專利名稱：止血敷料的制作方法
I.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種包括多個(gè)層的止血敷料，它包括可再吸收的材料和/或凝固蛋白。所述止血敷料可用于治療受傷的組織。
II.發(fā)明背景控制出血(流血)是急救和野外創(chuàng)傷護(hù)理的關(guān)鍵步驟。不幸的是，來自可接觸部位的過量出血或致命出血的發(fā)生并非是不常見的。J.M.Rocko等，J.Trauma 22635(1982)。來自越南戰(zhàn)爭的死亡率數(shù)據(jù)表明，10％的戰(zhàn)斗死亡，是由于不受控制的肢體出血造成的。SAS/STATUsers Guide，4th ed.(Cary，NCSAS Institute Inc；1990)。通過使用有效的野外出血控制方法，將有可能防止在越戰(zhàn)期間由于過量出血導(dǎo)致的超過1/3的死亡。SAS/STAT Users Guide，4th ed.(Cary，NCSAS Institute Inc；1990)。
盡管平民外傷死亡率統(tǒng)計(jì)數(shù)字沒有提供由于肢體出血導(dǎo)致的住院前死亡的確切數(shù)字，但是，病例和傳說的報(bào)道顯示了類似的死亡率。J.M.Rocko等，J.Trauma 22635(1982)。以上數(shù)據(jù)表明，通過住院前使用簡單的和有效的出血控制方法，可以實(shí)現(xiàn)存活率的顯著提高。
液體血纖蛋白密封劑業(yè)已被用作出血控制的手術(shù)室輔助物。J.L.Garza等，J.Trauma 30512-513(1990)；H.B.Kram等，J.Trauma3097-101(1990)；M.G.Ochsner等，J.Trauma 30884-887(1990)；T.L.Matthew等，Ann.Thorac.Surg.5040-44(1990)；H.Jakob等，J.Vasc.Surg.，1171-180(1984)。在第二次世界大戰(zhàn)的最后一年廣泛使用血纖蛋白原和凝血酶。不過受到了禁止，因?yàn)樗鼤鞑ジ窝?。D.B.Kendrick，Blood Program in WWII(Washington，DCOffice of the Surgeon General，Department of Army；1989)，363-368。
單一供體血纖蛋白密封劑業(yè)已被廣泛地在臨床上使用，不僅用于出血控制，而且用于各種手術(shù)場合。W.D.Spotnitz，Thromb.Haemost.74482-485(1995)；R.Lerner等，J.Surg.Res.48165-181(1990)。美國紅十字會以及其他機(jī)構(gòu)業(yè)已開發(fā)出了血漿蛋白純化方法，這些方法似乎能消除肝炎危險(xiǎn)。Reiss等，Trans.Med.Rev.1085-92(1996)。
干燥的血纖蛋白原-凝血酶敷料(TACHOCOMBTM，Hafslund NycomedPharma，Linz，Austria)業(yè)已在很多歐洲國家的手術(shù)室中使用。Schiele等，Clin.Materials 9169-177(1992)。這種敷料目前的配方中使用了牛凝血酶。盡管這種血纖蛋白原-凝血酶敷料不需要預(yù)先混合，并且便于使用，由于它需要在4℃下保存，并且在應(yīng)用于傷口上之前需要用鹽溶液預(yù)先濕潤，使它的應(yīng)用受到了限制。
業(yè)已披露了止血夾層敷料，它包括夾在血纖蛋白原層之間的凝血酶層(例如，參見PCT/US99/10952，該文獻(xiàn)被收作本文參考)。盡管這種敷料可應(yīng)用于治療受傷的組織的方法中，這種常規(guī)夾層敷料可能變得分層，從而使所述敷料各層的邊緣不再彼此粘接在一起。這種分層可能導(dǎo)致敷料構(gòu)成層之間減弱了的相互作用，使所述敷料在防止出血方面的效果減弱。
III.發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種止血敷料(例如，繃帶)，它包括夾在第一和第二血纖蛋白原層之間的凝血酶層，其中，所述凝血酶層不是與所述第一和/或第二血纖蛋白原層同延的。與凝血酶層是與整個(gè)第一和第二血纖蛋白原層同延的敷料相比，本發(fā)明止血敷料可用于治療傷口，并且提供抑制各層分層的意想不到的優(yōu)點(diǎn)。
因此，本發(fā)明提供了一種止血敷料，它包括(i)第一血纖蛋白原層；(ii)靠近所述第一血纖蛋白原層的凝血酶層；和(iii)靠近所述凝血酶層的第二血纖蛋白原層，其中，所述凝血酶層不是與所述止血敷料的所述第一和/或第二血纖蛋白原層同延的。
本發(fā)明相關(guān)的敷料包括(i)可再吸收的材料層；(ii)靠近所述可再吸收的材料層的第一血纖蛋白原層；(iii)靠近所述第一血纖蛋白原層的凝血酶層；和(iv)靠近所述凝血酶層的第二血纖蛋白原層，其中，所述凝血酶層不是與所述止血敷料的所述第一和/或第二血纖蛋白原層同延的。
在另一種實(shí)施方案中，所述止血敷料包括(i)第一血纖蛋白原層；(ii)靠近所述第一血纖蛋白原層的可再吸收的材料層；(iii)靠近所述可再吸收的材料層的凝血酶層；和(iv)靠近所述凝血酶層的第二血纖蛋白原層，其中，所述凝血酶層不是與所述止血敷料的所述第一和/或第二血纖蛋白原層同延的。
