專利名稱：新的dna片段及其對(duì)腫瘤的抑制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的用于醫(yī)療用DNA片段及其表達(dá)蛋白，特別是被命名為TSF395的DNA片段及其表達(dá)蛋白，該DNA片段及其表達(dá)蛋白可用于抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
背景技術(shù)：
從分子及細(xì)胞水平上講，人類腫瘤的發(fā)生具有廣泛的一致性，涉及到許多遺傳物質(zhì)的改變，從而驅(qū)使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為致死的轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞。這些改變一般包括自我刺激增長(zhǎng)的能力；喪失對(duì)生長(zhǎng)抑制因子的敏感性；逃避細(xì)胞的凋亡過程；無限的增殖潛力；持續(xù)的血管生成；組織浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的特性。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的復(fù)雜機(jī)制、抗腫瘤藥物的非特異性以及腫瘤細(xì)胞抗藥性機(jī)制的產(chǎn)生，構(gòu)成了腫瘤藥物治療的巨大障礙。針對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)制尋找特異性的抗腫瘤藥物已成為腫瘤藥物學(xué)研究的中心課題。
目前，大量的研究集中在在人類基因組中尋找能夠抑制腫瘤的基因片段，這些研究包括尋找新的DNA和新的蛋白質(zhì)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的蛋白包括，內(nèi)皮抑制素、血管生成抑制素等，但是具有強(qiáng)大抑制腫瘤生長(zhǎng)能力的DNA和蛋白質(zhì)很難發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明的發(fā)明人在抗腫瘤藥物的研究過程中，找到了一種來源于人類細(xì)胞基因組之外的新的DNA片段，該片段與載體結(jié)合，具有強(qiáng)大的抑制腫瘤生長(zhǎng)的功效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種新的DNA片段，本發(fā)明還提供它的制備以及它的應(yīng)用，特別是在腫瘤治療中的應(yīng)用。
本發(fā)明的DNA片段，其核苷酸堿基序列見序列表中序列1，本發(fā)明的DNA片段包括了它的任何一種存在形式，如它的一級(jí)結(jié)構(gòu)形式、二級(jí)結(jié)構(gòu)形式以及任何可存在的形式。
本發(fā)明的DNA片段，還包括列表中序列1的延長(zhǎng)或截短的DNA片段或其同義密碼子突變的DNA片段或其個(gè)別密碼子突變的DNA片段。
本發(fā)明的DNA片段，是通過以下方式篩選出來的
Anip973細(xì)胞一種腫瘤細(xì)胞，是人類肺腺癌細(xì)胞，通過對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，獲得培養(yǎng)液培養(yǎng)液的組成為Anip973細(xì)胞、DMEM培養(yǎng)基、小牛血清。
本發(fā)明的DNA片段存在于上述Anip973細(xì)胞的培養(yǎng)液中。從該培養(yǎng)液中可分離出本發(fā)明的DNA片段。
在對(duì)Anip973細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)過程中，時(shí)間為48小時(shí)，發(fā)現(xiàn)有4瓶培養(yǎng)液中腫瘤細(xì)胞Anip973生長(zhǎng)受到抑制，以此為起點(diǎn)，我們找到了本發(fā)明的DNA片段，并證明是該DNA片段在其中起作用。
通過以下方法可以分離出該DNA片段，過程如下取生長(zhǎng)受到抑制的Anip973細(xì)胞的培養(yǎng)液，將細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩遍，所得清洗液與上述所得培養(yǎng)液合并，取出1/10體積此細(xì)胞培養(yǎng)液用于無菌狀態(tài)下培養(yǎng)，檢測(cè)此培養(yǎng)液中是否含有常規(guī)培養(yǎng)條件下可生長(zhǎng)的細(xì)菌。另9/10體積細(xì)胞培養(yǎng)液在4℃，60000rpm離心1h，棄上清后得沉淀物。用TE緩沖液溶解沉淀物，用蛋白酶K消化。酶解完成后，加入一定體積飽和酚充分混勻，6000rpm，室溫離心，在所得上清中再加入等量體積的氯仿，充分混勻后，6000rpm，室溫離心，取出上清后，加入1/10體積3mol/L pH5.2 NaAc溶液，混勻后，再加入2.5倍體積的無水乙醇，混勻，-70℃保存一定時(shí)間后，4℃，15000rpm離心后，棄上清。所得沉淀物用70％冷乙醇洗滌一次，10000rpm離心，去上清后涼干沉淀物，溶于TE緩沖液中，用濃度為1％的低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳，溴化乙錠染色后，紫外燈下切下大小約為“25kb”電泳帶，65℃10min溶化此凝膠塊，采用瓊脂糖酶消化及苯酚-氯仿抽提和無水乙醇沉淀方法純化此“25kb”大小的DNA片段。
