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抑制sars冠狀病毒感染的中藥有效成分及其生物活性測定方法

文檔序號:1046300閱讀:645來源:國知局
專利名稱:抑制sars冠狀病毒感染的中藥有效成分及其生物活性測定方法
技術領域
本發(fā)明涉及一類抗SARS冠狀病毒藥物,具體涉及從植物中分離出的抑制SARS冠狀病毒侵染宿主細胞的有效成分。本發(fā)明還涉及利用固定化S2蛋白直接測定植物成分生物活性的方法。
背景技術
SARS病毒是一種帶囊膜的冠狀病毒,其侵染細胞的第一步就是病毒囊膜與宿主細胞的融合。若能有效抑制囊膜突起中的關鍵結構域S2蛋白,阻斷SARS病毒與宿主細胞的融合,則可防止SARS病毒侵染宿主細胞,起到預防和治療SARS的目的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是尋找SARS病毒spike蛋白中能與宿主蛋白結合的S2蛋白抑制劑,使其能阻斷SARS病毒與宿主細胞融合,從而阻斷SARS病毒侵染宿主細胞,達到預防與治療SARS的目的。
本發(fā)明創(chuàng)建了一種利用固定化S2蛋白直接測定植物成分生物活性的方法將S2蛋白偽聯(lián)到甲基丙烯酸聚合物上制成親和色譜柱,與質譜聯(lián)機后利用前沿親和色譜方法可快速從大量的植物成分中篩選出能有效結合S2蛋白的化合物。根據(jù)化合物在親和色譜柱上的保留時間判斷抑制活性的高低。還可通過質譜測定其分子量。
通過上述用固定化S2蛋白直接測定植物成分生物活性的方法,本發(fā)明從中藥五倍子中發(fā)現(xiàn)了母體結構為通式I的一類化合物具有抑制SARS冠狀病毒侵染宿主細胞的活性作用,可以達到本發(fā)明的目的 式I
其中, 式中m可以為0,1,2,3的任意整數(shù),m=0,表示O原子上接一個氫原子;m=1,表示O原子上接一個棓?;?;m=2表示O原子上接二個棓酰基,圖示為GG;m=3,表示O原子上接三個棓?;瑘D示為GGG,R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8,R9,R10;R11,R12,R13,R14,R15,R16,R17,R18表示氫原子、1-20個碳原子的烷基羥基,1-8個碳原子的烷氧基,1-20個碳原子上的?;?;(-CAH2AO)B-H(A是2或3,B是1以上的整數(shù))表示的聚亞氧烷基,或者以下述式II結構表示的的糖殘基,它們可以相同、也可以不同。
本類化合物還包括相鄰的棓酰基通過脫氫形成的化合物(圖中示意為G0),例如三棓?;?β-D-葡萄糖的柯里拉京及其衍生物,四棓?;?β-D-葡萄糖脫氫形成的化合物及其衍生物,五棓?;?β-D-葡萄糖脫氫形成的化合物及其衍生物等。
式(II)式I化合物屬于水解類單寧,主要富含于中國五倍子、土耳其五倍子等植物。
式I化合物還包括其水合物。
式I化合物可以形成各種可藥用的鹽。
將式I化合物與藥學上可接受的輔劑結合,可以制備治療和預防SARS病毒感染的藥物。
本發(fā)明對式I化合物進行了如下藥效學實驗1.采用SARS冠狀病毒(SARS Cornavirus,下面簡稱SARS-CoV)假病毒侵染系統(tǒng)進行抗SARS-CoV研究。
HIV-luc/SARS-CoV假病毒檢測系統(tǒng)是一種簡便、安全的SARS-CoV檢測系統(tǒng)。HIV-luc/SARS-CoV假病毒是用SARS-CoV的囊膜蛋白包裹env基因突變并攜帶luciferase基因的HIV核衣殼形成的SARS-CoV模擬病毒。這種假病毒能夠入侵SARS-CoV的宿主細胞VERO E6細胞,但由于缺少囊膜蛋白基因,不能繼續(xù)產生子代病毒,因而只能進行一輪侵染。假病毒侵染模型可以模擬病毒的入侵過程,因而利用這種模型可以篩選抑制病毒入侵的藥物、檢測病毒中和抗體。目前,這一方法已普遍使用于HIV-1的中和抗體檢測和藥物篩選。
2.SARS-CoV真病毒侵染模型,進行式I化合物的抗SARS-CoV研究。
本發(fā)明還進行了式I化合物的細胞毒性實驗。
