸鏈區(qū)、恒定區(qū)融合基因，該片段可以直接將抗原蛋白引導(dǎo)于APC表面，并與之結(jié)合，含有變形鏈球菌重要毒力因子的免疫活性區(qū)和功能區(qū)基因序列即葡糖基轉(zhuǎn)移酶GTF-I中葡聚糖結(jié)合區(qū)(GLU)序列，具有巨細(xì)胞病毒CMV的早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(CMV immediate-early ehancer/promoter)，該啟動(dòng)子增強(qiáng)表達(dá)的能力顯著高于其它如勞斯肉瘤病毒啟動(dòng)子LTR、猴病毒40(SV40)等啟動(dòng)子；pGJGLU/VAX具有卡那霉素抗性基因，用于人可以避免不必要的過敏反應(yīng)；pGJGLU/VAX具有牛生長激素(BGH)多聚腺苷?；盘枺试S高效轉(zhuǎn)錄終止以及mRNA的多聚腺苷?；饔谩?br> 圖2 pGJGLU/VAX重組質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶酶切分析電泳示意圖1 λHindIII分子量標(biāo)準(zhǔn)2 pVAX1 KpnJ單酶切3 pGJGLU/VAX NheI、NotI雙酶切4 pGJGLU/VAX KpnI單酶切圖3 重組質(zhì)粒pGJGLU/VAX在CHO細(xì)胞系中的表達(dá)示意圖重組質(zhì)粒pGJGLU轉(zhuǎn)染后的CHO細(xì)胞胞漿內(nèi)特異性表達(dá)產(chǎn)物。(cy3-SABC法，抗GTF抗體，×100)圖4陽性對照質(zhì)粒pGJGLU在CHO細(xì)胞系中的表達(dá)示意圖陽性對照質(zhì)粒pGJGLU轉(zhuǎn)染后的CHO細(xì)胞胞漿內(nèi)特異性表達(dá)產(chǎn)物。(cy3-SABC法，抗GTF抗體，×100)圖5空載體pVAX1在CHO細(xì)胞系中的表達(dá)示意圖空載體pVAX1轉(zhuǎn)染后的CHO細(xì)胞胞漿內(nèi)無特異性表達(dá)產(chǎn)物。(cy3-SABC法，抗GTF抗體，×100)圖6小鼠唾液抗GTF IgA抗體滴度示意圖pGJGLU/VAX i.m.pGJGLU/VAX i.m.組，于股四頭肌注射溶于生理鹽水中的重組質(zhì)粒pGJGLU/VAX。
pGJGLU/VAX i.n.pGJGLU/VAX i.n.組，經(jīng)鼻粘膜滴注溶于布比卡因中的重組質(zhì)粒pGJGLU/VAX。
pVAX1 i.m.pVAX1 i.m.組，于股四頭肌注射溶于生理鹽水中的載體質(zhì)粒pVAX1，作為陰性對照。
NS i.m.NS i.m.組，于股四頭肌注射生理鹽水，作為空白對照。
圖7小鼠血清抗GTF IgG抗體滴度示意圖pGJGLU/VAX i.m.pGJGLU/VAX i.m.組，于股四頭肌注射溶于生理鹽水中的重組質(zhì)粒pGJGLU/VAX。
pGJGLU/VAX i.n.pGJGLU/VAX i.n.組，經(jīng)鼻粘膜滴注溶于布比卡因中的重組質(zhì)粒pGJGLU/VAX。
pVAX1 i.m.pVAX1 i.m.組，于股四頭肌注射溶于生理鹽水中的載體質(zhì)粒pVAX1，作為陰性對照。
NS i.m.NS i.m.組，于股四頭肌注射生理鹽水，作為空白對照。
具體實(shí)施例方式
下面根據(jù)附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述根據(jù)圖1可知，運(yùn)用分子生物學(xué)專業(yè)軟件DNASIS綜合DNA序列分析軟件(日本日立公司)、Gene Construction kit 2.0基因模擬克隆軟件(美國Textco公司)分析和設(shè)計(jì)靶向防齲DNA疫苗并模擬克隆全過程。
根據(jù)圖2可知，用限制性酶NheI和NotI酶切處理靶向防齲真核表達(dá)質(zhì)粒pGJGLU(專利申請?zhí)?2139123.8)以及pVAX1載體；切下靶向融合基因(包括CTLA-4-Ig目的基因、GLU)和NheI和NotI酶切處理的pVAX1載體片段，膠回收純化目的片段；將上述兩種純化的目的片段在T4DNA連接酶作用下20-25℃連接過夜，次日轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，接種在卡那霉素陽性LB平板上；篩選重組陽性克隆，接種在卡那霉素陽性的LB培養(yǎng)基中，搖菌，提取質(zhì)粒，酶切證實(shí)構(gòu)建的正確性，最終構(gòu)建出編碼細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4信號肽、胞外區(qū)的序列和Igγ1鉸鏈區(qū)、恒定區(qū)融合基因與變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶的GLU區(qū)序列靶向防齲DNA疫苗pGJGLU/VAX。pVAX1經(jīng)KpnI單酶切得到了3.0kb片段，pGJGLU/VAX經(jīng)KpnI單酶切得到了5.0kb片段，經(jīng)NotI和NheI雙酶切得到CTLA4-Ig-GLU融合基因2.1kb片段和2.9kb的片段。電泳結(jié)果表明pGJGLU/VAX的插入片段大小與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)。