分離出該DNA片段后通過以下方法測(cè)序測(cè)序質(zhì)粒的構(gòu)建及陽性克隆分析pSI-TSF395/DH5α的構(gòu)建用BamHI和BglII雙酶切來源于Promema公司的pSI質(zhì)粒載體，雙酶切質(zhì)粒載體產(chǎn)生大小為2658bp及974bp的兩個(gè)片段，1％低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳回收大小為2658bp的載體片段，純化回收此DNA片段。將此DNA片段脫磷酸處理，純化回收質(zhì)粒DNA片段備用。部分酶切此大小約為“25kb”的DNA成分DNA(0.35μg/μl)10μl，10×反應(yīng)緩沖液5μl，稀釋后的限制性內(nèi)切酶Sau3A1(0.1u/μl)0.1μl，加水34.9μl至總反應(yīng)體積50μl，37℃酶解1h，用苯酚-氯仿抽提，無水乙醇沉淀此DNA成分。將經(jīng)Sau3A1酶切得到的大小不等的DNA片斷混合物與上述雙酶切得到的pSI 2658bp載體片段連接，2658bp載體片段經(jīng)雙酶切后兩端均含有GATC粘性末端，此GATC粘性末端與Sau3A1部分酶解DNA產(chǎn)生的GATC粘性末端可經(jīng)連接反應(yīng)構(gòu)成重組質(zhì)粒(重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖1所示)。連接反應(yīng)載體1μl，插入片段1μl，10×連接反應(yīng)緩沖液1μl，T4 DNA連接酶1μl，加水6μl至總體積10μl，16℃過夜。取出此連接反應(yīng)液2μl轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α。轉(zhuǎn)化后DH5α細(xì)菌涂于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板過夜。挑選40個(gè)不同菌落進(jìn)行微培養(yǎng)，采用Promega公司的“質(zhì)粒純化試劑盒”提取質(zhì)粒DNA。限制性內(nèi)切酶Pvu1酶切可用于鑒定含有DNA插入片段的重組質(zhì)粒。pSI載體上含有兩個(gè)Pvu1酶切位點(diǎn)，分別位于1008及2358堿基處，經(jīng)BglII和BamHI酶解后的2658bp載體片段如發(fā)生自身環(huán)化，再經(jīng)Pvu1酶解后，可產(chǎn)生大小為1350bp及1308bp的兩片段。此兩片段在瓊脂糖凝膠電泳上很難分開，呈現(xiàn)為單一區(qū)帶。DNA片段插入到BglII和BamHI酶切位點(diǎn)之間將增加1350bpDNA片段的長(zhǎng)度，而使其與1308bp片段相分離。
陽性克隆的DNA序列測(cè)定將上述方法篩選得到的30個(gè)陽性克隆從兩端進(jìn)行DNA序列測(cè)定，測(cè)序方法采用ABI公司出產(chǎn)的Prism 3700DNA自動(dòng)熒光測(cè)序儀完成。測(cè)序引物選自插入片段兩端的pSI載體序列。5’端引物為5’-tacggttcctggccttttg-3’，3’端引物為5’-ttcacgctgcgcaactgttggg-3’。長(zhǎng)插入片段的克隆還采用了相應(yīng)的內(nèi)引物完成其全序列測(cè)定。所有插入片段的序列經(jīng)2-3次重復(fù)測(cè)序以保證插入片段序列的準(zhǔn)確無誤。
利用DNA測(cè)序方法從兩端對(duì)各插入片段進(jìn)行了測(cè)序分析，在已完成測(cè)序的30個(gè)陽性克隆中，插入片段大小由74bp到2140bp不等。
DNA插入片段的信息分析利用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)獲得的插入片段序列進(jìn)行了如下的信息分析利用Blast系統(tǒng)分析各插入片段與DNA庫中已知序列的同源性比較；利用Sequencher系統(tǒng)確定各插入片段可能存在的閱讀框架結(jié)構(gòu)(Open Reading Frame，ORF)及其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，經(jīng)過以上分析，我們得到的DNA片段是序列表1中顯示的DNA片段序列。
將含有序列1的DNA序列的陽性克隆的DH5α命名為pSI-TSF395/DH5α。保存在含30％甘油的LB培養(yǎng)基中，-70℃貯存。
陽性克隆(pSI-TSF395)含有編碼395個(gè)氨基酸的閱讀框架。序列2提供了此片段編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
通過以上方法獲得的本發(fā)明的DNA片段，通過被轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α中，于2003年被保存在中國(guó)微生物保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏號(hào)為CGMCC No.1024，分類命名為大腸埃希氏菌，pSI-TSF395/DH5α。
本發(fā)明的DNA片段，可通過培養(yǎng)上述保藏的大腸桿菌DH5α分離提取獲得，該方法的主要內(nèi)容為在無菌條件下，用接菌環(huán)取一甘油管保存的pSI-TSF395/DH5α工程菌，接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37℃，220rpm搖床震蕩培養(yǎng)過夜。收集培養(yǎng)液，離心收集菌體，用promega公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取制備pSI-TSF395質(zhì)粒。用BamHI和BglII雙酶切pSI-TSF395質(zhì)粒，1％低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳，回收1541bp的插入片段。
本發(fā)明的DNA片段，也可通過PCR技術(shù)，從含有該片段的上述被保藏的大腸桿菌DH5α中分離合成。該技術(shù)所采用的主要方法是在無菌條件下，用接菌環(huán)取一甘油管保存的pSI-TSF395/DH5α工程菌，接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基37℃，220rpm搖床震蕩培養(yǎng)過夜。收集培養(yǎng)液，離心收集菌體，用promega公司的質(zhì)粒試劑盒提取制備pSI-TSF395質(zhì)粒。以pSI-TSF395質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增，0.8％瓊脂糖電泳回收。
