專利名稱:重組牛痘病毒的制作方法
本發(fā)明涉及一種重組牛痘病毒，更具體地說，涉及一種通過用減毒的利斯特(Lister)溫度敏感突變牛痘病毒菌株作為載體而得到的重組牛痘病毒，這種菌株在兔腎細胞中不具有高溫生長性，并在受精卵的絨毛尿囊膜上具有小的痘皰尺寸。
近年來，已經(jīng)發(fā)明了一個插入異源DNA的構(gòu)建重組牛痘病毒的方法，并建議了用插入，例如編碼傳染病病原體抗原的DNA作為異源的DNA來構(gòu)建的重組牛痘病毒用作活疫苗的方法(例如USP4，603，112，WO84/02077，等)。
該方法是按照例如下面的步驟(見圖1)來實現(xiàn)的。首先，用限制性內(nèi)切酶從對牛痘病毒生長非主要的一個DNA區(qū)中切出適當?shù)腄NA，并插入到一個質(zhì)粒中以制備一個第一重組質(zhì)粒。然后，把異源的DNA插入到該重組質(zhì)粒的牛痘病毒的DNA部分來制備一個第二重組質(zhì)粒。
另一方面，制備事先用牛痘病毒感染了的動物細胞，并把第二重組質(zhì)粒導入到該動物細胞中，由此在該感染動物細胞中引起了牛痘病毒和第二重組質(zhì)粒之間的同源重組，并產(chǎn)生了一個具有該異源的DNA導入其中的重組牛痘病毒(例如，上面提到過的那些現(xiàn)有技術(shù)文獻，Cell Technology vol.2，NO.9，P.84-87(1983)，等)。
按照該方法，根據(jù)不同的用途可插入各種各樣異源的DNA，并且該方法作為生產(chǎn)活疫苗的新方法很有用。
然而，在常規(guī)方法中使用的牛痘病毒大多是WR株(上面提到過的現(xiàn)有技術(shù)文獻，Journal of virology 49，857-864(1984)，等)，但由于這些牛痘病毒經(jīng)常會發(fā)生像腦炎或腦病以及進行性牛痘這樣一些嚴重的接種后的并發(fā)癥，所以出于安全的觀點，它們很難用于實踐。
因此，本發(fā)明人為了開發(fā)一種安全的活疫苗進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用一種減毒的利斯特溫度敏感突變株(即一種在兔腎細胞中不具有高溫生長性并在受精卵的絨毛尿囊膜上具有小痘皰尺寸的減毒的利斯特溫度敏感的突變牛痘病毒菌株)來代替WR株作為載體是很有效的，并在以前已申請過專利(日本專利申請?zhí)?8590/85)。
但是，盡管通過這種方法獲得的重組體在安全方面是很滿意的，但它在表達效率上是不足的，這是因為插入在該牛痘病毒基因組中的異源DNA是處在該牛痘病毒的非主要DNA區(qū)固有的啟動子控制之下。上述的重組體已發(fā)現(xiàn)是有缺點的，特別是由于在將它接種到實驗的哺乳動物上時，很難得到一種通過該異源DNA編碼的蛋白質(zhì)引起的免疫作用。
本發(fā)明的一個目的是要通過將彼此鄰接的具有啟動子功能的DNA和異源DNA插入到一個減毒的利斯特溫度敏感突變體中以提供一種具有高表達效率的牛痘病毒菌株。
本發(fā)明的另一個目的是要提供一個制備上述牛痘病毒的重組方法。
本發(fā)明還有一個目的是要提供一個通過培養(yǎng)上述牛痘病毒株來生產(chǎn)疫苗的方法。
于是，按照本發(fā)明，提供了一種重組牛痘病毒，它是通過把彼此鄰接的具有啟動子功能的DNA和能在它控制下表達的異源DNA插入到一個減毒的利斯特溫度敏感突變牛痘病毒株的非主要DNA區(qū)得到的，該突變牛痘病毒株在兔腎細胞中不具有高溫生長性并在受精卵絨毛尿囊膜上具有小的痘皰尺寸;還提供了一個制備上述牛痘病毒的重組方法及生產(chǎn)疫苗的方法。
圖1顯示了一個制備重組牛痘病毒方法的示意圖。圖2顯示了比較例2的實施方法。圖3至圖6顯示了實例1的實施方法。
用于將異源DNA插入其中的牛痘病毒是一種減毒的利斯特株病毒的溫度敏感突變體，它在受精卵的絨毛尿囊膜上痘皰的大小為3毫米或更小，最好為1毫米或更小，比原菌株(即利斯特株)的痘皰小，而且它在兔腎細胞中的停止溫度為41℃或更低些，最好是40.5℃或更低些。
在這里所使用的術(shù)語“減毒的”意指所說的突變體在兔和猴的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中呈現(xiàn)出顯著低于原菌株(即利斯特株)的致病力，并且基本上不會由于末梢的感染而侵襲到小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(見日本專利申請公開號44178/87的實例4)。一個特別優(yōu)越的突變體是把該突變體按5.8log10TCID50/〔一次〕劑量接入到重量為2.0至2.5公斤的日本白兔后的6天，由10%腦勻漿中回收到病毒量是2log10TCID50/ml或更少，最好是1或更少。
這樣的減毒的溫度敏感突變體，例如可以通過在兔腎細胞中，于30℃，傳代培養(yǎng)利斯特菌株，進行空斑克隆，然后選擇在40℃于Vero細胞中生長很弱的菌株，再進一步使這樣獲得的菌株在受精卵的絨毛尿囊膜上形成痘皰，選擇一個顯示較小痘皰的克隆來得到(見美國專利4，567，147)。