以上藥理毒理學實驗結果證實,本發(fā)明提供的式I化合物可抑制SARS冠狀病毒侵染宿主細胞,且對細胞毒性低,可作為抗SARS病毒感染的藥物。


圖1是前沿親和色譜柱的系統(tǒng)示意圖,其中1是ESI-TOF MS,2是三通閥,3是親和色譜柱,4、5分別是進樣器A和B;圖2是五倍子粗提物的質譜圖,其主要成分的編號與實施例2中表1中編號一致;
圖3是來自圖2中主要化合物的前沿色譜圖。圖3表示保留時間和強度的關系。
圖4是式I化合物對SARS-CoV假病毒的抑制實驗結果。圖中l(wèi)ucifease活性%表示luciferase活性抑制百分比,C[mol/L]表示式I化合物的濃度(單位為摩爾/升)。
具體實施例方式
實施例1式I化合物的獲得1.提取取干燥五倍子粉碎到適當粒度,用50%丙酮-水室溫浸提3次,每次24小時。回收溶劑至小體積。
以氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分別與水進行分配,分出氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水各個部分,進行減壓濃縮得氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水浸膏。
將乙酸乙酯部分用葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱層析分離,以甲醇-水-丙酮溶劑進行梯度洗脫,聚酰胺薄膜薄層檢測,用紫外光和三氯化鐵溶液顯色指示餾分。得到包括二棓?;?、三棓酰基、四棓?;咸烟谴制泛鸵晕迦〈鷹旛;?β-D-葡萄糖核上的C-2、C-3、C-4有任意分布的縮酚酸棓?;奈宓绞旛;咸烟谴制?。
二棓酰基、三棓酰基、四棓?;咸烟谴制贩謩e反復經過Sephadex LH-20柱層析純化,以甲醇-水-丙酮溶劑進行梯度洗脫,聚酰胺薄膜薄層檢測,用紫外光和三氯化鐵溶液顯色指示餾分。甲醇-水重結晶分別得到二棓?;⑷龡旛;⑺臈旛;咸烟羌兤?。
以五取代棓?;?-D-葡萄糖核上的C-2、C-3、C-4有任意分布的縮酚酸棓?;奈宓绞旛;咸烟谴制贩謩e反復經過Sephadex LH-20柱層析純化,以甲醇-水-丙酮溶劑進行梯度洗脫,聚酰胺薄膜薄層檢測紫外光和三氯化鐵溶液顯色指示餾分進一步提純。再以制備色譜反相柱材料、甲醇-水-草酸洗脫、紫外光(λ=280nm)檢測純化制備五到十二棓?;咸烟羌兤?。
2.二棓?;?、三棓?;⑺臈旛;咸烟呛鸵晕迦〈鷹旛;?β-D-葡萄糖核上的C-2、C-3、C-4有任意分布的縮酚酸棓?;奈宓绞旛;咸烟茄苌锵盗谢衔?。
對棓?;系姆恿u基的烷基化衍生物,根據(jù)碳原子個數(shù)可分為低級酯(如甲酯、乙酯、丙酯等)和高級酯(如辛酯、月桂酯、十八碳醇酯等)和特殊的酯(如甘油醇酯)。對甲苯磺酸做催化劑,二氧六環(huán)為溶劑制備烷基化衍生物,其具有更好的脂溶性。
對棓?;系姆恿u基的烷氧基化衍生物,對棓?;系姆恿u基進行烷氧基化反應(如甲氧基化反應、乙氧基化反應、丙氧基化反應等)。
實施例2利用固定化S2蛋白直接測定植物成分生物活性利用S2蛋白偽聯(lián)到自制的甲基丙稀酸聚合物上制成親和色譜柱與質譜聯(lián)機后通過前沿色譜方法從實施例1所得的五倍子活性部位、粗提物中篩選出能與S2蛋白結合的活性物質。
將5.0毫克的S2蛋白溶于0.5ml DMSO,再加2.8mg的EDCI作為活化試劑,然后在0.1M NaHCO3的緩沖液(pH=7)中偽聯(lián)到甲基丙烯酸聚合物載體上,最后得到在1g載體上固定化3.0mg的S2蛋白。在將固定化S2蛋白裝在2.1×30mm親和柱上,用2mMNH4Ac溶液(pH6.7)平衡4小時,用圖1裝置進行篩選。
將500μl五倍子粗提物用2mM NH4AC配成0.1mg.ml-1濃度注入進樣器A中,同時將500μl甲醇溶劑注入進樣器B中,使兩種溶液以5μl.min-1的速度進入三通閥混合,混合溶液進入ESI-TOF檢測。
表1 五倍子中10個主要成份的保留時間

表2 表1中兩個保留時間最長的化合物對SARS活病毒的抑制活性數(shù)據(jù)

*C表示完全抑制SARS病毒時化合物的濃度實施例3式I化合物對細胞的毒性