本發(fā)明還包括用于治療患者受傷的組織的方法，包括將本文所披露的任意一種新型止血敷料應(yīng)用于受傷的組織上。在所述方法中，所述止血敷料可以用對受傷組織來說是異源的液體水合，或它們可以用對受傷的組織來說內(nèi)源的液體水合。
本發(fā)明還包括用于制備止血敷料的方法，包括提供第一層血纖蛋白原，將凝血酶層涂敷在所述第一層血纖蛋白原上，和將第二層血纖蛋白原涂敷在所述凝血酶層上，其中，所述凝血酶層不是與所述第一血纖蛋白原層同延的和/或不是與所述第二血纖蛋白原層同延的。
類似地，本發(fā)明包括用于制備止血敷料的方法，包括提供在它上面結(jié)合了第一層血纖蛋白原的可再吸收的或不可再吸收的背層；將凝血酶層涂敷在所述第一層血纖蛋白原上，位于所述血纖蛋白原層的與結(jié)合所述可再吸收的或不可再吸收的背層的相反的一側(cè)；以及將第二層血纖蛋白原涂敷在所述凝血酶層上，其中，所述凝血酶層不是與所述第一血纖蛋白原層同延的和/或不是與所述第二血纖蛋白原層同延的。
在各種實(shí)施方案中，所述凝血酶層是獨(dú)立地與5％-95％(例如，20-50％)的所述第一和第二血纖蛋白原層同延的。所述凝血酶層能夠以多種形狀和形式中的任意一種構(gòu)成。例如，并且不局限于，所述凝血酶層被設(shè)計(jì)成一系列包括凝血酶的斑點(diǎn)陣列，單個(gè)包括凝血酶的斑點(diǎn)?；蛘?，所述凝血酶層可被設(shè)計(jì)成多條包括凝血酶的線。
所述止血敷料的每一層還可以任選包括一種或多種合適的填充物，粘合劑和/或增溶劑。另外，所述止血敷料的每一種還可以選擇性地包括釋放層，它含有防粘劑和/或基底材料。
可以理解的是，上述一般性說明以及下面的詳細(xì)說明，都僅僅是舉例性質(zhì)的和說明性質(zhì)的，并且希望提供如權(quán)利要求書提出的本發(fā)明的其他說明。
除非另有說明，本文所使用的技術(shù)和科學(xué)名詞具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所普遍理解的相同含義。本文所提到的所有專利，專利申請，以及出版物都被收作本文參考。
在本文中，被說成與血纖蛋白原層“不同延的”的所述凝血酶層是這樣的其中，所述凝血酶層在二維空間的空間邊界小于一個(gè)或兩個(gè)血纖蛋白原層的空間邊界，以便所述凝血酶層僅僅與所述止血敷料的所述第一血纖蛋白原層的表面積的大約5％-大約95％同延和/或僅與所述止血敷料的所述第二血纖蛋白原層表面積的大約5％-大約95％同延。例如，所述凝血酶層可以獨(dú)立地與所述第一和第二血纖蛋白原層的表面積的大約10，20，30，40，50，60，70，75，80，或90％同延。與所述血纖蛋白原層“同延的”所述凝血酶層，提供了對所述血纖蛋白原層的全面覆蓋，并且與所述血纖蛋白原層的100％的表面積同延。所述凝血酶層可以不與所述第一血纖蛋白原層同延，而是與所述第二血纖蛋白原層同延的，或者相反，例如，通過采用具有不同總表面積或形狀的血纖蛋白原層。
在本文中，″患者″表示需要醫(yī)療護(hù)理和/或治療的人類或動物個(gè)體。
在本文中，″傷口″表示對患者的任何組織的損傷，這種損傷導(dǎo)致了血液從循環(huán)系統(tǒng)中的流失。所述組織可以是內(nèi)部組織，如器官或血管，或外部組織，如皮膚。血液流失可以是內(nèi)部的，例如從破裂的器官中流失，或外部的，例如從破口中流出。傷口可存在于軟組織中，如器官，或存在于硬組織中，如骨骼。所述損傷可以是由任何制劑或來源導(dǎo)致的，包括創(chuàng)傷性損失，感染或手術(shù)干預(yù)。所述損傷可以是威脅生命的或不威脅生命的。
在本文中，″可再吸收的材料″表示自發(fā)降解的和/或通過哺乳動物身體降解成可以被消耗或以不明顯干擾傷口愈合和/或組織再生的形式消除的成分的材料，并且不會導(dǎo)致任何顯著的代謝紊亂。
在本文中，″穩(wěn)定性″表示決定活性和/或功能的材料的所述特征的保持力。
在本文中，″粘合劑″表示能改善所述止血敷料的一層與一個(gè)或多個(gè)不同的層的粘接和/或特定層的成分與其他層的成分的粘接的化合物或化合物的混合物。
在本文中，″增溶劑″表示能改善蛋白在含水溶劑中的溶解的化合物或化合物的混合物。
在本文中，″填充物″表示能賦予所述止血敷料的一層或多層蓬松度和/或孔隙度的化合物或化合物的混合物。
在本文中，″防粘劑″表示能促進(jìn)止血敷料從生產(chǎn)模具上取出的化合物或化合物的混合物。
在本文中，″發(fā)泡劑″表示在合適條件下水合時(shí)能產(chǎn)生氣體的化合物或化合物的混合物。
在本文中，″大約″表示加上或減去所標(biāo)明數(shù)值的大約10％。
與常規(guī)敷料相比，本發(fā)明的止血敷料提供了各種優(yōu)點(diǎn)。通過使用不是與一個(gè)或兩個(gè)血纖蛋白原層同延的所述凝血酶層，本發(fā)明的敷料不太容易在它們的邊緣分層，因此，使得該敷料更耐用，并且比常規(guī)敷料更容易處理。另外，這種敷料更適合大批量生產(chǎn)，并且提供對在所述敷料中分配的凝血酶數(shù)量的更好的控制。
