專利名稱：一種抗凝血性不溶性絲素材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為制備具有良好生物相容性，血液相容性以及機(jī)械性能并在水中可以穩(wěn)定存在的絲素蛋白材料的新方法，涉及生物材料。
背景技術(shù)：
絲素蛋白作為天然生物蛋白，具有優(yōu)異的生物相容性，低炎癥反應(yīng)性和良好的機(jī)械及物理化學(xué)性能，近年來受到生物材料界廣泛的研究。在人造皮膚，人造韌帶，人造骨，人造血管方面有良好的應(yīng)用前景，并可作為藥物緩釋材料，酶固定化材料等。在組織工程中，其優(yōu)異的細(xì)胞生長性和緩慢降解性也使其具有廣泛的應(yīng)用前景。雖然由于絲素蛋白在自然界以一維絲狀態(tài)存在，但在實(shí)際應(yīng)用中，則需要制備成二維薄膜或三維管材形態(tài)，所以要對(duì)絲素進(jìn)行溶解再生以制備符合使用要求的材料。
絲素蛋白溶解再生后，一般是溶于水的材料，在生物體內(nèi)容易造成流失，很難作為生物材料使用?，F(xiàn)有的使絲素蛋白不溶于水的處理方式是將絲素浸泡在甲醇溶液中，這種方法容易引發(fā)殘留甲醇對(duì)人體的危害問題。為避免甲醇對(duì)人體的危害，我們研究了在合適條件下直接制備不溶性絲素蛋白材料的新方法，并獲得了成功。
但是在另一方面，由于絲素蛋白的血液相容性較差，雖然其細(xì)胞生長性良好，從而在一定時(shí)間內(nèi)可以在薄膜表面產(chǎn)生新的內(nèi)皮細(xì)胞層，但植入體內(nèi)后在細(xì)胞沒有覆蓋表面的情況下容易產(chǎn)生凝血，從而不適合作為血液接觸類材料使用。為擴(kuò)展絲素蛋白在生物材料領(lǐng)域的應(yīng)用，必須對(duì)絲素蛋白進(jìn)行改性以提高材料的抗凝血性能尤其是短期的抗凝血性能?，F(xiàn)有的改善絲素抗凝血性的方法主要有接枝磷酸酯類化合物和等離子體改性等，反應(yīng)條件復(fù)雜，重復(fù)性差，并且抗凝血性的改善有一定的限制，不適合大規(guī)模使用。
本發(fā)明為解決絲素蛋白抗凝血性，尤其是短期抗凝血性的簡單方法，通過共混一定量的肝素，制得力學(xué)性能優(yōu)良，不溶于水的具有良好抗凝血性的材料，其優(yōu)異的抗凝血性可以在水中保持28天以上，考慮到絲素蛋白所具有的良好的生物相容性，此方法制備的材料在血液接觸類生物材料中具有廣泛的應(yīng)用前景。
絲素蛋白一般有兩種結(jié)晶態(tài)，其中α-螺旋為易溶于水的，而β-折疊為不溶于水的結(jié)晶態(tài)。自然狀態(tài)下絲素蛋白主要以β-折疊存在，不溶于水和其它一般溶劑，可以溶解在CaCl2/水/乙醇(摩爾比1∶8∶2)三元溶液或其它濃鹽溶液中，但是絲素溶解后會(huì)破壞絲素蛋白原有的β-折疊結(jié)構(gòu)，并且在干燥成膜后主要以α-螺旋或不定型形態(tài)存在，易溶于水，這極大的限制了該材料在生物領(lǐng)域的應(yīng)用。原來制備不溶性絲素薄膜的方法主要是通過甲醇處理使其晶型轉(zhuǎn)變，我們的研究表明在合適的濃度、溫度和蒸發(fā)速率等條件下，不溶性絲素蛋白材料可以直接制得，而不需甲醇處理。這種方法使不溶性絲素蛋白薄膜的制備更為安全和簡單。另一方面，絲素蛋白的抗凝血性能很難滿足血液接觸類材料的使用要求。研究表明絲素蛋白材料在植入體內(nèi)后會(huì)立即引發(fā)凝血，但由于絲素具有良好的細(xì)胞相容性，隨著植入時(shí)間的延長，材料表面逐漸有內(nèi)皮細(xì)胞層生成，從而其血液相容性也逐漸提高，當(dāng)植入體內(nèi)28天后，內(nèi)皮細(xì)胞層就會(huì)完全覆蓋絲素表面。因此，如果提高絲素蛋白的血液相容性，尤其是開始階段的血液相容性，將使絲素蛋白在血液類生物材料領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。