減毒的溫度敏感變種的具體例子包括用下述方法制備的LA菌株，LB菌株(CNTM-1-423)，等。1)LA菌株的制備把利斯特菌株作為原始菌株，在兔腎細胞中于30℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)36代以上，然后空斑克隆三次，分離出50個克隆。由50個克隆中選出一個于40℃，在由綠猴(Coropithecus aethiopus)腎細胞形成的Vero細胞中，顯示出生長最差的溫度敏感突變體。與原始菌株相比，該溫度敏感突變體在兔腎細胞中生長較好但在兔中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞中生長較差。在猴的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中顯示出與DIs菌株(由Dairen I菌株制備的一種減毒的微痘皰突變體)相似的致病力;但比原始菌株降低了很多。由于這些事實已被證實，所以給少量的受驗者進行了接種試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述的突變體導致了輕微的全身反應，有14%伴有發(fā)熱癥狀，隨后緩慢形成皮痂。為此，要試圖分離出一個顯示皮膚生長能力差的克隆。作為分離上述克隆的一個標誌，就是采用在受精卵的絨毛尿囊膜上痘皰的大小。這就是，將上面提到的溫度敏感突變體在兔腎細胞中傳代培養(yǎng)6代以上，然后空斑克隆兩次，分離出在受精卵絨毛尿囊膜上顯示出相對小(2至3毫米)而均勻的痘皰的克隆，這樣獲得的菌株被命名為LA菌株。該菌株的停止溫度為41℃，它比原始菌株減毒了很多。
2)LB菌株的制備把LA菌株在兔腎細胞中，于30℃，再進行三代以上的傳代培養(yǎng)，以分離出一個在受精卵的絨毛尿囊膜上顯示極小痘皰(1毫米或更小)的克隆。這樣獲得的菌株被命名為LB菌株。該菌株的停止溫度為40.5℃，它比LA菌株減毒更多。
表1顯示了作為原菌株的利斯特菌株與LB菌株性能之間的比較表1利斯特菌株與LB菌株的比較利斯特菌株 LB菌株停止溫度(在兔腎中 41℃或更高 40.5℃培養(yǎng)的細胞)空斑大小(在兔腎中 大(3.5毫米) 中等(2.0毫米)培養(yǎng)的細胞)痘皰大小 大(4.0毫米) 小(0.9毫米)在受精卵的絨毛尿囊 +++ +++膜中的可生長性在Vero細胞中的可 +++ +1生長性在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的致病性兔2+++ +Cynomolgus猴3有(死亡) 沒有(生存)通過末梢感染到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的侵襲力4小鼠(醋酸可的松， 有 沒有皮下接種)小鼠(未治療) 有 沒有皮膚生長能力兔 +++ +人 ++ +注釋1、它們彼此相差大約2log10TCID50。
2、根據(jù)大腦內(nèi)接種106.7TCID50病毒后6天回收的病毒量來估價的。
3、通過丘腦內(nèi)接種108.5TCID50病毒后鑒定的。
把具有啟動子功能的DNA連接在其上的異源DNA插入到這些牛痘病毒的溫度敏感突變體中的方法可使用常規(guī)的方法。例如這種插入可通過利用在牛痘病毒DNA區(qū)域中的一個非主要的區(qū)域來實現(xiàn)，這種區(qū)域的失去對生成的病毒的生長性沒有重要的影響。
詳細地說，先構(gòu)建一個含有一部分或全部上述的非主要DNA區(qū)的第一重組載體，然后構(gòu)建一個第二重組載體，在該載體中，帶有具有啟動子功能的DNA連接在其上的異源DNA已被插入到插入在第一重組載體的非主要的DNA區(qū)域中。然后把該第二重組載體用如磷酸鈣法這樣的常規(guī)方法導入到預先已用上面提及的溫度敏感牛痘突變體感染的動物細胞中去，從而通過上述的DNA區(qū)域，在感染的動物細胞中導致同源重組，以得到一種包含具有啟動子功能的DNA和異源DNA作為插入物的重組牛痘病毒(例如WO84/02077，Nature 302，7，April 1983，P490-495，Proc.Natl.Acad.Sci.in USA 79，7415-7419(1982)，等)。
作為本發(fā)明中使用的上述的非主要的DNA區(qū)可以使用任何一個非主要的DNA區(qū)，只要它對其生長性沒有根本的影響。這種非主要DNA區(qū)的具體例子包括例如一個具有胸苷激酶(TK)編碼的DNA區(qū)，一個具有血細胞凝集素(HA)編碼的DNA區(qū)，WR菌株牛痘病毒DNA的HindⅢF-片段，F(xiàn)-片段，M-片段和N-片段(Virus 36(1)，23-33(1986))，以及在美國專利4，603，112中描述的那些DNA區(qū)。
另一方面，用于構(gòu)建第一重組載體的載體不是關(guān)鍵的，可以使用任何的載體，只要非主要的DNA能被插入其中。載體的具體例子包括，例如，質(zhì)粒如PBR322，PBR325，PBR327，PBR328，PUC7，PUC8，PUC9，PUC19等等，噬菌體如入噬菌體，M13噬菌體等等，以及如PHC79這樣的cosmids(Gene 11，291(1980))。
第一質(zhì)粒載體可以用常規(guī)的方法來構(gòu)建。例如用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶完全地消化牛痘病毒DNA，接著分離和純化符合于非主要區(qū)的DNA片段，然后用酶的方法將它與一個用限制性內(nèi)切酶切開的載體連接起來，該限制性內(nèi)切酶在DNA中能產(chǎn)生像前面的限制性內(nèi)切酶所產(chǎn)生的一樣的粘性末端。