根據(jù)圖3、圖4、圖5可知，CHO細(xì)胞系用細(xì)胞培養(yǎng)液D/F(美國Gibco公司)37℃、5％CO2培養(yǎng)。培養(yǎng)瓶中預(yù)先加入蓋玻片，使用轉(zhuǎn)染劑梭華-SofastTM基因轉(zhuǎn)染試劑(廈門太陽馬生物工程有限公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。過程首先制備梭華-SofastTM/DNA復(fù)合物的制備，將1-2μg的DNA質(zhì)粒和3-5μl的梭華-SofastTm分別稀釋于100μl的不含血清和抗菌素的D/F中，輕輕混勻。將梭華-SofastTM稀釋液滴加到DNA稀釋液中，一邊滴加一邊混勻。20-25℃孵育15-20分鐘。將梭華-SofastTM/DNA復(fù)合物加到培養(yǎng)瓶中并輕輕搖動(dòng)使均勻混合。設(shè)置空載體對照以及pGJGLU陽性對照。放置37℃ CO2孵育箱孵育24-48小時(shí)后，取出蓋玻片，將轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)后培養(yǎng)板中的蓋玻片取出，PBS液漂洗3×2分鐘。中性福爾馬林(10％甲醛，以0.01M PBS稀釋)固定10分鐘。0.01M PBS洗滌3×5分鐘。加入山羊血清在20-25℃下封閉30分鐘。甩去多余液體，加1∶50兔抗GTF抗體4℃過夜，次日PBS洗滌3×5分鐘。加入生物素化羊抗兔IgG，37℃溫育30分鐘，PBS洗滌3×5分鐘，加入Cy3熒光素標(biāo)記的SABC后置37℃溫育30分鐘，PBS洗滌3×5分鐘。熒光顯微鏡觀察記錄。陽性對照和pGJGLU/VAX轉(zhuǎn)染細(xì)胞鏡下呈現(xiàn)強(qiáng)紅色熒光(圖3-6)，空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞鏡下無熒光(圖7-8)。證實(shí)了重組融合蛋白可以在真核細(xì)胞中正確表達(dá)。
DNA疫苗應(yīng)用研究根據(jù)圖6、圖7可知，為了驗(yàn)證pGJGLU/VAX的有效性，我們將26只雌性Babl/c小鼠隨機(jī)分為4組，分別經(jīng)肌肉注射和鼻粘膜途徑免疫，分組如下pGJGLU/VAX i.m.組8只，于股四頭肌注射溶于生理鹽水中的重組質(zhì)粒pGJGLU/VAX 100μg。
pGJGLU/VAX i.n.組8只，經(jīng)鼻粘膜滴注溶于0.25％布比卡因中的重組質(zhì)粒pGJGLU/VAX 50μg。
pVAX1 i.m.組5只，于股四頭肌注射溶于生理鹽水中的載體質(zhì)粒pVAX1100μg，作為陰性對照。
NS i.m.組5只，于股四頭肌注射生理鹽水100μg，作為空白對照。
免疫前和免疫后2、4、8、12周分別收集血清和唾液樣本。
ELISA法檢測血清和唾液中特異性抗體水平，各組唾液抗GTF特異性IgA抗體水平在第8周到第12周時(shí)均顯著高于對照組(P＜0.01)，但疫苗免疫各組間沒有顯著性差異(P＞0.05)，第12周時(shí)pGJGLU/VAX鼻粘膜滴注組特異性抗體水平最高(圖6)。
第4周時(shí)疫苗免疫組各組血清抗GTF特異性IgG抗體水平均顯著高于對照組，第8周到第12周pGJGLU/VAX肌注免疫組的特異性抗體水平顯著高于pGJGLU/VAX鼻粘膜免疫組(P＜0.01)(圖7)。
證實(shí)了該疫苗在小鼠體內(nèi)經(jīng)肌肉注射和鼻粘膜途徑免疫可以有效誘導(dǎo)特異性抗體反應(yīng)。
SEQUENCE LISTING<110>武漢大學(xué)<120>一種靶向防齲DNA疫苗及制備方法<130>無<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5001<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>人工序列<220>
<221>CDS<222>(702)..(2774)<223>人細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA4)信號肽、胞外區(qū)，免疫球蛋白γ1恒定和鉸鏈區(qū)，變形鏈球菌血清型C(S.mutans)葡糖基轉(zhuǎn)移酶GLU片段融合肽<220>
<221>CDS<222>(3228)..(4022)<223>卡那霉素抗性基因<220>
<221>promoter<222>(137)..(701)<223>
<220>
<221>BGH polyA_sgnal<222>(2831)..(3055)<223>
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355 360 365Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr370 375 380Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Thr Gly Glu Met Gly385 390 395 400Tyr Gln Ala Lys Gly Lys Phe Val Thr Thr Ala Asp Gly Lys Ile Arg405 410 415Tyr Phe Asp Lys Gln Ser Gly Asn Met Tyr Arg Asn Arg Phe Ile Glu420 425 430Asn Glu Glu Gly Lys Trp Leu Tyr Leu Gly Glu Asp Gly Ala Ala Val435 440 445Thr Gly Ser Gln Thr Ile Asn Gly Gln His Leu Tyr Phe Arg Ala Asn450 455 460Gly Val Gln Val Lys Gly Glu Phe Val Thr Asp His His Gly Arg Ile465 470 475 480Ser Tyr Tyr Asp Gly Asn Ser Gly Asp Gln Ile Arg Asn Arg Phe Val485 490 495Arg Asn Ala Gln Gly Gln Trp Phe Tyr Phe Asp Asn Asn Gly Tyr Ala500 505 510Val Thr Gly Ala Arg Thr Ile Asn Gly Gln Leu Leu Tyr Phe Arg Ala515 520 525Asn Gly Val Gln Val Lys Gly Glu Phe Val Thr Asp Arg Tyr Gly Arg530 535 540Ile Ser Tyr Tyr Asp Gly Asn Ser Gly Asp Gln Ile Arg Asn Arg Phe545 550 555 560Val Arg Asn Ala Gln Gly Gln Trp Phe Tyr Phe Asp Asn Asn Gly Tyr565 570 575Ala Val Thr Gly Ala Arg Thr Ile Asn Gly Gln His Leu Tyr Phe Arg580 585 590Ala Asn Gly Val Gln Val Lys