通過以下詳細(xì)說明，和權(quán)利要求書可以理解本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明的典型實(shí)施方案涉及一種止血敷料，例如，用于治療患者的受傷的組織，它包括(i)第一血纖蛋白原層；(ii)靠近所述第一血纖蛋白原層的凝血酶層；和(iii)靠近所述凝血酶層的第二血纖蛋白原層，其中，所述凝血酶層不是與所述第一和/或第二血纖蛋白原層同延的。
本發(fā)明的另一種實(shí)施方案涉及一種止血敷料，它包括(i)可再吸收的材料層；(ii)靠近所述可再吸收的材料層的第一血纖蛋白原層；(iii)靠近所述第一血纖蛋白原層的凝血酶層；和(iv)靠近所述凝血酶層的第二血纖蛋白原層，其中，所述凝血酶層不是與所述第一和/或第二血纖蛋白原層同延的。
本發(fā)明的另一種實(shí)施方案涉及一種用于治療患者的受傷組織的止血敷料，它包括(i)第一血纖蛋白原層；(ii)靠近所述第一血纖蛋白原層的可再吸收的材料層；(iii)靠近所述可再吸收的材料層的凝血酶層；和(iv)靠近所述凝血酶層的第二血纖蛋白原層，其中，所述凝血酶層不是與所述第一和/或第二血纖蛋白原層同延的。
所述止血敷料的每一層還可以任選包括一種或多種合適的填充物，如蔗糖。
所述止血敷料的每一層還可以任選包括一種或多種合適的粘合劑，如蔗糖。
所述止血敷料的每一層還可以任選包括一種或多種合適的增溶劑，如蔗糖。
所述止血敷料的每一層還可以任選包括一種或多種合適的發(fā)泡劑，如檸檬酸和碳酸氫鈉的混合物。
所述止血敷料的每一種還可以選擇性地包括釋放層，它包括防粘劑。典型的防粘劑是蔗糖。
所述止血敷料的每一種還可以包括基底材料，它位于所述敷料的與使用所述敷料時(shí)朝向傷口一側(cè)相反的一側(cè)。所述基底材料可以使用生理學(xué)上可接受的黏合劑粘貼或可以自我粘貼(例如，通過使表面帶靜電荷)。所述基底材料可以是可再吸收的材料或不可再吸收的材料，如硅酮膜片或塑料片。
用于所述止血敷料中的血纖蛋白原可以是血纖蛋白原復(fù)合物，或任何血纖蛋白原，或它的衍生物或代謝物(如血纖維蛋白肽A和血纖維蛋白肽B)，根據(jù)需要都可以使用。所述血纖蛋白原還可以包括因子XIII。
所述血纖蛋白原復(fù)合物可以是人血漿蛋白的混合物，業(yè)已對它進(jìn)行過純化，并且使病毒失活。血纖蛋白原復(fù)合物的典型的水溶液包括100-130mg/mL總蛋白，其中至少80％是血纖蛋白原。所述血纖蛋白原復(fù)合物的其他成分可以包括白蛋白(通常大約為5-25mg/mL)；血纖維蛋白溶酶原(通常大約為5μg/mL)；因子XIII(通常大約為10-40單位/mL)；和聚山梨酸酯80(通常低于3％)。所述血纖蛋白原復(fù)合物的pH通常在7.1-7.5的范圍內(nèi)。合適的血纖蛋白原復(fù)合物還可以包括纖連蛋白。
用于形成所述敷料的一層的所述血纖蛋白原，通常具有1mg/cm2-60mg/cm2的濃度，例如，至少5，10，15，20，30，40，50mg/cm2。例如，所述第一和第二血纖蛋白原層可以具有相同的尺寸，以便所述第二血纖蛋白原層大體上是與所述第一血纖蛋白原層同延的?；蛘撸龅谝谎w蛋白原層可以不是與所述第二血纖蛋白原層同延的；或所述第二血纖蛋白原層可以不是與所述第一血纖蛋白原層同延的。因此，所述第一血纖蛋白原層可以占所述第二血纖蛋白原層尺寸的高達(dá)100％，或所述第二血纖蛋白原層可以占所述第一血纖蛋白原層尺寸的高達(dá)100％。
用于所述止血敷料中的所述凝血酶可以是人血漿蛋白的冷凍干燥的混合物，它業(yè)已進(jìn)行過純化和病毒滅活。本發(fā)明的敷料通常包括效力為大約1-160國際單位(IU)/cm2的凝血酶，例如，至少5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，60，70，80，100，125，150IU/cm2。選擇性的成分包括白蛋白(通常為大約5mg/mL)和甘氨酸(通常為大約0.3M±0.05M)。所述凝血酶的pH通常在6.5-7.1的范圍內(nèi)。
可以將所述凝血酶層添加在所述第一血纖蛋白原層上，以便不與所述第一血纖蛋白原層同延和/或在添加所述第二血纖蛋白原層時(shí)不是與所述第二血纖蛋白原層同延的。例如，所述凝血酶層可以占所述第一血纖蛋白原層表面積的大約5％-大約95％和/或所述第二血纖蛋白原層表面積的大約5％-大約95％?？梢詫⑺瞿柑砑釉谒鲅w蛋白原層上，以單一斑點(diǎn)或一系列斑點(diǎn)形式添加在所述血纖蛋白原層上，以便所述凝血酶斑點(diǎn)的總表面積占所述第一血纖蛋白原層表面積的大約5％-大約95％和/或所述第二血纖蛋白原層表面積的大約5％-大約95％。