對(duì)本發(fā)明的DNA片段進(jìn)行了以下功效方面的實(shí)驗(yàn)首先制備含有TSF395等DNA片段表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Nhe1及Not1雙酶切真核細(xì)胞表達(dá)載體pCI質(zhì)粒，再用Klenow片段處理雙酶切后的質(zhì)粒載體。經(jīng)上述酶切處理后，4006bp大小的pCI載體被切割為3960bp及46bp兩個(gè)片段。0.8％低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳回收3960bp質(zhì)粒片段備連接反應(yīng)用。將上述提到的pSI-TSF395克隆先用限制性內(nèi)切酶BglII和BamHI雙酶切，再用Klenow片段處理雙酶切后的DNA片段，經(jīng)上述酶切處理后，pSI-TSF395質(zhì)粒被切割為大小分別為2658bp的載體部分及1541bp的TSF395插入片段部分。1％低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳回收1541bp大小的插入片段，經(jīng)瓊脂糖酶純化后將此插入片段與上述已制備的pCI3960bp載體DNA連接。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，采用與測(cè)序質(zhì)粒克隆類似的方法經(jīng)PvuI酶解篩選陽性克隆?；蛐蛄蟹治鲨b定插入片段的方向并證實(shí)插入片段的序列，將方向正確，DNA序列無誤的重組質(zhì)粒命名為pCI-TSF395。
重組質(zhì)粒pCI-TSF395瞬時(shí)轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞Anip973及BGC823利用脂質(zhì)體試劑DOTAP將重組質(zhì)粒pCI-TSF395轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞Anip973及BGC823，具體操作步驟如下37℃，5％CO2條件下，在含有5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)，備DNA轉(zhuǎn)染用。每種細(xì)胞設(shè)定三個(gè)實(shí)驗(yàn)組pCI-TSF395質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、pCI載體對(duì)照組、無DNA對(duì)照組。每個(gè)樣品做三個(gè)平行樣。先將轉(zhuǎn)染用DNA 15ug用Hepe’s液稀釋至75ul，然后在另一1.5ml管中將45ul DOTAP液稀釋至150ul，將相應(yīng)組的轉(zhuǎn)染用DNA與DOTAP稀釋液緩慢均勻混合，室溫下放置30min。在此期間用胰酶收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞，計(jì)數(shù)后，用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞至每100ul含有5000個(gè)細(xì)胞，將上述制備好的轉(zhuǎn)染液與5ml稀釋的細(xì)胞緩慢充分混合，分裝于96孔板的相應(yīng)孔中，轉(zhuǎn)染后12h，用新鮮培養(yǎng)液替換轉(zhuǎn)染液，直至24h，48h及72h三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)用WST-1測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)率。
三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)通過WST-1試劑檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖3及圖4所示，與對(duì)照轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)入pCI-TSF395質(zhì)粒組在兩組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)皆呈現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，Anip973及BGC823細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制達(dá)68％及64％，應(yīng)該視為非常有效的腫瘤生長(zhǎng)抑制劑。
本發(fā)明的DNA片段的應(yīng)用本發(fā)明的DNA片段可通過常規(guī)技術(shù)利用基因重組法獲得其表達(dá)的蛋白，該技術(shù)的主要內(nèi)容如下TSF395DNA片段可以應(yīng)用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)插入任何真核細(xì)胞或原核細(xì)胞的表達(dá)載體中，從而轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞或原核細(xì)胞構(gòu)建工程細(xì)胞株或工程菌，利用真核細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)或發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行工業(yè)化的生產(chǎn)，從培養(yǎng)液或發(fā)酵液中使用本領(lǐng)域的分離純化技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，序列2提供了本發(fā)明的DNA片段編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
通過本發(fā)明的DNA片段獲得的序列2的表達(dá)蛋白具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，可以將其制成醫(yī)療用的抗腫瘤藥物制劑，這些制劑可通過常規(guī)技術(shù)制備，這些制劑可以是重組蛋白的凍干粉針劑型，水針劑型，脂質(zhì)體包裹的口服劑型，脂質(zhì)體包裹的注射劑型，各種靶向制劑，各種復(fù)方制劑，口服給藥制劑，控釋制劑，緩釋制劑等。
在將序列2的表達(dá)蛋白制成藥物制劑的過程中，可以加入藥物可接受的載體，這些載體可以是淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、甘露醇、山梨醇、丙二醇、丙三醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。
