專利名稱：阿魏酸松柏酯在抗癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及川芎中抗癌活性成份的研發(fā)，具體地說是阿魏酸松柏酯在抗癌藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由于中藥是祖國(guó)醫(yī)藥學(xué)的寶貴遺產(chǎn)，迄今已有數(shù)千年的臨床實(shí)踐，并形成了系統(tǒng)的傳統(tǒng)中醫(yī)理論體系，在我國(guó)有著極其廣泛的應(yīng)用基礎(chǔ)。以中藥為本開發(fā)新藥具有目標(biāo)明確、毒副作用小、原料來源多等有利因素。
川芎Rhizoma Chuanxiong為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖，具有行氣活血，祛風(fēng)止痛之功效，為活血化瘀常用中藥。據(jù)報(bào)道其含有內(nèi)酯類、生物堿、有機(jī)酸類或酚類、以及中性油類等多種有效成分。目前報(bào)道的關(guān)于川芎有效成分的主要藥理作用有川芎嗪有增加冠脈流量，降低冠脈阻力，促進(jìn)動(dòng)脈微循環(huán)，對(duì)血小板凝聚有解聚作用；川芎浸膏能抑制小腸收縮和妊娠都子宮的收縮，生物堿、阿魏酸、川芎內(nèi)酯有解痙作用；水煎劑能夠抑制咖啡因的興奮作用；川芎揮發(fā)油有鎮(zhèn)靜作用；川芎提取物對(duì)細(xì)菌及真菌有抑制作用；含有川芎的復(fù)方可用于輔助腫瘤治療[文獻(xiàn)1.閻德海.CN 1109337A，1995抗腫瘤中藥調(diào)節(jié)復(fù)元湯；文獻(xiàn)2.沈漢澄.CN 1092972C，2002一種抗腫瘤及抗癌轉(zhuǎn)移的藥物；文獻(xiàn)3.趙金華，趙耘，姚倩等.CN 1362064A，2002一種抗腫瘤組合物及其制備方法和用途；文獻(xiàn)4.徐修禮，張建芳，劉寶瑞等.腫瘤.22(2)，107-108，2002川芎素對(duì)大腸癌細(xì)胞moser的影響及其與化療藥物的協(xié)同作用]。
到目前為止，有關(guān)川芎有效成分能夠抑制腫瘤細(xì)胞的報(bào)道只有川芎嗪[文獻(xiàn)5.張春玲，肖偉，王英年.中華實(shí)用醫(yī)學(xué).4(9)，26-29，2002黃芪、川芎嗪對(duì)腸癌患者陽PMBC分泌IL-4、IL-6的調(diào)節(jié)作用；文獻(xiàn)6.林洪生，李樹奇，裴迎霞等.中國(guó)新藥雜志.8(6)，384-386，1999川芎嗪、苦參堿對(duì)癌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附及粘附因子表達(dá)的影響；文獻(xiàn)7.林洪生，李樹奇，樸炳奎等.中國(guó)腫瘤.8(12)，574-576，1999三參沖劑對(duì)肺癌轉(zhuǎn)移中內(nèi)皮細(xì)胞及粘附因子的影響；文獻(xiàn)8.崔巍，徐世杰，藤靜茹等.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志.3(1)，27-28，31，1997活血化瘀中藥抑制腫瘤細(xì)胞——血小板聚集的實(shí)驗(yàn)研究]，但是川芎嗪在川芎中的含量極低，同時(shí)川芎嗪易升華，因此從川芎中提取川芎嗪用于抗腫瘤研究未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于為以中藥有效成分為基礎(chǔ)的新藥設(shè)計(jì)提供新的先導(dǎo)化合物—即研發(fā)松柏醇阿魏酸酯在抗癌藥物中的應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
通過色譜分離技術(shù)并結(jié)合體外藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，從傳統(tǒng)中藥——川芎中篩選出具有生理活性的有效成分—阿魏酸松柏酯。
本發(fā)明采用制備級(jí)色譜從川芎中分離純化出一種酯類化合物，并通過液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用、氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用、紅外光譜、紫外光譜、核磁共振對(duì)該化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。在抗腫瘤的MTT實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該化合物具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的生理活性。
具體為從傳統(tǒng)中藥——川芎中制備3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯，及其結(jié)構(gòu)鑒定；稱量一定量的川芎粉末置入燒瓶?jī)?nèi)，加入無水乙醇加熱回流，經(jīng)過濾得到提取液，揮發(fā)掉提取液中溶劑得膏狀物；在一定淋洗條件下(以乙腈/水為流動(dòng)相)，以裝有C18 SPE(固相萃取)柱分離上述提取物，收集洗脫的餾分；經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用分析后，將含有3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯餾分揮發(fā)掉溶劑得膏狀物。以制備型HPLCC18柱純化經(jīng)初步提純的膏狀物，收集3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯的峰。經(jīng)減壓蒸餾揮發(fā)掉溶劑，得到純度在98％以上的純品。最終由RP-HPLC、紫外光譜、質(zhì)譜、紅外光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，分子式為C20H20O6結(jié)構(gòu)式如下(也稱阿魏酸松柏酯) 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.為以中藥有效成分為基礎(chǔ)的新藥設(shè)計(jì)提供新的先導(dǎo)化合物。本發(fā)明首次從傳統(tǒng)中藥——川芎中分離純化出一種酯類的化合物——3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯，也稱為阿魏酸松柏酯。
2.建立了該化合物的液相色譜分離純化方法，操作簡(jiǎn)便易行。采用本發(fā)明中的制備方法，可以比較快捷地分離、純化出3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯，純度在98％以上。同時(shí)由于采用HPLC技術(shù)，本方法還具有重復(fù)性好，條件溫和，非常適用于化學(xué)穩(wěn)定性差的中藥有效成分的制備。
