專利名稱：A、o型口蹄疫病毒雙價(jià)dna疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA疫苗，特別是一種家畜A、O型口蹄疫病毒雙價(jià)DNA疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
口蹄疫是致偶蹄目動(dòng)物的一種傳播迅速、感染性高的發(fā)熱性傳染病，國際獸疫局將其列為A類傳染病之首。該病的病原為口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MDV)，屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬。多年來，許多國家為了預(yù)防和控制口蹄疫，投資了大量的人力、物力、財(cái)力，但是該病仍在廣大范圍內(nèi)流行。
自1989年發(fā)現(xiàn)該病以來，人們已研制出口蹄疫病毒的弱毒疫苗和滅毒疫苗，并廣泛運(yùn)用于生產(chǎn)。這兩種疫苗雖然具有較好的免疫原性，但是生產(chǎn)的安全性較差，需要對實(shí)驗(yàn)室以及參加實(shí)驗(yàn)的工作人員采取保護(hù)措施，保證不被致病物質(zhì)污染；保證病毒不泄漏。在疫苗生產(chǎn)過程中，病毒有可能沒有被完全殺死或充分減毒，會導(dǎo)致疫苗中含有高毒性致病物質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致被免疫動(dòng)物發(fā)病而使疾病大規(guī)模流行。絕大多數(shù)現(xiàn)行疫苗的有效期較短，而且常常需要冷凍保存，這增大了疫苗在農(nóng)村推廣使用的成本。DNA重組技術(shù)的發(fā)展為制造新一代重組疫苗提供了新思路。
DNA疫苗，又稱核酸疫苗，即將外源基因克隆到真核表達(dá)載體上，然后將重組的質(zhì)粒DNA直接注射到動(dòng)物體內(nèi)，使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生的抗原激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，引發(fā)免疫反應(yīng)。1990年Wolff等人首先發(fā)現(xiàn)注射DNA能使載體上的基因在局部肌肉細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，之后DNA疫苗已廣泛地用于病毒性、細(xì)菌性、寄生蟲感染性疾病，并且近年來逐漸應(yīng)用于腫瘤的治療研究。與第一、二代疫苗相比，核酸疫苗具有安全可靠、生產(chǎn)簡便、成本低廉、穩(wěn)定性好、運(yùn)輸方便，而且能表達(dá)經(jīng)修飾的天然抗原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全面的免疫反應(yīng)等特點(diǎn)。更重要的是DNA疫苗可實(shí)現(xiàn)將不同抗原的基因構(gòu)建在同一個(gè)表達(dá)載體中，制備多價(jià)核酸疫苗。
口蹄疫共包括A、O、C等7種血清型。我國主要以O(shè)型為主，A型口蹄疫也時(shí)有發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能同時(shí)有效地預(yù)防A、O型口蹄疫病毒的、制備簡單、運(yùn)輸儲存方便、成本低廉而又安全可靠的DNA疫苗及其制備方法。
本發(fā)明所說的A、O型口蹄疫病毒雙價(jià)DNA疫苗，是將A、O型口蹄疫病毒毒株VP1蛋白的抗原決定簇部分的編碼區(qū)串聯(lián)，并與能提高其免疫原性DNA片段連接。核苷酸序列為1 GGATCCATGGCTGTGCCAAACTTGCGTGGCGATTTGCAGGTGTTGGCTCAGAAAGTGGCT61 CGTACTTTGCCAGAGCTCCGATCGCGTCATAAACAGAAAATTGTGGCTCCAGTGAAACAG121 ACTTTGGAATTCGGCTCTGGCCGTCGTGGCGATATGGGCTCTTTGGCTGCTCGTGTGGTG181 AAACAGTTGCCAGGTACCGTCGACGCAGTTCCAAACTTGCGTGGTGATTTGCAGGTTTTG241GCACAGAAAGTTGCTCGTACCTTGCCAGGCTCTGGCCGTCGTGGCGATATGGGCTCTTTG301GCTGCTCGTGTGGTGAAACAGTTGCCATAG其中包含了O型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原決定簇基因編碼序列、A型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原決定簇基因編碼序列和連接片段。
本發(fā)明所說的A、O型口蹄疫病毒雙價(jià)DNA疫苗的制備方法是1、將以上片段經(jīng)酶切后與含真核啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。
2、經(jīng)酶切及PCR鑒定得陽性克隆，再經(jīng)測序鑒定確認(rèn)。
3、將此陽性克隆置于具相應(yīng)抗性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再加氯霉素，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)，收集菌體，懸浮于緩沖液中，加裂解液裂解細(xì)菌，加入欲冷中和液中和，放置后離心。上清經(jīng)過濾后加異丙醇，離心，沉淀用乙醇洗滌。
4、沉淀溶于Tris-EDTA(TE)緩沖液中，加入LiCl溶液，離心，上清加入異丙醇，離心后棄上清，用乙醇洗滌，沉淀的DNA用含RNAase的Tris-EDTA溶解，放置。