序列2的表達(dá)蛋白制成藥物制劑，其中活性成分占制劑總重量的0.1％-99.9％，其余為藥物可接受的載體，每劑藥劑中含有活性成分0.01mg-2000mg。
序列2的表達(dá)蛋白制成藥物制劑在應(yīng)用時(shí)優(yōu)選的采用注射方式給藥，可采用靜脈注射、局部注射、肌肉注射、定向注射，靶向注射，鞘內(nèi)注射等方法。
本發(fā)明的DNA片段也可通過常規(guī)技術(shù)用于基因治療，將其用于基因治療的主要技術(shù)內(nèi)容為將本發(fā)明的DNA片段重組到腺病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，各種真核細(xì)胞表達(dá)載體等載體中，利用基因治療技術(shù)如脂質(zhì)體包裹，基因槍等，對(duì)腫瘤病人實(shí)施治療。帶有本發(fā)明的DNA片段的載體可以制備成穩(wěn)定的各種基因注射劑或口服劑，用于腫瘤的治療或輔助治療。
本發(fā)明的DNA片段及其編碼的蛋白質(zhì)具有良好的抗腫瘤活性，產(chǎn)品易得而且穩(wěn)定，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，副作用小，是一種優(yōu)良的抗腫瘤藥物。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實(shí)施例1 分離提取DNA片段1.取生長(zhǎng)受到抑制的Anip973細(xì)胞的培養(yǎng)液，將細(xì)胞用PBS洗兩遍，所得清洗液與上述所得培養(yǎng)液合并，4℃，60000rpm離心1h，棄上清后得沉淀物。
2.用400μlTE緩沖液分別溶解沉淀物，加入濃度為20μg/μl的蛋白酶K 5μl，50℃條件下消化4h。酶解完成后，加入飽和酚400μl充分混勻，6000rpm，室溫離心5min，在所得上清中再加入400μl氯仿，充分混勻后，6000rpm，室溫離心5min，取出上清后，加入1/10體積3mol/L pH5.2 NaAc溶液，混勻后，再加入2.5倍體積的無水乙醇，混勻，-70℃保存20min后，4℃，15000rpm離心15min后，棄上清。所得沉淀物用1ml 70％冷乙醇洗滌一次，10000rpm離心10min，去上清后涼干沉淀物，溶于200μl TE緩沖液中。
3.低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收DNA片段取出20μl上步所得TE溶液，用濃度為1％的低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳，溴化乙錠染色后，紫外燈下切下大小約為“25kb”電泳帶，65℃10min溶化此凝膠塊，采用瓊脂糖酶消化及上述提及的苯酚-氯仿抽提和無水乙醇沉淀方法純化此“25kb”大小的DNA片段。
4.用BamHI和BglII雙酶切來源Promema公司的pSI質(zhì)粒載體，雙酶切質(zhì)粒載體產(chǎn)生大小為2658bp及974bp的兩個(gè)片段，1％低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳回收大小為2658bp的載體片段，純化回收此DNA片段。將此DNA片段脫磷酸處理DNA 8μl，10×CIAP緩沖液1μl，濃度為10u/μl的CIAP 1μl，50℃消化1h，純化回收質(zhì)粒DNA片段備用。部分酶切上步所得大小約為“25kb”的DNA成分DNA(0.35μg/μl)10μl，10×反應(yīng)緩沖液5μl，稀釋后的限制內(nèi)切酶Sau3A1(0.1u/μl)0.1μl，加水34.9μl至總反應(yīng)體積50μl，37℃酶解1h，用苯酚-氯仿抽提，無水乙醇沉淀此DNA成分。將經(jīng)Sau3A1酶切得到的大小不等的DNA片斷混合物與上述雙酶切得到的PSI 2658bp載體片段連接，2658bp載體片段經(jīng)此二酶酶解后兩端均含有GATC粘性末端，此GATC粘性末端與Sau3A1部分酶解DNA產(chǎn)生的GATC粘性末端可經(jīng)連接反應(yīng)構(gòu)成重組質(zhì)粒。連接反應(yīng)載體1μl，插入片段1μl，10×連接反應(yīng)緩沖液1μl，T4 DNA連接酶1μl，加水6μl至總體積10μl，16℃過夜。取出此連接反應(yīng)液2μl轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α。轉(zhuǎn)化后DH5α細(xì)菌涂于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板過夜。挑選40個(gè)不同菌落進(jìn)行微培養(yǎng)，采用Promega公司的“質(zhì)粒純化試劑盒”提取質(zhì)粒DNA。限制性內(nèi)切酶Pvu1酶解可用于鑒定含有DNA插入片段的重組質(zhì)粒。
5.將上述方法篩選得到的30個(gè)陽性克隆從兩端進(jìn)行DNA序列測(cè)定，測(cè)序方法采用ABI公司出產(chǎn)的Prism 3700DNA自動(dòng)熒光測(cè)序儀完成。測(cè)序引物選自插入片段兩端的pSI載體序列。5’端引物為5’-tacggttcctggccttttg-3’，3’端引物為5’-ttcacgctgcgcaactgttggg-3’。長(zhǎng)插入片段的克隆還采用了相應(yīng)的內(nèi)引物完成其全序列測(cè)定。所有插入片段的序列經(jīng)2-3次重復(fù)測(cè)序以保證插入片段序列的準(zhǔn)確無誤。利用DNA測(cè)序方法從兩端對(duì)各插入片段進(jìn)行了測(cè)序分析，在已完成測(cè)序的30個(gè)陽性克隆中，插入片段大小由74bp到2140bp不等。
6.利用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)獲得的插入片段序列進(jìn)行了如下的信息分析利用Blast系統(tǒng)分析各插入片段與DNA庫中已知序列的同源性比較；利用Sequencher系統(tǒng)確定各插入片段可能存在的閱讀框架結(jié)構(gòu)(Open Reading Frame，ORF)及其可能編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，經(jīng)過以上分析，我們得到的DNA片段是序列為序列1的片段。