肝素是最常用的抗凝血?jiǎng)?，具有良好的抗凝血性，被廣泛使用在聚氨酯等生物材料的抗凝血性的改善上。但是關(guān)于絲素同肝素共混的材料一直未見報(bào)道?？紤]到肝素為多糖，有良好的氫鍵形成的能力，與絲素都可以溶解在水溶液中，所以將肝素同絲素共混，通過氫鍵作用降低肝素的流失速率，使共混材料在較長時(shí)間內(nèi)具有優(yōu)異抗凝血性是可行的。
本發(fā)明目的是為克服絲素蛋白血液相容性差的缺點(diǎn)，利用肝素作為抗凝血?jiǎng)苽涓嗡赝z素均勻共混的機(jī)械性能良好的不溶性絲素蛋白材料的新方法。

發(fā)明內(nèi)容
將適量的肝素溶解在絲素溶液中后，攪拌，使之在低于90℃濃縮至100～500mg/ml的共混有肝素的高濃度透明絲素蛋白水溶液，將水溶液傾倒在聚苯乙烯板或玻璃板上，在干燥箱中20～200℃下?lián)]發(fā)干燥成不溶于水的絲素薄膜。
將高濃度的溶液澆鑄在不同直徑的模具中，在20～200℃下，控制干燥速度，揮發(fā)干燥成絲素蛋白管狀材料。制成具有優(yōu)異機(jī)械性能的不同直徑的不溶于水的具有血液相容性的絲素蛋白管材。
利用絲素蛋白溶液和肝素共混后，在一定溫度和高濃度下的自發(fā)晶型轉(zhuǎn)變獲得不溶于水的具有良好血液相容性的絲素薄膜或在進(jìn)一步濃縮的條件下，直接通過擠出，吹塑的方法制成管狀結(jié)構(gòu)，反應(yīng)條件溫和，成膜均勻，肝素對(duì)絲素蛋白的結(jié)晶沒有不良影響，并可以同絲素形成氫鍵，此方法適合材料的大規(guī)模制備，并在保持材料良好機(jī)械性能和生物相容性的基礎(chǔ)上，使材料提高了血液相容性。
本發(fā)明的具體實(shí)現(xiàn)是將蠶絲在0.5％的Na2CO3溶液中100℃煮60min，以除去蠶絲外部的絲膠蛋白并將煮過的絲素蛋白用蒸餾水多次洗滌后干燥，獲得純的絲素蛋白。將一定量的絲素蛋白溶于CaCl2/水/乙醇(摩爾比1∶8∶2)三元溶液或其它濃鹽溶液中，并用透析帶透析三天，以除去溶液中的氯化鈣和乙醇，從而得到純凈的絲素蛋白水溶液。將0.1～10％的肝素加入到此絲素溶液中溶解，將此水溶液經(jīng)攪拌，在低于90℃的范圍內(nèi)對(duì)此溶液進(jìn)行濃縮，獲得濃度為100～500mg/ml的透明絲素肝素混合水溶液，攪拌的目的是防止絲素溶液在濃縮過程中凝固，并給絲素以取向力，促進(jìn)絲素向β-折疊的轉(zhuǎn)變。將此高濃度的透明溶液傾倒在聚苯乙烯或玻璃板上，在溫度為20～200℃的干燥箱中干燥，控制干燥速度，制得透明的不溶于水的絲素蛋白薄膜，還可以將透明溶液傾倒在聚苯乙烯或玻璃板上后，通過將其部分覆蓋，控制溶液的揮發(fā)速度，制備透明的絲素肝素共混薄膜。
此透明溶液經(jīng)進(jìn)一步濃縮可以通過澆鑄，擠出及吹塑得到力學(xué)性能優(yōu)異的不溶于水的絲素肝素共混材料的管材。
本發(fā)明在直接制備不溶性絲素薄膜的基礎(chǔ)上，通過共混肝素的方法提高材料的抗凝血性，避免了以往制備方法和改性方法的復(fù)雜性，制備過程大大簡化。