是否能成功地獲得所需要的載體，可以這樣來看，例如通過這樣一個方法，該方法包括用一個含有通過與切開的載體的酶的連結(jié)而得到的重組載體的DNA混合物來轉(zhuǎn)化(或轉(zhuǎn)導)一種微生物，例如大腸桿菌，并從這樣得到的轉(zhuǎn)化(或轉(zhuǎn)導)株中選擇一個具有包含了非主要區(qū)DNA插入在其中的所需載體的菌株。
在本發(fā)明中，由這樣獲得的第一重組載體和有具有啟動子功能的DNA插入在其上的異源DNA構(gòu)建了第二重組載體。
作為用于本發(fā)明的具有啟動子功能的DNA可使用含有任何堿基序列的DNA，不論是合成的還是自然的DNA，只要在由一種牛痘病毒占有的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中有效地起著啟動子的作用，例子有例如在Journal of Virology Sept 1984，P662-669中作為例證的牛痘病毒基因組中發(fā)現(xiàn)的一些啟動子序列，具體的有，具有7.5K多肽編碼的牛痘病毒基因的啟動子，具有19K多肽編碼的牛痘病毒基因的啟動子，具有42K多肽編碼的牛痘病毒基因的啟動子，具有胸苷激酶編碼的牛痘病毒基因的啟動子，具有28K多肽編碼的牛痘病毒基因的啟動子，等。
雖然所用的異源DNA是非關(guān)鍵的，但它最好是具有感染疾病病原體(例如病毒，細菌，寄生蟲，原生動物，等)的抗原蛋白編碼的DNA。異源DNA的具體例子包括，例如具有皰疹病毒，水皰性口炎病毒，肝炎B病毒，肝炎A病毒，肝炎非A非B因子，腳和口腔疾病病毒，脊髓灰質(zhì)炎病毒，狂犬病病毒，日本腦炎病毒，霍亂桿菌，沙門桿菌，tetranus桿菌，瘧原蟲、血吸蟲等的抗原蛋白編碼的DNA區(qū)。除了這些具有抗原蛋白的DNA外，還可以使用具有如血凝因子Ⅷ和Ⅸ等這些有用蛋白質(zhì)編碼的DNA。
在本發(fā)明中，在構(gòu)建第二重組載體之前，應當先把具有啟動子功能的DNA連接到異源DNA上。這樣的連結(jié)可按照構(gòu)建第一重組載體的方法進行。例如把具有啟動子功能的DNA插入到一個載體中，然后把異源DNA以正確譯讀方向插入到啟動子部位的下游，之后，用適宜的限制性內(nèi)切酶由上述的載體中切割出所須的DNA區(qū)域。
既然是這樣，將具有啟動子功能的DNA與異源DNA彼此鄰接的連接是很重要的。通常，把啟動子部位中的轉(zhuǎn)錄起始部位與異源DNA中的第一轉(zhuǎn)譯起始部位之間的距離調(diào)節(jié)到200個堿基對或更少些，最好為100個堿基對或更少些。
第二重組載體是由這樣獲得的有具有啟動子功能的DNA直接連于其上的異源DNA與第一重組載體制備的。也可以用常規(guī)方法進行這種制備。例如，用限制性內(nèi)切酶切開第一重組載體，使插入第一重組載體的牛痘病毒非主要DNA區(qū)中有裂開的部位，然后，用DNA聚合酶鈍化這樣獲得的DNA片段的兩端，再把有具有啟動子功能DNA的異源DNA片段直接導入，并用酶法與上述的DNA片段連接，該異源DNA片段的兩端也已相似地用DNA聚合酶處理而被純化了。
所需要的第二重組載體可以用如第一重組載體同樣的方式來采集。
在本發(fā)明中，第二重組載體再被導入到預先用一種牛痘病毒感染的動物細胞中，借以形成重組牛痘病毒。
作為所使用的動物細胞，只要該牛痘病毒能在其中生長，任何細胞都可使用。這種動物細胞的具體例子包括，例如TK-143(從人的骨肉瘤中得來的)，F(xiàn)L(從人的羊膜中得來的)，Hela(從人的子宮頸癌得來的)，KB(從人的鼻咽癌得到的)，CJ-1(從猴的腎得到的)，BSC-1(從猴的腎得到的)，RK13(從兔腎得到的)，L929(從小鼠結(jié)締組織得到的)，CE(雞胚胎)細胞，CFF(雞胚胎纖維細胞)，等。
作為把重組載體導入到動物細胞中去的方法，可以使用常規(guī)的方法，例如磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、微注射法或其它方法。
構(gòu)建的重組牛痘病毒的選擇也可以用常規(guī)的方法來進行。例如，當這個非主要的DNA區(qū)是一個具有胸苷激酶編碼的DNA區(qū)時，該重組牛痘病毒可以通過培養(yǎng)在含有25μg/ml的5-溴脫氧尿苷(BUdR)的培養(yǎng)介質(zhì)中進行了三天的同源重組的牛痘病毒感染的胸苷激酶一缺乏細胞，并選擇由這種重組牛痘病毒形成的空斑來獲得。
可是，當把一種停止溫度為40.5℃的菌株用作利斯特溫度敏感突變牛痘病毒菌株時，要得到一個重組牛痘病毒是很困難的。并且，該重組牛痘病毒的空斑只有用含有較低BUdR濃度的培養(yǎng)介質(zhì)進行
5天或更多天的培養(yǎng)才能被選擇。
作為生產(chǎn)一種疫苗的方法，可以采用常規(guī)的方法。例如把重組牛痘病毒接種到一個適宜的宿主中去，例如像白兔這樣的小動物，在生長一定的期限后，從該宿主分離出如此生長的減毒病毒，并用作疫苗。
這樣獲得的重組牛痘病毒在體外的表達活性比本發(fā)明人在以前構(gòu)建的，不含具有啟動子功能的DNA插在其中的重組體高幾百倍或更多(見后面要描述的實例3)。表達活性的這種改進作用比用WR菌株作為親代菌株(見WO84/02077)的情況下獲得的顯著得多。與以WR菌株作為親代菌株獲得的重組體比較，本發(fā)明的重組體顯示出每個感染細胞的異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量要高得多，盡管它的病毒感染力效價較低。