1.實驗材料受試式I化合物結構如下 細胞系Vero E6,用DMEM+10%FBS培養(yǎng)2.實驗方法用DMEM+2%FBS將受試化合物進行連續(xù)倍比稀釋,取經稀釋的受試化合物50微升加入到96孔板中長成單層的VERO E6細胞中,每個稀釋度接種8個孔,37攝氏度CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)60-72小時后,各孔加入MTT(5毫克/毫升)10微升,繼續(xù)培養(yǎng)4小時,吸去培養(yǎng)基,于各孔中加入100微升DMSO,稍稍振蕩,于570納米(參考波長630納米)波長測定OD值。
3.實驗結果得到受試化合物對VERO E6細胞的半數(shù)毒性濃度(CC50)為851.1微克/毫升。實施例4對SARS假病毒的抑制實驗1.實驗材料1)細胞系293T,Vero E6用DMEM+10%FBS培養(yǎng)2)質粒攜帶人源化SARS-CoV的S蛋白的表達質粒pCMV-hs和報告質料pHIV-luc由本實驗室提供3)受試式I化合物結構同實施例32.實驗方法1)產生HIV-SARS假病毒培養(yǎng)293T細胞,轉染前一天將293T細胞傳代至10厘米培養(yǎng)皿中,使細胞密度為2×106細胞/孔,pHIV-luc和pCMV-hs表達質粒共轉染293T細胞,構建假病毒a)取pHIV-luc和pCMV-hs表達質粒各10微克置450微升滅菌水中,混勻,加入62微升2摩爾CaCl2,混勻;b)取500微升2×HBS置5毫升試管中,以2滴/秒的速率加入DNA/CaCl2,加完后,輕彈管壁混勻;c)將上述1毫升沉淀中逐滴加入10厘米培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細胞上清中,輕輕混勻,置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時d)收取細胞的培養(yǎng)上清,1000轉/分離心5分鐘,取上清做0.45微米濾膜過濾。
2)侵染抑制實驗a)于96孔板傳Vero E6(2×103細胞/孔),24小時后用于制備的假病毒侵染b)取制備的假病毒50微升與用3%DMEM倍比稀釋的受試化合物50微升于37攝氏度孵育30分鐘,然后于上述假病毒/受試化合物混合物中加入到96孔板中c)上述96孔板置CO2孵箱48小時后用Wallac Microbeta 1420 Counter作luciferase檢測(Promega Luciferase Assay Kit)。
3.實驗結果結果見附圖4所示。得到受試化合物半數(shù)有效濃度為(EC50)為3.4微克/毫升,CC50為851.1微克/毫升。
根據(jù)以上所得受試化合物的CC50值和EC50值,計算出受試化合物藥物篩選指數(shù)SI(selective index,CC50/EC50)為250.32。
實施例5對SARS真病毒的抑制實驗1.實驗材料細胞系Vero E6用DMEM+10%FBS培養(yǎng)受試式I化合物結構同實施例3對照藥物甘草甜素2.實驗方法1)從病人組織標本中分離SARS-CoVa)在細胞培養(yǎng)瓶中接種Vero E6細胞,于CO2孵箱培養(yǎng)24小時b)取SARS尸解肺組織標本,在預冷的乳缽中研成勻漿,加入適量的病毒稀釋液(含500單位/毫升青霉素、500單位/毫升鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,pH7.2),180g離心20分鐘,取上清接種于1)步中已長成單層的VERO-E6,37℃吸附1小時,吸出標本液,加入含有2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,37攝氏度,CO2孵箱培養(yǎng)48小時至細胞出現(xiàn)典型細胞病變,收取細胞培養(yǎng)上清,180g離心20分鐘,含病毒的上清培養(yǎng)液分裝置-80攝氏度保存。