實(shí)施例2 培養(yǎng)保藏的大腸桿菌DH5α分離提取DNA片段1.在無菌條件下，用接菌環(huán)取一甘油管保存的pSI-TSF395/DH5α工程菌，接種于10ml含50ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化鈉，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.2)，37℃，220rpm搖床震蕩培養(yǎng)過夜。
2.收集2～3ml培養(yǎng)液，10000rpm，離心5分鐘收集菌體，用promega公司的質(zhì)粒試劑盒提取制備pSI-TSF395質(zhì)粒。
3.用BamHI和BglII雙酶切pSI-TSF395質(zhì)粒，酶切條件pSI-TSF395質(zhì)粒5ug，BamHI和BglII各1ul，10×酶切緩沖液2ul，加水至20ul，37℃酶切2小時(shí)。
4.1％低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳，溴化乙錠染色后，紫外燈下切下大小約為“1.5kb”電泳帶，65℃10min溶化此凝膠塊，采用瓊脂糖酶消化及上述提及的以及本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的苯酚-氯仿抽提和無水乙醇沉淀方法純化此“1.5kb”大小的DNA片段，回收1541bp的插入片段。
實(shí)施例3 PCR技術(shù)合成DNA片段1.在無菌條件下，用接菌環(huán)取一甘油管保存的pSI-TSF395/DH5α工程菌，接種于10ml含50ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化鈉，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.2)，37℃，220rpm搖床震蕩培養(yǎng)過夜。2.收集2～3ml培養(yǎng)液，10000rpm，離心5分鐘收集菌體，用promega公司的質(zhì)粒試劑盒提取制備pSI-TSF395質(zhì)粒。
3.以pSI-TSF395質(zhì)粒為模板，5’端引物為5’-tacggttcctggccttttg-3’，3’端引物為5’-ttcacgctgcgcaactgttggg-3’，進(jìn)行PCR反應(yīng)，pSI-TSF395質(zhì)粒1ul，10×PCR緩沖液5ul，上游引物(10uM)和下游引物(10uM)各1ul，dNTP1ul，25mM MgCI2 5ul，DMSO 5ul，pfu 1ul，H2O 30ul，94℃2分鐘，循環(huán)程序94℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃3分鐘，35個(gè)循環(huán)，72℃保溫8分鐘，0.8％瓊脂糖電泳回收。
實(shí)施例4 DNA片段對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制實(shí)驗(yàn)利用脂質(zhì)體試劑DOTAP將重組質(zhì)粒pCI-TSF395轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞Anip973及BGC823，具體操作步驟依據(jù)廠家推薦的方法37℃，5％CO2條件下，在含有5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)，備DNA轉(zhuǎn)染用。每種細(xì)胞設(shè)定三個(gè)實(shí)驗(yàn)組pCI-TSF395質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、pCI載體對(duì)照組、無DNA對(duì)照組。每個(gè)樣品做三個(gè)平行樣。先將轉(zhuǎn)染用DNA 15ug用Hepe’s液稀釋至75ul，然后在另一1.5ml管中將45ul DOTAP液稀釋至150ul，將相應(yīng)組的轉(zhuǎn)染用DNA與DOTAP稀釋液緩慢均勻混合，室溫下放置30min。在此期間用胰酶收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞，計(jì)數(shù)后，用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞至每100ul含有5000個(gè)細(xì)胞，將上述制備好的轉(zhuǎn)染液與5ml稀釋的細(xì)胞緩慢充分混合，分裝于96孔板的相應(yīng)孔中，轉(zhuǎn)染后12h，用新鮮培養(yǎng)液替換轉(zhuǎn)染液，直至24h，48h及72h三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)用WST-1測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)率。


圖1為pSI-TSF395重組測(cè)序質(zhì)粒結(jié)構(gòu)2為pCI-TSF395重組真核表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)3為pCI-TSF395重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)人肺癌細(xì)胞株Anip973生長(zhǎng)的抑制作用圖4為pCI-TSF395重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)人腸癌細(xì)胞株BGC823生長(zhǎng)的抑制作用序列表<110>哈藥集團(tuán)技術(shù)中心<120>新的DNA片段及其對(duì)腫瘤的抑制<160>3<210>1<211>1541<212>DNA<213>人工序列<223>DNA片段存在于生長(zhǎng)受到抑制的Anip973細(xì)胞的培養(yǎng)液中，從該培養(yǎng)液中分離出的DNA片段<400>1gatctctgcc ggctggtggg agtccggccc gcccagcagg cccaggagca tcgaggtatc 60gtgcatcttg cctttgccga aacagtgttc ggcgatgcat gggagtcaga