此外，本發(fā)明的重組體的生長力基本上與不含具有啟動子功能DNA插在其中的重組體相等，而且在兔中樞神經(jīng)系統(tǒng)中關(guān)于致病力的性能特性還更優(yōu)越。
因此，按照本發(fā)明，通過把含有直接連接在其上的，具有啟動子功能DNA的異源DNA插入到一個在兔腎細胞中沒有高溫生長性并且在受卵絨毛尿囊膜上具有較小痘皰尺寸的利斯特溫度敏感突變牛痘病毒菌株的非主要DNA區(qū)中，可以獲得這樣一種重組牛痘病毒，它既使被接種到哺乳動物中也不失去它的生長力，可確保該異源DNA的充分表達，允許產(chǎn)生其抗體，而且在安全方面是極好的。此外，這種重組牛痘病毒的優(yōu)點還在于由于每個感染細胞的異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量的增加，因此用在試驗等方面的細胞量可被減少。
實例參考下列的實例可以更具體地解釋本發(fā)明。
比較例1(1)含有牛痘病毒TK基因的第一載體(質(zhì)粒PCZ02)的制備(見圖2)用ECORI消化5μg的PBR328，然后用酚-氯仿(1∶1)提取，并用乙醇沉淀回收被切開的PBR328，然后，通過S1酶處理鈍化這樣獲得的DNA片段的兩個末端。再連接經(jīng)這樣處理的DNA片段以得到一個沒有ECORI切開部位的質(zhì)粒(PCZO1)。通過用該連接的DNA轉(zhuǎn)化反應潛能大腸桿菌菌株C600細胞及選出氯霉素敏感轉(zhuǎn)化株來選擇PCZ01。
隨后，用Hind Ⅲ處理5ug的質(zhì)粒PCZ01，并用苯酚-氯仿提取，在乙醇沉淀后收集DNA。通過堿性磷酸酶的處理除去在5′-末端的磷酸基團，用苯酚-氯仿再次提取DNA，然后通過乙醇沉淀進行收集。用0.1μg的含有牛痘病毒胸苷激酶(TK)基因的純化的牛痘病毒(WR菌株)Hind ⅢJ片段與0.5μg的切開的PCZ01 DNA連接，把這樣所獲得的重組質(zhì)粒稱為PCZ02。通過下面的方法來證實在PCZ02中存在著牛痘病毒TK基因。先用連接的DNA轉(zhuǎn)化反應潛能大腸桿菌菌株HB101細胞，并選出對氨芐青霉素有抗性但對四環(huán)素敏感的細胞。然后用Birnboin和Doiy方法(Nucleic Acid Res，Ⅰ，1513～(1979))從這些細胞中提取質(zhì)粒，在用Hind Ⅲ消化后，用電泳法測試是否有與原牛痘病毒Hind Ⅲ J片段同樣長度的片段存在。
(2)含有HBs Ag基因的第二載體(質(zhì)粒PCZ03)的制備
(見圖2)使用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ消化10μg含有一個具有肝炎B表面抗原編碼基因(HBsAg)的質(zhì)粒PBRHBadr 72(Nucleic acid Res.vol 11，NO，13，4601-4610(1983))，然后用低融瓊脂糖電泳法(40伏特，60小時)分離出大約1.27Kb的DNA片段。隨后用溴化-3，8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶嗡染色(ethidium bromide dyeing)來鑒定DNA片段，并切出凝膠，用苯酚進行提取。然后通過乙醇沉淀，收集含有HBsAg基因的大約1.27Kb的DNA片段。把收集的DNA片段溶解在10μl含有10mM Tris-Hcl(pH8.0)和1mM EDTA的緩沖溶液中，用DNA聚合酶處理使它們的兩個末端鈍化，用苯酚-氯仿提取，再通過乙醇沉淀進行回收。
另一方面，1ug ECORI連接物的5′-末端用10單位的在Kination緩沖液中的激酶，于37℃磷酸化30分鐘，然后加入預先制備好的HBsAg DNA片段并在12℃進行連接16小時。反應混合物用苯酚-氯仿處理，通過酒精沉淀收集DNA后添加20單位的EcoRI進行進一步的消化，用苯酚-氯仿處理，再用乙醇沉淀。
另一方面，以每ugDNA2單位的量，用EcoRI在緩沖液中于37℃處理PCZ02 2小時，使之線性化。通過使線性化的質(zhì)粒處在含有50mM Tris-Hcl(pH9.0)，1mM Mgcl2，0.1mM Zncl2和1mM亞精胺的緩沖溶液中，用0.1單元的牛小腸堿性磷酸酶使線性質(zhì)粒的5′末端脫磷酸化。然后用等量的苯酚-氯仿提取緩沖液，并通過乙醇沉淀來回收DNA。在由66mMTris-Hcl(pH7.5)，6.6mM Mgcl2，10mM DTT和0.5mM ATP組成的混合物中，于12℃將這樣獲得的線性質(zhì)粒處理15小時，然后與0.2ug含有HBsAg基因的1.27Kb的Eco RI片段進行連接。把所得到的質(zhì)粒用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌株HB101，并且在含有1.5%瓊脂和50μg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)介質(zhì)中，將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞在37℃培養(yǎng)15小時。這種在瓊脂上生長的轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞在含50μg/ml氨芐青霉素的LB液體介質(zhì)中，于37℃培養(yǎng)15小時并用上述的Birnboim和Doly方法進行鈍化。在一種緩沖液中把10%的每種DNA樣品用5單位的EcoRI，在37℃消化1小時，并用瓊脂糖電泳法進行篩選以獲得質(zhì)粒DNAs的1.27Kb的EcoR Ⅰ片段。