本發(fā)明在直接制備不溶性絲素薄膜的基礎(chǔ)上，通過共混肝素的方法提高材料的抗凝血性，關(guān)鍵技術(shù)在于1.將肝素共混入絲素溶液，保持了肝素的生物活性，2.在溶液濃縮前加入肝素，避免肝素在材料中聚集，并有利于絲素同肝素之間的氫鍵形成.肝素作為性能良好的抗凝血?jiǎng)┰卺t(yī)療領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。在生物材料領(lǐng)域，為提高材料的抗凝血性，肝素的接枝和共混也是最基本的方法。肝素接枝后，可以使材料具有長效的抗凝血性，但是接枝會(huì)破壞肝素的活性基團(tuán)，從而使肝素的抗凝血性能降低。肝素共混入材料可以保持肝素的高抗凝血性，但是在一段時(shí)間后肝素會(huì)完全流失?？紤]到絲素具有良好的生物相容性，在植入體內(nèi)一段時(shí)間后在表面生成新的內(nèi)皮細(xì)胞層，從而具有良好的血液相容性，同時(shí)肝素和絲素可能形成氫鍵而使肝素可以在絲素薄膜內(nèi)較長時(shí)間的存在，所以從綜合考慮，使用肝素共混的方法是比較有效的提高絲素抗凝血性的方法?？紤]到肝素在溫度過高時(shí)活性容易降低，而在濃縮后加入又會(huì)發(fā)生肝素的聚集，將肝素在濃縮之前加入，而濃縮溫度控制在90℃以下，這樣可以在盡可能保持肝素活性的基礎(chǔ)上，絲素同肝素充分相互作用，使肝素和絲素有足夠的氫鍵形成，并均勻分布。
制備出的絲素薄膜或管材用紅外光譜，X射線衍射，以及絲素肝素共混薄膜37℃下在水中24小時(shí)的流失率來測(cè)定薄膜的結(jié)構(gòu)和在水中的溶解性。并通過甲苯氨藍(lán)實(shí)驗(yàn)測(cè)定肝素在水中24小時(shí)的流失率以及薄膜在水中浸泡28天后的抗凝血性的變化來研究肝素在材料中的流失情況。結(jié)果表明共混肝素后的絲素薄膜仍然完全不溶于水，主要結(jié)晶態(tài)為β-折疊，肝素的加入對(duì)絲素結(jié)晶沒有不良影響。絲素和肝素之間有氫鍵生成。甲苯氨藍(lán)實(shí)驗(yàn)表明肝素的流失速率隨時(shí)間的增長而降低，24小時(shí)的流失率接近13％。在水中浸泡28天后，材料仍然具有良好的抗凝血性。對(duì)材料機(jī)械性能測(cè)定發(fā)現(xiàn)其濕態(tài)的最大拉伸強(qiáng)度不小于10MPa，最大拉伸率不小于40％，機(jī)械性能優(yōu)良。材料的抗凝血性測(cè)量顯示，表示材料抗凝血性的三個(gè)指標(biāo)時(shí)間即凝血酶時(shí)間(TT)，凝血酶原時(shí)間(PT)，和部分凝血活酶時(shí)間(APTT)分別超過測(cè)量儀器的設(shè)定值，即TT＞200s，APTT＞150s，PT＞50s.而共混肝素之前，絲素抗凝血性的三個(gè)指標(biāo)分別為TT＝14.4s，APTT＝25.4s，PT＝13.0s.顯示共混肝素后該材料具有非常優(yōu)異的抗凝血性能。經(jīng)過水中浸泡28天之后仍然保持良好的抗凝血性，TT和APTT仍然大于儀器的設(shè)定值，而PT則有一定的降低(13.3s)。這使得該材料成為優(yōu)良的短效和中效抗凝血材料，考慮到該具有優(yōu)良抗凝血性的材料在體內(nèi)28天之內(nèi)可以生長出完全覆蓋的內(nèi)皮細(xì)胞層，因此該材料完全可以應(yīng)用于血液接觸材料。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)有肝素共混可以保持其良好的抗凝血性，并對(duì)絲素的結(jié)晶沒有不良影響，制備簡單，易于控制，重復(fù)性好，容易獲得質(zhì)量均勻的薄膜或管材。肝素和絲素共混后，兩者之間可以形成氫鍵從而使肝素的擴(kuò)散速率減慢，給細(xì)胞生長以充分的時(shí)間。整個(gè)過程中以水為溶劑，安全性高。因此本發(fā)明對(duì)絲素蛋白在血液接觸類材料中的應(yīng)用具有重大意義和實(shí)際價(jià)值。