Gly Glu Phe Val Thr Asp Arg His Gly595 600 605Arg Ile Ser Tyr Tyr Asp Gly Asn Ser Gly Asp Gln Ile Arg Asn Arg6l0 615 620Phe Val Arg Asn Ala Gln Gly Gln Trp Phe Tyr Phe Asp Asn Asn Gly625 630 635 640Tyr Ala Val Thr Gly Ala Arg Thr Ile Asn Gly Gln His Leu Tyr Phe645 650 655Arg Ala Asn Gly Val Gln Val Lys Gly Glu Phe Val Thr Asp Arg Tyr660 665 670Gly Arg Ile Ser Tyr Tyr Asp Ala Asn Ser Gly Glu Arg Val Arg Ile675 680 685Val Asp690<210>3
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<223>人工序列<400>3Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val1 5 10 15Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser20 25 30Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe35 40 45Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala50 55 60Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val65 70 75 80Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu85 90 95Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys100 105 110Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro115 120 125Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala130 135 140Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu145 150 155 160Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala165 170 175Ser Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys180 185 190Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp195 200 205Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala210 215 220Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe225 230 235 240Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe245 250 255Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe260
權(quán)利要求
1.一種靶向防齲DNA疫苗，其特征在于大腸桿菌(Escherichia coli)，Escherichia coli JM109/pGJGLU/VAX，CCTCC NOM204027。
2.一種實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述的一種靶向防齲DNA疫苗的制備方法，它包括下列步驟A.用限制性酶NheI和NotI酶切處理靶向融合防齲真核表達(dá)質(zhì)粒pGJGLU切下CTLA-4-Ig目的基因、GLU片段，用相同限制性酶處理pVAX1載體；B.電泳膠回收純化CTLA-4-Ig目的基因、GLU片段和NheI和NotI酶切處理的pVAX1載體片段；C.將上述兩種純化的目的片段在T4DNA連接酶作用下連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，接種在卡那霉素陽性LB平板上；D.篩選重組陽性克隆，接種在卡那霉素陽性的LB培養(yǎng)基中，搖菌，提取質(zhì)粒，質(zhì)粒為pGJGLU/VAX。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種靶向融合防齲DNA疫苗的制備方法，其特征在于pGJGLU/VAX靶向融合防齲DNA疫苗的基因序列為SEQUENCE LISTING。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種靶向防齲DNA疫苗及制備方法，大腸桿菌Escherichia coli JM109/pGJGLU/VAX，CCTCC NoM204027。用限制性酶NheI和NotI酶切處理靶向防齲真核表達(dá)質(zhì)粒pGJGLU切下靶向融合基因(包括CTLA－4－Ig目的基因和GLU片段)，將靶向融合基因克隆到pVAX1載體中，酶切證實(shí)構(gòu)建的正確性，并命名為pGJGLU/VAX，轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞CHO細(xì)胞系，證實(shí)可以在真核細(xì)胞正確表達(dá)重組蛋白。本發(fā)明方法簡單，安全性高，生產(chǎn)成本低廉，免疫應(yīng)答持久，可大幅度提高其免疫效能。
文檔編號A61P1/02GK1593663SQ200410013318
公開日2005年3月16日 申請日期2004年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月18日
發(fā)明者樊明文, 賈榮, 郭繼華, 邊專, 陳智, 彭彬, 范兵 申請人:武漢大學(xué)