由于1.27Kb的EcoR Ⅰ肝炎B病毒的DNA片段可以以正確方位或反方向方位插入到每個質(zhì)粒中，所以對插入基因的方位要進行篩選。它是通過用xho Ⅰ在一種緩沖液中消化由質(zhì)粒PCZ20得到的質(zhì)粒1小時，用瓊脂糖電泳法來分析所得到的DNA片段以及比較它們的長度來進行的。一種HBsAg基因以與牛痘病毒TK基因啟動子正確方位插入到其中的質(zhì)粒被稱為PCZ03，而HBsAg基因以反方向方位插入到其中的質(zhì)粒被稱為PCZ04。
(3)重組牛痘病毒的制備把一種減毒的牛痘病毒菌株(減毒的牛痘菌株LA，在兔腎細胞中的停止溫度為41℃，在受精卵絨毛尿囊膜上的痘皰尺寸是2-3mm，由起始菌株制備的方法已在前面敘述過)以0.1pfu/細胞的量，接種到直徑為6cm的北特爾平皿(Petri dish)中培養(yǎng)的RK-13細胞中。在2.2ml的無菌水中溶解12μg通過把HBsAg基因插入到牛痘病毒TK基因中而獲得的PCZ03質(zhì)粒，并用Hidaka等人的方法(Tampaku，Kakusan，Kaso(Protein，Nucleic Acid，Enzyme)27，340(1985))制備DNA一磷酸鈣共沉淀物。接種后45分鐘，把0.5ml的共沉淀物滴在被感染的RK-13細胞上。把該北特利平皿在一個有5%Co2的培養(yǎng)箱中，于37℃放置30分鐘，加入4.5ml含有10%胎牛血清的EagleMEM。3小時后，用新鮮的液體培養(yǎng)基換掉該培養(yǎng)基，培養(yǎng)48小時后，把該培養(yǎng)基與培養(yǎng)的細胞一起反復冰凍和融化三次，隨后超聲處理1分鐘。
為了證實重組體中的HBsAg基因插入物，把上述的空斑形成病毒接種到培養(yǎng)在直徑為6cm的北特爾平皿的TK-陰性(TK-)(line 143)細胞中，45分鐘后，培養(yǎng)基用含有1%瓊脂，12%胎牛血清和25μg/mlBUdR的Eagle MEM覆蓋。培養(yǎng)3天后，感染的細胞用0.01%的Neutural紅染色，空斑形成的百分比約為0.05%。由北特爾平皿中取出瓊脂平板，在4℃進行貯存。用一個滅菌的尼龍膜壓在余留在北特爾平皿底部的細胞表面上以使病毒轉(zhuǎn)移，用0.5N NaoH處理10分鐘，再用1M Tris-Hcl緩沖液處理5分鐘，反復進行三次，再用含1.5M NaCl的0.5M Tris-HCl緩沖液處理5分鐘。然后用2×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl和0.015MC3H4(OH)(CooNa)3)浸透此尼龍膜，在80℃烘2小時。然后用4×SET(0.6M NaCl，0.008M Tris-HCl，4mM EDTA，pH7.8)-10×Denhard-0.1%SDS在68℃處理2小時。用4×SET-10×Denhardt-0.1%SDS-0.1%Na4P2O7-50ug的變性鮭精子DNA/ml和用32p標記的肝炎BDNA于68℃，通過切口平移(nick-translation)進行14小時的雜化，洗滌尼龍膜后，把X射線膠片一張放在另一張上面進行自動射線照相。證實了有斑點存在，把該X射線膠片放在瓊脂板上于4℃貯存。那些在位置上與斑點重合的空斑被鑒定為是由于含有HBsAg基因的重組體(rLA菌株)，用滅菌的巴氏吸管進行分離。
比較例2通過按比較例1進行實驗得到一個含有HBsAg基因的重組體(rLB菌株)，只是將減毒的天花LB菌株(在兔腎細胞中的停止溫度40.5℃，在受精卵絨毛尿囊膜上痘皰尺寸約0.9mm，CNCM-I-423)用作利斯特溫度敏感突變牛痘病毒，并且選擇重組牛痘病毒的方法也作了如下改變選擇重組體的方法用上面提及的空斑一形成病毒接種到在直徑為6cm的北特爾平皿中培養(yǎng)的TK-陰性(TK-)(line 143)細胞中，45分鐘后，用含有1%瓊脂，12%胎牛血清和15μg/mlBUdR的Eagle MEM覆蓋培養(yǎng)基。培養(yǎng)三天后，用有同樣組成的MEM覆蓋Eagla MEM，這些細胞再培養(yǎng)三天。然后感染的細胞用0.01%的Neutral紅染色。此后，它們用與比較例1同樣的方法進行處理。
實例1(1)含有牛痘病毒TK基因的第一重組載體(質(zhì)粒pUNZ 34)的制備(見圖3)用Hind Ⅲ消化5ug的puc9，然后用苯酚一氯仿(1∶1)提取，通過乙醇沉淀回收切開的PUC9。通過堿性磷酸酶的處理，除去5′-末端的磷酸基因，用苯酚一氯仿再提取DNA并通過乙醇沉淀進行回收。用0.1ug的純化的牛痘病毒(上述的LB菌株)的Hind Ⅲ K片段(大約5.0Kbp)連接0.5ug被切開的PUC9DNA，把這樣得到的重組質(zhì)粒稱為PUNZ 34利斯特菌株的Hind Ⅲ K片段與WR菌株的Hind Ⅲ J片段相當這是已知的(J.Gen.Vircl。45，683(1979))，可以認為TK基因是存在于Hind Ⅲ K片段中。