c)病毒滴度測定取100微升上述分離的含病毒培養(yǎng)上清用DMEM作10×連續(xù)稀釋,加入到96孔板中長成單層的VERO E6細胞中,每個稀釋度接種8個孔,CO2孵箱培養(yǎng)72小時,各孔加入MTT(5毫克/毫升)10微升,繼續(xù)培養(yǎng)4小時,吸去培養(yǎng)基,于各孔中加入100微升DMSO,稍稍振蕩,于570納米(參考波長630納米)波長測定OD值,用Reed andMuench法計算病毒滴度(TCID50)。
2)SARS-CoV活病毒入侵細胞抑制實驗用DMEM+2%FBS將受試化合物進行連續(xù)倍比稀釋,取經稀釋的受試化合物50微升與200 TCID50的SARS-CoV活病毒混合,37攝氏度結合30分鐘后加入到96孔板中長成單層的VERO E6細胞中,每個稀釋度接種8個孔,37攝氏度CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)60-72小時后,各孔加入MTT(5毫克/毫升)10微升,繼續(xù)培養(yǎng)4小時,吸去培養(yǎng)基,于各孔中加入100微升DMSO,稍稍振蕩,于570納米(參考波長630納米)波長測定OD值。
用甘草甜素作為陽性對照藥物同時進行如上抑制實驗。
3.實驗結果見下表。

討論經用真病毒和假病毒進行藥效學(二者的結果比較吻合)檢測表明,本發(fā)明提供的式I化合物具有較好的對抗SARS-CoV的作用。與已報道的甘草甜素(EC50值和SI值分別為600微克/毫升和8.3,J Cinatl Lancet.2003 Jun 14;361(9374)2045-6)相比較,本發(fā)明的化合物的抗SARS-CoV的作用優(yōu)于甘草甜素。
權利要求
1.用式I化合物制備抑制SARS冠狀病毒感染的藥物的用途, 式I其中, 式中m可以為0,1,2,3的任意整數(shù),m=0,表示O原子上接一個氫原子;m=1,表示O原子上接一個棓?;?;m=2表示O原子上接二個棓?;?,圖示為GG;m=3,表示O原子上接三個棓酰基,圖示為GGG,R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8,R9,R10;R11,R12,R13,R14,R15,R16,R17,R18表示氫原子、1-20個碳原子的烷基羥基,1-8個碳原子的烷氧基,1-20個碳原子上的酰基;(-CAH2AO)B-H(A是2或3,B是1以上的整數(shù))表示的聚亞氧烷基,或者以下述式II結構表示的的糖殘基,它們可以相同,也可以不同;式I化合物還包括相鄰的棓酰基通過脫氫形成的化合物。 式(II)
2.權利要求1所述的用途,其中式I化合物是
3.權利要求1所述的用途,其中式I化合物包括其水合物。
4.權利要求1或3所述的用途,其中式I化合物包括其可藥用的鹽。
5.一種利用固定化S2蛋白直接測定植物成分生物活性的方法,其特征是將S2蛋白偶聯(lián)到甲基丙烯酸聚合物上制成親和色譜柱,與質譜聯(lián)機后利用前沿親和色譜方法從植物中篩選能有效結合S2蛋白的化合物;根據(jù)化合物在親和色譜柱上的保留時間判斷抑制活性的高低,并通過質譜測定化合物的分子量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類從植物中分離出的抑制SARS冠狀病毒侵染宿主細胞的有效成分,其結構母體為如通式I。本發(fā)明采用SARS假病毒侵染系統(tǒng)和真病毒侵染模型,對式I化合物進行了抗SARS冠狀病毒研究,證實其對SARS冠狀病毒具有抑制作用,可用于治療和預防SARS病毒感染。本發(fā)明還涉及利用固定化S2蛋白直接測定植物成分生物活性的方法。
文檔編號A61P11/00GK1602853SQ200310101980
公開日2005年4月6日 申請日期2003年10月20日 優(yōu)先權日2003年10月20日
發(fā)明者徐筱杰, 鄧宏魁, 陳麗蓉, 丁明孝, 段德良, 易凌, 李正全, 袁克湖, 駱宏鵬, 曲秀霞, 朱麗荔, 陳堅, 左國營, 江鵬斐, 慶婷婷, 胡建和, 聶玉春 申請人:北京大學
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