所述凝血酶的斑點(diǎn)可以具有任何幾何形狀，例如，實(shí)心或空心圓形，矩形，三角形，直線，無定型形狀，或它們的組合?？梢詫⑺霭唿c(diǎn)以有序的或隨機(jī)的方式添加在所述第一血纖蛋白原層上。多個(gè)斑點(diǎn)可以構(gòu)成多種形狀和圖案中的任意一種，如陣列，網(wǎng)格，一系列同圓心的斑點(diǎn)(例如同心圓或方形)，重疊系列的斑點(diǎn)(例如，重疊的圓)，從軸上發(fā)射的輻條，或任何其他結(jié)構(gòu)，只要所述凝血酶的表面積是所述第一血纖蛋白原層表面積的大約5％-大約95％和/或所述第二血纖蛋白原層表面積的大約5％-大約95％就行。一般，與少量的大斑點(diǎn)相比，大量的小斑點(diǎn)是優(yōu)選的。例如，20×20陣列的斑點(diǎn)一般比占據(jù)相同總表面積的10×10陣列的斑點(diǎn)更好。不過，所述斑點(diǎn)可以具有任何尺寸，只要所述凝血酶的表面積是所述第一血纖蛋白原層表面積的大約5％-大約95％和/或所述第二血纖蛋白原層表面積的大約5％-大約95％就行。例如，根據(jù)所述敷料的總體尺寸，所述斑點(diǎn)的直徑，寬度或長度可以是，但不局限于至少大約0.01，0.1，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10mm或更大。在一種實(shí)施方案中，例如各自具有2-3mm直徑的四個(gè)圓形斑點(diǎn)，可以占據(jù)敷料的平方厘米。多種其他形狀屬于本發(fā)明的范圍，并且可以被本領(lǐng)域技術(shù)人員方便地采用。
所述敷料可以制成多種尺寸和形狀中的任意一種。通常，所述敷料具有可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員方便地操縱的尺寸和形狀，一般沿任何一條邊的長度都小于12″，例如，1″×1″，1″×2″，4″×4″等。所述敷料的含水量通常低于8％(例如，低于7，6，5，4，3，2或1％)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種可再吸收的材料的任意一種都可應(yīng)用于本發(fā)明中。例如，所述可再吸收的材料可以是蛋白類物質(zhì)，如血纖蛋白，角蛋白，膠原和/或明膠，或醣類物質(zhì)，如藻酸鹽，甲殼質(zhì)，纖維素，蛋白聚糖(例如，聚-N-乙酰葡糖胺)，乙醇酸聚合物，乳酸聚合物，或乙醇酸/乳酸共聚物。例如，所述可再吸收的材料可以是醣類物質(zhì)?？稍傥盏牟牧系牡湫屠邮且訴ICRYLTM和DEXONTM為商標(biāo)出售的材料。
一般，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知并且可以獲得的任何方式將所述止血敷料的各層彼此粘接在一起。通常，所述血纖蛋白原層和/或所述凝血酶層(s)是作為一系列快速冷凍水溶液層添加的，并且隨后進(jìn)行低溫干燥或冷凍干燥，例如，在添加每一層之后，并且在組裝整個(gè)敷料之后。所述各層可以通過多種技術(shù)中的任意一種添加，包括噴霧，吸液(例如，使用多通道吸液管)，噴灑，使用掩模，靜電沉積，使用微量注射陣列系統(tǒng)，或使用分配歧管分配，它包括用于產(chǎn)生高密度陣列的口。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，在用模具制備所述敷料時(shí)，在添加所述敷料的第一層之前，將諸如蔗糖的防粘劑涂敷在所述模具上。在這樣的實(shí)施方案中，所述止血敷料還包括釋放層，它包括所述防粘劑。
另外，可以將所述生理學(xué)上可接受的粘接劑涂敷在所述可再吸收的材料和/或所述基底材料(如果存在的話)上，并且隨后將所述血纖蛋白原層和/或所述凝血酶層粘接在它上面。
在所述敷料的一種實(shí)施方案中，所述生理學(xué)上可接受的粘接劑具有切變強(qiáng)度和/或結(jié)構(gòu)，以便在將所述敷料應(yīng)用在受傷的組織上之后，所述可再吸收的材料和/或基底材料可以與所述血纖蛋白原層分離。在另一種實(shí)施方案中，所述生理學(xué)上可接受的粘接劑具有切變強(qiáng)度，以便在將所述敷料應(yīng)用在受傷的組織上之后，所述可再吸收的材料和/或基底材料不能與所述血纖蛋白原層分離。
合適的血纖蛋白原和凝血酶可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的并且可以獲得的任何純化方法從人或哺乳動物血漿中獲得；從重組組織培養(yǎng)物，病毒，酵母，或細(xì)菌等的上清液或培養(yǎng)液中獲得。上述物質(zhì)包括能表達(dá)人或哺乳動物血漿蛋白的基因，該基因是通過標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)導(dǎo)入的；或從轉(zhuǎn)基因動物的流體(例如血液，乳液，淋巴液，或尿液等)中獲得，所述動物包括能表達(dá)人血纖蛋白原和/或人凝血酶的基因，該基因是按照標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入的。
一般，用于所述止血敷料中的所述血纖蛋白原和/或所述凝血酶的純度具有相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的能產(chǎn)生所述蛋白的效力和穩(wěn)定性的合適純度。可以對所述血纖蛋白原和/或所述凝血酶進(jìn)行多個(gè)層析純化步驟處理，如親和層析和免疫親和層析，以便除去在生產(chǎn)，儲存和/或使用期間可能導(dǎo)致所述血纖蛋白原和/或所述凝血酶分解，激活和/或降解的物質(zhì)?？梢酝ㄟ^純化除去所述物質(zhì)的典型例子包括蛋白污染物，如血纖維蛋白溶酶原，間-α胰蛋白酶抑制劑和前-α胰蛋白酶抑制劑；非蛋白污染物，如脂蛋白；蛋白和非蛋白污染物的混合物，如脂蛋白。