在PUNZ34中存在Hind Ⅲ K片段可以這樣證實轉(zhuǎn)化反應潛能大腸桿菌株JM-103細胞，使該轉(zhuǎn)化株在含5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(0.003%)，異丙基-β-D-吡喃半乳糖苷(0.03mM)和40ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基瓊脂平板上形成菌落，并用與比較例1同樣的方式由白菌落中提取DNA。
(2)含有具有7.5K多肽編碼的早期牛痘病毒基因啟動子的質(zhì)粒(PUWP-1)的制備(見圖4)用限制性核酸內(nèi)切酶Hind Ⅲ消化Sug牛痘病毒(WR菌株)的DNA(大約180Kbp)，通過低融瓊脂糖電泳法(40伏特60小時)分離大約21Kbp的Hind Ⅲ C片段。隨后用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶嗡染色，對該DNA片段進行鑒定，然后切出凝膠并用苯酚處理，通過乙醇沉淀回收該Hind Ⅲ C片段，接著用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR Ⅰ消化該Hind Ⅲ C片段，并在上述同樣的條件下分離出大約9.7Kbp的EcoR Ⅰ A片段，并以上述的方式從凝膠中提取，再用乙醇沉淀回收，進一步用限制性核酸內(nèi)切酶Sal Ⅰ消化EcoR Ⅰ A片段。另一方面，用Sal Ⅰ消化5ug的PUC9，然后用苯酚一氯仿(1∶1)提取，通過乙醇沉淀來回收，把事先通過用Sal Ⅰ消化制備的該片段與切開的PUC9連接，并且把所獲得的含有7.5K多肽編碼的牛痘病毒的啟動子區(qū)的重組質(zhì)粒稱為PUWHES-1。
在上述的EcoR Ⅰ A片段中存在著四個Sal Ⅰ識別部位，并且當該片段用Sal Ⅰ消化時，含有啟動子區(qū)的片段和不含有啟動子區(qū)的片段基本上以同樣的長度產(chǎn)生(見Mass等人，Cell 125，805-813(1921))。因此，有不含啟動子區(qū)片段作為插入物的質(zhì)粒(PUWHES-2)也同時產(chǎn)生。然而，由于在該片段中有Hinc Ⅱ識別部位存在，這兩種質(zhì)?？梢酝ㄟ^上述部位存在的優(yōu)點來相互區(qū)分。
詳細地說，通過用所獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化反應潛能大腸桿菌株JM 103細胞來篩選，獲得PUWHES-1，以與比較例1(1)同樣的方式提取質(zhì)粒，用限制性核酸內(nèi)切酶Hinc Ⅱ同樣消化，把消化物進行瓊脂糖電泳，選擇在電泳中給出大約0.9Kb片段的質(zhì)粒。
其后，用限制性核酸內(nèi)切酶Sal Ⅰ消化5μg質(zhì)粒PUWHES-1，用低熔融瓊脂糖凝膠電泳法回收1ug約0.9Kbp的含7.5K啟動子區(qū)的DNA片段。用限制性核酸內(nèi)切酶RSa Ⅰ消化1μg的該DNA片段，之后通過低熔融瓊脂糖凝膠電泳回收0.2ug含7.5K啟動子區(qū)的DNA片段(圖4中的黑體部分)。
另一方面，用Sal Ⅰ和Sma Ⅰ消化0.5ug的PCU9，然后用苯酚一氯仿(1∶1)提取，通過乙醇沉淀回收。接著，將這樣得到的DNA片段與含7.5K啟動子區(qū)的DNA片段連接，把所得到的重組質(zhì)粒稱為PUWP-1。PUWP-1中存在牛痘病毒7.5K啟動子基因可通過下列事實被證實用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化反應潛能大腸桿菌株JM103細胞，然后用與比較例1(1)相同的方式進行質(zhì)粒的提取，用Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ消化，該消化物進行瓊脂糖電泳，由此獲得大約0.3Kbp的片段。
(3)含有HBsAg基因直接連接到一個具有7.5K多肽編碼的早期牛痘病毒基因的啟動子上的質(zhì)粒(PUWPHBS-1)的制備(見圖5)用EcoR Ⅰ處理1.3ug的質(zhì)粒PUMP-1，并用苯酚一氯仿提取，用乙醇沉淀后回收DNA。用堿性磷酸酶處理除去5′-末端的磷酸基因，這樣處理過的DNA用苯酚一氯仿再次提取后通過乙醇沉淀回收。用一包含了具有肝炎B表面抗原(HBSAg)(與比較例1中所使用的相同)編碼的基因的大約1.27Kbp的EcoR Ⅰ DNA片段與1.3ug的切開的UPWP-1 DNA連結(jié)。
因為EcoR Ⅰ肝炎B病毒DNA片段(圖5中的陰影部分)可以相對于被插入的啟動子以正確的方位或相反的方位插入到每個質(zhì)粒中。根據(jù)插入基因的方位進行篩選可以如此進行，用在緩沖溶液中的Hinc Ⅱ消化從質(zhì)粒PUWP-1得來的質(zhì)粒，通過瓊脂糖電泳來分析所得到的DNA片段，并比較它們的長度。HBsAg基因已經(jīng)相對于牛痘病毒7.5K啟動子基因以正確的方位插入的質(zhì)粒稱為PUWPHBS-1，而HBsAg基因以其相反方位插入的質(zhì)粒稱為PUWPHBS-22。啟動子部位中的轉(zhuǎn)錄起始部位與EcoR Ⅰ HBsAg DNA片段中的轉(zhuǎn)譯起始部位之間的距離大約是60bp，它們都已插入質(zhì)粒PUWPHBS-1中。
(4)含有已連接上具有7.5K多肽編碼的早期牛痘病毒基因的HBsAg基因的第二重組載體(質(zhì)粒PUNZEn)的制備(見圖6)。
用EcoR Ⅰ，消化1.5μg上述(1)中所獲得的質(zhì)粒PUNZ 34，然后用苯酚一氯仿(1∶1)提取，并通過乙醇沉淀回收已切開的PUNZ 34。