agctgcccgg 120cttggcgacg cgtgccttcc acatctctac gacgtgcggg tccatctgct tgtcgaattc 180aggggtcgct gatgaagtgg ttgatgtcca agatccgcag gggcatgggt acgttgctgc 240gttcctgcag atcgtcgagg ccatcgccgt tgctcgaggg gggggatgtg tttgtggcca 300gccgcgacgg gctgaccacg gtgggattca cggtggcgtg ctgacgctgg ggctcatgtg 360ctgttgcgga accggtgggc aaacgcatcc gtcgccccga ccagagtgtg gaccgtggcc 420ggtttgttcg ggctgtggcc aggggtctct ttcaagcaat tcagtttcga tgttcgccgg 480tactggacgt gcgtttggct gtccatttct caaaagaggg ggagccgtta acgtaatccg 540gttcccaaag ccacgaaccg ccactggttt caaaccagag cacggtctcg tctcgaccat 600ctccgtaaag gtgaaagtgg ccaagcgcgg gctccgatat gctggtaagc aaataatgaa 660attctccact gaaggaaccg gcggactcat cgaacttttt aatagccaga cggaatacgt 720tactggatca gtcggcagcg gcgcttccga aggccgcggc gcacaggtga tgcgagaggc 780ctgtgcctgc aaggcccgca acaggcgcgg caaggatggc gtcagtcgga acggcgtgcg 840cacgctctcc ggacgcgcat ggcggtcgcc caagtcgatc ttccggacgc gcaaatcggc 900gtcagcctct attccaggaa cggcgacggc aacaaagaag aaatcgacaa gcagcccggc 960cggaccatcg gtggctattt cctgcgtctg cggagccggg gtgcggtgcg cattcaatgg 1020ggggacgcca gggttccacc ccggatcaac gccaattact ggagccccac ggaagtcggc 1080
cgggttggcg ggggatatcg cgcgtgtctt caaccaacag aattcgcatg gacagtgtct 1140ccgtacgcag tacgggccgt gttggctcgc gcagcttcag gccaaggggg gctccgaaag 1200cctcgagttt ggcgcccgca cgcccgttga agagggagaa tcaccngagg cttccgaata 1260ctccgactgc tgggtcgatt aagcccgcca tggtacgtgc ttaacgccat ggcggcccgc 1320gagaaaggcg cacacatcct cacgcagacc cgttgcgtca gcgcccatcg cgccsscggc 1380cagtgggaaa tgaacatgga gcgtgccgac ggcagcctgt tctcgatctc ggggaagtac 1440agcggcagat agtgggtcag gatcagttat ccacagggct gacgctgctc ggcgtactgt 1500tcggccntgc ccaactcttg ttggccagta tttcgaggat c 1541<210>2<211>395<212>PRT<213>人工序列<400>2Met His Gly Ser Gln Lys Leu Pro Gly Leu Ala Thr Arg Ala Phe His Ile Ser Thr Thr15 10 15 20Cys Gly Ser Ile Cys Leu Ser Asn Ser Gly Val Ala Asp Glu Val Val Asp Val Gln Asp25 30 35 40Pro Gln Gly His Gly Tyr Val Ala Ala Phe Leu Gln Ile Val Glu Ala Ile Ala Val Ala45 50 55 60Arg Gly Gly Gly Cys Val Cys Gly Gln Pro Arg Arg Ala Asp His Gly Gly Ile His Gly65 70 75 80Gly Val Leu Thr Leu Gly Leu Met Cys Cys Cys Gly Thr Gly Gly Gln Thr His Pro Ser85 90 95 100Pro Arg Pro Glu Cys Gly Pro Trp Pro Val Cys Ser Gly Cys Gly Gln Gly Ser Leu Ser105 110 115 120Ser Asn Ser Val Ser Met Phe Ala Gly Thr Gly Arg Ala Phe Gly Cys Pro Phe Leu Lys125 130 135 140Arg Gly Gly Ala Val Asn Val Ile Arg Phe Pro Lys Pro Arg Thr Ala Thr Gly Phe Lys145 150 155 160Pro Glu His Gly Leu Val Ser Thr Ile Ser Val Lys Val Lys Val Ala Lys Arg Gly Leu