在使用所述止血敷料，所述血纖蛋白原和所述凝血酶可以在將所述敷料應(yīng)用在受傷的組織上時(shí)通過從出血的傷口中流出的患者的內(nèi)源流體(例如，血液)激活?；蛘?，在從受傷的組織中流出的流體不足以提供所述蛋白層的適當(dāng)水合的情況下，可以在將所述止血敷料應(yīng)用在受傷的組織上之前或當(dāng)時(shí)通過應(yīng)用生理學(xué)上可接受的液體(例如，水，緩沖液，鹽水)激活所述血纖蛋白原和/或所述凝血酶，所述液體中選擇性地含有任何必要的輔助因子和/或酶。
另外，在所述止血敷料的一層或多層中可以含有一種或多種添加劑，例如藥物，如生長因子、多克隆和單克隆抗體以及其他化合物。所述添加劑的典型例子包括，但不局限于抗生素，如四環(huán)素和環(huán)丙沙星，阿莫西林和甲硝噠唑；抗凝固劑，如活化的蛋白C，肝素，prostracyclin(PGI2)，前列腺素，白三烯，抗凝血酶III，ADP酶，和血纖維蛋白溶酶原活化劑；類固醇，如地塞米松，前列環(huán)素的抑制劑，前列腺素，白三烯和/或激肽，以便抑制炎癥；心血管藥物，如鈣通道抑制劑；血管擴(kuò)張劑和血管收縮劑；化學(xué)引誘物；局部麻醉劑，如丁哌卡因；和抗增殖/抗腫瘤藥物，如5-氟尿嘧啶(5-FU)，紫杉酚和/或泰索帝；抗病毒劑，如gangcyclovir，齊多夫定，amantidine，阿糖腺苷，ribaravin，三氟尿苷，無環(huán)鳥苷，二脫氧尿苷和病毒成分或基因產(chǎn)物的抗體；細(xì)胞因子，如α-或β-或γ-干擾素，α-或β-腫瘤壞死因子和白介素；集落刺激因子；紅細(xì)胞生成素；抗真菌劑，如大扶康，ketaconizole和制霉菌素；抗寄生蟲藥，如戊雙脒；抗炎制劑，如α-1-抗胰蛋白酶和α-1-抗胰凝乳蛋白酶；麻醉劑，如丁哌卡因；鎮(zhèn)痛劑；防腐劑；和激素。其他典型的添加劑包括，但不局限于維生素和其他營養(yǎng)添加劑；糖蛋白；纖連蛋白；肽和蛋白；糖類(包括簡單的和/或復(fù)雜的)；蛋白聚糖；抗血管生成素；抗原；脂類或脂質(zhì)體；和寡核苷酸(正義和/或反義DNA和/或RNA)。
以下例子僅僅是說明性的，而不是要像所述權(quán)利要求書那樣限定本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，在不超出本發(fā)明構(gòu)思和范圍的前提下，可以對本發(fā)明的方法進(jìn)行各種改進(jìn)和改變。因此，本發(fā)明期望覆蓋本發(fā)明的改進(jìn)和改變，只要這些改變屬于所述權(quán)利要求書以及它們的等同方案的范圍。
本文所提到的所有專利和文獻(xiàn)都被專門收作本文參考。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例例1下面所提供的實(shí)施例表明，通過以如下方式制備敷料可以減少所述敷料的分層，其中，所述凝血酶層不是與所述第一和第二血纖蛋白原層同延的。在本實(shí)施例中，將凝血酶以兩種結(jié)構(gòu)中的任意一種分配到所述第一血纖蛋白原層上。在常規(guī)敷料上，所述凝血酶完全覆蓋所述第一血纖蛋白原層(這種設(shè)計(jì)在本文中被稱為“完全”覆蓋)。在本發(fā)明的敷料中，所述凝血酶被作為一個(gè)圓設(shè)置在所述第一血纖蛋白原層的頂部，它不是與所述第一血纖蛋白原層同延的(在本文中，這種設(shè)計(jì)被稱為“圓形”覆蓋)。
為了制備所述敷料，按常規(guī)方式制備血纖蛋白原35mg/ml的總蛋白(TP)存在于緩沖液D中(100mM NaCl，1.1mM CaCl2·H2O，10mMTris HCl，10mM檸檬酸鈉，2％蔗糖，2.8mg/ml白蛋白，0.52mg/mlTWEEN-80，pH7.2)，它含有濃度為80mg/g TP的白蛋白和濃度為15mg/g TP的聚山梨酸酯。用四種緩沖液中的每一種制備具有4745IU/ml效力的凝血酶濃縮物，以便獲得含有2000IU/ml的凝血酶溶液。在表1中示出了這四種緩沖液。所述敷料是手工生產(chǎn)的，并且生產(chǎn)了四種凝血酶配方和覆蓋類型的每一種的18個(gè)敷料，以便產(chǎn)生總共144種敷料。對所述敷料進(jìn)行冷凍干燥，用脫水劑包裝，然后通過體外測定分析外觀，含水量，γ二聚體化，和可凝固蛋白百分比，并且進(jìn)行活體豬動脈切開術(shù)測定。
外觀在外觀測定中測試所有敷料的分層。如果所述敷料的所述血纖蛋白原層沿所有四條邊彼此連接在一起的話，就認(rèn)為這種敷料合格。所述敷料層的分層使得這種敷料難以操縱，并且如果在所述層上還存在表面裂紋的話，使得這種敷料容易斷裂。如表1所示，與其中的凝血酶層是以完全覆蓋的形式添加的敷料相比(1，3，5和7組)，所述凝血酶層以圓形覆蓋的方式施加的敷料(2，4，6和8組)在分層實(shí)驗(yàn)(即外觀測試)中具有更高的合格率。盡管用凝血酶完全覆蓋制成的敷料傾向于不能通過外觀測試，用以圓形覆蓋形式施加的凝血酶制成的敷料幾乎100％通過了所述外觀實(shí)驗(yàn)。
表1

無論制備所述凝血酶的緩沖液如何，都觀察到了改善了的對分層的抗性。因此，從某些緩沖液配方中除去氯化鈣，不會影響凝塊的形成，盡管氯化鈣是凝血酶激活所必須的。以上結(jié)果表明，在所述血纖蛋白原制劑中存在足夠的氯化鈣(1.1mM)，以便促進(jìn)凝血酶活化。類似地，固體含量的增加(賴氨酸)不會產(chǎn)生顯著影響。