隨后，用Hpa Ⅱ消化10μg用上述(3)制備的質(zhì)粒PUWPHBS-1，然后通過低融瓊脂糖電泳(40伏特，60小時)分離大約1.2Kbp的DNA片段。接著用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶嗡進行染色，鑒定，切出該凝膠，用苯酚提取。通過乙醇沉淀回收含有牛痘病毒7.5K啟動子基因和HBsAg基因的約1.2Kb的DNA片段。把上述被切開的PUNZ 34加到這些DNA片段中，并將它們的兩個末端用DNA聚合酶處理鈍化，隨后用苯酚一氯仿提取，通過乙醇沉淀進行回收。連接如此得到的DNA片段，并且把所得到的含有有HBsAg基因直接連結(jié)上的HBsAg的重組質(zhì)粒稱為PUNZEn。
作為所需要的質(zhì)粒PUNZEn的鑒定可通過用xho Ⅰ消化所獲得的質(zhì)粒，用瓊脂糖電泳分析所得到的DNA片段并比較它們的長度來實現(xiàn)。
(5)重組牛痘病毒的制備以比較例1(3)中所描述的相同方法進行實驗，獲得一個含7.5K啟動子基因和HBsAg基因的重組件(rLA-p菌株)，只是用上述(4)所制備的質(zhì)粒PUNZEn來代替質(zhì)粒PCZ03。
實例2以比較例2中所描述的相同方法進行實驗，獲得一個含有7.5K啟動子基因和HBsAg基因的重組體(rLB-p菌株)，只是用在實例1(4)中制備的質(zhì)粒PUNZEn來代替質(zhì)粒PCZ03。
實例3重組體在細胞中的表達用本發(fā)明的每個病毒株(rLA-p和rLB-p)和沒有7.5K啟動子插入其中的參照病毒株(rLA和rLB)，以28.2至32.3的m.o.i，接種到在短試管中培養(yǎng)的RK-13細胞(約5×105個細胞)中。于37℃吸附1小時后，取出該病毒溶液并用Eagle MEM清洗細胞，之后，加入含有2%小牛血清的Eagle MEM。
為了在HBsAg產(chǎn)生時測定HBsAg和牛痘病毒傳染效價，在培養(yǎng)24小時和48小時時收集培養(yǎng)物上清液和細胞提取物。通過收集短試管中的培養(yǎng)物上清液，加入等容量的含有2%小牛血清的Eagle MEM到殘余物中以及反復冰凍-融化兩次來得到細胞提取物。
用酶免疫分析法(EIA法，DAINABOT有限公司;Anzyme)測定每個培養(yǎng)物上清液和每個細胞提取物的HBsAg，并用492nm波長的吸收值(OD492)來表示。
牛痘病毒的效價可用下列方法測定，以+進制方式，用Eagle MEM稀釋每次收集的培養(yǎng)物上清液和細胞提取物，把0.1ml的每個稀釋液接種到在4個短試管中培養(yǎng)的RK-13細胞中，使之在37℃對其進行吸附1小時。吸附后，取出病毒溶液，加入含有2%小牛血清的Eagle MEM0.5ml，之后，所得的混合物在37℃滾動培養(yǎng)7天，規(guī)定呈現(xiàn)CPE情況的為感染，并計算出TCID50/ml。
結(jié)果是，與未將7.5K啟動子插入其中的rLA或rLB病毒相比，rLA-P或rLB-P病毒，即本發(fā)明的重組體，無論是在培養(yǎng)24小時或48小時時，其培養(yǎng)物上清液或細胞提取物都顯示出高幾百倍的HBsAg產(chǎn)量，并且顯出極大地改善了體外HBsAg的表達百分比。在以上二個時間點上，在測定HBsAg時，病毒的傳染性效價對所有的病毒株都是105.0-8.0TCID50/ml，而且在所有的情況下沒有顯著的差別。
實例4給兔接種牛痘病毒重組體把5×108TCID50的在上面實例或比較例中制備的每個牛痘病毒重組體或其原始菌株接種到日本白兔中，在耳朵上靜脈注射或在背上不同的7個部位上皮下注射使兔子感染。接種后，每隔一天直至第14天從其耳上抽血，分離出血清，然后冷凍并在-20℃貯存。
這樣處理的兔子沒有一個在這14天的觀察中顯示任何異常。
把冷凍血清都放在室溫中使其融化，通過酶免疫分析法(AUSABEIA.Abott Laboratories，樣品量為0.2ml)測定對HBsAg的抗體的效價，所得的結(jié)果顯示在表3上。
表3上的抗體效價是用稀釋度來表示的，在逐次把稀釋后進行試驗，在這樣的稀釋度下，每個血清呈現(xiàn)陽性。
表3在用重組牛痘病毒感染的兔中抗-HBsAg抗體的效價菌株接種 參照菌株 本發(fā)明菌株LB rLB rLA-P rLA-P rLB-P rLB-P后的天數(shù) (iv) (iv) (iv) (id) (iv) (id)2 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜14 ＜1 ＜1 10 40 10 106 ＜1 ＜1 ＞400 ＞400 100 108 ＜1 2 ＞400 ＞400 ＞400 4010 ＜1 ＜1 ＞400 ＞400 100 10012 ＜1 ＜1 ＞400 ＞400 100 10014 ＜1 ＜1 ＞400 ＞400 100 100
從這些結(jié)果中可以看出本發(fā)明的重組體與原始菌株(LB株)和比較例2中獲得的重組體(rLB菌株)相比較已大大地改進了在體內(nèi)誘發(fā)產(chǎn)生抗體的能力。
實例5給兔再接種牛痘病毒重組體以皮下注射的方式將5×108TCID50的牛痘病毒重組體rLA-P接種到日本白兔中，接種7天后，取血樣測定對HBsAg的抗體的效價。該效價是600m.I.U.效價隨時間的推延而減小，接種16個月后為21mI.U.