165 170 175 180Arg Tyr Ala Gly Lys Gln Ile Met Lys Phe Ser Thr Glu Gly Thr Gly Gly Leu Ile Glu185 190 195 200Leu Phe Asn Ser Gln Thr Glu Tyr Val Thr Gly Ser Val Gly Ser Gly Ala Ser Glu Gly205 210 215 220Arg Gly Ala Gln Val Met Arg Glu Ala Cys Ala Cys Lys Ala Arg Asn Arg Arg Gly Lys225 230 235 240Asp Gly Val Ser Arg Asn Gly Val Arg Thr Leu Ser Gly Arg Ala Trp Arg Ser Pro Lys245 250 255 260Ser Ile Phe Arg Thr Arg Lys Ser Ala Ser Ala Ser Ile Pro Gly Thr Ala Thr Ala Thr265 270 275 280Lys Lys Lys Ser Thr Ser Ser Pro Ala Gly Pro Ser Val Ala Ile Ser Cys Val Cys Gly285 290 295 300Ala Gly Val Arg Cys Ala Phe Asn Gly Gly Thr Pro Gly Phe His Pro Gly Ser Thr Pro305 310 315 320Ile Thr Gly Ala Pro Arg Lys Ser Ala Gly Leu Ala Gly Asp Ile Ala Arg Val Phe Asn325 330 335 340Gln Gln Asn Ser His Gly Gln Cys Leu Arg Thr Gln Tyr Gly Pro Cys Trp Leu Ala Gln345 350 355 360Leu Gln Ala Lys Gly Gly Ser Glu Ser Leu Glu Phe Gly Ala Arg Thr Pro Val Glu Glu365 370 375 380Gly Glu Ser Pro Glu Ala Ser Glu Tyr Ser Asp Cys Trp Val Asp385 390 395<210>3<211>395<212>PRT<213>人工序列<400>3gatctctgcc ggctggtggg agtccggccc gcccagcagg cccaggagca tcgaggtatc 60gtgcatcttg cctttgccga aacagtgttc ggcg 94
atg cat ggg agt cag aag ctg ccc ggc ttg gcg acg cgt gcc ttc cac atc tct acg acg 154Met His Gly Ser Gln Lys Leu Pro Gly Leu Ala Thr Arg Ala Phe His Ile Ser Thr Thr15 10 15 20tgc ggg tcc atc tgc ttg tcg aat tca ggg gtc gct gat gaa gtg gtt gat gtc caa gat 214Cys Gly Ser Ile Cys Leu Ser Asn Ser Gly Val Ala Asp Glu Val Val Asp Val Gln Asp25 30 35 40ccg cag ggg cat ggg tac gtt gct gcg ttc ctg cag atc gtc gag gcc atc ccg gtt gct 274Pro Gln Gly His Gly Tyr Val Ala Ala Phe Leu Gln Ile Val Glu Ala Ile Ala Val Ala45 50 55 60cga ggg ggg gga tgt gtt tgt ggc cag ccg cga cgg gct gac cac ggt ggg att cac ggt 334Arg Gly Gly Gly Cys Val Cys Gly Gln Pro Arg Arg Ala Asp His Gly Gly Ile His Gly65 70 75 80ggc gtg ctg acg ctg ggg ctc atg tgc tgt tgc gga acc ggt ggg caa acg cat ccg tcg 394Gly Val Leu Thr Leu Gly Leu Met Cys Cys Cys Gly Thr Gly Gly Gln Thr His Pro Ser85 90 95 100ccc cga cca gag tgt gga ccg tgg ccg gtt tgt tcg ggc tgt ggc cag ggg tct ctt tca 454Pro Arg Pro Glu Cys Gly Pro Trp Pro Val Cys Ser Gly Cys Gly Gln Gly Ser Leu Ser105 110 115 120agc aat tca gtt tcg atg ttc gcc ggt act gga cgt gcg ttt ggc tgt cca ttt ctc aaa 514Ser Asn Ser Val Ser Met Phe Ala Gly Thr Gly Arg Ala Phe Gly Cys Pro Phe Leu Lys125 130 135 140aga ggg gga gcc gtt aac gta atc cgg ttc cca aag cca cga acc gcc act ggt ttc aaa 574Arg Gly Gly Ala Val Asn Val Ile Arg Phe Pro Lys Pro Arg Thr Ala Thr Gly Phe Lys145 150 155 160cca gag cac ggt ctc gtc tcg acc atc tcc gta aag gtg aaa gtg gcc aag cgc ggg ctc 634Pro Glu His Gly Leu Val Ser Thr Ile Ser Val Lys Val Lys Val Ala Lys Arg Gly Leu165 170 175 180cga tat gct ggt aag caa ata atg aaa ttc tcc act gaa gga acc ggc gga ctc atc gaa 694Arg Tyr Ala Gly Lys Gln Ile Met Lys Phe Ser Thr Glu Gly Thr Gly Gly Leu Ile Glu185 190 195 200