測定了來自每一組的敷料的含水量。所述敷料的含水量平均為0.98％，并且在該組中非常一致，在0.80-1.16％范圍內(nèi)。這種含水量是這種敷料所常有的。
將來自每一組的一個(gè)敷料用于在常規(guī)測定方法中測定γ-γ二聚體化。正如在以下文獻(xiàn)中所披露的Okude等，Biol.Pharm.Bull.16448-452，γ-γ雙體測定方法測定了凝血酶使血纖蛋白原的γ鏈交聯(lián)，以便形成凝塊的能力。一般，為了進(jìn)行該測定，在低濕度腔室中將每一個(gè)敷料研磨成均勻的，細(xì)的粉末，并且分成兩個(gè)相等的部分。將500μL0.9％的鹽水添加到一個(gè)部分中，并且將500μL的Okude溶解溶液(ODS)(10M尿素，1％SDS，0.1％β-巰基乙醇，0.01％溴酚藍(lán))添加到另一個(gè)部分中。對這兩部分進(jìn)行短時(shí)間的渦旋攪拌，并且在40℃下培養(yǎng)5分鐘。這樣使得可以在所述鹽溶液樣品中形成凝塊，而ODS中的變性制劑能抑制凝塊形成。將兩種樣品懸浮在5倍體積的ODS中，在40℃下培養(yǎng)1小時(shí)，溶解在含有β-巰基乙醇的Laemmli樣品中，并且在SDS-PAGE凝膠上電泳。用考馬斯藍(lán)對所述凝膠進(jìn)行染色，以便觀察蛋白。如表1所示，在凝結(jié)之后，所有敷料都表現(xiàn)出高百分比的二聚體化，而在非凝結(jié)敷料中表現(xiàn)出低百分比的二聚體化，這表明了在生產(chǎn)所述敷料期間，所述凝血酶和血纖蛋白原之間沒有發(fā)生相互作用。
可凝固蛋白還對來自每一組的兩種敷料進(jìn)行了測試，以便測定敷料中可凝固蛋白的百分比。在本測定方法中，將敷料潤濕，并且通過離心使凝固的蛋白沉淀。從所述凝血酶制劑中的某一些中消除CaCl2，不會明顯影響凝塊的形成。正如上面說明二聚體化時(shí)所披露的，以上結(jié)果表明，在所述血纖蛋白原制劑中存在足夠的氯化鈣(1.1mM)，以便促進(jìn)凝血酶活化。
離體豬動脈切開術(shù)敷料性能測試在來自離體的豬動脈切開術(shù)測定中測試了來自某些組的十二種所述止血敷料，以便確定所述敷料是否能夠在模擬的傷口中保持適當(dāng)?shù)膲毫ΑＨ绫?所示，以圓形覆蓋形式生產(chǎn)的敷料，其所述凝血酶層不是與所述血纖蛋白原層同延的，在本測定方法中，它能夠保持適當(dāng)?shù)膲毫Α?br> 按以下方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的來自離體的豬動脈切開術(shù)測定。獲得冷凍的豬主動脈，并且解凍。主動脈可以在4℃下解凍過夜，或者在37℃的水浴中分別包裹。從所述主動脈的前面大約11厘米處切除多余的結(jié)締組織。通常，前5-5.5cm沒有側(cè)枝血管。隨后的5-5.5cm應(yīng)當(dāng)具有不超過1-2個(gè)側(cè)枝血管。這些側(cè)枝血管可以方便地密封或用氰基丙烯酸酯膠修補(bǔ)。
將所述主動脈切成兩個(gè)5.5cm的片段。使用止血鉗或平端鑷子翻轉(zhuǎn)主動脈，暴露出它的內(nèi)部。在37℃用1-5mL的PBS洗滌所述血管的內(nèi)部和外部。在20cc注射器上拉伸O形環(huán)，在它的一側(cè)鉆出大約0.6cm(0.25英寸)的孔。使用手指或止血鉗將所述血管拉到所述注射器上。將具有相同尺寸的另一個(gè)O形環(huán)結(jié)合在它的底部。
使用彎曲的止血鉗，小心地將兩個(gè)O形環(huán)固定在所述血管頂部。在兩個(gè)O形環(huán)之間的距離應(yīng)當(dāng)為3.5cm。所述動脈應(yīng)當(dāng)貼切地配合，并且可靠地固定。對所述固定的血管進(jìn)行定位，以便所述注射器上的孔位于O形環(huán)之間的距離的中點(diǎn)。
用37℃的PBS填充所述注射器，并且通過所述注射器的外側(cè)放入螺桿，并且進(jìn)入所述柱塞，以便所述柱塞保持在固定狀態(tài)。用1-2ml的37℃的PBS洗滌所述注射器上的動脈。使用16號針頭在所述注射器孔的中央形成孔(大約距離每一個(gè)O形環(huán)1.75cm)。每使用12次之后就應(yīng)當(dāng)更換所述16號針頭。
打開裝有所述敷料的密封袋，并且馬上將所述敷料放置在所述切口(距離每一個(gè)O形環(huán)大約0.5cm，以便不會接觸每一個(gè)O形環(huán))上。在使用之前，所有敷料都應(yīng)當(dāng)獨(dú)立包裝。
使用P-1000Pipetman，用37℃的PBS濕潤所述敷料。對于15mg/cm2的敷料來說使用800μL，而對于8mg/cm2的敷料來說使用500μL。馬上將所述注射器護(hù)罩放置在所述敷料頂部，以便不會接觸任意一個(gè)O形環(huán)。輕輕按壓以便固定。
將所述注射器放入37℃的培養(yǎng)箱中，使用所述真空室，以便保持所述注射器以及它的所有部件靜止。用塑料覆蓋物覆蓋，在頂部牢固地放置200g重量。確保所述重量的均勻分布。讓它在37℃下培養(yǎng)5分鐘。