實(shí)施例實(shí)施例1將蠶絲在0.5％的Na2CO3溶液中100℃煮60min，以除去蠶絲外部的絲膠蛋白并將煮過的絲素蛋白用蒸餾水仔細(xì)洗滌后干燥，獲得純的絲素蛋白。將1克絲素蛋白溶于10毫升的CaCl2/水/乙醇(摩爾比1∶8∶2)三元溶液中，將此絲素溶液在透析帶中透析三天，除去溶液中的氯化鈣和乙醇，從而得到透明的絲素溶液。稱取0～30mg的肝素加入到絲素溶液中溶解。將溶液倒入燒杯，在低于90℃水浴加熱情況下，用攪拌器輕微攪拌，揮發(fā)濃縮。將溶液濃縮至150～300mg/ml，為透明溶液。隨后將此濃溶液在聚苯乙烯板上鋪展，在干燥箱中50～200℃下干燥成膜，其厚度可以通過溶液質(zhì)量控制。所成薄膜均勻透明，抗凝血性優(yōu)良。
實(shí)施例2制備純的絲素蛋白水溶液如實(shí)施例1所示。
稱取20～50mg的肝素到絲素溶液中溶解。將溶液倒入燒杯，在低于90℃水浴加熱情況下，用攪拌器輕微攪拌，揮發(fā)濃縮。將溶液濃縮至200～350mg/ml，為透明溶液。隨后將此濃溶液在聚苯乙烯板上鋪展，在干燥箱中50～200℃下干燥成膜，其厚度可以通過溶液質(zhì)量控制。所成薄膜均勻透明，抗凝血性優(yōu)良。
實(shí)施例3制備純的絲素蛋白水溶液如實(shí)施例1所示。
稱取0～30mg的肝素加入到絲素溶液中溶解。將溶液倒入燒杯，在低于90℃水浴加熱情況下，用攪拌器輕微攪拌，揮發(fā)為150～300mg/ml的透明溶液，將此溶液在靜止?fàn)顟B(tài)下，在干燥箱中50～200℃下干燥成半凝固狀態(tài)，然后用機(jī)械擠出的方法制備出混有肝素的絲素蛋白管。
實(shí)施例4制備純的絲素蛋白水溶液如實(shí)施例1所示。
稱取0～30mg的肝素加入到絲素溶液中溶解。將溶液倒入燒杯，在低于90℃水浴加熱情況下，用攪拌器輕微攪拌，揮發(fā)為150～500mg/ml的透明溶液，將溶液倒入不同直徑的模具中，在50～200℃下干燥制備出管狀材料。
實(shí)施例5稱取0～30mg的肝素加入到絲素溶液中溶解。將溶液倒入燒杯，在低于90℃水浴加熱情況下，用攪拌器輕微攪拌，揮發(fā)濃縮。將溶液濃縮至150～300mg/ml，為透明溶液。隨后將此濃溶液在聚苯乙烯板上鋪展，在干燥箱中50～200℃下干燥成膜，將所成薄膜用二氧化硫等離子體進(jìn)行表面處理，得到細(xì)胞生長性進(jìn)一步改善的薄膜。
實(shí)施例6稱取0～30mg的肝素加入到絲素溶液中溶解。將溶液倒入燒杯，在低于90℃水浴加熱情況下，用攪拌器輕微攪拌，揮發(fā)濃縮。將溶液濃縮至150～300mg/ml，為透明溶液。隨后將此濃溶液在聚苯乙烯板上鋪展，在干燥箱中50～200℃下干燥成膜，將所成薄膜用二氧化碳等離子體進(jìn)行表面處理，得到細(xì)胞生長性進(jìn)一步改善的薄膜。
權(quán)利要求
1.一種抗凝血性不溶性絲素材料的制備方法，其特征在于將0.1～10％肝素溶解在絲素溶液中后，攪拌，使之在低于90℃濃縮至100～500mg/ml的共混有肝素的高濃度透明絲素蛋白水溶液，將水溶液傾倒在聚苯乙烯板或玻璃板上，在干燥箱中20～200℃下?lián)]發(fā)干燥成不溶于水的絲素薄膜。
2.如權(quán)利要求1所述的共混有肝素的高濃度透明絲素蛋白水溶液，其特征在于將高濃度的溶液澆鑄在不同直徑的模具中，在20～200℃下，控制干燥速度，揮發(fā)干燥成絲素蛋白管狀材料?；蚋稍镏涟肽虪顟B(tài)經(jīng)機(jī)械擠出或吹塑成管狀，制成具有優(yōu)異機(jī)械性能的不同直徑的不溶于水的具有血液相容性的絲素蛋白管材。
全文摘要
一種具有良好抗凝血性的絲素材料的制備方法，涉及生物高分子材料。選用CaCl
文檔編號(hào)A61K47/42GK1608683SQ20031010198
公開日2005年4月27日 申請(qǐng)日期2003年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月20日
發(fā)明者曹傳寶, 呂強(qiáng), 張瑛, 馬西蘭, 翟華嶂, 朱鶴孫 申請(qǐng)人:北京理工大學(xué)