5、加含PEG 8000的NaCl，離心后收集DNA沉淀，經(jīng)TE溶解后分別用酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次。
6、水相加乙酸銨及乙醇，離心去上清，用乙醇洗，晾干備用。
所說的真核啟動(dòng)子可選用猴空泡病毒SV40早期啟動(dòng)子，勞氏瘤病毒啟動(dòng)子(RSV)，腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(ADV)或人巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動(dòng)子等。
提取的質(zhì)粒DNA應(yīng)以閉合環(huán)狀雙鏈DNA為主，可以通過瓊脂糖凝膠電泳判斷。提取的DNA還需用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測定。通過OD260nm/OD280nm來估計(jì)DNA純度，純DNA樣品該比值應(yīng)在1.8～2.0之間，如果小于此值，說明有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染；如大于此值，說明有RNA污染。
因?yàn)槌Ｓ玫霓D(zhuǎn)化菌均為革蘭氏陰性細(xì)菌，其細(xì)胞壁上有一種稱內(nèi)毒素的成份，可使機(jī)體產(chǎn)生細(xì)菌性休克，在機(jī)體注射之前，應(yīng)用鱟血試劑盒檢測其內(nèi)毒素含量。
將純化后的DNA疫苗注射4～6齡的小鼠，注射免疫前先在接種部位注射25％蔗糖用于提高質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，15分鐘后在相同部位注射150μg DNA疫苗。半月后以相同劑量加強(qiáng)免疫一次，一周后眼眶采血，制備血清供ELISA檢測用。ELISA板每孔分別包被5～10μg純化的標(biāo)準(zhǔn)A或O型口蹄疫病毒蛋白，4℃過夜，洗滌液洗滌5～10分鐘，用封閉液封閉1～2小時(shí)，按系列梯度稀釋免疫后待測血清，加陰性、陽性血清作為對照，37℃溫育1小時(shí)，洗滌后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，加200uL/孔TMB顯色底物，室溫避光30分鐘，加終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀波長450nm，參考波長630nm處測OD值，用空白孔調(diào)零點(diǎn)，讀取各孔OD值，如OD值大于陰性對照OD值的2.1倍，被認(rèn)為是陽性。測得DNA免疫小鼠后抗A和抗O型口蹄疫病毒的效價(jià)分別為10240、81920。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1、屬A、O型雙價(jià)疫苗，免疫后動(dòng)物能同時(shí)產(chǎn)生抗A、O型口蹄疫病毒的抗體；2、該疫苗制備安全，無減毒、滅活疫苗可能引起的致病作用；3、疫苗穩(wěn)定性好、有效期長、運(yùn)輸儲存方便、無特殊要求，有利于推廣使用；4、誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答；5、能表達(dá)經(jīng)修飾的天然抗原，具有與天然抗原相同的構(gòu)象和抗原性；6、具有高產(chǎn)性，生產(chǎn)工藝簡單，成本低廉。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例將對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明實(shí)施例1將包含O型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原決定簇基因編碼序列、A型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原決定簇基因編碼序列、連接片段的合成序列，經(jīng)酶切后與猴空泡病毒SV40早期啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)酶切及PCR鑒定得陽性克隆，再經(jīng)測序鑒定確認(rèn)。將此陽性克隆置于具抗性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，次日加氯霉素，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)，收集菌體，懸浮于緩沖液中，加新鮮配制的NaOH和SDS裂解細(xì)菌，加入欲冷中和液中和，放置后離心；上清經(jīng)紗布過濾后加異丙醇，離心，沉淀用乙醇洗滌；沉淀溶于Tris-EDTA(TE)緩沖液中，加入等體積的LiCl溶液，離心，上清加入異丙醇，離心后棄上清，用乙醇洗滌，沉淀的DNA用含RNAase的Tris-EDTA溶解，室溫放置；加等體積含PEG 8000的NaCl，離心后收集DNA沉淀，經(jīng)TE溶解后分別用酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次；水相加乙酸銨及乙醇，離心去上清，用乙醇洗，晾干備用。提取的質(zhì)粒DNA應(yīng)以閉合環(huán)狀雙鏈DNA為主，可經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳判斷。提取的DNA用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測定。通過OD260nm/OD280nm的比值估計(jì)DNA純度，比值為1.8。