從所述培養(yǎng)箱中取出注射器。小心去掉覆蓋所述敷料的護(hù)罩。將所述注射器連接在與蠕動泵連接的管上。所述管應(yīng)當(dāng)是這樣安裝的，以便它通過所述泵，并且與相反一側(cè)的Y形接頭連接。所述Y形接頭產(chǎn)生了兩個(gè)出口，可以在另一側(cè)產(chǎn)生反壓時(shí)從一側(cè)將所述PBS泵送到所述注射器中。用聯(lián)機(jī)壓力換能器-分析儀直接測定反壓，并且使用DMSI-200/1軟件記錄。
將37℃的PBS泵入所述注射器，并且馬上開始監(jiān)測產(chǎn)生的壓力。開始30秒鐘的緩慢提升(對于E229中的泵來說，將1x速度設(shè)定為4，而對于E132中的泵來說，將1x速度設(shè)定為7.5)，以便所述初始流速為大約0.3mL/分鐘。
在前30秒鐘之后，將所述流速逐漸加大到大約3mL/分鐘(兩種設(shè)置均為10x速度)。進(jìn)行這種操作直到獲得200mm Hg的壓力。一旦達(dá)到了200mm Hg的壓力，啟動定時(shí)器2分鐘時(shí)間。
一旦獲得200mm Hg，停止所述泵。監(jiān)測所產(chǎn)生的壓力。如果壓力開始下降，再次啟動泵，直到獲得適當(dāng)?shù)膲毫?。在所?分鐘的間隔中這種操作可以根據(jù)需要經(jīng)常進(jìn)行(在正常條件下，壓力應(yīng)當(dāng)保持在200-215mm Hg之間)。另外，注意任何泄露以及它的位置。如果發(fā)生泄露，注意最大時(shí)間以及泄露時(shí)的爆發(fā)壓力。根據(jù)以下合格/失敗指標(biāo)判斷敷料性能。
如果敷料能保持相當(dāng)一致的200mm Hg的壓力兩分鐘時(shí)間并且絕對沒有泄露的話，就認(rèn)為它是合格的。如果敷料保持相當(dāng)一致的200mm Hg的壓力兩分鐘時(shí)間，并且僅有少量泄露的話同樣認(rèn)為它是合格的(例如，它自身能重新密封的緩慢滲出或泄露)。
如果敷料由于嚴(yán)重泄露而不能保持適當(dāng)壓力的話，就認(rèn)為它是不合格的。這包括由于較差的粘接所導(dǎo)致的泄露，以及由于生產(chǎn)缺陷所導(dǎo)致的泄露。盡管如此，在本測定中被認(rèn)為不合格的敷料也可用于處理不太嚴(yán)重的傷口。
例2
在下面的表2中提供的數(shù)據(jù)證實(shí)了分層可能是由于所述凝血酶層(或緩沖液)完全覆蓋在所述第一血纖蛋白原層上造成的。生產(chǎn)出涂敷了凝血酶的敷料，以便所述凝血酶層不是與所述第一血纖蛋白原層同延的，大體上通過了所述分層外觀測試(表2中的9-11組和13-16組)。類似地，生產(chǎn)的敷料沒有中間層，即僅具有兩個(gè)血纖蛋白原層，大體上不會變得分層，并且所述血纖蛋白原層緊緊地彼此粘接在一起。
在本實(shí)施例中，按上述方法制備血纖蛋白原，并且按表2所述制備凝血酶。所述血纖蛋白原層(大約1.2mL)是使用可編程的吸液管添加的，并且所述敷料是按本文所披露的方法手工生產(chǎn)的。通過使用噴槍噴霧或通過吸液添加所述敷料的中間層(即凝血酶或血纖蛋白原)。對于每一種配方和涂敷方法來說，添加了四種不同體積的中間層，120μl的體積被認(rèn)為是“標(biāo)準(zhǔn)”體積。在通過噴霧添加所述中間層時(shí)，延長噴霧時(shí)間，以便增加噴涂的體積。其中所述凝血酶是噴霧的所有的組獲得完全覆蓋所述第一血纖蛋白原層。在通過吸液添加所述中間層時(shí)，所述第一血纖蛋白原層的完全覆蓋只有在添加1000μl的中間層時(shí)才能獲得。將較小體積的中間層用于驗(yàn)證分層是通過添加所述凝血酶層，以便它不是與所述血纖蛋白原層同延而抑制的。測試了每一組中的六個(gè)敷料。將第一組用作對照，并且評估含水量，γ-γ二聚體化，可凝固蛋白的百分比，以及外觀(即分層)。對照敷料表現(xiàn)出的含水量為1.3％，在凝固時(shí)具有良好的二聚體化(82％)，所述非凝固樣品的低二聚體化(1％)，以及低的，但是可接受的可凝固蛋白的百分比(68％)。評估所有敷料的分層，并且在表2中示出了合格敷料的數(shù)量。
在表2中示出的數(shù)據(jù)表明，在以完全覆蓋所述血纖蛋白原層的形式添加所述中間層時(shí)(1-8和12組)，所有敷料都變得在它們的邊緣分層。在獲得部分覆蓋時(shí)，所述敷料大體上具有合格的外觀。增加通過吸液添加的所述凝血酶中間層的體積可以增強(qiáng)所述敷料的分層這一發(fā)現(xiàn)表明，分層在更大程度上是所述中間層的覆蓋率和組成的作用，而不是在敷料生產(chǎn)期間中間層冷凍的速度的作用引起的。因此，所述凝血酶層不是與所述血纖蛋白原層同延的敷料能夠抑制分層。
表2

其他實(shí)施方案盡管業(yè)已結(jié)合本發(fā)明的上述詳細(xì)說明和優(yōu)選實(shí)施方案對本發(fā)明進(jìn)行了說明，上述說明是用于解釋，而不是用于限定本發(fā)明的，本發(fā)明是由所附權(quán)利要求書的范圍限定的。其他方面，優(yōu)點(diǎn)，和改進(jìn)屬于以下權(quán)利要求書的范圍。
權(quán)利要求
1.一種止血敷料，它包括(i)第一血纖蛋白原層；(ii)靠近所述第一血纖蛋白原層的凝血酶層；和(iii)靠近所述凝血酶層的第二血纖蛋白原層，其中，所述凝血酶層不是與所述第一血纖蛋白原層和/或所述第二血纖蛋白原層同延的。