3.本發(fā)明應(yīng)用的化合物具有一定的抗腫瘤細(xì)胞(宮頸癌Hela細(xì)胞)的活性，且無毒副作用。由于目前的抗腫瘤藥物普遍存在著明顯的毒副作用，而該化合物來源于常用的中藥，因此更具有進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造和研究的價(jià)值，為以中藥為基礎(chǔ)的新抗癌藥物開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化打下基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1稱量經(jīng)粉碎(35目)川芎粉末120g置入燒瓶?jī)?nèi)，加入700mL無水乙醇，浸泡30min，加熱回流1h，過濾(0.5μm)制備提取液。減壓蒸餾揮發(fā)掉提取液中溶劑得膏狀物。以裝有30g的40μm C18填料的SPE柱分離上述提取物，分別用30/70，50/50(v/v)的乙腈/水溶液和純乙腈淋洗，收集洗脫的餾分。經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用分析，3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯在50％乙腈溶液洗脫的餾分中。減壓蒸餾揮發(fā)掉溶劑得膏狀物。以制備型HPLCC18柱純化上述初步提純的膏狀物，流動(dòng)相為37/63(v/v)的乙腈/水溶液，收集3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯的峰。經(jīng)減壓蒸餾揮發(fā)掉溶劑，得到純度在98％以上的純品。對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的抑制率為50％時(shí)的濃度約為3.7μg/μL。
在本發(fā)明中，也可以用其他溶劑對(duì)川芎進(jìn)行提取，諸如甲醇、95％乙醇、水等，但是經(jīng)過實(shí)驗(yàn)乙醇在浸出3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯的效率高于其他溶劑。
應(yīng)用例體外MTT(四唑鹽)法測(cè)量3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的抑制率；取90mg阿魏酸松柏酯溶于250μL無水乙醇中，加入250μL PBS稀釋，分別加入4、6、8、10、12μL至培養(yǎng)宮頸癌Hela細(xì)胞的96孔板中(平行測(cè)定8孔)。培養(yǎng)后，利用ELISA檢測(cè)儀在570nm測(cè)定光密度；抑制率分別為47.7％、79.4％、79.4％、82.1％、83.2％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯有一定的抗腫瘤活性。
MTT的檢測(cè)方法1以每孔103---104密度接種細(xì)胞于96孔板上。
2細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入MTT(5mg/ml)，37℃孵育3-4小時(shí)，終止培養(yǎng)，小心吸棄上清液。每孔加入0.1-.0.2mlDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。
3比色用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570nm處測(cè)定其吸收度。
權(quán)利要求
1.阿魏酸松柏酯在抗癌藥物中的應(yīng)用。
2.按照權(quán)利要求1所述阿魏酸松柏酯在抗癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的阿魏酸松柏酯是從川芎中分離獲取的。
3.按照權(quán)利要求2所述阿魏酸松柏酯在抗癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述阿魏酸松柏酯的分離獲取過程如下，川芎粉末置于溶液中加熱回流，過濾得到提取液，揮發(fā)掉提取液中溶劑得膏狀物；在乙腈/水為流動(dòng)相的淋洗條件下，以裝有C18 SPE柱分離上述提取物，收集洗脫的餾分；通過液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析后，將含有3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯餾分揮發(fā)掉溶劑得膏狀物；以制備型HPLC C18柱純化經(jīng)初步提純的膏狀物，收集3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙烯酸3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-烯丙基酯的峰，經(jīng)減壓蒸餾揮發(fā)掉溶劑，得到產(chǎn)品。
4.按照權(quán)利要求3所述阿魏酸松柏酯在抗癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述溶液為甲醇、95％乙醇、乙醇或水。
5.按照權(quán)利要求3所述阿魏酸松柏酯在抗癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述溶液為乙醇。
6.按照權(quán)利要求3所述阿魏酸松柏酯在抗癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述乙腈/水的體積比例為30～100∶0～70。
全文摘要
本發(fā)明涉及川芎中抗癌活性成分的研發(fā)，具體地說是阿魏酸松柏酯在抗癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下本發(fā)明首次從傳統(tǒng)中藥——川芎中分離純化出阿魏酸松柏酯，為以中藥有效成分為基礎(chǔ)的新藥設(shè)計(jì)提供新的先導(dǎo)化合物；建立了該化合物的液相色譜分離純化方法，操作簡(jiǎn)便易行、重復(fù)性好，條件溫和，非常適用于化學(xué)穩(wěn)定性差的中藥有效成分的制備；為以中藥為基礎(chǔ)的新抗癌藥物開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化打下基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61K31/216GK1608616SQ200310104929
公開日2005年4月27日 申請(qǐng)日期2003年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月24日
發(fā)明者鄒漢法, 孔亮, 孫乃昌, 吳麗華, 陳學(xué)國(guó) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所