將純化后DNA疫苗注射4齡小鼠，注射免疫前先在接種部位注射25％蔗糖用于提高質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，15min后在相同部位注射150μg DNA疫苗。半月后相同劑量加強(qiáng)免疫一次，一周后眼眶采血，制備血清供ELISA檢測用。ELISA板每孔分別包被5μg純化的標(biāo)準(zhǔn)A或O型蛋白質(zhì)，4℃過夜，洗滌液洗滌10min，用封閉液封閉2h，按系列梯度稀釋免疫后的待測血清，加陰性、陽性血清作為對照，37℃溫育1h，洗滌后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，加200μL/孔TMB顯色底物，室溫避光30min，加終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀波長450nm處測OD值，用空白孔調(diào)零點(diǎn)，如OD值大于陰性對照OD值的2.1倍，認(rèn)為是陽性。測得DNA免疫后抗A和抗O型口蹄疫病毒的效價(jià)分別為10240、81920。
實(shí)施例2將包含O型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原決定簇基因編碼序列，A型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原決定簇基因編碼序列、連接片段的合成序列，經(jīng)酶切后與勞氏瘤病毒啟動(dòng)子(RSV)的真核表達(dá)載體相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)酶切及PCR鑒定得陽性克隆，再經(jīng)測序鑒定確認(rèn)。將此陽性克隆置于具抗性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，次日加氯霉素，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)，收集菌體，懸浮于緩沖液中，加新鮮配制的NaOH和SDS裂解細(xì)菌，加入欲冷的中和液中和，放置后離心。其余步驟與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例3將包含O型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原決定簇基因編碼序列，A型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原決定簇基因編碼序列、連接片段的合成序列，酶切后與腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(ADV)的真核表達(dá)載體相連接，次日轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)酶切及PCR鑒定得陽性克隆，再經(jīng)測序鑒定確認(rèn)。將此陽性克隆置于具抗性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，次日加氯霉素，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)，收集菌體，懸浮于緩沖液中，加新鮮配制的NaOH和SDS裂解細(xì)菌，加入欲冷的中和液中和，放置后離心。其余步驟與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例4將包含O型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原決定簇基因編碼序列，A型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原決定簇基因編碼序列、連接片段的合成序列，經(jīng)酶切后與人巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)酶切、PCR鑒定和測序鑒定得陽性克隆。將此陽性克隆置于具抗性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入氯霉素后震蕩培養(yǎng)，收集菌體，懸浮于緩沖液中，加新鮮配制的NaOH和SDS裂解細(xì)菌，加入欲冷的中和液中和，放置后離心。其余步驟與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例5
化學(xué)方法合成的DNA片段與經(jīng)BamHI和NotI雙酶切的真核表達(dá)載體pCDNA3產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM101。經(jīng)酶切、PCR鑒定得陽性克隆pCDNA3-T8-3S，經(jīng)測序鑒定確認(rèn)。將此陽性克隆置于具有Ampr的LB培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)過夜，次日加氯霉素使其終濃度為150μg/mL，于37℃搖菌15h，再按以下方法進(jìn)行質(zhì)粒的大量提取及純化菌液于4℃以4,000轉(zhuǎn)/min離心15min，棄上清；將菌體懸浮于預(yù)冷的STE(0.1MNaCl，10mM Tris(pH8.0)，1mM EDTA(pH8.0))中，以4,000轉(zhuǎn)/min離心15min，棄上清；收集的菌體用溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0))懸?。