ctt ttt aat agc cag acg gaa tac gtt act gga tca gtc ggc agc ggc gct tcc gaa ggc 754Leu Phe Asn Ser Gln Thr Glu Tyr Val Thr Gly Ser Val Gly Ser Gly Ala Ser Glu Gly205 210 215 220cgc ggc gca cag gtg atg cga gag gcc tgt gcc tgc aag gcc cgc aac agg cgc ggc aag 814Arg Gly Ala Gln Val Met Arg Glu Ala Cys Ala Cys Lys Ala Arg Asn Arg Arg Gly Lys225 230 235 240gat ggc gtc agt cgg aac ggc gtg cgc acg ctc tcc gga cgc gca tgg cgg tcg ccc aag 874Asp Gly Val Ser Arg Asn Gly Val Arg Thr Leu Ser Gly Arg Ala Trp Arg Ser Pro Lys245 250 255 260tcg atc ttc cgg acg cgc aaa tcg gcg tca gcc tct att cca gga acg gcg acg gca aca 934Ser Ile Phe Arg Thr Arg Lys Ser Ala Ser Ala Ser Ile Pro Gly Thr Ala Thr Ala Thr265 270 275 280aag aag aaa tcg aca agc agc ccg gcc gga cca tcg gtg gct att tcc tgc gtc tgc gga 994Lys Lys Lys Ser Thr Ser Ser Pro Ala Gly Pro Ser Val Ala Ile Ser Cys Val Cys Gly285 290 295 300gcc ggg gtg cgg tgc gca ttc aat ggg ggg acg cca ggg ttc cac ccc gga tca acg cca 1054Ala Gly Val Arg Cys Ala Phe Asn Gly Gly Thr Pro Gly Phe His Pro Gly Ser Thr Pro305 310 315 320att act gga gcc cca cgg aag tcg gcc ggg ttg gcg ggg gat atc gcg cgt gtc ttc aac 1114Ile Thr Gly Ala Pro Arg Lys Ser Ala Gly Leu Ala Gly Asp Ile Ala Arg Val Phe Asn325 330 335 340caa cag aat tcg cat gga cag tgt ctc cgt acg cag tac ggg ccg tgt tgg ctc gcg cag 1174Gln Gln Asn Ser His Gly Gln Cys Leu Arg Thr Gln Tyr Gly Pro Cys Trp Leu Ala Gln345 350 355 360ctt cag gcc aag ggg ggc tcc gaa agc ctc gag ttt ggc gcc cgc acg ccc gtt gaa gag 1234Leu Gln Ala Lys Gly Gly Ser Glu Ser Leu Glu Phe Gly Ala Arg Thr Pro Val Glu Glu365 370 375 380gga gaa tca ccn gag gct tcc gaa tac tcc gac tgc tgg gtc gat taa 1282Gly Glu Ser Pro Glu Ala Ser Glu Tyr Ser Asp Cys Trp Val Asp385390 395
gcccgcca tggtacgtgc ttaacgccat ggcggcccgc gagaaaggcg cacacatcct 1340cacgcagacc cgttgcgtca gcgcccatcg cgccsscggc cagtgggaaa tgaacatgga 1400gcgtgccgac ggcagcctgt tctcgatctc ggggaagtac agcggcagat agtgggtcag 1460gatcagttat ccacagggct gacgctgctc ggcgtactgt tcggccntgc ccaactcttg 1520ttggccagta tttcgaggat c 154權(quán)利要求
1.一種DNA片段，其核苷酸堿基序列為序列表中序列1的序列或其延長(zhǎng)或截短的DNA片段或其同義密碼子突變的DNA片段或其個(gè)別密碼子突變的DNA片段。
2.保藏號(hào)為CGMCC No.1024的大腸桿菌DH5α菌株，其特征在于，該菌株含有權(quán)利要求1的DNA片段。
3.權(quán)利要求1的DNA片段的制備方法，其特征在于，對(duì)權(quán)利要求2的大腸桿菌DH5α菌株進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，從培養(yǎng)液中分離提純。
4.權(quán)利要求1的DNA片段的制備方法，其特征在于，采用PCR擴(kuò)增技術(shù)，用大腸桿菌慣用密碼子進(jìn)行生物合成。
5.權(quán)利要求1的DNA片段在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1的DNA片段在制備基因治療藥物中的應(yīng)用。
7.一種多肽，其特征在于，其編碼DNA片段為權(quán)利要求1的DNA片段，其氨基酸序列為序列表中序列2的序列。
8.權(quán)利要求10的多肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求10的多肽的制備方法，其特征在于，將權(quán)利要求1的DNA片段用基因重組技術(shù)轉(zhuǎn)染到真核或原核細(xì)胞中，經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)，分離純化得到。
10.一種重組質(zhì)粒，其特征在于，含有權(quán)利要求1的DNA片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的DNA片段及其對(duì)腫瘤的抑制及其表達(dá)蛋白，特別是被命名為TSF395的DNA片段及其表達(dá)蛋白，該DNA片段及其表達(dá)蛋白可用于抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1611603SQ200310101699
公開日2005年5月4日 申請(qǐng)日期2003年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月28日
發(fā)明者冷國(guó)慶, 曲洪琴, 李會(huì)成, 李鄭武 申請(qǐng)人:哈藥集團(tuán)技術(shù)中心