2.一種止血敷料，它包括(i)可再吸收的材料層；(ii)靠近所述可再吸收的材料層的第一血纖蛋白原層；(iii)靠近所述第一血纖蛋白原層的凝血酶層；和(iv)靠近所述凝血酶層的第二血纖蛋白原層，其中，所述凝血酶層不是與所述第一血纖蛋白原層和/或所述第二血纖蛋白原層同延的。
3.一種止血敷料，它包括(i)第一血纖蛋白原層；(ii)靠近所述第一血纖蛋白原層的可再吸收的材料層；(iii)靠近所述可再吸收的材料層的凝血酶層；和(iv)靠近所述凝血酶層的第二血纖蛋白原層，其中，所述凝血酶層不是與所述第一血纖蛋白原層和/或所述第二血纖蛋白原層同延的。
4.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的止血敷料，其中，所述凝血酶層是與5％-95％的所述第一血纖蛋白原層同延的。
5.如權(quán)利要求4的止血敷料，其中，所述凝血酶層是與20％-50％的所述第一血纖蛋白原層同延的。
6.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的止血敷料，其中，所述凝血酶層是與5％-95％的所述第二血纖蛋白原層同延的。
7.如權(quán)利要求6的止血敷料，其中，所述凝血酶層是與20％-50％的所述第一血纖蛋白原層同延的。
8.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的止血敷料，其中，所述凝血酶層被設(shè)計(jì)成一系列包含凝血酶的斑點(diǎn)。
9.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的止血敷料，其中，所述凝血酶層被設(shè)計(jì)成包含凝血酶的單個(gè)斑點(diǎn)。
10.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的止血敷料，其中，所述凝血酶層被設(shè)計(jì)成包含凝血酶的多條線。
11.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的止血敷料，還包括基底材料。
12.如權(quán)利要求2的止血敷料，其中，所述可再吸收的材料選自下列一組乙醇酸聚合物，乳酸聚合物和乙醇酸/乳酸共聚物。
13.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的止血敷料，其中，所述層中的一個(gè)或多個(gè)包含增溶劑。
14.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的止血敷料，其中，所述層中的一個(gè)或多個(gè)包含填充物。
15.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的止血敷料，其中，所述層中的一個(gè)或多個(gè)包含粘合劑。
16.一種治療受傷組織的方法，包括將如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的止血敷料應(yīng)用在受傷的組織上。
17.如權(quán)利要求16的方法，還包括用所述受傷的組織以外的液體水合所述止血敷料。
18.如權(quán)利要求16的方法，還包括用所述受傷的組織內(nèi)的液體水合所述止血敷料。
19.一種制備止血敷料的方法，該方法包括提供第一層血纖蛋白原；將凝血酶層涂敷在所述第一層血纖蛋白原上；和將第二層血纖蛋白原涂敷在所述凝血酶層上，其中，所述凝血酶層不是與所述第一血纖蛋白原層和/或所述第二血纖蛋白原層同延的。
20.如權(quán)利要求19的方法，其中，所述凝血酶層是與5％-95％的所述第一血纖蛋白原層同延的。
21.如權(quán)利要求19的方法，其中，所述凝血酶層是與5％-95％的所述第二血纖蛋白原層同延的。
22.一種制備止血敷料的方法，該方法包括提供在它上面結(jié)合了第一層血纖蛋白原的可再吸收的或不可再吸收的背層；將凝血酶層涂敷在所述第一層血纖蛋白原上，位于所述血纖蛋白原層的與結(jié)合所述可再吸收的或不可再吸收的背層的相反的一側(cè)；和將第二層血纖蛋白原涂敷在所述凝血酶層上，其中，所述凝血酶層不是與所述第一血纖蛋白原層和/或所述第二血纖蛋白原層同延的。
23.如權(quán)利要求22的方法，其中，所述凝血酶層是與5％-95％的所述第一血纖蛋白原層同延的。
24.如權(quán)利要求22的方法，其中，所述凝血酶層是與5％-95％的所述第二血纖蛋白原層同延的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種止血敷料，它包括多個(gè)層，所述層包括可再吸收的材料和/或凝血蛋白。具體地講，本發(fā)明包括敷料，其中，凝血酶層被夾在所述第一和/或第二層血纖蛋白原層之間，并且，其中，所述凝血酶層不是與所述第一和/或第二層血纖蛋白原同延的。所述止血敷料可用于治療受傷的組織。
文檔編號A61K38/48GK1688348SQ03823811
公開日2005年10月26日 申請日期2003年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月10日
發(fā)明者M·J·馬科菲 申請人:美國國家紅十字會