患有迈r配制的溶液II(0.2M NaOH，1％SDS)，顛倒混勻6次，室溫放置3min；加入預(yù)冷的溶液III(5M乙酸鉀)，上下顛倒混勻，冰浴放置10min；12,000g 4℃離心15min；將上清經(jīng)四層紗布過濾入離心管中，加0.6倍體積的異丙醇，充分混勻，于室溫放置10min；12,000g室溫離心15min棄上清，用70％乙醇洗滌，然后經(jīng)100％乙醇洗滌；DNA沉淀溶于TE中；加入等體積的5M LiCl，4℃下以10,000轉(zhuǎn)/min離心10min；上清轉(zhuǎn)移至另一干凈的離心管中，加入等量的異丙醇，充分混勻，室溫10,000轉(zhuǎn)/min離心10min；棄上清，用70％乙醇洗滌，蒸發(fā)乙醇；沉淀的DNA用含RNAase的TE(pH8.0)溶解，室溫放置30min；加等體積含13％(W/V)PEG 8000的1.6M NaCl，充分混勻，用4℃12,000g離心5min，收集DNA沉淀，用pH8.0的TE溶解，用酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次；將水相轉(zhuǎn)至新的離心管中，加10M乙酸銨，充分混勻，加2倍體積乙醇，室溫靜置10min，于4℃，12,000g離心5min；去上清，用70％乙醇洗DNA，12,000g 4℃離心2min；去上清，晾干備用。
權(quán)利要求
1.A、O型口蹄疫病毒雙價(jià)DNA疫苗，其特征在于將A、O型口蹄疫病毒毒株的VP1蛋白抗原決定簇部分的編碼區(qū)串聯(lián)，并與能提高其免疫原性的DNA片段連接。
2.如權(quán)利要求1所述的A、O型口蹄疫病毒雙價(jià)DNA疫苗，其特征在于該疫苗的核苷酸序列為1 GGATCCATGGCTGTGCCAAACTTGCGTGGCGATTTGCAGGTGTTGGCTCAGAAAGTGGCT61 CGTACTTTGCCAGAGCTCCGATCGCGTCATAAACAGAAAATTGTGGCTCCAGTGAAACAG121 ACTTTGGAATTCGGCTCTGGCCGTCGTGGCGATATGGGCTCTTTGGCTGCTCGTGTGGTG181 AAACAGTTGCCAGGTACCGTCGACGCAGTTCCAAACTTGCGTGGTGATTTGCAGGTTTTG241GCACAGAAAGTTGCTCGTACCTTGCCAGGCTCTGGCCGTCGTGGCGATATGGGCTCTTTG301GCTGCTCGTGTGGTGAAACAGTTGCCATAG其中包含了O型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原決定簇基因編碼序列；A型口蹄疫病毒VP1蛋白抗原決定簇基因編碼序列和連接片段。
3.A、O型口蹄疫病毒雙價(jià)DNA疫苗的制備方法，其特征在于其步驟為1)、將連接片段經(jīng)酶切后與含真核啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；2)、經(jīng)酶切及PCR鑒定得陽性克隆，再經(jīng)測序鑒定確認(rèn)；3)、將此陽性克隆置于具抗性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再加氯霉素繼續(xù)震蕩培養(yǎng)，收集菌體，懸浮于緩沖液，加NaOH和SDS裂解細(xì)菌，加入預(yù)冷的中和液中和，放置后離心；4)、上清經(jīng)過濾后加異丙醇，離心，沉淀用乙醇洗滌；5)、沉淀溶于Tris-EDTA(TE)緩沖液中，加入LiCl，離心，上清加入異丙醇，離心后棄上清，用乙醇洗滌，沉淀的DNA用含RNAase的Tris-EDTA溶解，放置；6)、加含PEG 8000的NaCl，離心后收集DNA沉淀，經(jīng)TE溶解后分別用酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次；7)、水相加乙酸銨及乙醇，離心去上清，用乙醇洗，晾干備用。
4.如權(quán)利要求3所述的A、O型口蹄疫病毒雙價(jià)DNA疫苗的制備方法，其特征在于所說的真核啟動(dòng)子可選用猴空泡病毒SV40早期啟動(dòng)子，勞氏瘤病毒啟動(dòng)子，腺病毒主要晚期啟動(dòng)子或人巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子等真核啟動(dòng)子。
全文摘要
涉及一種家畜A、O型口蹄疫病毒雙價(jià)DNA疫苗。將A、O型口蹄疫病毒毒株的VP1蛋白抗原決定簇部分的編碼區(qū)串聯(lián)，與能提高其免疫原性的DNA片段連接。將片段酶切后與真核表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；PCR鑒定得陽性克?。唤?jīng)培養(yǎng)，收集菌體，裂解細(xì)菌，離心；上清經(jīng)過濾，離心，洗滌；沉淀溶于緩沖液，加入LiCl，離心，棄上清，用乙醇洗滌，沉淀的DNA用含RNAase的Tris－EDTA溶解；加NaCl，離心后收集DNA沉淀，經(jīng)TE溶解后抽提；水相加乙酸銨及乙醇，離心去上清，用乙醇洗。屬A、O型雙價(jià)疫苗，免疫后動(dòng)物能同時(shí)產(chǎn)生抗A、O型口蹄疫病毒的抗體；無減毒、滅活疫苗可能引起的致病作用；高產(chǎn)、穩(wěn)定、長效、儲運(yùn)方便；誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全面免疫應(yīng)答；能表達(dá)經(jīng)修飾的天然抗原。
文檔編號A61P31/00GK1557486SQ20041000215
公開日2004年12月29日 申請日期2004年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月13日
發(fā)明者陳亮, 邵寒娟, 蘇勇波, 林濤, 陳 亮 申請人:廈門大學(xué)