為了測定對HBsAg效價的變化，對同一兔子附加接種5×108TCID50的重組體rLA-P。接種7天后的效價是594mI.U.;也就是說，觀察到出現(xiàn)與第一次接種幾乎同樣的效價。
如上所示，由于現(xiàn)在這種重組體具有再次產(chǎn)生免疫力的能力，因此可以說這種重組體是一種非常有希望作為活疫苗的材料。
對HBsAg的抗體效價(m.I.U./ml)是按照RIA平行線測定法，以HBIG(10I.U./ml)作對照測定的。
實例6牛痘病毒重組體在兔體內(nèi)的生長對實例4中得到的血清進行血紅細胞凝集抑制作用(HI)試驗(Gakuyukai，National Institute of Health “Servey of virus Experimentation”2nd ed.P.217～，Maruzen Co.，Ltd.(June 1973))，由此研究對牛痘病毒抗體的效價。通過制備每個血清-系列的2倍稀釋液(即以2n倍稀釋每個血清)來進行試驗，并把在血紅細胞凝集中呈現(xiàn)抑制作用的血清的最大稀釋度作為n值。得到的結(jié)果被列示在表4中。
表4
從這些結(jié)果中可以看出，本發(fā)明的重組體在兔體中的生長性基本上與其親代菌株相等。
實例6在兔中樞神經(jīng)系統(tǒng)中致病力的試驗為了把本發(fā)明的重組體(rLA-P和rLB-P)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的致病力與不含有7.5K啟動子插入其中的重組體或WR菌株的致病力進行比較，對兔進行腦內(nèi)接種試驗。
對每個健康的，重量為2.0至2.5Kg的日本白兔，用0.25ml各種病毒菌株的106.8TCID50的病毒溶液在大腦內(nèi)接種。在臨床觀察6天后，處死存活的兔子，從其腦內(nèi)回收病毒，并進行病理學和組織學的檢查，所得的結(jié)果顯示在表5中。
結(jié)果是，本發(fā)明的重組體(rLA-P和rLB-P)顯示出與rLA和rLB有相似的病毒回收率和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的致病力，但是與WR菌株比較，顯示出一個較低的病毒回收率和低得多的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的致病力。這些結(jié)果表明，重組體rLA-P和rLB-P像它們各自的親代菌株一樣是減毒的病毒。
接種后腦病和腦炎的致病機制已由牛痘病毒侵入腦子并在那里生長而導致腦脊髓膜炎和脈絡(luò)叢炎的假定來解釋。上述的動物實驗被認為是研究病毒的中樞神經(jīng)系統(tǒng)致病力的一個典型系統(tǒng)，而對中樞神經(jīng)系統(tǒng)只具有低致病力的本發(fā)明重組體被認為是高度安全的病毒并適合于作為活疫苗。
權(quán)利要求
1.一個通過將具有啟動子功能的DNA和能在其控制之下進行表達的異源DNA，彼此鄰接地插入到一個減毒的利斯特溫度敏感突變牛痘病毒菌株的非主要DNA區(qū)中所得到的重組牛痘病毒，該突變牛痘病毒菌株在兔腎細胞中不具有高溫生長性并在受精卵絨毛尿囊膜上具有小的痘皰尺寸
2.一個如權(quán)利要求
1所述的重組牛痘病毒，其中啟動子中的轉(zhuǎn)錄初始部位與異源DNA中的第一轉(zhuǎn)譯初始部位之間的距離是200個堿基或更少。
3.一個如權(quán)利要求
1所述的重組牛痘病毒，其中該利斯特溫度敏感突變牛痘病毒菌株在兔腎細胞中的停止溫度是41℃或更低。
4.一個如權(quán)利要求
1所述的重組牛痘病毒，其中該利斯特溫度敏感突變牛痘病毒菌株在受精卵的絨毛尿囊膜上的痘皰尺寸是3毫米或更小。
5.一個如權(quán)利要求
1所述的重組牛痘病毒，其中該利斯特溫度敏感突變牛痘病毒菌株的非主要DNA區(qū)是一個具有胸苷激酶編碼的DNA。
6.一個如權(quán)利要求
1所述的重組牛痘病毒，其中具有啟動子功能的DNA是一個具有7.5K多肽編碼的早期牛痘病毒基因的啟動子。
7.一個如權(quán)利要求
1所述的重組牛痘病毒，其中異源DNA是具有傳染病病原體蛋白質(zhì)編碼的DNA。
8.一個如權(quán)利要求
1所述的重組牛痘病毒，其中該蛋白質(zhì)是肝炎B表面抗原。
專利摘要
一個通過將具有啟動子功能的DNA和能在其控制之下進行表達的異源DNA，彼此鄰接地插入到一個減毒的利斯特溫度敏感突變牛痘病毒菌株的非主要DNA區(qū)中所得到的重組件痘病毒，該突變牛痘病毒菌株在免腎細胞中不具有高溫生長性并在受精卵絨毛尿囊膜上具有小的痘皰尺寸。
文檔編號C12R1/91GK87106793SQ87106793
公開日1988年7月20日 申請日期1987年9月4日
發(fā)明者小島朝人, 小林廣茂, 安田斡司, 后藤浩之, 中里早木子, 鴨川幸市, 森田迪夫, 渡邊邦子 申請人:國立預防衛(wèi)生研究所長, 日本澤恩株式會社千葉縣導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan