專利名稱：免疫調(diào)節(jié)組合物,其制備方法和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫調(diào)節(jié)制劑，該免疫調(diào)節(jié)制劑的制備方法以及使用方法。具體地說，本發(fā)明涉及免疫調(diào)節(jié)制劑，它包含陽離子縮合劑、免疫調(diào)節(jié)化合物(IMC)以及穩(wěn)定劑。本發(fā)明還涉及給予免疫調(diào)節(jié)制劑來調(diào)節(jié)至少一種免疫應(yīng)答。

背景技術(shù)：
針對(duì)感染或其它抗原性攻擊而產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的類型通?？筛鶕?jù)該應(yīng)答中參與的T輔助(Th)細(xì)胞的亞組來區(qū)分。Th1亞組負(fù)責(zé)典型的細(xì)胞介導(dǎo)免疫功能，如遲發(fā)型超敏性和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的激活，而Th2亞組則是更有效地起B(yǎng)細(xì)胞激活輔助物的功能。對(duì)抗原的免疫反應(yīng)類型通常受細(xì)胞響應(yīng)該抗原而產(chǎn)生的細(xì)胞因子的影響。Th1和Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的差別被認(rèn)為是反映了這兩個(gè)亞組的不同生物學(xué)功能。例如參見，Romagnani(2000)Ann.Allergy Asthma Immunol.859-18。
Th1亞組特別適合對(duì)病毒感染、胞內(nèi)病原體以及腫瘤細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，因?yàn)樗置贗L-2和IFN-γ，而這些物質(zhì)激活CTL。Th2亞組則更適合對(duì)自由生活的細(xì)菌和腸道寄生蟲發(fā)生反應(yīng)，它能介導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)，因?yàn)橐呀?jīng)知道IL-4和IL-5分別誘導(dǎo)IgE產(chǎn)生和嗜酸性粒細(xì)胞的激活。通常，Th1和Th2細(xì)胞分泌不同的細(xì)胞因子類型，因此一類反應(yīng)能夠中和另一類反應(yīng)的活性。Th1/Th2平衡的移動(dòng)能導(dǎo)致例如變態(tài)反應(yīng)，或者導(dǎo)致CTL反應(yīng)增加。
對(duì)于許多感染性疾病如結(jié)核病和瘧疾，Th2型反應(yīng)對(duì)于感染幾乎沒有保護(hù)力。建議的疫苗采用了衍生自靶抗原的小肽以及其它目前使用的抗原劑而避免使用有潛在感染性的完整病毒顆粒，但是其并不能引發(fā)達(dá)到治療效果所需的免疫反應(yīng)(免疫應(yīng)答)。這種缺陷的一個(gè)不幸例子是缺少在治療上有效的人免疫缺陷病毒(HIV)疫苗?；诘鞍踪|(zhì)的疫苗通常誘導(dǎo)Th2-型免疫反應(yīng)，其特征是有高滴度的中和抗體，但是沒有明顯的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力。
而且，在某些癥狀中，一些類型的抗體反應(yīng)是不合適的，這在IgE抗體反應(yīng)導(dǎo)致過敏休克的變態(tài)反應(yīng)中尤為顯著。通常，變態(tài)反應(yīng)也涉及Th2-型免疫反應(yīng)。包括變應(yīng)性哮喘在內(nèi)的變態(tài)反應(yīng)的特征是有在接觸變應(yīng)原后數(shù)秒至數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生的特征是細(xì)胞脫顆粒的早期反應(yīng)，以及在4至24小時(shí)后發(fā)生的特征為嗜酸性粒細(xì)胞滲透入接觸變應(yīng)原的部位的晚期反應(yīng)。具體地說，在變態(tài)反應(yīng)的早期，變應(yīng)原與嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞上的IgE抗體交聯(lián)，從而引發(fā)脫顆粒，而隨后從肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞中釋放出組胺以及其它炎癥介導(dǎo)物。在晚期反應(yīng)期間，嗜酸性粒細(xì)胞滲入接觸變應(yīng)原的部位，從而導(dǎo)致組織損失和功能障礙。
對(duì)變應(yīng)性疾病的抗原免疫治療是皮下注射少的但是逐漸增加量的抗原。這種免疫治療防止了誘導(dǎo)產(chǎn)生IgE-介導(dǎo)的過敏反應(yīng)的發(fā)生，但是不能有效地解決變態(tài)反應(yīng)后期反應(yīng)的細(xì)胞因子介導(dǎo)的行為。因此，到目前為止，該方法獲得了有限的成功。
通過給予某些DNA序列(通常稱為免疫刺激序列或“ISS”)，誘導(dǎo)產(chǎn)生了偏向Th1型的免疫反應(yīng)(通過Th1-相關(guān)細(xì)胞因子的分泌來表明)。將免疫刺激多核苷酸和抗原的給藥產(chǎn)生了針對(duì)所給予的抗原的Th1型免疫反應(yīng)。Roman等人(1997)Nature Med.3849-854。例如，真皮內(nèi)注射了以鹽水或佐劑明礬配制的大腸桿菌β半乳糖苷酶(β-Ga1)的小鼠的反應(yīng)是產(chǎn)生了特異性IgG1和IgE抗體以及分泌IL-4和IL-5但不分泌IFN-γ的CD4+細(xì)胞，這表明T細(xì)胞主要是Th2亞組。然而，皮內(nèi)(或用齒形皮膚刮擦涂藥器)注射了編碼β-Ga1并含有ISS的質(zhì)粒DNA的小鼠的反應(yīng)是產(chǎn)生了IgG2a抗體和分泌IFN-γ但不分泌IL-4和IL-5的CD4+細(xì)胞，表明T細(xì)胞主要是Th1亞組。另外，注射了質(zhì)粒DNA的小鼠的特異性IgE產(chǎn)生減少66-75％。Raz等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 935141-5145。通常，對(duì)裸DNA免疫的反應(yīng)的特征是受抗原激活的CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、TNFα和IFN-γ，其表明是Th1型反應(yīng)。如減少的IgE產(chǎn)生所表明的，這是治療過敏和哮喘中特別重要的。免疫刺激多核苷酸刺激Th1型免疫反應(yīng)的能力用細(xì)菌抗原、病毒抗原和變應(yīng)原得到了證明(例如參見，WO 98/55495)。令人感興趣的是，ISS通過細(xì)胞表面受體(Toll樣受體或TLR9)作用，但是最近的一個(gè)報(bào)道提示ISS的內(nèi)化是激活TLR9所需要的。Chuang等人，2002，J.Leukoc.Biol.71(3)538-44；Ahmad-Nejad等人，2002，Eur.J.Immunol.32(7)1958-68。
其它基于DNA的治療方法在DNA作用前必需內(nèi)化。盡管某些組織能攝取有限量的核酸(Wolff，1997，Neuromuscul.Disord.7(5)314-8)，但是更多的注意力放在了提高基因治療和反義構(gòu)建物內(nèi)化的制劑上。這些制劑通常包括使用一種陽離子來使DNA和一種或多種脂質(zhì)(通常脂質(zhì)體形式)縮合，以促進(jìn)膜融合。例如，Semple等人，2001，Bioch.Biophys.Acta 1510152-166，Cappaccioli等人，1993，Bioch.Biophys Res.Comm.197(2)818-25，Maurer等人，2001，Biophys.J.802310-26，Shi等人，2001，Nucl.Acid Res.29(10)2079-87，和Meyer等人，1998，J.Biol.Chem.273(25)15621-27，它們均公開了在體外在含血清的培養(yǎng)基內(nèi)使用陽離子脂質(zhì)/DNA的組合物。其它陽離子/DNA組合已經(jīng)在含血清培養(yǎng)基中作了測(cè)試，包括DNA和聚-L-賴氨酸(Ginobbi等人，1997，Anticancer Res.1729-36，Stewart等人，199，Mol.Pharmacol.501487-94，和Gonzalez-Ferreiro等人，2001，J.Controlled Release 73381-90)，陽離子型肽(Junghans等人，2000，Nucl.AcidRes.28(10)e45，Wyman等人，1997，Biochemistry363008-17)，聚合的陽離子型洗滌劑(Dauty等人，2001，J.Am.Chem.Soc.123(38)9227-34)，聚氨基脂質(zhì)(Guy-Caffey等人，1995，J.Biol.Chem.270(52)31391-96)，陽離子嵌段共聚物(Kabanov等人，1995，Bioconj.Chem.6(6)639-43)，以及陽離子樹突狀聚合物(dendrimer)(Bielinska等人，1996，Nucl.AcidRes.24(11)2176-82，Yoo等人，1999，Pharmaceut.Res.16(12)1799-1804)。Legendre等人在Proc.Nat’l Acad.SciUSA 90893-97(1993)中公開了使用幾種不同的陽離子(包括陽離子性抗生素禾頭孢素(gramidin)S以及多粘菌素B)來提高基因治療構(gòu)建物的轉(zhuǎn)導(dǎo)。美國專利No.5,744,166公開了聚陽離子聚合物和DNA的藥物組合物，其可任選地含有泊洛沙姆407或明膠。Chavany等人(1992，Pharmaceut.Res.9(4)441-49)公開了非離子型洗滌劑(泊洛沙姆188)對(duì)于含有烷基三甲銨鹽(CTAB)和DNA的制劑的影響。另外，國際專利申請(qǐng)No.WO 01/15726公開了帶電荷脂質(zhì)和ISS的組合。
發(fā)明概述 本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)個(gè)體尤其是人體內(nèi)免疫反應(yīng)的新的組合物和方法。申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，該新的免疫調(diào)節(jié)組合物具有顯著提高的免疫調(diào)節(jié)活性。
本發(fā)明一方面涉及一種組合物，它包含陽離子縮合劑、免疫調(diào)節(jié)化合物(IMC)以及穩(wěn)定劑。另一方面，本發(fā)明涉及包含陽離子縮合劑、免疫調(diào)節(jié)化合物(IMC)以及穩(wěn)定劑的顆粒組合物。本發(fā)明還包括藥物組合物，其包含本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物還可包括或任選地排除其它組分，包括脂肪酸和/或抗原分子。
本發(fā)明另一方面涉及調(diào)節(jié)個(gè)體內(nèi)免疫反應(yīng)的方法，該方法包括將本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)組合物給予該個(gè)體，其給予的量足以調(diào)節(jié)所述個(gè)體內(nèi)的免疫反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明方法進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)可實(shí)施在個(gè)體上，這些個(gè)體包括患有Th2型免疫反應(yīng)相關(guān)疾病(如過敏或變應(yīng)原誘導(dǎo)的哮喘)的個(gè)體、接受疫苗如治療性疫苗(如包含變應(yīng)原表位、分枝桿菌表位或腫瘤相關(guān)表位的疫苗)或預(yù)防性疫苗的個(gè)體、患癌癥的個(gè)體、患感染性疾病的個(gè)體以及有可能接觸傳染性因子的個(gè)體。
本發(fā)明另一方面涉及增加個(gè)體內(nèi)γ干擾素(IFN-γ)的方法，該方法包括將有效量的本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)組合物給予該個(gè)體。本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物的給予增加了該個(gè)體內(nèi)的IFN-γ。適合這些方法的對(duì)象包括患有自發(fā)性肺纖維化(IPF)、硬皮病、輻射誘導(dǎo)的皮膚纖維化、肝纖維化(包括血吸蟲誘導(dǎo)的肝纖維化)、腎纖維化以及可通過給予IFN-γ來改善的其它病癥的對(duì)象。
本發(fā)明另一方面涉及一種增加個(gè)體內(nèi)IFN-α的方法，該方法包括將有效量的本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)組合物給予該個(gè)體。本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物的給予增加了該個(gè)體內(nèi)的IFN-α水平。適合這些方法的對(duì)象包括患有對(duì)IFN-α的給予有應(yīng)答反應(yīng)的疾病(包括病毒感染和癌癥)的對(duì)象。
本發(fā)明另一方面涉及緩解感染性疾病的一種或多種癥狀的方法，該方法包括將有效量的本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)組合物給予患感染性疾病的個(gè)體。本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物的給予緩解了該感染性疾病的一種或多種癥狀。可用本發(fā)明來治療的感染性疾病包括由細(xì)胞病原體引起的感染性疾病(例如分枝桿菌疾病、瘧疾、利什曼病、弓形蟲病、血吸蟲病或華支睪吸蟲病)，可包括或排除病毒性疾病。
本發(fā)明還涉及進(jìn)行本發(fā)明方法的藥盒。本發(fā)明的藥盒通常包含一個(gè)容器，該容器有本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物(或如本文所述的，用于產(chǎn)生本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)組合物的材料)，并任選地包括一說明書，該說明書是關(guān)于該免疫調(diào)節(jié)組合物在例如當(dāng)個(gè)體患有與Th2型免疫反應(yīng)相關(guān)的疾病(例如變態(tài)反應(yīng)或變應(yīng)原誘導(dǎo)的哮喘)時(shí)、當(dāng)個(gè)體接受疫苗如治療性疫苗(如包含變應(yīng)原表位、分枝桿菌表面或腫瘤相關(guān)表位的疫苗)或預(yù)防性疫苗時(shí)，當(dāng)個(gè)體患有癌癥時(shí)，當(dāng)個(gè)體患感染性疾病時(shí)，或當(dāng)個(gè)體有可能接觸傳染性因子時(shí)，對(duì)個(gè)體進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。
本發(fā)明還提供了制備本發(fā)明制劑的方法，該方法包括將免疫調(diào)節(jié)化合物(IMC)、穩(wěn)定劑和陽離子縮合劑組合起來制成一混合物。在一些實(shí)施方案中，制備本發(fā)明制劑的方法包括將免疫調(diào)節(jié)化合物(IMC)與穩(wěn)定劑組合起來制成初步的混合物，然后在該最初混合物內(nèi)加入陽離子縮合劑制成免疫調(diào)節(jié)組合物。本發(fā)明還提供了用這些方法制得的免疫調(diào)節(jié)制劑。
發(fā)明詳述 本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了新的組合物和方法來調(diào)節(jié)個(gè)體、包括且尤其是人體內(nèi)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。本發(fā)明的組合物包含陽離子縮合劑、免疫調(diào)節(jié)化合物(IMC)和穩(wěn)定劑的顆粒復(fù)合物。令人驚奇的是，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)IMC和陽離子縮合劑以及穩(wěn)定劑一起配制后其免疫調(diào)節(jié)活性比該免疫調(diào)節(jié)化合物單獨(dú)時(shí)有顯著增加。
通用術(shù)語 除非另有所述，本發(fā)明的實(shí)施將采用常規(guī)的分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的。這些技術(shù)在例如以下文獻(xiàn)中有充分的描述Molecular CloningA Laboratory Manual，second edition(Sambrook等人，1989)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney編，1987)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir & C.C.Blackwell編)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller & M.P.Calos編，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等編，1987)；PCRThe Polymerase Chain Reaction，(Mullis等編，1994)；CurrentProtocols in Immunology(J.E.Coligan等編，1991)；The Immunoassay Handbook(D.Wild編，Stockton Press NY，1994)；Bioconjugate Techniques(Greg T.Hermanson編，AcademicPress，1996)；和Methods of Immunological Analysis(R.Masseyeff，W.H.Albert，和N.A.Staines編，WeinheimVCH Verlags gesellschaft mbH，1993)。
定義 本文所用的單數(shù)形式“一個(gè)(種)”和“這個(gè)(種)”包括指代復(fù)數(shù)，除非另有所述。例如，“一個(gè)(種)”IMC包括一個(gè)(種)或多個(gè)(種)IMC。
本文所用的術(shù)語“多核苷酸”和“寡核苷酸”可以互換，其包括單鏈DNA(ssDNA)、雙鏈DNA(dsDNA)，單鏈RNA(ssRNA)和雙鏈RNA(dsRNA)、經(jīng)修飾的寡核苷酸和寡核苷或其組合。寡核苷酸的構(gòu)型可以呈線形或環(huán)狀，或者寡核苷酸可有線性和環(huán)形的片段。寡核苷酸是由核苷通常通過磷酸酯鍵連接而成的聚合物，但是寡核苷酸中也可采用其它連接鍵如硫代磷酸酯鍵。核苷由嘌呤(腺嘌呤、鳥嘌呤或肌苷或其衍生物)或嘧啶(胸腺嘧啶、胞嘧啶或尿嘧啶或其衍生物)堿基與糖相連而組成。DNA中的四種核苷單元(或堿基)稱為脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸腺嘧啶和脫氧胞嘧啶。核苷酸是核苷的磷酸酯。
本文采用單字母來表示核苷酸序列的堿基，其中A表示腺嘌呤、G是鳥嘌呤、C是胞嘧啶、T是胸腺嘧啶、U是尿嘧啶、I是肌苷、R是嘌呤、Y是嘧啶。
本文所用的術(shù)語“ISS”指能在體外、體內(nèi)和/或活體外引起可測(cè)定的免疫應(yīng)答反應(yīng)的多核苷酸序列?？蓽y(cè)定的免疫反應(yīng)例子包括，但不局限于，抗原特異性抗體的產(chǎn)生、細(xì)胞因子的分泌、淋巴細(xì)胞群如NK細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等的激活或擴(kuò)增。較佳的是，ISS序列優(yōu)先激活Th1型應(yīng)答反應(yīng)。用于本發(fā)明的多核苷酸含有至少一個(gè)ISS。本文所用的術(shù)語“ISS”也是含ISS多核苷酸的簡稱。
本文所用的術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)”和“調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)”指免疫刺激性和免疫抑制性效應(yīng)。免疫調(diào)節(jié)主要是免疫反應(yīng)整體的定量變化，但是伴隨免疫調(diào)節(jié)也會(huì)發(fā)生定性變化。根據(jù)本發(fā)明而免疫調(diào)節(jié)的免疫反應(yīng)是偏向“Th1型”免疫反應(yīng)而非“Th2型”免疫反應(yīng)移動(dòng)的免疫反應(yīng)。Th1型應(yīng)答反應(yīng)通常被認(rèn)為是細(xì)胞免疫系統(tǒng)(例如細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞)的反應(yīng)，而Th2型應(yīng)答反應(yīng)通常是基于“體液”或抗體的。Th1型免疫反應(yīng)通常具有對(duì)抗原的反應(yīng)“遲發(fā)性超敏”的特征，并且可以在生物化學(xué)水平上通過Th1相關(guān)的細(xì)胞因子(如IFN-γ，IL-2，IL-12，和TNF-β以及IFN-α和IL-6)水平的增加來檢測(cè)，但是I1-6也與Th2型反應(yīng)相關(guān)。Th1型免疫反應(yīng)通常伴隨產(chǎn)生細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)和低水平或短時(shí)的抗體產(chǎn)生。Th2型免疫反應(yīng)通常伴有較高水平的抗體產(chǎn)生，包括IgE的產(chǎn)生，其沒有或有很少的CTL產(chǎn)生，以及Th2相關(guān)細(xì)胞因子(如IL-4)的表達(dá)。因此，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)可通過例如經(jīng)本發(fā)明方法處理的個(gè)體內(nèi)相對(duì)于未處理個(gè)體IFN-γ的增加和/或IgE產(chǎn)生的減少來識(shí)別。
術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)”可以指顆粒組合物和/或多核苷酸。因此，即便當(dāng)組合物所含的多核苷酸具有的序列在以單獨(dú)多核苷酸形式存在時(shí)沒有表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)拿庖哒{(diào)節(jié)活性，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物可能表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)活性。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物的多核苷酸單獨(dú)存在時(shí)，其沒有“分離的免疫調(diào)節(jié)活性(獨(dú)自的免疫調(diào)節(jié)活性)”或有“較差的分離的免疫調(diào)節(jié)活性”(即與顆粒組合物相比)。多核苷酸的“分離的免疫調(diào)節(jié)活性(獨(dú)自的免疫調(diào)節(jié)活性)”是通過用表示免疫反應(yīng)至少一個(gè)方面的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)(如本文所公開的那些)測(cè)定具有相同核酸骨架(例如硫代磷酸酯、磷酸二酯、嵌合體)的分離的多核苷酸的免疫調(diào)節(jié)活性來確定的。
本文所用的術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)化合物”或“IMC”指具有免疫調(diào)節(jié)活性且具有含序列5′-CG-3′的核酸部分的分子。IMC可以由一含有多個(gè)ISS、由一個(gè)ISS組成或本身沒有免疫調(diào)節(jié)活性的核酸部分組成。IMC可以由多核苷酸組成(“多核苷酸IMC”)，或可含有其它部分。因此，術(shù)語IMC包括嵌合的免疫調(diào)節(jié)化合物(“CIC”)，其中加入了兩個(gè)或多個(gè)核酸部分，其中至少一個(gè)部分包含與非核苷酸間隔部分共價(jià)連接的序列5′-CG-3′。
本文所用的術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)組合物”、“顆粒組合物”以及“免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物”指含有陽離子縮合劑、IMC和穩(wěn)定劑的組合物。
術(shù)語“抗原”指被抗體或T細(xì)胞抗原受體識(shí)別并與之特異性結(jié)合的物質(zhì)。抗原可包括肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、多糖、碳水化合物復(fù)合物、糖、神經(jīng)節(jié)苷脂、脂質(zhì)和磷脂，以及其部分和其組合?？乖梢允悄切┨烊话l(fā)現(xiàn)的或是合成的抗原。適合包括在本發(fā)明組合物內(nèi)的抗原包括能引發(fā)B細(xì)胞或T細(xì)胞抗原特異性反應(yīng)的任何分子。較佳的是，抗原引發(fā)了對(duì)抗原有特異性的抗體的應(yīng)答反應(yīng)。半抗原包括在“抗原”的范圍內(nèi)。半抗原是低分子量的化合物，其本身沒有免疫原性，但是當(dāng)其與含有抗原決定簇的免疫原性分子偶聯(lián)時(shí)其被賦予了免疫原性。小分子可能需要進(jìn)行半抗原化以賦予其抗原性。本發(fā)明抗原宜包括肽、脂質(zhì)(如甾醇、脂肪酸以及磷脂)、多糖(如流感嗜血菌疫苗中所用的那些多肽)、神經(jīng)節(jié)苷脂和糖蛋白。
“佐劑”指這樣的物質(zhì)，當(dāng)其加入免疫原性制劑(如抗原)中后，它非特異性地增強(qiáng)了受體宿主接觸該混合物后對(duì)于該制劑的免疫反應(yīng)。
術(shù)語“肽”是多肽，其具有足夠的長度和一定組成來實(shí)現(xiàn)生物學(xué)反應(yīng)，例如產(chǎn)生抗體或細(xì)胞因子活性，無論該肽是否是半抗原。肽長度通常有至少6個(gè)氨基酸殘基。術(shù)語“肽”還包括經(jīng)修飾的氨基酸(無論是天然還是非天然存在的)，這些修飾包括但不局限于磷酸化、糖基化、PEG化、脂質(zhì)化和甲基化。
“抗原性肽”包括純化的天然肽、合成肽、重組肽、肽粗提物或處于部分純化或未純化的活性狀態(tài)的肽(如作為減毒或滅活病毒、細(xì)胞或微生物一部分的肽或這些肽的片段)。因此，“抗原性肽”或“抗原多肽”指表現(xiàn)出一種或多種抗原性的整個(gè)或部分多肽。因此，例如“Amb a 1抗原性多肽”或“Amb a 1多肽抗原”是來自表現(xiàn)出抗原性(即與抗體或T細(xì)胞受體特異性結(jié)合)的Amb a 1的氨基酸序列，不管它是整個(gè)序列還是序列的一部分和/或修飾序列。
“對(duì)抗原的變態(tài)反應(yīng)”指一種免疫反應(yīng)，其特征通常是產(chǎn)生嗜酸性粒細(xì)胞和/或抗原特異性IgE及其所得的效應(yīng)。如本領(lǐng)域所熟知的，IgE與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞上的IgE受體結(jié)合。在以后接觸IgE所識(shí)別的抗原時(shí)，抗原與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞上的IgE交聯(lián)，導(dǎo)致這些細(xì)胞脫顆粒(包括但不局限于組胺釋放)?？梢岳斫夂皖A(yù)計(jì)，術(shù)語“對(duì)抗原的變態(tài)反應(yīng)”、“過敏反應(yīng)”、“變應(yīng)性疾病”是同等適用于本發(fā)明的某些方法的。而且，可以理解并預(yù)計(jì)本發(fā)明的方法包括那些同樣適合預(yù)防變態(tài)反應(yīng)以及治療先前存在的變應(yīng)性疾病的方法。
本文所用的術(shù)語“變應(yīng)原”指通常為蛋白質(zhì)的抗原或分子的抗原性部分，它在與對(duì)象接觸后引發(fā)變應(yīng)性反應(yīng)。通常該對(duì)象對(duì)于變應(yīng)原有變態(tài)反應(yīng)，這可通過丘疹以及發(fā)紅(flare)試驗(yàn)或本領(lǐng)域已知的方法來顯示。即便只有少數(shù)對(duì)象在接觸該分子后表現(xiàn)出變應(yīng)性(例如IgE)免疫反應(yīng)，仍稱該分子是變應(yīng)原。許多分離的變應(yīng)原是本領(lǐng)域中已知的。它們包括但不局限于本文表1所提供的那些。
術(shù)語“脫敏”指給予表現(xiàn)出過敏反應(yīng)的對(duì)象增加劑量的變應(yīng)原的過程。用于脫敏的變應(yīng)原劑量的例子是本領(lǐng)域中已知的，例如參見，F(xiàn)ornadley(1998)Otolaryngol.Clin.North Am.31111-127。
“抗原特異性免疫治療”指涉及抗原并產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原特異性調(diào)節(jié)的任何形式的免疫治療。就變應(yīng)原而言，抗原特異性免疫治療包括但不局限于脫敏治療。
“個(gè)體”是脊椎動(dòng)物，較佳的是哺乳動(dòng)物，更佳的是人。哺乳動(dòng)物包括但不局限于人、靈長動(dòng)物、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)動(dòng)物、嚙齒類動(dòng)物和寵物。脊椎動(dòng)物還包括但不局限于鳥類(即禽類)和爬行動(dòng)物。
物質(zhì)的“有效量”或“充足量”是該量足以實(shí)現(xiàn)有利的或所需的結(jié)果，包括臨床結(jié)果。因此，“有效量”取決于其施用時(shí)的情況。在給予調(diào)節(jié)對(duì)抗原的免疫反應(yīng)的組合物的情況下，有效量的免疫調(diào)節(jié)制劑是，與單獨(dú)給予抗原時(shí)獲得的免疫反應(yīng)相比，該量足以實(shí)現(xiàn)這樣的調(diào)節(jié)。有效量可以通過一次或多次給藥來給予。
本文所用的術(shù)語“共同給予”指至少兩種不同物質(zhì)的給藥時(shí)間足夠地靠近，以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。較佳的是，共同給藥指同時(shí)給予至少兩種不同的物質(zhì)。
免疫反應(yīng)如Th1反應(yīng)的“刺激”指反應(yīng)的增加，它可以是反應(yīng)的引發(fā)和/或增強(qiáng)。
“IgE相關(guān)疾病”是這樣的生理癥狀，其部分特征是有持續(xù)或不持續(xù)的升高的IgE水平。IgE相關(guān)疾病包括但不局限于過敏和變態(tài)反應(yīng)、過敏相關(guān)疾病(下述)、哮喘、鼻炎、結(jié)膜炎、風(fēng)疹、休克、膜翅目刺痛過敏以及藥物過敏和寄生蟲感染。該術(shù)語還包括這些疾病的相關(guān)表現(xiàn)。這些疾病中的IgE通常是抗原特異性的。
“過敏相關(guān)疾病”指由抗原特異性IgE免疫反應(yīng)的結(jié)果引起的疾病。這些結(jié)果可包括但不局限于低血壓和休克。過敏癥是過敏相關(guān)疾病的一個(gè)例子，在其期間組胺被釋放到循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)，引起血管擴(kuò)張以及毛細(xì)管滲透性提高，從而導(dǎo)致血循環(huán)大量失去血漿。過敏癥可以是全身發(fā)病(所伴隨的效應(yīng)發(fā)生在整個(gè)身體上)，也可以是局部發(fā)病(反應(yīng)局限于特定的靶組織或器官)。
本文所用的術(shù)語“病毒(性)疾病”指以病毒為病因制劑的疾病。病毒性疾病的例子包括乙肝、丙肝、流感、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)和帶狀皰疹。
本文所用的且本領(lǐng)域熟知的術(shù)語“治療”是一種獲得有利的或需要的結(jié)果(包括臨床結(jié)果)的方法。在本發(fā)明中，有利的或希望的臨床結(jié)果包括，但不局限于，一種或多種癥狀的緩解或緩和、病情減輕、病情穩(wěn)定(即不再惡化)、防止疾病擴(kuò)散、延遲或減緩疾病的進(jìn)展、緩解或減輕疾病狀況、以及消除疾病(部分或全部)，這些結(jié)果是可檢測(cè)的或不能檢測(cè)的?！爸委煛边€指與不接受治療所預(yù)計(jì)的存活相比存活時(shí)間延長。
疾病的“減輕”指與未治療疾病相比，疾病或病情的程度和/或不希望的臨床表現(xiàn)減少了，和/或進(jìn)展的時(shí)間歷程減緩或延長了。尤其是在變態(tài)反應(yīng)的情況下，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，減輕不一定通過給予一劑就能發(fā)生，而通常是在給予一系列劑量后發(fā)生的。因此，足以減輕反應(yīng)或疾病的量可以一次或多次給予。
由本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)組合物引發(fā)的“抗體滴度”或“抗體量”指在給予免疫調(diào)節(jié)組合物后某時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的給定抗體的量。
“Th1相關(guān)抗體”是這樣的抗體，它的產(chǎn)生和/或增加與Th1免疫反應(yīng)相關(guān)。例如，IgG2a在小鼠內(nèi)是Th1相關(guān)抗體。在本發(fā)明中，Th1相關(guān)抗體的測(cè)定可以是對(duì)一種或多種此類抗體的測(cè)定。例如，在人體內(nèi)，Th1相關(guān)抗體的測(cè)定可以測(cè)定IgG1和/或IgG3。
“Th2相關(guān)抗體”是這樣的抗體，它的產(chǎn)生和/或增加與Th2免疫反應(yīng)相關(guān)。例如，IgG1在小鼠內(nèi)是Th2相關(guān)抗體。在本發(fā)明中，Th2相關(guān)抗體的測(cè)定可以是對(duì)一種或多種此類抗體的測(cè)定。例如，在人體內(nèi)，Th2相關(guān)抗體的測(cè)定可以測(cè)定IgG2和/或IgG4。
“抑制”某功能或活性(如細(xì)胞引子產(chǎn)生、抗體產(chǎn)生或組胺釋放)是指，當(dāng)與其它條件相同只是感興趣參數(shù)不同的情況相比，或與另一狀況相比，功能或活性減少。例如，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物和抑制組胺釋放的抗原一起給予或包含該抗原后，組胺的釋放比單獨(dú)抗原所誘導(dǎo)的組胺釋放減少了。
“血清蛋白質(zhì)”是在未患疾病的哺乳動(dòng)物(尤其是未患疾病的牛)的血清內(nèi)通常發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)。最普遍的血清蛋白是血清白蛋白。
本文所用的術(shù)語“包含”及其同義詞指的是包括的意思，即，等價(jià)于術(shù)語“包括”及其相應(yīng)的同義詞。
組合物 本發(fā)明提供用于調(diào)節(jié)個(gè)體內(nèi)免疫反應(yīng)的新的組合物。該新的組合物是包含陽離子縮合劑、IMC和穩(wěn)定劑的制劑。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物還可包含抗原和/或脂肪酸。
本發(fā)明的組合物通常呈顆粒形式。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所明顯知道的，本發(fā)明的顆粒組合物由一群大小不同的顆粒組成。由于這一天然產(chǎn)生的差異，本發(fā)明組合物中的顆粒大小是用范圍或以最大或最小直徑來描述的。如果至少95％的顆粒(以質(zhì)量計(jì))符合指定的尺寸，則認(rèn)為其具有該尺寸的顆粒(例如，如果至少97％的顆粒的直徑小于20微米，則認(rèn)為組合物由直徑小于20微米的顆粒組成)。顆粒大小可用本領(lǐng)域已知的任何常規(guī)方法來測(cè)定，包括過濾(例如用“深”過濾來捕獲大于截留尺寸的顆粒)、動(dòng)態(tài)光散射、電子顯微鏡包括TEM(尤其是與冷凍破裂加工聯(lián)合)和SEM等。
本發(fā)明的組合物宜包含直徑小于約50微米的顆粒，更佳的是直徑小于大約20微米的顆粒，但是在某些實(shí)施方案中，顆粒的直徑可小于大約3、2或1微米。較佳的顆粒大小范圍包括直徑為大約0.01-50微米、0.02-20微米、0.05-5微米以及0.05-3微米。
本發(fā)明組合物的組分可以各種比例/量存在于組合物內(nèi)，但是考慮穩(wěn)定劑以及任選組分(如脂肪酸)與抗原的量保持相對(duì)不變，穩(wěn)定劑通常在大約0.1-0.5％(v/v)范圍內(nèi)，脂肪酸在大約0-0.5％范圍內(nèi)，抗原濃度在大約0.1-100微克/毫升范圍內(nèi)，較佳在大約1-100微克/毫升，更佳在大約10-50微克/毫升范圍內(nèi)。在本發(fā)明組合物中，IMC和陽離子縮合劑的量和比例可在較大的范圍內(nèi)變化。IMC的用量在某種程度上根據(jù)IMC的分子量而變，通常在大約50微克/毫升至2毫克/毫升范圍內(nèi)，較佳在大約100微克/毫升至1毫克/毫升范圍內(nèi)。陽離子縮合劑存在的量通常超過IMC(以質(zhì)量計(jì))，通常的比例為大約1:2(IMC∶陽離子縮合劑)至1∶6，更佳的約為2∶5至1∶5。
本發(fā)明組合物的顆粒大小是隨許多變量而變的函數(shù)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，組合物顆粒的大小分布可通過改變陽離子縮合劑與IMC之比來調(diào)節(jié)。例如，在列舉性的+ISS/0.4％吐溫85/0.4％油酸酯/多粘菌素B的組合物中，改變陽離子縮合劑與IMC之比可以使平均粒徑從陽離子縮合劑IMC為1時(shí)的大約1.5微米變?yōu)殛栯x子縮合劑IMC為10時(shí)的大約45微米。
在某些實(shí)施方案中，該組合物包含陽離子縮合劑、IMC以及作為穩(wěn)定劑的非離子型洗滌劑。在其它實(shí)施方案中，該組合物包含使膜破裂的陽離子型脂肽(較佳的是多粘菌素，更佳的是多粘菌素B(PMXB))、IMC和穩(wěn)定劑。在一些實(shí)施方案中，所述穩(wěn)定劑不是血清蛋白質(zhì)(尤其不是牛血清蛋白質(zhì))。此類實(shí)施方案的一個(gè)典型組合物采用了多氧乙烯醚洗滌劑如吐溫80或吐溫85作為穩(wěn)定劑，用油酸酯作為任選的額外穩(wěn)定劑。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含免疫調(diào)節(jié)顆粒，其中該顆粒是通過將陽離子縮合劑、IMC和作為穩(wěn)定劑的非離子型洗滌劑相混合起來而制得。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含免疫調(diào)節(jié)顆粒，其中該顆粒是通過將膜破裂陽離子型脂肽(較佳的是多粘菌素，更佳的是PMXB)、IMC和穩(wěn)定劑混合起來而制得的。在一些實(shí)施方案中，穩(wěn)定劑不是血清蛋白(尤其不是牛血清蛋白質(zhì))。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含免疫調(diào)節(jié)顆粒，其中該顆粒是通過將IMC和作為穩(wěn)定劑的非離子型洗滌劑混合起來形成IMC/穩(wěn)定劑混合物、然后將陽離子縮合劑與該IMC/穩(wěn)定劑混合物合并起來而形成的。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含免疫調(diào)節(jié)顆粒，其中該顆粒是通過將IMC和穩(wěn)定劑混合起來形成IMC/穩(wěn)定劑混合物、然后將膜破裂陽離子脂肽(較佳的是多粘菌素，更佳的是PMXB)與該IMC/穩(wěn)定劑混合物合并起來而形成的。在某些方案中，穩(wěn)定劑不是血清蛋白(尤其不是牛血清蛋白質(zhì))。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含免疫調(diào)節(jié)顆粒，其中該顆粒包含陽離子縮合劑、IMC和作為穩(wěn)定劑的非離子型洗滌劑。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含免疫調(diào)節(jié)顆粒，其中顆粒包含膜破裂陽離子脂肽(較佳的是多粘菌素、更佳的是PMXB)IMC和穩(wěn)定劑。在一些實(shí)施方案中，穩(wěn)定劑不是血清蛋白質(zhì)(尤其不是牛血清蛋白質(zhì))。
陽離子縮合劑 用于本發(fā)明組合物和方法陽離子縮合劑是在生理pH(即，pH約為7.0-7.5)下帶正電荷的分子。較佳的是，用于本發(fā)明的陽離子縮合劑不是兩性的，是聚陽離子的，即每個(gè)分子有多個(gè)正電荷。用于本發(fā)明的陽離子縮合劑包括親水性或兩性聚陽離子。
較佳的陽離子縮合劑包括(a)膜破裂陽離子脂肽，其包括但不局限于，多粘菌素A、多粘菌素B(包括多粘菌素B1和多粘菌素B2)、多粘菌素C、多粘菌素D、多粘菌素E(也稱為粘桿菌素)、多粘菌素K、多粘菌素M、多粘菌素P、多粘菌素S和多粘菌素T；環(huán)桿菌素類、包括環(huán)桿菌素A、環(huán)桿菌素B、環(huán)桿菌素C、環(huán)桿菌素D、環(huán)桿菌素E和環(huán)桿菌素F；八肽素(octapeptin)；兩性霉素類，包括兩性霉素B以及乙酰化肽，包括辛?；?KFFKFFKFF和?；鵎ALA(辛?；?WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALEACEA；(b)膜破裂陽離子肽，包括但不局限于多粘菌素B(PMXB)九肽；殺菌肽類包括殺菌肽A，殺菌肽B和殺菌肽P1，KFFKFFKFF和KALA(WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA)；(c)單鏈陽離子表面活性劑，包括但不局限于十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，芐基-二甲基-溴化銨(BDAB)、CpyrB(十六烷基-溴化吡啶鎓)，CimB(十六烷基溴化咪唑鎓)；和聚陽離子性聚合物，包括但不局限于，聚-L-賴氨酸(PLL)和聚乙烯胺(PEI)。在某些實(shí)施方案中，陽離子縮合劑是膜破裂陽離子脂肽，較佳的是多粘菌素，更佳的是PMXB。在一些實(shí)施方案中，陽離子縮合劑可不包括脂肪酸酯(即，脂質(zhì))和雙鏈陽離子表面活性劑。
免疫調(diào)節(jié)化合物 根據(jù)本發(fā)明，免疫調(diào)節(jié)化合物(IMC)是具有免疫調(diào)節(jié)活性且包含具有序列5′-CG-3′的核酸部分的分子。IMC可以是多核苷酸，或是摻入了核酸部分且其中至少一個(gè)包含序列5′-CG-3′如CIC的化合物。當(dāng)IMC是多核苷酸時(shí)，該多核苷酸可含有至少一個(gè)ISS，也可含有多個(gè)ISS。ISS可以和多核苷酸毗連，或是在該多核苷酸內(nèi)隔開有其它核苷酸堿基。在某些實(shí)施方案中，IMC由一個(gè)ISS組成。因此多核苷酸IMC可含有本文所述的任何一個(gè)或多個(gè)ISS的組合?；蛘撸琁MC可以是包含至少兩個(gè)核酸部分的CIC，其中至少一個(gè)包含與間隔臂部分共價(jià)連接的序列5′-CG-3′。當(dāng)作為本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)組合物的一個(gè)組分給予時(shí)，IMC影響了在體外、體內(nèi)和/或活體外可測(cè)定的免疫反應(yīng)。
多核苷酸IMC可以有大于6個(gè)堿基或堿基對(duì)的任何長度，其通常包含序列5′-胞嘧啶，鳥嘌呤-3′，較佳的是大于15個(gè)堿基或堿基對(duì)，更佳的是大于20個(gè)堿基或堿基對(duì)。如本領(lǐng)域中所熟知的，5′-胞嘧啶，鳥嘌呤-3′中的胞嘧啶通常是非甲基化的，尤其是在C-5位，但是在某些實(shí)施方案中，胞嘧啶允許甲基化，例如在N-4位。多核苷酸IMC還可包含序列5′-嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧啶，C，G-3′。多核苷酸IMC還可包含序列5’-嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧啶，C，C-3’。如下文多核苷酸序列所示，多核苷酸IMC可包含(即，含有一個(gè)或多個(gè))序列5’-T，C，G-3’或5’-T，C，G，A-3’。因此，多核苷酸IMC可包含5′-CG-3′和/或5’-TCG-3’和/或5’-TCGA-3’，在某些實(shí)施方案中，尿嘧啶(U)可以代替胸腺嘧啶。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC可包含序列5’-C，G，嘧啶，嘧啶，C，G-3’(例如5’-CGTTCG-3’)。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC可包含序列5’-C，G，嘧啶，嘧啶，C，G，嘌呤，嘌呤-3’。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC包含序列5’-嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧啶-3’(例如5’-AACGTT-3’)。如下文進(jìn)一步討論的，多核苷酸IMC可含有5-溴胞嘧啶以代替ISS中5′-CG-3′，5’-TCG-3’，5’-TCGA-3’，5’-UCG-3’，或5’-UCGA-3’中的″C″。
在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC可包含序列5’-嘌呤，T，C，G，嘧啶，嘧啶-3’。
在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC包含下列序列的任一個(gè)GACGCTCC；GACGTCCC；GACGTTCC；GACGCCCC；AGCGTTCC；AGCGCTCC；AGCGTCCC；AGCGCCCC；AACGTCCC；AACGCCCC；AACGTTCC；AACGCTCC；GGCGTTCC；GGCGCTCC；GGCGTCCC；GGCGCCCC；GACGCTCG；GACGTCCG；GACGCCCG；GACGTTCG；AGCGCTCG；AGCGTTCG；AGCGTCCG；AGCGCCCG；AACGTCCG；AACGCCCG；AACGTTCG；AACGCTCG；GGCGTTCG；GGCGCTCG；GGCGTCCG；GGCGCCCG。
在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC包含下列序列的任一個(gè)GACGCT；GACGTC；GACGTT；GACGCC；GACGCU；GACGUC；GACGUU；GACGUT；GACGTU；AGCGTT；AGCGCT；AGCGTC；AGCGCC；AGCGUU；AGCGCU；AGCGUC；AGCGUT；AGCGTU；AACGTC；AACGCC；AACGTT；AACGCT；AACGUC；AACGUU；AACGCU；AACGUT；AACGTU；GGCGTT；GGCGCT；GGCGTC；GGCGCC；GGCGUU；GGCGCU；GGCGUC；GGCGUT；GGCGTU。
在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC包含下列序列的任一個(gè)GABGCT；GABGTC；GABGTT；GABGCC；GABGCU；GABGUC；GABGUU；GABGUT；GABGTU；AGBGTT；AGBGCT；AGBGTC；AGBGCC；AGBGUU；AGBGCU；AGBGUC；AGBGUT；AGBGTU；AABGTC；AABGCC；AABGTT；AABGCT；AABGUC；AABGUU；AABGCU；AABGUT；AABGTU；GGBGTT；GGBGCT；GGBGTC；GGBGCC；GGBGUU；GGBGCU；GGBGUC；GGBGUT；GGBGTU，其中B是5-溴胞嘧啶。
在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC包含下列序列的任一個(gè)GABGCTCC；GABGTCCC；GABGTTCC；GABGCCCC；AGBGTTCC；AGBGCTCC；AGBGTCCC；AGBGCCCC；AABGTCCC；AABGCCCC；AABGTTCC；AABGCTCC；GGBGTTCC；GGBGCTCC；GGBGTCCC；GGBGCCCC；GABGCTCG；GABGTCCG；GABGCCCG；GABGTTCG；AGBGCTCG；AGBGTTCG；AGBGTCCG；AGBGCCCG；AABGTCCG；AABGCCCG；AABGTTCG；AABGCTCG；GGBGTTCG；GGBGCTCG；GGBGTCCG；GGBGCCCG；GABGCTBG；GABGTCBG；GABGCCBG；GABGTTBG；AGBGCTBG；AGBGTTBG；AGBGTCBG；AGBGCCBG；AABGTCBG；AABGCCBG；AABGTTBG；AABGCTBG；GGBGTTBG；GGBGCTBG；GGBGTCBG；GGBGCCBG，其中B是5-溴胞嘧啶。
在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC包含下列序列的任一個(gè)GABGCUCC；GABGUCCC；GABGUTCC；GABGTUCC；GABGUUCC；AGBGUUCC；AGBGTUCC；AGBGUTCC；AGBGCUCC；AGBGUCCC；AABGUCCC；AABGUUCC；AABGUTCC；AABGTUCC；AABGCUCC；GGBGUUCC；GGBGUTCC；GGBGTUCC；GGBGCUCC；GGBGUCCC；GABGCUCG；GABGUCCG；GABGUUCG；GABGUTCG；GABGTUCG；AGBGCUCG；AGBGUUCG；AGBGUTCG；AGBGTUCG；AGBGUCCG；AABGUCCG；AABGUUCG；AABGUTCG；AABGTUCG；AABGCUCG；GGBGUUCG；GGBGUTCG；GGBGTUCG；GGBGCUCG；GGBGUCCG；GABGCUBG；GABGUCBG；GABGUUBG；GABGUTBG；GABGTUBG；AGBGCUBG；AGBGUUBG；AGBGUCBG；AGBGUTBG；AGBGTUBG；AABGUCBG；AABGUUBG；AABGUTBG；AABGTUBG；AABGCUBG；GGBGUUBG；GGBGUTBG；GGBGTUBG；GGBGCUBG；GGBGUCBG，其中B是5-溴胞嘧啶。
在一些實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)化合物包含序列5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO1)。在其它實(shí)施方案中，多核苷酸IMC包含下列序列的任一個(gè) 5’-TGACCGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO2)； 5’-TCATCTCGAACGTTCCACAGTCA-3’(SEQ ID NO3)； 5’-TGACTGTGAACGTTCCAGATGA-3’(SEQ ID NO4)； 5’-TCCATAACGTTCGCCTAACGTTCGTC-3’(SEQ ID NO5)； 5’-TGACTGTGAABGTTCCAGATGA-3’(SEQ ID NO6)，其中B是5-溴胞嘧啶； 5’-TGACTGTGAABGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO7)，其中B是5-溴胞嘧啶； 5’-TGACTGTGAABGTTBGAGATGA-3’(SEQ ID NO8)，其中B是5-溴胞嘧啶； 5’-GAAABGUTCG-3’(SEQ ID NO9)，其中B是5-溴胞嘧啶； 5’-BGAABGUTCG-3’(SEQ ID NO10)，其中B是5-溴胞嘧啶； 5’-TCGAGCGTTCT-3’(SEQ ID NO11)； 5’-TGAACGUTCG-3’(SEQ ID NO12)； 5’-GAACCGTTCG-3’(SEQ ID NO13)； 5’-CGAACGTTCG-3’(SEQ ID NO14)； 5’-ATCGACTCTCGAGCGTTCTC-3’(SEQ ID NO15)； 5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’(SEQ ID NO16)； 5’-TCGTCGAACGTTCGTT-3’(SEQ ID NO17)； 5’-TCGTCGAACGTTCG-3’(SEQ ID NO18)； 5’-TCGTCGAACGTT-3’(SEQ ID NO19)； 5’-TCGAACGTTC-3’(SEQ ID NO20)，以及 5’-TCGTCGAT-3’。
在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC可以有7個(gè)堿基(或堿基對(duì))或更多。因此，在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC包含或由下式的序列組成5’-TCGX1X2X3X4-3’或5’-UCGX1X2X3X4-3’，其中X1，X2，X3，X4是核苷酸。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC包含下列序列的任一個(gè)5’-TCGTTTT-3’；5’-TCGAAAA-3’；5’-TCGCCCC-3’；5’-TCGGGGG-3’；5’-TCGUUUU-3’；5’-TCGIIII-3’；5’-UCGTTTT-3’；5’-UCGAAAA-3’；5’-UCGCCCC-3’；5’-UCGGGGG-3’；5’-UCGUUUU-3’；5’-UCGIIII-3’。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC包含或由下式的序列組成5’-X1TCGX2X3X4-3’或5’-X1UCGX2X3X4-3’，其中X1，X2，X3，X4是核苷酸。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC包含下列序列的任一個(gè)5’-TTCGTTT-3’；5’-ATCGATT-3’；5’-TUCGTTT-3’；5’-AUCGATT-3’。在其它實(shí)施方案中，多核苷酸IMC包含或由下式序列組成5’-X1X2TCGX3X4-3’或5’-X1X2UCGX3X4-3’，其中X1，X2，X3，X4是核苷酸。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC包含下列序列的任一個(gè)5’-TTTCGTT-3’；5’-AATCGAT-3’；5’-TTUCGTT-3’；5’-AAUCGAT-3’。
在某些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC包含下式的序列5’-X1X2AX3CGX4TCG-3’(SEQ ID NO21)其中X1是T，G，C或B(B＝5-溴胞嘧啶)，其中X2是T，G，A或U，其中X3是T，A或C，其中X4是T，G或U。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)該式的多核苷酸IMC不包括5’-TGAACGTTCG-3’(SEQ ID NO22)或5’-GGAACGTTCG-3’(SEQ ID NO23)。
在其它實(shí)施方案中，多核苷酸IMC包含下式的序列5’-X1X2AX3 BGX4TCG-3’(SEQ ID NO24)其中B是5-溴胞嘧啶，其中X1是T，G，C或B(B＝5-溴胞嘧啶)，其中X2是T，G，A或U，其中X3是T，A或C，其中X4是T，G或U。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)該式的多核苷酸IMC不包括5’-TGAABGTTCG-3’(SEQ ID NO25)(B＝5-溴胞嘧啶)。
在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC包含序列5’-TCGTCGX1-3’，其中X1是核苷酸。在其它實(shí)施方案中，多核苷酸IMC包含下列序列的任一個(gè)5’-TCGTCGA-3’；5’-TCGTCGC-3’；5’-TCGTCGG-3’；5’-TCGTCGT-3’；5’-TCGTCGU-3’；5’-TCGTCGI-3’。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC包含序列5’-TCGUCGX1-3’，5’-UCGTCGX1-3’，或5’-UCGUCGX1-3’，其中X1是核苷酸。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC包含下列序列的任一個(gè)5’-TCGUCGA-3’；5’-TCGUCGC-3’；5’-TCGUCGG-3’；5’-TCGUCGT-3’；5’-TCGUCGU-3’；5’-TCGUCGI-3’；5’-UCGTCGA-3’；5’-UCGTCGC-3’；5’-UCGTCGG-3’；5’-UCGTCGT-3’；5’-UCGTCGU-3’；5’-UCGTCGI-3’；5’-UCGUCGA-3’；5’-UCGUCGC-3’；5’-UCGUCGG-3’；5’-UCGUCGT-3’；5’-UCGUCGU-3’；5’-UCGUCGI-3’。
在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC包含根據(jù)下式的序列5’-T mC GX1X2X3X4-3’或5’-U mC GX1X2X3X4-3’，其中X1，X2，X3，X4是核苷酸，mC是如本文所述的修飾的胞嘧啶。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC包含根據(jù)下式的序列5’-X1T mCGX2X3X4-3’或5’-X1U mC GX2X3X4-3’，其中X1，X2，X3，X4是核苷酸。在一些實(shí)施方案中，ISS包含根據(jù)下式的序列5’-X1X2T mC GX3X4-3’或5’-X1X2U mC GX3X4-3’，其中X1，X2，X3，X4是核苷酸。
在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC包含根據(jù)下式的序列5’-T mC GTCGX1-3’，5’-T mC GUCGX1-3’，5’-U mC GTCGX1-3’或5’-U mC GUCGX1-3’，其中X1是核苷酸。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC包含根據(jù)下式的序列5’-TCGT mC GX1-3’，5’-UCGT mC GX1-3’，5’-TCGU mC GX1-3’或5’-UCGU mC GX1-3’，其中X1是核苷酸。在其它實(shí)施方案中，多核苷酸IMC包含根據(jù)下式的序列5’-T mC GT mC GX1-3’，5’-U mC GT mC GX1-3’，5’-T mC GU mC GX1-3’或5’-U mC GU mC GX1-3’，其中X1是核苷酸。如本文所述，修飾的胞嘧啶(mC)包括在胞嘧啶的C-5和/或C-6增加吸電子部分，其包括但不局限于，C-5位鹵化的胞嘧啶，例如5-溴胞嘧啶。
因此，在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC包含下列序列的任一個(gè)5’-TBGTTTT-3’；5’-TBGAAAA-3’；5’-TBGCCCC-3’；5’-TBGGGGG-3’；5’-TBGUUUU-3’；5’-TBGIIII-3’；5’-TBGTCGA-3’；5’-TBGTCGC-3’；5’-TBGTCGG-3’；5’-TBGTCGT-3’；5’-TBGTCGU-3’；5’-TBGTCGI-3’；5’-TCGTBGA-3’；5’-TCGTBGC-3’；5’-TCGTBGG-3’；5’-TCGTBGT-3’；5’-TCGTBGU-3’；5’-TCGTBGI-3’；5’-TBGTBGA-3’；5’-TBGTBGC-3’；5’-TBGTBGG-3’；5’-TBGTBGT-3’，5’-TBGTBGU-3’；5’-TBGTBGI-3’；其中B是5-溴胞嘧啶。
在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC由序列5’-TCGTCGX1-3’組成，其中X1是核苷酸。在某些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC由序列5’-TCGTCGA-3’；5’-TCGTCGC-3’；5’-TCGTCGG-3’；5’-TCGTCGT-3’；5’-TCGTCGU-3’；5’-TCGTCGI-3’組成。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC由序列5’-TCGUCGX1-3’，5’-UCGTCGX1-3’，或5’-UCGUCGX1-3’組成，其中X1是核苷酸。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC由下列序列的任一個(gè)組成5’-TCGUCGA-3’；5’-TCGUCGC-3’；5’-TCGUCGG-3’；5’-TCGUCGT-3’；5’-TCGUCGU-3’；5’-TCGUCGI-3’；5’-UCGTCGA-3’；5’-UCGTCGC-3’；5’-UCGTCGG-3’；5’-UCGTCGT-3’；5’-UCGTCGU-3’；5’-UCGTCGI-3’；5’-UCGUCGA-3’；5’-UCGUCGC-3’；5’-UCGUCGG-3’；5’-UCGUCGT-3’；5’-UCGUCGU-3’；5’-UCGUCGI-3’。
在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC由下式的序列組成5’-T mC GX1X2X3X4-3’或5’-U mC GX1X2X3X4-3’，其中X1，X2，X3，X4是核苷酸，其中mC是如本文所述的修飾的胞嘧啶。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC由下式的序列組成5’-X1T mCGX2X3X4-3’或5’-X1U mC GX2X3X4-3’，其中X1，X2，X3，X4是核苷酸。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC由下式序列組成5’-X1X2T mC GX3X4-3’或5’-X1X2U mCGX3X4-3’，其中X1，X2，X3，X4是核苷酸。
在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC由下式序列組成5’-TmC GTCGX1-3’，5’-TmC GUCGX1-3’，5’-U mC GTCGX1-3’或5’-U mC GUCGX1-3’，其中X1是核苷酸。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC由下式序列組成5’-TCGT mC GX1-3’，5’-UCGT mCGX1-3’.5’-TCGU mC GX1-3’或5’-UCGU mC GX1-3’，其中X1是核苷酸。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC由下式序列組成5’-T mC GT mC GX1-3’，5’-U mC GT mCGX1-3’，5’-T mC GU mC GX1-3’或5’-U mC GU mC GX1-3’，其中X1是核苷酸。如本文所述，修飾的胞嘧啶(mC)包括在胞嘧啶的C-5和/或C-6位增加吸電子部分，其包括但不局限于，C-5位鹵化的胞嘧啶，例如5-溴胞嘧啶。
因此，在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC由下列序列的任一個(gè)組成5’-TBGTTTT-3’；5’-TBGAAAA-3’；5’-TBGCCCC-3’；5’-TBGGGGG-3’；5’-TBGUUUU-3’；5’-TBGIIII-3’；5’-TBGTCGA-3’；5’-TBGTCGC-3’；5’-TBGTCGG-3’；5’-TBGTCGT-3’；5’-TBGTCGU-3’；5’-TBGTCGI-3’；5’-TCGTBGA-3’；5’-TCGTBGC-3’；5’-TCGTBGG-3’；5’-TCGTBGT-3’；5’-TCGTBGU-3’；5’-TCGTBGI-3’；5’-TBGTBGA-3’；5’-TBGTBGC-3’；5’-TBGTBGG-3’；5’-TBGTBGT-3’，5’-TBGTBGU-3’；5’-TBGTBGI-3’；其中B是5-溴胞嘧啶。
如本文所述，多核苷酸IMC的長度大于6個(gè)堿基或堿基對(duì)。因此，在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC小于下列任一長度(堿基或堿基對(duì))10,000；5,000；2500；2000；1500；1250；1000；750；500；300；250；200；175；150；125；100；75；50；25；20；18；16；14。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸IMC大于下列任一長度(堿基或堿基對(duì))6；7；8；10；12；14；15；20；25；30；40；50；60；75；100；125；150；175；200；250；300；350；400；500；750；1000；2000；5000；7500；10000；20000；50000?；蛘撸嗪塑账酙MC的大小可以有一個(gè)范圍，該范圍的上限為10,000；5,000；2500；2000；1500；1250；1000；750；500；300；250；200；175；150；125；100；75；50；25；20；18；或16，以及獨(dú)立選擇的下限7；8；10；12；14；15；20；25；30；40；50；60；75；100；125；150；175；200；250；300；350；400；500；750；1000；2000；5000；7500，其中下限低于上限。
IMC的多核苷酸部分可有例如本領(lǐng)域所知的修飾，其包括但不局限于，3’OH或5’OH基團(tuán)的修飾、核苷酸堿基的修飾、糖組分的修飾以及磷酸酯基團(tuán)的修飾。下面描述各種此類修飾。
較佳的是，IMC的核苷酸部分中的胞嘧啶沒有甲基化，但是在某些實(shí)施方案中，IMC可含有一個(gè)或多個(gè)甲基化的胞嘧啶。在這些實(shí)施方案中，核苷酸部分的5′-CG-3′中的胞嘧啶在C-5位沒有甲基化。然而，在具有甲基化胞嘧啶的這些IMC中，可考慮對(duì)N-4位進(jìn)行甲基化。
IMC的核苷酸部分可以是單鏈或雙鏈DNA，以及單鏈或雙鏈RNA或其它修飾的多核苷酸。IMC核苷酸部分可以包括或不包括一個(gè)或多個(gè)可存在于上述基序中的或可延伸在該基序外的回文區(qū)域，還可包含其它的側(cè)接序列，其中的一些在本文有所描述。
IMC的核苷酸部分可含有天然存在的或經(jīng)修飾的、非天然存在的堿基，可含有經(jīng)修飾的糖、磷酸酯和/或末端。例如，磷酸酯修飾包括但不局限于，磷酸甲酯、硫代磷酸酯、亞磷酰胺(橋連的或非橋連的)、磷酸三酯和二硫代磷酸酯，這些修飾可以組合使用。例如參見，表8中列舉的IMC。還可用其它非磷酸酯鍵。較佳的是，本發(fā)明的寡核苷酸包含磷酸二酯和/或硫代磷酸酯骨架。也可制備本領(lǐng)域已知的糖修飾，如2’-烷氧基-RNA類似物、2’-氨基-RNA類似物以及2’-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合體以及本文描述的其它修飾物，并與任何磷酸酯修飾組合。堿基修飾的例子包括，但不局限于，在ISS的胞嘧啶的C-5位和/或C-6位加入吸電子部分(例如5-溴胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-碘胞嘧啶)。例如參見，國際專利申請(qǐng)No.WO 99/62923。
IMC的核苷酸部分可用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)和核酸合成設(shè)備來合成，這些技術(shù)包括但不局限于酶方法、化學(xué)方法以及從較大的寡核苷酸的序列降解。例如參見，Ausubel等人(1987)；以及Sambrook等人(1989)。當(dāng)用酶方法組裝時(shí)，可用諸如T4 DNA或RNA連接酶等連接酶將各個(gè)單元連接起來。美國專利No.5，124,246。寡核苷酸降解可通過使寡核苷酸接觸核酸酶來實(shí)現(xiàn)，例如美國專利No.4,650,675中所列舉的那樣。
IMC的核苷酸部分也可用常規(guī)的多核苷酸分離步驟來分離。這些步驟包括，但不局限于，使探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢測(cè)共有的核苷酸序列，對(duì)表達(dá)庫進(jìn)行抗體篩選以檢測(cè)共有的結(jié)構(gòu)特征，以及用聚合酶鏈反應(yīng)合成特定的天然序列。
環(huán)狀多核苷酸IMC部分可以分離、用重組方法合成或用化學(xué)方法合成。當(dāng)通過分離或重組方法獲得環(huán)狀多核苷酸IMC部分時(shí)，它宜為質(zhì)粒。較小環(huán)狀多核苷酸的化學(xué)合成可用文獻(xiàn)中描述的任何方法來進(jìn)行，例如參見Gao等人(1995)Nucleic AcidsRes.232025-2029；和Wang等人(1994)Nucleic Acids Res.222326-2333。
制備寡核苷酸和經(jīng)修飾的寡核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的。具有磷酸二酯鍵的天然存在的DNA或RNA通常是用以下方法來合成的依次將合適的核苷亞磷酰胺連接到正在生長的3′端連于固相載體的寡核苷酸的5′-羥基上，然后使中間產(chǎn)物亞磷酸三酯氧化成磷酸三酯。一旦合成了所需的寡核苷酸序列，從載體上取下寡核苷酸，將磷酸三酯去保護(hù)成磷酸二酯，用氨水或其它堿使核苷堿基去保護(hù)。例如參見，Beaucage(1993)“寡脫氧核糖核苷酸的合成(Oligodeoxyribonucleotide Synthesis)”，Protocols forOligonucleotides and Analogs，Synthesis and Properties(Agrawal編)Humana Press，Totowa，NJ；Warner等人(1984)DNA 3401以及美國專利No.4,458,066。
IMC核苷酸部分還可含有磷酸酯修飾的寡核苷酸。含有經(jīng)修飾的磷酸酯鍵或非磷酸酯鍵的多核苷酸的合成也是本領(lǐng)域已知的。關(guān)于綜述可見Matteucci(1997)“寡核苷酸類似物回顧(Oligonucleotide Analogsan Overview)”，Oligonucleotides as TherapeuticAgents，(D.J.Chadwick和G.Cardew編)John Wiley and Sons，New York，NY。在本發(fā)明的寡核苷酸中，可以與糖或糖類似物部分相連的磷酸衍生物(或經(jīng)修飾的磷酸酯基團(tuán))可以是單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。上述磷酸酯類似物的制備及其摻入核苷酸、經(jīng)修飾的核苷酸和寡核苷酸本身均是已知的，因此這里不再加以贅述。Peyrottes等人(1996)Nucleic Acids Res.241841-1848；Chaturvedi等人(1996)Nucleic Acids Res.242318-2323；以及Schultz等人(1996)Nucleic Acids Res.242966-2973。例如，硫代磷酸酯寡核苷酸的合成與上述天然存在的寡核苷酸的合成相似，只是氧化步驟被硫化步驟代替(Zon (1993)“寡核苷硫代磷酸酯(Oligonucleoside Phosphorothioates)”Protocols for Oligonucleotides andAnalogs，Synthesis and Properties(Agrawal編)Humana Press，pp.165-190)。類似的，其它磷酸酯類似物的合成，例如磷酸三酯(Miller等人(1971)JACS 936657-6665)，非橋連的亞磷酰胺(Jager等人(1988)Biochem.277247-7246)，N3’至P5’的亞磷酰胺(Nelson等人(1997)JOC 627278-7287)以及二硫代磷酸酯(美國專利No.5,453,496)的合成也已有所描述。還可使用其它不基于磷酸的修飾的寡核苷酸(Stirchak等人(1989)Nucleic Acids Res.176129-6141)。具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸比具有磷酸二酯骨架的寡核苷酸更具免疫原性，且在注射入宿主體內(nèi)后更具耐降解能力。Braun等人，(1988)J.Immunol.1412084-2089；和Latimer等人(1995)Mol.Immunol.321057-1064。
用于本發(fā)明組合物的IMC的核苷酸部分可含有核糖核苷酸(含有核糖作為唯一或主要的糖組分)、脫氧核糖核苷酸(含有脫氧核糖作為主要的糖組分)，或者如本領(lǐng)域中已知的，核苷酸部分中可摻入經(jīng)修飾的糖或糖類似物。因此，除了核糖和脫氧核糖，糖組分可以是戊糖、脫氧戊糖、己糖、脫氧己糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、來蘇糖以及糖“類似物”環(huán)戊基。糖可以是吡喃糖型或呋喃糖型。IMC核苷酸部分的糖部分宜為核糖、脫氧核糖、阿拉伯糖或′-O-烷基核糖的呋喃糖苷，糖可以α或β端基異構(gòu)連接在各自的雜環(huán)堿基上。糖修飾物包括，但不局限于，2′-烷氧基-RNA類似物、2′-氨基-RNA類似物和2′-烷氧基或氨基-RNA/DNA嵌合體。這些糖或糖類似物的制備以及糖或類似物與雜環(huán)堿基(核酸堿基)本身相連而成的各個(gè)“核苷”是已知的，無需在此贅述，只需描述到這些制備物能與任何具體實(shí)施例相關(guān)的程度即可。在制備IMC的核苷酸部分時(shí)，還可制備糖修飾并與任何磷酸酯修飾組合。
摻入IMC核苷酸部分的雜環(huán)堿基或核酸堿基可以是天然存在的主要的嘌呤和嘧啶堿基(即上述的尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、肌苷、腺嘌呤和鳥嘌呤)，以及所述主要堿基的天然存在的和合成的修飾物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，本領(lǐng)域中可獲得大量包含各種雜環(huán)堿基和各種糖部分(以及糖類似物)的“合成的”非天然核苷，只要其能滿足本發(fā)明的其它標(biāo)準(zhǔn)，那么IMC的核苷酸部分可包括除天然存在的核苷酸的主要5種堿基組分外的一種或數(shù)種雜環(huán)堿基。然而，核苷酸部分中的雜環(huán)堿基宜包括，但不局限于，尿嘧啶-5-基、胞嘧啶-5-基、腺嘌呤-7-基、腺嘌呤-8-基、鳥嘌呤-7-基、鳥嘌呤-8-基、4-氨基吡咯并[2.3-d]嘧啶-5-基，2-氨基-4-氧吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基，2-氨基-4-氧吡咯并[2.3-d]嘧啶-3-基，其中嘌呤通過9位、嘧啶通過1-位、吡咯并嘧啶通過7-位、吡唑并嘧啶通過1-位與ISS的糖部分相連。
IMC的核苷酸部分可含有至少一個(gè)例如國際申請(qǐng)WO 99/62923中所述的經(jīng)修飾的堿基。本文所用的術(shù)語“經(jīng)修飾的堿基”是“堿基類似物”的同義詞，例如“經(jīng)修飾的胞嘧啶”與“胞嘧啶類似物”同義。類似地，“經(jīng)修飾的”核苷或核苷酸在本文中定義為與核苷或核苷酸“類似物”同義。堿基修飾的例子包括但不局限于在ISS的胞嘧啶的C-5位和/或C-6位加入吸電子部分。該吸電子部分宜為鹵素。經(jīng)修飾的胞嘧啶可包括，但不局限于，氮胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、氯代的胞嘧啶、環(huán)胞嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氟胞嘧啶、氟嘧啶、5，6-二氫胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、羥基脲、5-硝基胞嘧啶、5-羥基胞嘧啶以及任何其它嘧啶類似物或經(jīng)修飾的嘧啶。較佳的經(jīng)修飾的尿嘧啶是C-5和/或C-6位經(jīng)過修飾的，較佳的是用鹵素修飾，其包括但不局限于溴尿嘧啶例如5-溴尿嘧啶、氯尿嘧啶例如5-氯尿嘧啶、氟尿嘧啶例如5-氟尿嘧啶、碘尿嘧啶例如5-碘尿嘧啶、以及羥基尿嘧啶。另見Kandimalla等人，2001，Bioorg.Med.Chem.9807-813。例如參見，國際專利申請(qǐng)No.WO 99/62923。堿基修飾的其它例子包括在堿基內(nèi)加入一個(gè)或多個(gè)硫醇基團(tuán)，其包括但不局限于，6-硫代-鳥嘌呤，4-硫代-胸腺嘧啶以及4-硫代-尿嘧啶。另外，一些核苷酸部分可包含經(jīng)修飾的堿基，如7-脫氮鳥苷代替任何鳥苷殘基，或用選自N-乙基胞嘧啶或N-4-甲基胞嘧啶的修飾的胞嘧啶代替任何胞嘧啶殘基，包括5′-CG-3′中的胞嘧啶。
堿基修飾的核苷的制備和用所述堿基修飾的核苷作為前體來合成經(jīng)修飾的多核苷酸的方法在例如美國專利4,910,300，4,948,882，和5,093,232中有所描述。這些堿基經(jīng)修飾的核苷經(jīng)過設(shè)計(jì)，從而使得它們能用化學(xué)合成方法摻入寡核苷酸的二末端之一或內(nèi)部。這些在寡核苷酸二末端之一或內(nèi)部的堿基修飾的核苷可作為肽或其它抗原的連接位點(diǎn)。糖部分經(jīng)修飾的核苷也已有描述(包括但不局限于，例如美國專利4,849,513，5,015,733，5,118,800，5,118,802)，其可用類似方法使用。
在某些實(shí)施方案中，IMC是嵌合的免疫調(diào)節(jié)化合物(“CIC”)，例如在2002年6月21日提交的共同擁有的美國專利申請(qǐng)No.10/176,883和10/177,826中描述的那些，這些文獻(xiàn)均全部納入本文作為參考。
CIC含有一個(gè)或多個(gè)核酸部分和一個(gè)或多個(gè)非核酸間隔臂部分?？紤]將符合各種結(jié)構(gòu)式的CIC用作IMC，包括在下式I-VII中描述的核心結(jié)構(gòu)。式I-III顯示了“線性CIC”的核心序列。式IV-VI顯示了“支鏈CIC”的核心序列。式VII顯示了“單間隔臂CIC”的核心結(jié)構(gòu)。
在本文提供的每個(gè)式子中，“N”表示核酸部分(以5′到3′或3′到5′的方向排列)，“S”表示非核酸間隔臂部分。破折號(hào)(“-”)表示核酸部分和非核酸部分之間的共價(jià)鍵。雙破折號(hào)(“--”)表示非核酸間隔臂部分和至少二個(gè)核酸部分之間的共價(jià)鍵。三破折號(hào)(“---”)表示非核酸間隔臂部分和多個(gè)(即至少3個(gè))核酸部分之間的共價(jià)鍵。下標(biāo)用來表示核酸或非核酸間隔臂部分處于不同位置。然而，用下標(biāo)來區(qū)分不同的核酸部分并不意味著這些部分必須有不同的結(jié)構(gòu)或序列。類似地，用下標(biāo)區(qū)分不同的間隔臂部分并不意味著這些部分必須有不同的結(jié)構(gòu)。例如，在下式II中，表示為N1和N2的核酸部分可以有相同或不同的序列，表示為S1和S2的間隔臂部分可以有相同或不同的結(jié)構(gòu)。而且，在核心結(jié)構(gòu)的末端還可共價(jià)連接額外的化學(xué)部分(例如磷酸酯、單核苷酸、額外的核酸部分、烷基、氨基、巰基或二硫鍵或連接基團(tuán)和/或間隔臂部分)。
線性CIC具有核心結(jié)構(gòu)中的非核酸間隔臂部分與不超過2個(gè)核酸部分共價(jià)連接的結(jié)構(gòu)。典型線性CIC符合以下式子 N1-S1-N2 (I) N1-S1-N2-S2-N3 (II) N1-S1-N2-S2-[Nv-Sv]A(III) 其中A是大約1-100之間的整數(shù)，[Nv-Sv]表示與非核酸間隔臂部分偶聯(lián)的核酸部分的A個(gè)額外的重復(fù)。下標(biāo)“v”表示N和S每個(gè)“[Nv-Sv]”重復(fù)中的N和S是獨(dú)立選擇的。“A”有時(shí)在1-10之間，有時(shí)在1-3之間，有時(shí)為確切的1，2，3，4或5。在一些實(shí)施方案中，A是在1，2，3，4，或5的下限和10，20，50或100的獨(dú)立選擇的上下的范圍內(nèi)(例如在3和10之間)的一個(gè)整數(shù)。
典型的線性CIC包括 TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-OH (Ia) TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-PO4(Ib) TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-HEG (Ic) HEG-TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-HEG (Id) TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-HEG-TCGTCGA (Ie) TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-(HEG)4-TCGTCGA (If) (TCGTCGA)2-glycerol-TCGTCGA-HEG-TCGTCGA(Ig) PO4-TCGTCGA-HEG-TCGTCGA(Ih) TCGTCGA-(HEG)15-T (Ii) (TCGTCGA-HEG)2-甘油-HEG-TCGTCGA(Ij) TCGTCGA-HEG-T-HEG-T (Ik) 較佳的線性CIC包括5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’-HEG-5’-AGATGAT-3’，5’-TCGTCG-HEG-AACGTT-HEG-AGATGAT-3’，和5’-TCGTCGA-C3-ACGTTCG-C3-AGATGAT-3’。
支鏈CIC包含與至少3個(gè)核酸部分共價(jià)連接的多價(jià)的間隔臂部分(Sp)。典型的支鏈CIC用下式來描述 [Nv]A---Sp (IV) [Sv-Nv]A---Sp (V) (S1-N1)-Sp--(Nv)A(VI) 其中Sp是與數(shù)量為“A”的獨(dú)立選擇的核酸部分Nv、Sv-Nv(其包含與核酸部分共價(jià)連接的間隔臂部分)共價(jià)連接的多價(jià)間隔臂。對(duì)于式IV和V，A至少為3。在式IV和V的各個(gè)實(shí)施方案中，A是3-100之間的整數(shù)(包括端值)，但是A可以是在由下限為大約3，5，10，50，或100以及獨(dú)立選擇的上限約為5，7，10，50，100，150，200，250，或500所確定的范圍之內(nèi)的整數(shù)，或A可以大于500。對(duì)于式VI，A至少是2，是在下限為2，5，10，50，或100以及獨(dú)立選擇的上限為5，10，50，100，150，200，250，或500的范圍內(nèi)的整數(shù)，或是大于500。
典型的支鏈CIC包括 (TCGTCGA)2-甘油-TCGTCGA (IVa) (TCGTCGA-HEG)2-甘油-TCGTCGA (IVb) (TCGTCGA-HEG-TCGTCGA)2-甘油-TCGTCGA (IVc) [(TCGTCGA)2-甘油-TCGTCGA]2-甘油-TCGTCGA (IVd) 較佳的支鏈CIC包括(5’-TCGACGT-3’-HEG)2-甘油-HEG-5’-TCGACGT-3’和(5’-TCGTCGA-3’-HEG)2-甘油-HEG-5’-AACGTTC-3’。
單間隔臂CIC包含單個(gè)核酸部分與單個(gè)間隔臂部分共價(jià)偶聯(lián)的結(jié)構(gòu)，即， N1-S1 (VII) 在一較佳的實(shí)施方案中，S1具有多聚物的結(jié)構(gòu)，該多聚物包含通常通過酯鍵(如磷酸二酯或硫代磷酸酯)相連接的較小單元(例如HEG，TEG，甘油，1’2’-二脫氧核糖，C2烷基-C12烷基亞單位等)(如上所述)。例如參見下文的式VIIa。該多聚物可以是異聚體或均聚體。在一個(gè)實(shí)施方案中，間隔臂是單體單元(例如HEG，TEG，甘油，1’2’-二脫氧核糖，C2烷基-C12烷基接頭等)通過酯鍵(例如磷酸二酯或硫代磷酸酯)連接的異聚體。例如參見下文式VIIb。
典型的單間隔臂CICs包括 TCGTCGA-(HEG)15 (VIIa) TCGTCGA-HEG-丙基-HEG-丙基-HEG(VIIb). 在某些實(shí)施方案中，CIC的末端結(jié)構(gòu)共價(jià)相連接的(例如核酸部分與核酸部分連接；間隔臂部分與間隔臂部分連接，或核酸部分與間隔臂部分連接)，結(jié)果產(chǎn)生了環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
用于本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物中的IMC的CIC包括至少一個(gè)核酸部分。本文所用的術(shù)語“核酸部分”指核苷酸單體(即，單核苷酸)或核苷酸聚合物(即，包含至少2個(gè)毗連的核苷酸)。如本文所述，核苷酸包含(1)與磷酸酯基團(tuán)以酯鍵連接的糖連接的嘌呤或嘧啶，或(2)用例如下文所述的類似物代替堿基和/或糖和/或磷酸酯的類似物。在有多個(gè)核酸部分的CIC中，核酸部分可以相同或不同。
摻入免疫調(diào)節(jié)組合物中的CIC中所用的核酸部分可包含本文公開的任何多核苷酸IMC序列，而且還是有6個(gè)堿基對(duì)或更少的序列。預(yù)期在包含多個(gè)核酸部分的CIC，核酸部分可以有相同或不同的長度。6個(gè)或更少核苷酸的核酸部分宜包括序列5′-CG-3’，或任選的5’-TCG-3’或5’-ACG-3’，但是在某些實(shí)施方案中，當(dāng)CIC包含多個(gè)核酸部分時(shí)，只需一個(gè)部分包含序列5′-CG-3’。
預(yù)計(jì)在包含多個(gè)核酸部分的CIC中，核酸部分可以是相同或不同的。因此，在各個(gè)實(shí)施方案中，摻入免疫調(diào)節(jié)組合物的CIC包含(a)具有相同序列的核酸部分；(b)核酸部分的多個(gè)重復(fù)；或(c)兩種或多種不同的核酸部分。單個(gè)核酸部分可包含多個(gè)ISS，這些ISS可以是毗連的，重疊的，或由核酸部分內(nèi)的額外核苷酸堿基分開。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸部分包括一個(gè)或多個(gè)回文區(qū)。在單鏈寡核苷酸的情況下，術(shù)語“回文”指，如果寡核苷酸與互補(bǔ)序列復(fù)合形成雙鏈分子，則該序列是回文的。在另一實(shí)施方案中，一個(gè)核酸部分的序列是與CIC中的第二核酸部分相關(guān)的回文或部分回文序列。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，CIC的一個(gè)或多個(gè)核酸部分的序列不是回文序列。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，CIC的一個(gè)或多個(gè)核酸部分的序列不包括超過四個(gè)堿基、任選地超過6個(gè)堿基的回文序列。
摻入免疫調(diào)節(jié)組合物的CIC包含一個(gè)或多個(gè)與核酸部分共價(jià)連接的非核酸間隔臂部分。為了方便，本文有時(shí)將非核酸間隔臂部分簡稱為“間隔臂”或“間隔臂部分”。間隔臂的分子量通常約為50-50000，典型的約為75-5000，更通常的情況是在大約75-500之間。在各個(gè)實(shí)施方案中，它們與一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或三個(gè)以上的核酸部分共價(jià)連接。有各種制劑適合用來連接核酸部分。例如在科學(xué)文獻(xiàn)中被稱為“非核酸接頭”、“非核苷酸接頭”或“化合價(jià)平臺(tái)分子”的各種化合物可用作CIC中的間隔臂。在某些實(shí)施方案中，間隔臂包含多個(gè)共價(jià)連接的亞單位，并可有均聚或異聚的結(jié)構(gòu)?？梢岳斫?，非核酸間隔臂的定義內(nèi)不包括單核苷酸和多核苷酸，沒有這一區(qū)別的話，核酸部分和毗連的非核酸間隔臂部分將沒有區(qū)別。
在某些實(shí)施方案中，間隔臂可包含一個(gè)或多個(gè)脫堿基核苷酸(即，缺少核苷酸堿基，但是有糖和磷酸酯部分)。典型的脫堿基核苷酸包括1’2’-二脫氧核糖，1’-脫氧核糖，1’-脫氧阿拉伯糖及其聚合物。
其它合適的間隔臂包含任選取代的烷基、任選取代的聚二醇、任選取代的聚胺、任選取代的多元醇、任選取代的聚酰胺、任選取代的聚醚、任選取代的聚亞胺、任選取代的聚磷酸二酯(例如聚(1-磷酸-3-丙醇)等。任選的取代基包括醇、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基和丙氧基)、直鏈或支鏈烷基(例如C1-C12烷基)、胺、氨基烷基(例如氨基C1-C12烷基)、亞磷酰胺、磷酸酯、硫代磷酸酯、酰肼、肼、鹵素(例如F、Cl、Br、或I)、酰胺、烷基酰胺(例如酰胺C1-C12烷基)、羧酸、羧酸酯、羧酸酸酐、羧酸鹵、磺酰鹵、亞氨基酸酯、異氰酸酯、異硫氰酸酯、鹵代甲酸酯、碳化二亞胺加合物、醛、酮、巰基、鹵代乙?；?、烷基鹵、磺酸烷酯、NR1R2其中R1R2是—C(＝O)CH＝CHC(＝O)(馬來酰亞胺)、硫醚、氰基、糖(例如甘露糖、半乳糖和葡萄糖)、α，β-不飽和羰基、烷基汞、α，β-不飽和砜。
合適的間隔臂可包含多環(huán)分子，例如有苯基或環(huán)己基環(huán)的那些分子。間隔臂可以是聚醚，如聚磷酸丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、雙功能的多環(huán)分子如雙功能的并環(huán)戊二烯、茚、萘、甘菊環(huán)、庚間三烯并庚間三烯、亞聯(lián)苯基、asymindacene、sym-indacene、苊烯、芴、phenalene、菲、蒽、螢蒽、acephenathrylene、aceanthrylene、苯并菲、芘、屈、萘并萘、噻蒽、異苯并呋喃、色烯、氧雜蒽、phenoxathiin，它們可以是取代或修飾或聚醚和多環(huán)分子的組合。多環(huán)分子可以被C1-C5烷基、C6烷基、鏈烯基、羥基烷基、鹵素或鹵代烷基取代或多取代。含氮多雜環(huán)分子(例如中氮茚)通常不是合適的間隔臂。間隔臂還可以是多元醇如甘油或季戊四醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，間隔臂包含1-磷酸丙烷(phosphopropane))3-磷酸酯或1-磷酸丙烷)4-磷酸酯(也稱為四磷酸丙二醇和五磷酸丙二醇)。在一個(gè)實(shí)施方案中，間隔臂包含衍生的2，2’-亞乙基二氧二乙胺(EDDA)。
用于CIC的非核酸間隔臂的具體例子包括在以下文獻(xiàn)中描述的“接頭”Cload和Schepartz，J.Am.Chem.Soc.(1991)，1136324；Richardson和Schepartz，J.Am.Chem.Soc.(1991)，1135109；Ma等人，Nucleic Acids Research(1993)，212585；Ma等人，Biochemistry(1993)，321751；McCurdy等人，Nucleosides & nucleotide(1991)，10287；Jaschke等人，Tetrahedron Lett.(1993)，34301；Ono等人，Biochemistry(1991)，309914；以及Arnold等人，題目為“用于核苷酸探針的非核酸連接劑”的國際出版物No.WO89/02429。
其它合適的間隔臂包括有以下文獻(xiàn)描述的接頭Salunkhe等人，J.Am.Chem.Soc.(1992)，1148768；Nelson等人，Biochemistry 355339-5344(1996)；Bartley等人，Biochemistry 3614502-511(1997)；Dagneaux等人.Nucleic Acids Research 244506-12(1996)；Durand等人，NucleicAcids Research 186353-59(1990)；Reynolds等人，NucleicAcids Research，24760-65(1996)；Hendry等人Biochemica et Biophysica Acta，1219405-12(1994)；Altmann等人，Nucleic Acids Research，234827-35(1995)。還有其它合適的間隔臂在歐洲專利No.EP0313219Bl(Arnold等人)，“用于核苷酸探針的非核酸連接劑”以及美國專利No.6,117,657(Usman等人)中有所描述。
典型的非核酸間隔臂包含寡聚-乙二醇(例如三甘醇，四甘醇，六甘醇間隔臂，以及含有多達(dá)約10、20、40、50、100或200個(gè)乙二醇單元的其它聚合物)，烷基間隔臂(例如丙基，丁基，己基，和其它C2-C12烷基間隔臂，例如常用的C2-C10烷基間隔臂，最常用的C2-C6烷基間隔臂)，脫堿基核苷酸間隔臂，從甘油衍生得到的對(duì)稱或不對(duì)稱的間隔臂，季戊四醇或1，3，5-三羥基環(huán)己烷(如本文描述的對(duì)稱的二倍或三倍間隔臂部分)。間隔臂還可包含上述化合物的異聚或均聚的寡聚物和聚合物(例如通過酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物(二硫鍵)、磷酸二酯、硫代磷酸酯、亞磷酰胺、磷酸三酯、二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯等其它連接鍵連接)。
合適的間隔臂部分可賦予CIG電荷和/或疏水性，賦予CIC有利的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)(例如穩(wěn)定性提高、在血液內(nèi)的駐留時(shí)間延長)，和/或使CIC靶向特定細(xì)胞或器官?？蛇x擇或修飾間隔臂部分來適應(yīng)CIC以獲得所需的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)或適合所需的給藥模型(例如口服給藥)。讀者將會(huì)理解，為了方便起見，間隔臂(或間隔臂組分)有時(shí)會(huì)采用衍生獲得該間隔臂組分的化合物的化學(xué)名稱(例如六甘醇)，但能理解CIC實(shí)際上是含有該化合物和毗連核酸部分或其它間隔臂部分組件的偶聯(lián)物。
在包含多個(gè)間隔臂部分的CIC中，間隔臂可以相同或不同。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，CIC中的所有非核酸間隔臂部分具有相同的結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中，CIC包含的非核酸間隔臂具有至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種或更多不同的結(jié)構(gòu)。
在本發(fā)明考慮的某些實(shí)施方案中，CIC的間隔臂部分定義為排除某些結(jié)構(gòu)。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，間隔臂不是脫堿基核苷酸或脫堿基核苷酸的聚合物。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，間隔臂不是寡聚(乙二醇)(例如HEG、TEG等)或多聚(乙二醇)。在一些實(shí)施方案中，間隔臂不是C3烷基間隔臂。在一些實(shí)施方案中，間隔臂不是多肽。因此，在某些實(shí)施方案中，免疫原性分子如蛋白質(zhì)或多肽不適合作為間隔臂部分的組件。然而，如下文所討論的，預(yù)期在某些實(shí)施方案中，CIC是“蛋白質(zhì)類的CIC”，即，它包含了含有多肽的間隔臂。例如下文所討論的，在某些實(shí)施方案中，可用多肽抗原作為平臺(tái)(多價(jià)間隔臂)來與多個(gè)核酸部分偶聯(lián)。然而，在某些實(shí)施方案中，間隔臂部分不是蛋白質(zhì)和/或不是抗原(即，如果不從CIC分離出來，間隔臂部分不是抗原)。
合適的間隔臂部分不會(huì)使得其作為組分的CIC不溶于水溶液(例如PBS，pH 7.0)。因此，間隔臂的定義不包括微米載體或納米載體。另外，具有低溶解度的間隔臂部分如十二烷基間隔臂(當(dāng)以1，12-二羥基十二烷的二醇前體形式測(cè)定時(shí)，其溶解度小于5毫克/毫升)不是較佳的，因?yàn)樗赡芙档虲IC的親水性和活性。當(dāng)以二醇前體形式測(cè)定時(shí)，間隔臂部分宜具有比5毫克/毫升高得多(例如大于等于20毫克/毫升、大于等于50毫克/毫升或大于等于100毫克/毫升)的溶解度。
CIC的電荷可由核酸部分中的磷酸酯、硫代磷酸酯或其它基團(tuán)以及非核酸間隔臂部分的基團(tuán)提供。在本發(fā)明的某些方案中，非核酸間隔臂部分?jǐn)y帶凈電荷(例如凈正電荷或凈負(fù)電荷，當(dāng)其pH下測(cè)定時(shí))。在一個(gè)有用的實(shí)施方案中，CIC具有凈負(fù)電荷。在一些實(shí)施方案中，CIC中的間隔臂部分的負(fù)電荷可通過對(duì)本文所述的間隔臂亞單位進(jìn)行衍生處理以增加其電荷來提高。例如，甘油可以與兩個(gè)核酸部分共價(jià)連接，其余的醇可與活化的亞磷酰胺反應(yīng)，然后通過氧化或硫化分別形成磷酸酯或硫代磷酸酯。在某些實(shí)施方案中，CIC中非核酸間隔臂部分提供的負(fù)電荷(即，當(dāng)有多個(gè)間隔臂時(shí)，是電荷總數(shù))大于CIC中核酸部分提供的負(fù)電荷。電荷可根據(jù)分子式來計(jì)算，或用試驗(yàn)測(cè)定，例如用毛細(xì)管電泳方法來測(cè)定(Li編，1992，Capillary electrophoresis，Principles，Practice and Application Elsevier Science Publishers，Amsterdam，TheNetherlands，pp202-206)。
如上所述，合適的間隔臂可以是較小的非核酸(例如非核苷酸)化合物的聚合物，這些化合物如本文所述，它們本身可用作間隔臂，包括通常稱為非核苷酸“接頭”的化合物。這樣的聚合物(即多單元間隔臂)可以是異聚或均聚的，通常含有通過酯鍵(例如磷酸二酯或硫代磷酸酯)連接的多個(gè)單體單元(例如HEG、TEG、甘油、1′2′-二脫氧核糖等)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，間隔臂包含非核苷酸單元(例如2至約100個(gè)單元，或2至約50個(gè)，例如2至約5個(gè)，或者例如約5至50個(gè)，例如約5-20個(gè))的聚合(例如異聚)結(jié)構(gòu)。
為了描述，含有多單元間隔臂的CIC包括 5’-TCGTCG-(C3)15-T 5’-TCGTCG-(甘油)15-T 5’-TCGTCG-(TEG)8-T 5’-TCGTCG-(HEG)4-T 其中(C3)15指15個(gè)丙基接頭通過硫代磷酸酯相連；(甘油)15指15個(gè)甘油接頭通過硫代磷酸酯連接；(TEG)8指8個(gè)三甘醇接頭通過硫代磷酸酯連接；(HEG)4指4個(gè)六甘醇接頭通過硫代磷酸酯連接。應(yīng)理解，某些多單元間隔臂具有凈負(fù)電荷，可通過增加酯-連接的單體單元的數(shù)量來增加負(fù)電荷。
在某些實(shí)施方案中，間隔臂部分是多價(jià)非核酸間隔臂部分(即“多價(jià)間隔臂”)。如本文所述，含有多價(jià)間隔臂的CIC含有與三個(gè)或多個(gè)核酸部分共價(jià)連接的間隔臂。多價(jià)間隔臂有時(shí)在本領(lǐng)域中稱為“平臺(tái)分子”。多價(jià)間隔臂可以是聚合的或非聚合的。合適的分子例子包括甘油或取代的甘油(例如2-羥基甲基甘油、菊芋糖基(levulinyl)-甘油)；四氨基苯，七氨基β環(huán)糊精，1，3，5-三羥基環(huán)己烷，季戊四醇以及季戊四醇衍生物，四氨基季戊四醇，1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷(Cyclam)，1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷(Cyclen)，聚乙烯亞胺，1，3-二氨基-2-丙醇和取代的衍生物，丙基氧甲基]乙基化合物(例如“三倍體”)，聚乙二醇衍生物例如所謂的“星形PEGs”和“bPEG”(例如參見Gnanou等人，1988，Makromol.Chem.1892885；Rein等人，1993，Acta Polvmer44225，Merrill等人，美國專利5,171,264；Shearwater Polymers Inc.，Huntswlle AL)以及樹突狀聚合物。
樹突狀聚合物是本領(lǐng)域中已知的，它是化學(xué)上定義的球狀分子，通常通過多官能單體的多步或反復(fù)反應(yīng)獲得支鏈結(jié)構(gòu)來制得的(例如參見Tomalia等人，1990，Angew.Chem.Iht.Ed.Engl.29138-75)。已知有各種樹突狀聚合物，例如以氨基為末端的聚酰胺型胺，聚乙烯亞胺和聚丙烯亞胺樹突狀聚合物。用于本發(fā)明的典型的樹突狀聚合物包括“致密星形”聚合物或“星反射形”聚合物，如美國專利Nos.4,587,329；5,338,532；和6,177,414中描述的那些，包括所謂的“聚(酰胺基胺)(″PAMAM″)樹突狀聚合物”。適用于本發(fā)明的其它多聚間隔臂分子包括在化學(xué)上定義的非聚合物的化合價(jià)平臺(tái)分子，如美國專利5,552,391；和PCT申請(qǐng)PCT/US00/15968(出版為WO 00/75105)；PCT/US96/09976(出版為WO 96/40197)，PCT/US97/10075(出版為WO 97/46251)；PCT/US94/10031(出版為WO 95/07073)；和PCT/US99/29339(出版為WO 00/34231)中描述的那些。還可使用其它許多合適的多價(jià)間隔臂，它們是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的。
核酸部分與平臺(tái)分子的偶聯(lián)可用任何方式來實(shí)現(xiàn)，通常涉及核酸部分和平臺(tái)分子上的官能團(tuán)和一個(gè)或多個(gè)交聯(lián)劑。用標(biāo)準(zhǔn)的合成化學(xué)技術(shù)將連接基團(tuán)加到平臺(tái)上。連接基團(tuán)可用標(biāo)準(zhǔn)的合成技術(shù)加到核酸部分上。
具有各種價(jià)數(shù)的多價(jià)間隔臂可用于本發(fā)明的實(shí)踐，在不同的實(shí)施方案中，CIC的多價(jià)間隔臂與大約3-400個(gè)、通常3-100個(gè)、有時(shí)3-50個(gè)、更通常3-10個(gè)核酸部分相連，有時(shí)與超過400個(gè)核酸部分連接。在不同的實(shí)施方案中，多價(jià)間隔臂與超過10個(gè)、超過25個(gè)、超過50個(gè)或超過500個(gè)核酸部分(它們可以相同或不同)偶聯(lián)。應(yīng)當(dāng)理解，在CIC包含多價(jià)間隔臂的某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一群分子結(jié)構(gòu)稍有不同的CIC。例如，當(dāng)用樹突狀聚合物作為多價(jià)間隔臂制備CIC時(shí)，產(chǎn)生了一定程度上異質(zhì)的混合物，即每個(gè)樹突狀聚合物分子與不同數(shù)量(在或主要在可測(cè)定的范圍內(nèi))的核酸部分連接。
經(jīng)衍生處理而能與核酸部分連接的多糖可作為CIC中的間隔臂。合適的多糖包括天然存在的多糖(如葡聚糖)以及合成的多糖(如Ficoll(菲科))。例如，氨基乙基羧甲基菲科(AECM-Ficoll)可用Inman，1975，J.Imm.114704-709的方法來制備。然而，AECM-Ficoll可以和異雙官能交聯(lián)劑例如6-馬來酰亞胺基己?；鵑-羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)，然后與硫醇衍生的核酸部分偶聯(lián)(見Lee，等人，1980，Mol.Imm.17749-56)。其它多糖可以用類似方式修飾。
本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本說明書的指導(dǎo)和本領(lǐng)域中的知識(shí)能夠用常規(guī)方法制備CIC。制備核酸部分(例如寡核苷酸和經(jīng)修飾的寡核苷酸)的技術(shù)是已知的。核酸部分可用包括但不局限于酶學(xué)方法、化學(xué)方法和酶與化學(xué)方法的組合的技術(shù)來合成。例如，可用以下方法化學(xué)合成含有磷酸二酯鍵的DNA或RNA依次將合適的核苷亞磷酰胺依次連接到正在生長的3′端連于固相載體的寡核苷酸的5′-羥基上，然后使中間產(chǎn)物亞磷酸三酯氧化成磷酸三酯。用于DNA合成的有用的固相載體包括可控孔徑玻璃(Controlled Pore Glass)(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，聚苯乙烯珠?；|(zhì)(PrimerSupport，Amersham Pharmacia，Piscataway，NJ)和TentGel(Rapp Polymere GmbH，Tubingen，Germany)。一旦合成了所需的寡核苷酸序列，從載體上移去寡核苷酸，將磷酸三酯去保護(hù)成磷酸二酯，用氨水或其它堿使核苷堿基去保護(hù)。
例如，含有磷酸二酯鍵的DNA或RNA多核苷酸(核酸部分)通常通過反復(fù)重復(fù)以下步驟來合成a)從3′端與固相載體連接的核苷或核酸的5′羥基上移去保護(hù)基團(tuán)；b)將活化的核苷亞磷酰胺與5′-羥基相連，c)將亞磷酸三酯氧化成磷酸三酯，和d)給未反應(yīng)的5′-羥基加帽。含有硫代磷酸酯鍵的DNA或RNA用上述方法制得，只是氧化步驟被硫化步驟代替。一旦合成了所需的寡核苷酸序列，從載體上移去寡核苷酸，將磷酸三酯去保護(hù)成磷酸二酯，用氨水或其它堿使核苷堿基去保護(hù)。例如參見，Beaucage(1993)“寡脫氧核糖核苷酸的合成(Oligodeoxyribonucleotide Synthesis)”PROTOCOLSFOR OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGS，SYNTHESIS AND PROPERTIES(Agrawal編)Humana Press，Totowa，NJ；Warner等人(1984)DNA 3401；Tang等人(2000)Org.ProcessRes.Dev.4194-198；Wyrzykiewica等人(1994)Bioorg.&Med.Chem.Lett.41519-1522；Radhakrishna等人(1989)J.Org.Chem.554693-4699和美國專利No.4,458,066。能自動(dòng)合成特定序列的核酸部分的可程控機(jī)器可從各種途徑獲得。其例子包括Expedite8909自動(dòng)化DNA合成儀(Perseptive Biosystem，F(xiàn)ramington MA)；ABI 394(AppliedBiosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)；以及OligoPilot II(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。
可用含有酸不穩(wěn)定的5′保護(hù)基團(tuán)和3′-亞磷酰胺的堿基保護(hù)的核苷(單體)從3′向5′方向裝配多核苷酸。這些單體的例子包括5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-保護(hù)的核苷-3’-O-(N，N-二異丙基氨基)2-氰基乙基亞磷酰胺，其中保護(hù)的核苷例子包括，但不局限于，N6-苯甲?；佘铡4-苯甲?；?、N2-異丁酰鳥苷、胸苷和尿苷。在這種情況下，所用的固相載體含有3′-連接的保護(hù)的核苷。或者，可用含有酸不穩(wěn)定的3′保護(hù)基團(tuán)和5′-亞磷酰胺的堿基保護(hù)的核苷(單體)以5響3′方向裝配多核苷酸。這些單體的例子包括3’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-保護(hù)的核苷-5’-O-(N，N-二異丙基氨基)2-氰基乙基亞磷酰胺，其中保護(hù)的核苷例子包括，但不局限于，N6-苯甲?；佘铡4-苯甲?；?、N2-異丁酰鳥苷、胸苷和尿苷(Glen Research，Sterling，VA)。在這種情況下，所用的固相載體含有5′-連接的保護(hù)核苷。環(huán)狀核酸組分可被分離、通過重組方法合成或用化學(xué)方法合成。化學(xué)合成可用文獻(xiàn)中描述的任何方法，例如參見Gao等人(1995)Nucleic Acids Res.232025-2029和Wang等人(1994)Nucleic Acids Res.222326-2333。
用常規(guī)方法可實(shí)現(xiàn)非核酸間隔臂部分的加入。加入特定間隔臂部分的方法是本領(lǐng)域中已知的，例如在上文所述的文獻(xiàn)中有所描述。例如參見Durand等人，Nucleic AcidsResearch 186353-59(1990)。間隔臂部分和核酸部分之間的共價(jià)鍵可以有多種類型，包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、亞磷酰胺、磷酸三酯、二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯和其它連接鍵。通常，用與合成核酸部分所用的相同的亞磷酰胺類化學(xué)物質(zhì)能方便地將間隔臂部分和核酸部分組合起來。例如，本發(fā)明的CIC可以用自動(dòng)化DNA合成儀(例如Expedite 8909；Perseptive Biosystems，F(xiàn)ramington，MA)用亞磷酰胺化學(xué)物質(zhì)來方便地合成(例如參見Beaucage，1993，同上；CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry，同上)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，用自動(dòng)化DNA合成儀進(jìn)行的相同(或等價(jià))合成步驟也可人工進(jìn)行，如果需要的話。在這樣的合成中，通常用4，4′-二甲氧基三苯甲基基團(tuán)來保護(hù)間隔臂(或多聚間隔臂的間隔臂亞單位)的一端，而另一端含有亞磷酰胺基團(tuán)。
具有必需的保護(hù)和反應(yīng)基團(tuán)的各種間隔臂可以市售購得，例如 三甘醇間隔臂或“TEG 9-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)三甘醇-1-O-[(2- 間隔臂” 氰基乙基)N，N-二異丙基亞磷酰胺](Glen Research，22825 Davis Drive，Sterling，VA) 六甘醇間隔臂或“HEG 18-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)六甘醇-1-O-[(2- 間隔臂” 氰基乙基)N，N-二異丙基亞磷酰胺](Glen Research，Sterling，VA) 丙基間隔臂3-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧)丙基氧-1-O-[(2- 氰基乙基)N，N-二異丙基亞磷酰胺](Glen Research，Sterling，VA)； 丁基間隔臂4-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧)丁基氧-1-O-[(2- 氰基乙基)N，N-二異丙基亞磷酰胺](Chem Genes Corporation，Ashland Technology Center， 200 Homer Ave，Ashland，MA) 己基間隔臂6-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧)己基氧-1-O-[(2- 氰基乙基)N，N-二異丙基亞磷酰胺] 2-(羥基甲基)乙基間隔 1-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧)-3-(菊芋糖基氧)- 臂或“HME間隔臂”丙基氧-2-O-[(2-氰基乙基)N，N-二異丙基亞磷 酰胺]；也稱為“不對(duì)稱支鏈”間隔臂 “脫堿基核苷酸間隔臂”5-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-1，2-二脫氧核糖- 或“脫堿基間隔臂” 3-O-[(2-氰基乙基)N，N-二異丙基亞磷酰胺] (Glen Research，Sterling，VA) “對(duì)稱支鏈間隔臂”或 1，3-O，O-二(4，4’-二甲氧基三苯甲基)甘油-2-O- “甘油間隔臂” [(2-氰基乙基)N，N-二異丙基亞磷酰胺](Chem Genes，Ashland，MA) “三倍體間隔臂” 2，2，2-O，O，O-三[3-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基 氧)丙基氧甲基]乙基-1-O-[(2-氰基乙基)N，N- 二異丙基亞磷酰胺](Glen Research，Sterling， VA) “對(duì)稱二倍體間隔臂” 1，3-O，O-二[5-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧)戊 基酰氨基]丙基-2-O-[(2-氰基乙基)N，N-二異丙 基亞磷酰胺](Glen Research，Sterling，VA) “十二烷基間隔臂” 12-(4，4’-二甲氧基三苯甲基氧)十二烷基氧-1- O-[(2-氰基乙基)N，N-二異丙基亞磷酰胺] (Glen Research，Sterling，VA) 這些以及各種其它許多保護(hù)的間隔臂前體(例如包括DMT和亞磷酰胺基團(tuán)保護(hù)基團(tuán))是可以購得的，或可常規(guī)方法來合成，從而用于制備本文所述的CIC。根據(jù)生產(chǎn)商說明書來控制儀器，根據(jù)所需的次序加入核苷酸單體和間隔臂。
盡管用亞磷酰胺類化學(xué)物質(zhì)能方便地制備某些CIC，但是應(yīng)理解本發(fā)明的CIC并不局限于用任何特定合成或制備方法制得的化合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，制得了有多價(jià)間隔臂與多類核酸部分偶聯(lián)的CIC。例如，有兩個(gè)馬來酰亞胺基團(tuán)(其能與含巰基的多核苷酸反應(yīng))和兩個(gè)活性酯基團(tuán)(其能和有氨基的核酸反應(yīng))的平臺(tái)已有描述(例如參見PCT/US94/10031，出版為WO 95/07073)。這兩個(gè)活性基團(tuán)可相互獨(dú)立反應(yīng)。這將導(dǎo)致CIC含有總共4個(gè)核酸部分，每個(gè)序列兩個(gè)。
具有多價(jià)間隔臂含有兩種不同核酸序列的CIC也可用上述的對(duì)稱支鏈間隔臂以及常規(guī)亞磷酰胺化學(xué)物質(zhì)來制備(例如用人工或自動(dòng)方法)。該對(duì)稱支鏈間隔臂含有亞磷酰胺基團(tuán)和兩個(gè)保護(hù)基團(tuán)，這兩個(gè)保護(hù)基團(tuán)是相同的，可以同時(shí)除去。例如，在一個(gè)方法中，合成第一核酸并與對(duì)稱的支鏈間隔臂相連，從間隔臂中除去保護(hù)基團(tuán)。然而，在間隔臂上合成另外兩個(gè)核酸(具有相同序列)(每一步中采用合成單個(gè)核酸部分所用試劑量的兩倍)。
類似的方法可用于將三種不同的核酸部分(下面稱為核酸I、II和III)與多價(jià)平臺(tái)(例如不對(duì)稱支鏈間隔臂)相連。這用自動(dòng)化DNA合成儀進(jìn)行最方便。在一個(gè)實(shí)施方案中，不對(duì)稱支鏈間隔臂含有亞磷酰胺基團(tuán)和兩個(gè)正交的(orthogonal)保護(hù)基團(tuán)(這兩個(gè)保護(hù)基團(tuán)可以獨(dú)立地除去)。首先，合成核酸I，然后將不對(duì)稱支鏈間隔臂連接到核酸I上，然后在選擇性除去一個(gè)保護(hù)基團(tuán)后加入核酸II。對(duì)核酸II去保護(hù)，加帽，然后除去間隔臂上的其它保護(hù)基團(tuán)。最后合成核酸III。
在一些實(shí)施方案中，合成核酸部分，用標(biāo)準(zhǔn)的合成化學(xué)技術(shù)加入反應(yīng)性連接基團(tuán)(例如氨基、羧酸酯、巰基、二硫基等)。反應(yīng)性連接基團(tuán)(認(rèn)為其形成了所得間隔臂部分的一部分)與另外的非核酸化合物偶聯(lián)，形成間隔臂部分。用核酸合成的標(biāo)準(zhǔn)方法采用文獻(xiàn)中描述的或市售的各種試劑將連接基團(tuán)加到核酸上。例子包括含有保護(hù)的氨基、羧酸酯基團(tuán)、巰基或二硫基以及亞磷酰胺基團(tuán)的試劑。一旦通過活化的亞磷酰胺基團(tuán)將這些化合物摻入核酸內(nèi)并去保護(hù)后，它們向核酸提供了氨基、羧酸酯基或巰基反應(yīng)性。
各種長度的親水性接頭是有用的，例如可用來連接核酸部分和平臺(tái)分子。各種合適的接頭是已知的。合適的接頭非限制性地包括乙二醇的線性寡聚物或聚合物。這些接頭包括具有下式的接頭R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2其中n＝0-200，m＝1或2，R1＝H或保護(hù)基團(tuán)如三苯甲基，R2＝H或烷基或芳基，例如4-硝基苯酯。這些接頭可通過硫醚來連接含巰基反應(yīng)性基團(tuán)(如鹵代乙?；?、馬來酰亞胺等)的分子以及通過酰胺鍵與含氨基的第二分子連接。連接次序可以不同，即硫醚鍵可形成在酰胺鍵之前或之后。其它有用的接頭包括Sulfo-SMCC(4-[N-馬來酰亞胺基甲基]-環(huán)己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亞胺酯)Pierce Chemical Co.product 22322；Sulfo-EMCS(N-[γ-馬來酰亞胺基己酰氧磺基琥珀酰亞胺酯)Pierce Chemical Co.product 22307；Sulfo-GMBS(N-[ε-馬來酰亞胺基丁酰氧]磺基琥珀酰亞胺酯)Pierce Chemical Co.product 22324(Pierce Chemical Company，Rockford，IL)，以及具有式馬來酰亞胺基-R-C(O)NHS酯，其中R＝烷基、環(huán)戊基、乙二醇聚合物等的類似化合物。
核酸部分和多價(jià)間隔臂共價(jià)連接的特別有用的方法在上文所述文獻(xiàn)中有所描述。
在某些實(shí)施方案中，將多肽如蛋白質(zhì)抗原或抗原片段作為多價(jià)間隔臂部分與多個(gè)核酸部分直接或通過接頭共價(jià)偶聯(lián)，形成“蛋白類CIC”。該多肽可以是所適合的免疫反應(yīng)所需要的抗原或免疫原，或是載體(例如白蛋白)。蛋白類CIC通常包含至少一個(gè)、通常數(shù)個(gè)或多個(gè)核酸部分，這些核酸部分的長度在2-7之間，更通常地在4-7之間，或者在2-6之間，或?yàn)?、4、6，或?yàn)?和5個(gè)核苷酸。而且，這些核酸部分具有較差的免疫調(diào)節(jié)活性或沒有分離的免疫調(diào)節(jié)活性。在閱讀了本說明書公開內(nèi)容后，制備蛋白類CIC的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。例如，可用本領(lǐng)域已知的方法使核酸與多肽間隔臂部分共價(jià)偶聯(lián)，該方法包括使核酸部分的3′或5′端(或核酸部分中內(nèi)部的經(jīng)合適修飾的堿基處)與具有合適反應(yīng)基團(tuán)(例如N-羥基琥珀酰亞胺酯，它能與胞嘧啶殘基的N4位氨基直接反應(yīng))相連。另一個(gè)例子是，多肽能通過已經(jīng)摻入核酸部分內(nèi)的胺、巰基或羧基與核酸的游離5′端相連。另外，該多肽能與本文所述的間隔臂部分相連。另外，一端有保護(hù)的胺、巰基或羧基并有亞磷酰胺的連接基團(tuán)可以與多核苷酸的羥基共價(jià)連接，隨后去保護(hù)，使其官能團(tuán)能用于共價(jià)連接CIC和肽。
包含具有序列5′-CG-3′的核酸部分的免疫調(diào)節(jié)化合物以及CIC在本領(lǐng)域中已經(jīng)共同擁有的美國臨時(shí)申請(qǐng)Nos.60/299,883和60/375,253中有所描述。這些和其它IMC的免疫調(diào)節(jié)活性很容易用表示免疫反應(yīng)不同方面(例如細(xì)胞因子分泌、抗體產(chǎn)生、NK細(xì)胞激活以及T細(xì)胞增殖)的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)來鑒定。例如參見WO 97/28259；WO 98/16247；WO 99/11275；Krieg等人(1995)Nature 374546-549；Yamamoto等人(1992)J.Immunol.1484072-4076；Ballas等人(1996)J.Immunol.1571840-1845；Klinman等人(1997)J.Immunol.1583635-3639；Sato等人(1996)Science 273352-354；Pisetsky(1996)J.Immunol.156421-423；Shimada等人(1986)Jpn.J.Cancer Res.77808-816；Cowdey等人(1996)J.Immunol.1564570-4575；Roman等人(1997)；以及Lipford等人(1997)Eur.J.Immunol.272340-2344。這些方法同樣適用于評(píng)價(jià)本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物的免疫調(diào)節(jié)活性。
在一些實(shí)施方案中，與含有相同IMC的本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)組合物相比，IMC在體外、體內(nèi)和/或活體外沒有測(cè)得活性(不具有分離的免疫調(diào)節(jié)活性)或是活性較差(具有較差的分離的免疫調(diào)節(jié)活性)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所能理解的，分離的免疫調(diào)節(jié)活性的確定可以取決于濃度，而在給定濃度下確定沒有“分離的免疫調(diào)節(jié)活性”的IMC實(shí)際上在較高的濃度下有分離的免疫調(diào)節(jié)活性。
當(dāng)給予相同濃度的IMC時(shí)，測(cè)試的多核苷酸的活性比含有相同IMC的本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)組合物少時(shí)，該IMC就被稱為具有“較差的免疫調(diào)節(jié)活性”。較佳的是，該測(cè)試IMC的分離的免疫調(diào)節(jié)活性不超過免疫調(diào)節(jié)組合物的大約50％，更佳的不超過大約20％，最佳的不超過免疫調(diào)節(jié)組合物的大約10％，在某些實(shí)施方案中甚至更低。
IMC的“分離的免疫調(diào)節(jié)活性”是通過測(cè)定給定濃度的分離的IMC的免疫調(diào)節(jié)活性、作為本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)組合物的一部分所給予的IMC的免疫調(diào)節(jié)活性(與分離的IMC處于相同濃度下)以及比較免疫調(diào)節(jié)活性數(shù)值來確定的。免疫調(diào)節(jié)活性可用表示免疫反應(yīng)不同方面(如本文所述)的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)來測(cè)定。例如，可用本文所述的人PBMC試驗(yàn)。當(dāng)用人PBMC試驗(yàn)時(shí)，通常兩種化合物在相同條件下(例如用相同的細(xì)胞，通常在大約20微克/毫升的濃度下)的平行試驗(yàn)來比較兩種化合物的活性。通常，濃度是通過測(cè)定260nm下的吸光度并用0.5 OD260/ml＝20微克/毫升的轉(zhuǎn)化值來確定的。這樣能使測(cè)試樣品中的核酸總量標(biāo)準(zhǔn)化。另外，可用本領(lǐng)域已知的其它方法測(cè)定濃度或重量。為了說明供血者的差別，通常在多個(gè)供血者內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)大多數(shù)供血者的PBMC與IMC接觸后IFN-γ分泌量不明顯高于沒有該測(cè)試化合物下的分泌量、或者不明顯高于(在某些實(shí)施方案中)存在無活性對(duì)照化合物(例如5’-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’)(SEQ ID NO26)的分泌量時(shí)，該IMC就不具有“分離的免疫調(diào)節(jié)活性”。
穩(wěn)定劑 用于本發(fā)明組合物和方法的穩(wěn)定劑包括可懸浮于水中減少水的表面張力的那些穩(wěn)定劑，但是溶于水和/或與水完全混溶的穩(wěn)定劑是較佳的。有許多類穩(wěn)定劑能用于本發(fā)明的組合物和方法，它們包括蛋白質(zhì)(較佳的是親水性蛋白質(zhì))、非離子型洗滌劑、聚合物型表面活性劑(例如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮)、陽離子型洗滌劑、陰離子型洗滌劑和脂肪酸，但是在某些實(shí)施方案中，穩(wěn)定劑的定義中不包括血清蛋白質(zhì)(尤其是牛血清蛋白質(zhì))、脂肪酸和/或離子型洗滌劑。
任何蛋白質(zhì)可用作本發(fā)明的穩(wěn)定劑。在某些實(shí)施方案中，穩(wěn)定劑是不作為抗原的蛋白質(zhì)(如下討論)；在這些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)宜從與組合物受者相同的物種衍生得到(例如，打算將組合物給人用，則用作穩(wěn)定劑的蛋白質(zhì)宜為人蛋白)。血清白蛋白是可用作該實(shí)施方案中的穩(wěn)定劑的典型蛋白。在其它實(shí)施方案中，采用抗原作為穩(wěn)定劑，在這種情況下該抗原不需要、通常最好不與預(yù)期的接受者種類相匹配。用于本發(fā)明的組合物和方法的抗原如下所述。
用于本發(fā)明組合物和方法的非離子型洗滌劑包括葡糖酰胺類(glucamides)，例如癸基二甲基氧化膦(APO-10)和二甲基十二烷基氧化膦(APO-12)、辛?；?N-甲基葡糖酰胺(MEGA-8)、壬?；?N-甲基葡糖酰胺(MEGA-9)和癸?；?N-甲基葡糖酰胺(MEGA-10)；聚氧乙烯醚洗滌劑，包括聚氧乙烯(10)十二烷酯(Genapol C100)、聚氧乙烯(4)月桂醚(BRIJ30)、聚氧乙烯(9)月桂醚(LUBROLPX)聚氧乙烯(23)月桂醚(BRIJ35)、聚氧乙烯(2)十六烷基醚(BRIJ52)、聚氧乙烯(10)十六烷基醚(BRIJ56)、聚氧乙烯(20)十六烷基醚(BRIJ58)、聚氧乙烯(2)十八烷基醚(BRIJ72)、聚氧乙烯(10)十八烷基醚(BRIJ76)、聚氧乙烯(20)十八烷基醚(BRIJ78)、聚氧乙烯(100)十八烷基醚(BRIJ700)、聚氧乙烯(2)油基醚(BRIJ92)、聚氧乙烯(10)油基醚(BRIJ97)、聚氧乙烯(20)油基醚(BRIJ98)、異三癸基聚(乙二醇醚)8(Genapol80)、PLURONICF-68、PLURONICF-127、十二烷基聚(乙二醇醚)9(Thesit)聚氧乙烯(10)異辛基苯基醚(TRITONX-100)、聚氧乙烯(8)異辛基苯基醚(TRITONX-114)、聚乙二醇山梨糖醇酐單月桂酸酯(TWEEN20)、聚氧乙烯山梨糖醇酐單棕櫚酸酯(TWEEN40)、聚乙二醇山梨糖醇酐單硬脂酸酯(TWEEN60)、聚氧乙烯山梨糖醇酐三硬脂酸酯(TWEEN65)、聚乙二醇山梨糖醇酐單油酸酯(TWEEN80)、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐三油酸酯(TWEEN85)、泊洛沙姆188和聚乙二醇-p-異辛基苯基醚(Nonidet NP40)，烷基麥芽糖苷(maltoside)洗滌劑(包括環(huán)己基-n-乙基-β-D-麥芽糖苷、環(huán)己基-n-己基-β-D-麥芽糖苷、和環(huán)己基-n-甲基-β-D-麥芽糖苷)、n-癸?；崽牵贿拎咸擒疹?包括甲基6-O-(N-庚基氨基甲酰)-a-D-吡喃葡糖苷(HECAMEG)；以及烷基吡喃葡糖苷類，例如n-癸基-β-D-吡喃葡糖苷、n-庚基-β-D-吡喃葡糖苷、n-十二烷基-β-D-吡喃葡糖苷、n-壬基-β-D-吡喃葡糖苷、n-辛基-α-D-吡喃葡糖苷、和n-辛基-β-D-吡喃葡糖苷、烷基硫代吡喃葡糖苷類，包括n-庚基-β-D-硫代吡喃葡糖苷、烷基麥芽吡喃糖苷類，包括n-癸基-β-D-麥芽吡喃糖苷和n-辛基-β-D-麥芽吡喃糖苷、n-癸基-β-D-硫代麥芽糖苷、毛地黃皂苷、n-十二烷基蔗糖、n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷、庚烷1，2，3-三醇、n-辛酰基-β-D-葡糖基胺(NOGA)、n-辛酰基蔗糖、泊洛沙姆(聚氧乙烯/聚氧丙烯嵌段共聚物)，例如泊洛沙姆188和泊洛沙姆407，以及磺基三甲銨乙內(nèi)酯，包括SB-10、SB-12、和SB-14，以及n-十一烷基-β-D-麥芽糖苷。較佳的穩(wěn)定劑包括聚氧乙烯醚洗滌劑、尤其是聚乙二醇山梨糖醇酐單油酸酯和聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐三油酸酯。
用于本發(fā)明組合物和方法的陰離子洗滌劑包括辛酸及其鹽、鵝去氧膽酸及其鹽、膽酸及其鹽、癸烷磺酸及其鹽、脫氧膽酸及其鹽、葡糖脫氧膽酸(glycodeoxycholic acid)及其鹽、月桂酰肌氨酸及其鹽、n-十二烷基硫酸酯及其鹽(包括鈉鹽和鋰鹽)、牛磺鵝脫氧膽酸及其鹽、?；悄懰峒捌潲}、?；敲摎淠懰峒捌潲}、?；敲撗跄懰峒捌潲}、?；鞘懰峒捌潲}、以及?；菫跛?urso)脫氧膽酸及其鹽。
陽離子洗滌劑包括十六烷基吡啶鎓及其鹽，十六烷基三甲銨及其鹽(包括十六烷基三甲基溴化銨(CTAB))，十二烷基三甲銨及其鹽(包括十二烷基三甲基溴化銨)，咪唑啉烷基銨、季咪唑啉以及四癸基三甲銨及其鹽，包括四癸基三甲基溴化銨。
選擇用作穩(wěn)定劑的洗滌劑宜為被認(rèn)為是油/水乳化洗滌劑的那些洗滌劑。油/水乳化洗滌劑是本領(lǐng)域已知的，其通常的特征是有大約8-18的疏水性/親脂性平衡(HLB)。摻入顆粒組合物的洗滌劑宜具有大約10-16、更佳約為11-15的HLB值(例如聚乙二醇山梨糖醇酐單油酸酯的HLB為15.4；聚氧乙烯(10)異辛基苯基醚的HLB為13.5；聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐三油酸酯的HLB為11)。
脂肪酸 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物還可包括一個(gè)或多個(gè)脂肪酸或其鹽作為額外的組分。在采用脂肪酸作為本發(fā)明組合物中的穩(wěn)定劑組分以及額外組分的實(shí)施方案中，用作穩(wěn)定劑的脂肪酸與用作“附加”組分的脂肪酸是不同的。用于本發(fā)明組合物的脂肪酸的碳原子數(shù)在4-30范圍內(nèi)，可以是不飽和的(例如硬脂酸)、單不飽和的(例如油酸)或多不飽和的(例如亞油酸)，但是單不飽和和多不飽和的脂肪酸通常是較好的。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物中可加入碳鏈長度至少約為4，5，6，8，10，15，18，或20個(gè)碳原子且少于約30，25，20，19，15或10個(gè)碳原子的脂肪酸。因此，在一些實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的脂肪酸可以有在4-30、5-25、10-20或15-20個(gè)碳原子的碳鏈長度。
可用于本發(fā)明組合物的脂肪酸包括，但不局限于，花生四烯酸、癸酸、山萮酸、二十二碳六烯酸、花生酸、二十一烷酸、十七烷酸、庚酸、己酸、月桂酸、亞油酸、亞麻酸、肉豆蔻酸、十九烷酸、壬酸、辛酸、油酸、棕櫚油酸、十五烷酸、硬脂酸、二十四烷酸、二十三烷酸、十三烷酸以及十一烷酸，較佳的用于本發(fā)明組合物的脂肪酸包括油酸、棕櫚油酸和亞油酸。
抗原 在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，抗原被摻入免疫調(diào)節(jié)組合物中或與免疫調(diào)節(jié)組合物一同給予。摻入抗原的那些免疫調(diào)節(jié)組合物可將抗原摻入顆粒組合物本身中，或是將其溶解或懸浮于顆粒組合物所懸浮的溶液中。任何抗原均可摻入或與本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物一同給予。
在一些實(shí)施方案中，抗原是變應(yīng)原。重組變應(yīng)原的例子提供在表1中。許多變應(yīng)原的制備是本領(lǐng)域中熟知的，其包括但不局限于豚草花粉變應(yīng)原抗原E(Amb a I)(Rafnar等人(1991)J.Biol.Chem.2661229-1236)，草變應(yīng)原Lol p 1(Tamborini等人(1997)Eur.J.Biochem.249886-894)，主要塵螨變應(yīng)原Der pI和Der PII(Chua等人(1988)J. Exp.Med.167175-182；Chua等人(1990)Int.Arch.Allergy Appl. Immunol.91124-129)，家養(yǎng)貓變應(yīng)原Fel d I(Rogers等人(1993)Mol.Immunol.30559-568)，白樺花粉Bet vl(Breiteneder等人(1989)EMBO J.81935-1938)，日本雪松變應(yīng)原Cryj 1和Cryj 2(Kingetsu等人(2000)Immunology 99625-629)，以及來自其它樹花粉的蛋白抗原(Elsayed等人(1991)Scand.J.Clin.Lab.Invest.Suppl.20417-31)。如上所述，來自樹木的變應(yīng)原是已知的，其包括來自樺樹、杜松和日本雪松的變應(yīng)原。從草花粉制備用于體內(nèi)給藥的蛋白抗原已有報(bào)道。
在一些實(shí)施方案中，變應(yīng)原是食物變應(yīng)原，包括但不局限于，花生變應(yīng)原，例如Ara h I(Stanley等人(1996)Adv.Exp.Med.Biol.409213-216)；胡桃變應(yīng)原，例如，Jug rI(Tueber等人(1998)J.Allergy Clin.Immunol.101807-814)；巴西堅(jiān)果變應(yīng)原，例如，白蛋白(Pastorello等人(1998)J.Allergy Clin.Immunol.1021021-1027；蝦變應(yīng)原，例如Pen a I(Reese等人(1997)Int.Arch.Allergy Immunol. 113240-242)；蛋變應(yīng)原，例如卵類粘蛋白(Crooke等人(1997)J.Immunol.1592026-2032)；奶變應(yīng)原，例如，牛β-乳球蛋白(lactoglobin)(Selot al.(1999)Clin.Exp.Allergy 291055-1063)；魚變應(yīng)原，例如，小白蛋白(Van Do等人(1999)Scand.J.Immunol.50619-625；Galland等人(1998)J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.70663-71)。在一些實(shí)施方案中，變應(yīng)原是乳膠變應(yīng)原，包括但不局限于，Hev b 7(Sowka等人(1998)Eur.J.Biochem.255213-219)。表1顯示了可使用的典型變應(yīng)原的列表。
表1重組變應(yīng)原組變應(yīng)原參考文獻(xiàn)動(dòng)物甲殼綱蝦/龍蝦 原肌球蛋白Pan s I Leung等人(1996)J.Allergy Clin.Immunol.98954-961Leung等人(1998)Mol.Mar.Biol.Biotechnol.712-20昆蟲螞蟻 Soli2(毒液) Schmidt等人J Allergy Clin Immunol.，1996，9882-8蜜蜂 磷脂酶A2(PLA) 透明質(zhì)酸酶(Hya) Muller等人J Allergy Clin Immunol，1995，96395-402Forster等人J Allergy Clin Immunol，1995，951229-35Muller等人Clin Exp Allergy，1997，27915-20 Soldatova等人J Allergy Clin Immunol，1998，101691-8蟑螂Bla g Bd9OK Bla g 4(calycin) 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 Per a 3 Helm等人J Allergy Clin Immunol，1996，98172-180 Vailes等人J Allergy Clin Immunol，1998，101274-280 Arruda等人J Biol Chem，1997，27220907-12 Wu等人Mol Immunol，1997，341-8塵螨 Der p 2(主要變應(yīng)原)Lynch等人J Allergy Clin Immunol，1998，101562-4 Hakkaart等人Clin Exp Allergy，1998， Der p2變體 Der f2 Der p10Tyr p228169-74 Hakkaart等人Clin Exp Allergy，1998，2845-52 Hakkaart等人Int Arch AllergyImmunol，1998，115(2)150-6Mueller等人J Biol Chem，1997，27226893-8Smith等人J Allergy Clin Immunol，1998，101423-5 Yasue等人Clin Exp Immunol，1998，1131-9Yasue等人Cell Immunol，1997，18130-7Asturias等人Biochim Biophys Acta，1998，139727-30Eriksson等人Eur J Biochem，1998大黃蜂 抗原5 aka Dol mV(毒液)Tomalski等人Arch Insect Biochem Physiol，1993，22303-13蚊子 Aed a I(唾液三磷酸腺苷雙磷酸酶)Xu等人Int Arch Allergy Immunol，1998，115245-51小黃蜂 抗原5，透明質(zhì)酸酶和磷脂酶(毒液)King等人J Allergy Clin Immunol，1996，98588-600哺乳動(dòng)物貓 Fel d I Slunt等人J Allergy Clin Immunol，1995，951221-8Hoffmann等人(1997)J Allergy Clin Immunol99227-32Hedlin Curr Opin Pediatr，1995，7676-82牛 Bos d 2(鱗屑；脂合成素(lipocalin) β-lactoglobulin(BLG，主要牛奶變應(yīng)原)Zeiler等人J Allergy Clin Immunol，1997，100721-7Rautiainen等人Biochem Bioph.Res Comm.，1998，247746-50Chatel等人Mol Immunol，1996，331113-8Lehrer等人Crit Rev Food Sci Nutr，1996，36553-64狗 Can f I和Can f2，唾液脂合成素 Konieczny等人Immunology，1997，92577-86Spitzauer等人J Allergy Clin Immunol，1994，93614-27Vrtala等人J Immunol，1998，1606137-44馬 Equ cl(主要變應(yīng)原，脂合成素)Gregoire等人J Biol Chem，1996，27132951-9 小鼠 小鼠尿蛋白(MUP)Konieczny等人Immunology，1997，92577-86 其它哺乳動(dòng)物變應(yīng)原胰島素 Ganz等人J Allergy Clin Immunol，1990，8645-51Grammer等人J Lab Clin Med，1987，109141-6Gonzalo等人Allergy，1998，53106-7干擾素干擾素α2cDetmar等人Contact Dermatis，1989，20149-50軟體動(dòng)物 拓?fù)浼∏虻鞍?Leung等人J Allergy Clin Immunol，1996，98954-61植物變應(yīng)原大麥Hor v 9Astwood等人Adv Exp Med Biol，1996，409269-77樺樹花粉變應(yīng)原，Betv4 rBet v 1 Bet v 2(抑制蛋白)Twardosz等人Biochem Bioph.Res Comm.，1997，239197Pauli等人J Allergy Clin Immunol，1996，971100-9van Neerven等人Clin Exp Allergy，1998，28423-33Jahn-Schmid等人Immunotechnology，1996，2103-13Breitwieser等人Biotechniques，1996，21918-25Fuchs等人J Allergy Clin Immunol，1997，100356-64巴西堅(jiān)果 球蛋白 Bartolome等人Allergol Immunopathol，1997，25135-44櫻桃 Pru a I (主要變應(yīng)原)Scheurer等人Mol Immunol，1997，34619-29 玉米 Zm13(花粉) Heiss等人FEBS Lett，1996，381217-21Lehrer等人Int Arch Allergy Immunol，1997，113122-4草 Ph1 p1， Ph1 p2，Ph1 p5(牧草花粉) Hol 15絨狀草(velvet grass)花粉Bluegrass變應(yīng)原 Cyn d 7百慕大草 Cyn d 12(抑制蛋白) Bufe等人Am J Respir Crit Care Med，1998，1571269-76Vrtala等人J Immunol Jun 15，1998，1606137-44Niedeberger等人J Allergy Clin Immun.，1998，101258-64 Schramm等人Eur J Biochem，1998，252200-6 Zhang等人JImmunol，1993，151791-9 Smith等人Int Arch Allergy Immunol，1997，114265-71 Asturias等人Clin Exp Allergy，1997，271307-13Fuchs等人J Allergy Clin Immunol，1997，100356-64日本雪松 Jun a 2 (Juniperusashei) Cry j 1，Cry j 2(Cryptomeriajaponica)Yokoyama等人Biochem.Biophys.Res.Commun.，2000，275195-202Kingetsu等人Immunology，2000，99625-629 杜松 Jun o 2(花粉) Tinghino等人J Allergy Clin Immunol，1998，101772-7膠乳Hev b 7Sowka等人Eur J Biochem，1998，255213-9Fuchs等人J Allergy Clin Immunol，1997，100356-64MercurialisMer a I(抑制蛋白)Vallverdu等人J Allergy Clin Immunol，1998，101363-70芥末(黃色)Sin a I(種子)Gonzalez de la Pena等人Biochem Bioph.ResComm.，1993，190648-53油菜籽Bra r I花粉變應(yīng)原Smith等人Int Arch Allergy Immunol，1997，114265-71花生 Ara h I Stanley等人Adv Exp Med Biol，1996，409213-6Burks等人J Clin Invest，1995，961715-21Burks等人Int Arch Allergy Immunol，1995，107248-50PoapratensisPoa p9 Parronchi等人Eur J Immunol，1996，26697-703Astwood等人Adv Exp Med Biol，1996，409269-77豚草Amb aISun等人Biotechnology Aug，1995，13779-86Hirschwehr等人J Allergy Clin Immunol，1998，101196-206Casale等人J Allergy Clin Immunol，1997，100110-21黑麥Lol p ITamborini等人Eur J Biochem，1997，249886-94胡桃 Jug r I Teuber等人J Allergy Clin Immun.，1998，101807-14小麥 變應(yīng)原 Fuchs等人J Allergy Clin Immunol，1997，100356-64Donovan等人Electrophoresis，1993，14917-22真菌曲霉 Asp f1，Asp f2，Asp f3，Asp f4 ，rAsp f6 Crameri等人Mycoses，1998，41 Suppl l56-60Hemmann等人Eur J Immunol，1998，281155-60Banerjee等人J Allergy Clin Immunol，1997，99821-7Crameri Int Arch Allergy Immunol，1998，11599-114 過氧化錳歧化酶(MNSOD)Crameri等人Adv Exp Med Biol，1996，409111-6Moser等人J Allergy Clin Immunol，1994，931-11 Mayer等人Int Arch Allergy Immunol，1997，113213-5Blomia 變應(yīng)原 Caraballo等人Adv Exp Med Biol，1996，40981-3青霉菌變應(yīng)原Shen等人Clin Exp Allergy，1997，27682-90裸蓋菇(Psilocybe)Psi c 2 Horner等人Int Arch Allergy Immunol，1995，107298-300 在一些實(shí)施方案中，抗原來感染性因子，包括原生動(dòng)物、細(xì)菌、真菌(包括單細(xì)胞和多細(xì)胞)，以及病毒性感染性因子。病毒抗原的合適例子如本文所述，它們是本領(lǐng)域中已知的。細(xì)菌包括流感嗜血菌、結(jié)核分枝桿菌以及百日咳博德特氏菌。原生動(dòng)物感染性因子包括瘧原蟲、利什曼原蟲屬、錐蟲屬和血吸蟲屬。真菌包括白色念珠菌。
在一些實(shí)施方案中，抗原是病毒抗原。病毒多肽抗原包括但不局限于HIV蛋白如HIV gag蛋白(包括但不局限于膜固著(MA)蛋白、核心衣殼(CA)蛋白以及核衣殼(NC)蛋白)、HIV聚合酶、流感病毒基質(zhì)(M)蛋白和流感病毒核衣殼(NP)蛋白、乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心蛋白(HBcAg)、乙肝e蛋白(HBeAg)、乙肝DNA聚合酶、丙肝抗原等。討論流感病毒疫苗接種的參考文獻(xiàn)包括Scherle和Gerhard(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 854446-4450；Scherle和Gerhard(1986)J.Exp.Med.1641114-1128；Granoff等人(1993)Vaccine 11S46-51；Kodihalli等人(1997)J.Virol.713391-3396；Ahmeida等人(1993)Vaccine 111302-1309；Chen等人(1999)Vaccine 17653-659；Govorkova和Smirnov(1997)Acta Virol.(1997)41251-257；Koide等人(1995)Vaccine133-5；Mbawuike等人(1994)Vaccine 121340-1348；Tamura等人(1994)Vaccine12310-316；Tamura等人(1992)Eur.J.Immunol.22477-481；Hirabayashi等人(1990)Vaccine 8595-599。其它多肽抗原的例子是組特異性或亞組特異性抗原，已知有許多感染性因子，其包括但不局限于，腺病毒、單純皰疹病毒、乳頭瘤病毒、呼吸道合胞病毒和痘病毒。
許多抗原性肽和蛋白質(zhì)是已知的，是本領(lǐng)域中可以得到。而其它抗原性肽可用常規(guī)技術(shù)鑒定。為了針對(duì)腫瘤形成或治療已有腫瘤而免疫接種，免疫調(diào)節(jié)肽可包括腫瘤細(xì)胞(活的或輻照的)、腫瘤細(xì)胞抽提物、或腫瘤抗原的蛋白亞單位，這些腫瘤抗原例如是Her-2/neu、Mart1、癌胚抗原(CEA)、神經(jīng)節(jié)苷脂、人乳脂肪球(human milk fatglobule，HMFG)、粘液素(MUC1)、MAGE抗原、BAGE抗原、GAGE抗原、gp100、前列腺特異性抗原(PSA)以及酪氨酸酶。用于免疫為基礎(chǔ)的避孕疫苗可以通過與ISS一起給予精蛋白來形成。Lea等人(1996)Biochim.Biophys.Acta 1307263。
減毒和滅活的病毒適合用作本文中的抗原。這些病毒的制備是本領(lǐng)域中熟知的，其中有許多可以市售購得(例如參見Physicians’Desk Reference(1998)第52版，Medical Economics Company，Inc.)。例如，脊髓灰質(zhì)炎病毒可購自IPOL(PasteurMerieux Connaught)和ORIMUNE(Lederle Laboratories)，甲肝病毒可購自VAQTA(Merck)，麻疹病毒可購自ATTENUVAX(Merck)，腮腺炎病毒可購自MUMPSVAX(Merck)，風(fēng)疹病毒可購自MERUVAXII(Merck)。另外，減毒和滅活的病毒如HIV-1、HIV-2、單純皰疹病毒、乙肝病毒、輪狀病毒、人和非人乳頭瘤病毒和緩慢腦病毒(slowbrain viruse)可以提供肽抗原。
在一些實(shí)施方案中，抗原包含病毒載體如牛痘、腺病毒和金絲雀痘病毒。
抗原可用本領(lǐng)域已知的純化技術(shù)從其來源分離得到，更方便地是可用重組方法產(chǎn)生。
抗原肽可包括純化的天然肽、合成肽、重組蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)粗提物、減毒或滅活的病毒、細(xì)胞、微生物或這些肽的片段。免疫調(diào)節(jié)肽可以是天然的，或是用化學(xué)方法或酶方法合成。任何本領(lǐng)域已知的的化學(xué)合成方法都是合適的?？捎萌芤合嚯暮铣蓙順?gòu)建中等大小的肽，而對(duì)于肽的化學(xué)構(gòu)建，可采用固相合成方法。Atherton等人(1981)Hoppe Seylers Z.Physiol.Chem.362833-839。還可用蛋白水解性酶來偶聯(lián)氨基酸，從而產(chǎn)生肽。Kullmann(1987)Enzymatic Peptide Synthesis，CRC Press，Inc?；蛘撸衫眉?xì)胞的生物化學(xué)機(jī)制或通過從生物學(xué)來源分離獲得肽。重組DNA技術(shù)可用于產(chǎn)生肽。Hames等人(1987)轉(zhuǎn)錄和翻譯的實(shí)用方法(Transcription and TranslationAPractical Approach)，IRL Press。肽也可用親和層析等標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來分離。
較佳的是，抗原是肽、脂質(zhì)(例如甾醇，不包括膽固醇，脂肪酸和磷脂)、如流感嗜血菌疫苗中所用的那些多糖，神經(jīng)節(jié)苷脂、脂蛋白和糖蛋白。它們可用本領(lǐng)域已知的幾種方法(包括用化學(xué)和酶方法來分離和合成)來獲得。在某些情況下，例如對(duì)于許多甾醇、脂肪酸和磷脂，分子的抗原性部分是市售購得的。
用于本發(fā)明組合物以及使用該組合物的方法的病毒性抗原例子包括，但不局限于，HIV抗原。這些抗原包括，但不局限于，從HIV包膜糖蛋白(包括但不局限于gp160，gp120和gp41)衍生得到的那些抗原。HIV基因和抗原的許多序列是已知的。例如，Los Alamos國立實(shí)驗(yàn)室HIV序列數(shù)據(jù)庫收集、管理和注釋了HIV核苷酸和氨基酸序列。該數(shù)據(jù)庫可通過因特網(wǎng)地址http//hiv-web.1anl.gov/進(jìn)入，也可從每年度出版物中獲得，見Human Retroviruses and AIDS Compendium(例如，2000版)。
衍生自感染性因子的抗原可用本領(lǐng)域已知的方法從例如天然病毒或細(xì)菌抽提物、從被該感染性因子感染的細(xì)胞、從純化的多肽、從重組產(chǎn)生的多肽和/或合成肽獲得。
在一些實(shí)施方案中，抗原與IMC相連。IMC可以各種方式與抗原相連。該連接可以在IMC的3′或5′端，或與IMC內(nèi)部經(jīng)合適修飾的堿基相連。如果肽具有合適的反應(yīng)性基團(tuán)(例如N-羥基琥珀酰亞胺酯)，它可以與胞嘧啶殘基的N-4位氨基直接反應(yīng)。根據(jù)IMC中的胞嘧啶的數(shù)量和位置，可在一個(gè)或多個(gè)殘基處實(shí)現(xiàn)特異性標(biāo)記。
或者，可將如本領(lǐng)域已知的的經(jīng)修飾的寡核苷酸摻入IMC的任一末端或其內(nèi)部位置。它們可以含有封閉的官能團(tuán)，當(dāng)這些官能團(tuán)解除封閉后，它們可與感興趣肽上存在的各種官能團(tuán)反應(yīng)或連接。
抗原可以通過固相載體化學(xué)方法與IMC的3′端相連。例如，IMC可以加到預(yù)先合成在載體上的多肽上(Haralambidis等人，Nucleic Acids Res.(1990)18493-99；Haralambidis等人，Nucleic Acids Res.(1990)18501-505)。或者，可以合成IMC使得其通過3′端延伸的可斷裂接頭與固相載體相連。在使IMC從載體上化學(xué)斷裂后，IMC的3′端留有末端巰基(Zuckermann等人，Nucleic Acids Res.(1987)155305-5321；Corey等人，(1987)Science 2381401-1403)，或末端氨基(Nelson等人，Nucleic Acids Res.(1989)171781-94)。氨基修飾的IMC與肽氨基的偶聯(lián)可按照Benoit等人，Neuromethods(1987)643-72中描述的那樣進(jìn)行。巰基修飾的IMC與肽的羧基的偶聯(lián)可按照Sinah等人，Oligonucleotide AnaloguesA Practical Approach(1991)IRL Press中描述的那樣進(jìn)行。
抗原可通過IMC合成期間已經(jīng)摻入IMC的胺、巰基或羧基基團(tuán)與IMC的5′端相連。較佳的是，當(dāng)IMC固定在固相載體上時(shí)，將一端有包含保護(hù)的胺、巰基或羧基而另一端有亞磷酰胺的連接基團(tuán)共價(jià)連接在IMC的5′羥基上(Agrawal等人，NucleicAcids Res.(1986)146227-6245；Connolly，Nucleic Acids Res.(1985)134485-4502；Coull等人，Tetrahedron Lett.(1986)273991-3994；Kremsky等人，Nucleic Acids Res.(1987)152891-2909；Connolly，Nucleic Acids Res.(1987)3131-3139；Bischoff等人，Anal.Biochem.(1987)164336-344；Blanks等人，Nucleic Acids Res.(1988)1610283-10299；美國專利Nos.4,849,513，5,015,733，5,118,800，和5,118,802)。在去保護(hù)后，可用潛在的胺、巰基和羧基官能團(tuán)將IMC共價(jià)連接到肽上(Benoit等人，同上；Sinah等人，Oligonucleotide AnaloguesA Practical Approach(1991)IRL Press)。
肽抗原可以與IMC中任何位置的經(jīng)修飾的胞嘧啶或尿嘧啶相連。經(jīng)修飾堿基C-5上摻入具有潛在反應(yīng)性官能團(tuán)(如胺或羧基基團(tuán))的“接頭臂”為肽連接提供了一種手段(Ruth，第4屆重組DNA研究會(huì)議，p.123)。
IMC與肽的連接也可通過高親和性的非共價(jià)相互作用(如生物素-鏈霉親和素復(fù)合體)來形成。例如在寡核苷酸經(jīng)修飾堿基上可以連接生物素基團(tuán)(Roget等人，NucleicAcids Res.(1989)177643-7651)。在肽上摻入鏈霉親和素部分后，可使鏈霉親和素偶聯(lián)的肽與生物素化的IMC形成非共價(jià)結(jié)合的復(fù)合體。
IMC與脂質(zhì)的連接可用標(biāo)準(zhǔn)方法來形成。這些方法包括，但不局限于，合成寡核苷酸-磷脂偶聯(lián)物(Yanagawa等人，Nucleic Acids Symp.Ser.(1988)19189-92)、寡核苷酸-脂肪酸偶聯(lián)物(Grabarek等人，Anal.Biochem.(1990)18513135；Staros等人，Anal.Biochem.(1986)156220-22)，以及寡核苷酸-甾醇偶聯(lián)物(Boujrad等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90572831)。
IMC與寡糖的連接可用已知的標(biāo)準(zhǔn)方法形成。這些方法包括，但不局限于，合成寡核苷酸-寡糖偶聯(lián)物，其中寡糖是免疫球蛋白的一部分(O’Shannessy等人，J.AppliedBiochem.(1985)734755)。
IMC與寡糖的連接可用已知的標(biāo)準(zhǔn)方法形成。這些方法包括，但不局限于，合成寡核苷酸-寡糖偶聯(lián)物，其中寡糖是免疫球蛋白的一部分(O’Shannessy等人，J.AppliedBiochem.(1985)734755)。
還可用基因方法或化學(xué)方法將佐劑和細(xì)胞因子連接在IMC/抗原偶聯(lián)物上。此類融合肽的例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的，其可參見Czerkinsky等人，Infect.Immun.，57107277(1989)；Nashar等人，Vaccine，11235-40(1993)；以及Dertzbaugh和Elson，Infect.Immun.，6148-55(1993)。
環(huán)狀I(lǐng)MC與抗原的連接可以幾種方式形成。當(dāng)用重組或化學(xué)方法來合成環(huán)狀I(lǐng)MC時(shí)，可將經(jīng)修飾的核苷摻入IMC內(nèi)(Ruth，Oligonucleotide and AnaloguesA PracticalApproach(1991)IRL Press)。然后用標(biāo)準(zhǔn)的連接技術(shù)來連接環(huán)狀I(lǐng)MC和抗原或免疫刺激性肽(Goodchild，1990，Bioconjugate Chem.1165)。當(dāng)環(huán)狀I(lǐng)MC是分離的或用重組或化學(xué)方法合成時(shí)，連接可通過化學(xué)激活或光激活摻入抗原或免疫刺激性肽中的反應(yīng)性基團(tuán)(例如碳烯、自由基)來形成。
用于連接肽和其它分子與IMC的其它方法可參見C.Kessler核酸的非放射活性標(biāo)記法“Nonradioactive labeling methods for nucleic acids”L.J.Kricka(編)″NonisotopicDNA Probe Techniques，″Academic Press 1992以及Geoghegan和Stroh，Bioconiug.Chem.，3138-146，1992。
在其它實(shí)施方案中，IMC和抗原通過連接在平臺(tái)分子上而緊密相連。該平臺(tái)可以是蛋白質(zhì)類或非蛋白質(zhì)類(即有機(jī)物如聚合物和樹突狀聚合物)。蛋白質(zhì)類平臺(tái)的例子包括但不局限于，白蛋白、γ球蛋白、免疫球蛋白(IgG)和卵白蛋白。Borel等人(1990)Immunol.Methods 126159-168；Dumas等人(1995)Arch.Dematol.Res.287123-128；Borel等人(1995)Int.Arch.Allergy Immunol.107264-267；Borel等人(1996)Ann.N.Y.Acad.Sci.77880-87。為了適合結(jié)合IMC和抗原，平臺(tái)是多價(jià)的(即，含有多個(gè)結(jié)合或連接部分)，較佳的是可含有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。聚合物平臺(tái)的其它例子是葡聚糖、聚丙烯酰胺凝膠、菲可、羧甲基纖維素、聚乙烯醇、聚乙烯亞胺和聚D-谷氨酸/D-賴氨酸。
使用平臺(tái)分子的理論是本領(lǐng)域熟知的。通常，平臺(tái)含有或經(jīng)衍生處理含有IMC和抗原的合適結(jié)合位點(diǎn)。另外，對(duì)IMC和/或抗原衍生處理以提供合適的連接基團(tuán)。例如，簡單的平臺(tái)是雙官能接頭(即有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn))，例如肽。
較佳的平臺(tái)分子是生物學(xué)上穩(wěn)定化的，即它們?cè)隗w內(nèi)排泌半衰期通常有數(shù)小時(shí)至數(shù)日至數(shù)月，以便提供治療效果，它們宜由合成的組成明確的單鏈組成。它們的分子量通常在大約200至200000范圍內(nèi)，較佳的在大約200至50000范圍內(nèi)(或少于例如30000)?；蟽r(jià)平臺(tái)分子的例子是聚合物(或包含聚合物)，如聚乙二醇(PEG)、聚-D-賴氨酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、D-谷氨酸和D-賴氨酸(比例為3∶2)。較佳的聚合物是以聚乙二醇為基礎(chǔ)的分子量約為200-8000的聚合物?？墒褂玫钠渌肿邮前椎鞍缀虸gG。
適用于本發(fā)明的其它較佳的平臺(tái)分子是如美國專利5,552,391中所述的化學(xué)成分明確的非聚合的化合價(jià)平臺(tái)分子。適用于本發(fā)明的特別佳的均質(zhì)的化學(xué)成分明確的化合價(jià)平臺(tái)分子是經(jīng)衍生處理的2，2’-亞乙基二氧二乙胺(EDDA)和三甘醇(TEG)。其它合適的化合價(jià)平臺(tái)分子包括，但不局限于，四氨基苯、七氨基β環(huán)糊精、四氨基季戊四醇、1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷(Cyclam)和1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷(Cyclen)。
這些平臺(tái)通常是用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)合成技術(shù)制得的。PEG必須經(jīng)衍生處理而成為多價(jià)，這可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。適合偶聯(lián)物合成的一些物質(zhì)，如PEG、白蛋白和IgG，可以市售購得。
IMC以及核酸與平臺(tái)分子的偶聯(lián)可用任何方式來實(shí)現(xiàn)，通常是涉及采用抗原和IMC平臺(tái)以及平臺(tái)分子上的一種或多種交聯(lián)劑和官能團(tuán)。平臺(tái)和IMC和抗原必須有合適的連接基團(tuán)。連接基團(tuán)用標(biāo)準(zhǔn)的合成化學(xué)技術(shù)加到平臺(tái)上。連接基團(tuán)可用標(biāo)準(zhǔn)固相合成技術(shù)或重組技術(shù)加到多肽抗原和IMC上。為了與接頭相連，重組方法可能需要翻譯后修飾，這些方法是本領(lǐng)域中已知的。
例如，多肽含有氨基酸側(cè)鏈部分，該側(cè)鏈含有作為多肽與平臺(tái)偶聯(lián)部位的官能團(tuán)如氨基、羧基或巰基。如果多肽并未含有這些基團(tuán)，可將具有這些官能團(tuán)的殘基加入多肽中。殘基的摻入可用固相合成技術(shù)或重組技術(shù)，這兩種技術(shù)均是肽合成領(lǐng)域中熟知的。當(dāng)多肽具有碳水化合物側(cè)鏈(或如果抗原是碳水化合物)時(shí)，可用常規(guī)化學(xué)方法摻入氨基、巰基和/或醛基官能團(tuán)。例如在氰基氫硼化鈉存在下通過與亞乙基二胺反應(yīng)摻入伯胺基團(tuán)，通過與半胱胺二鹽酸鹽反應(yīng)然后用標(biāo)準(zhǔn)的二硫化物還原劑還原可以引入巰基，而在用高碘酸氧化后可產(chǎn)生醛基。如果平臺(tái)不具有合適的官能團(tuán)，它也可用類似方式衍生處理來含有官能團(tuán)。
具有不同長度的親水性接頭可用來連接IMC和抗原與平臺(tái)分子。合適的接頭包括乙二醇的線性寡聚物或聚合物。這樣的接頭包括具有下式的接頭R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2其中n＝0-200，m＝1或2，R1＝H或保護(hù)基團(tuán)如三苯甲基，R2＝H或烷基或芳基，例如4-硝基苯酯。這些接頭可通過硫醚與含有巰基反應(yīng)性基團(tuán)(如鹵代乙?；?、馬來酰亞胺等)的分子連接，并通過酰胺鍵與含有氨基的第二分子連接。這些接頭的連接次序是靈活的，即，硫醚可首先或最后形成。
組合物的制備方法 本領(lǐng)域眾所周知，DNA與聚陽離子分子復(fù)合通常形成了沉淀或非常大的顆粒。本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)制備組合物的方法可以控制顆粒大小，從而實(shí)現(xiàn)了組合物的免疫調(diào)節(jié)效力，因?yàn)榧s0.1-20微米的顆粒具有最優(yōu)的免疫調(diào)節(jié)活性。因此，本發(fā)明還提供了制備本發(fā)明組合物的方法以及用這些方法制得的組合物。
本領(lǐng)域眾所周知，DNA與聚陽離子分子復(fù)合通常形成了沉淀或非常大的顆粒。本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)制備組合物的方法可以控制顆粒大小，從而實(shí)現(xiàn)了組合物的免疫調(diào)節(jié)效力，因?yàn)榧s0.1-20微米的顆粒具有最優(yōu)的免疫調(diào)節(jié)活性。因此，本發(fā)明還提供了制備本發(fā)明組合物的方法以及用這些方法制得的組合物。
盡管本發(fā)明的組合物可以摻入疏水性組分，但是該組合物較好是在水相中制備。水相可以是純水，但是更好的是含有一種溶質(zhì)的水溶液，該溶質(zhì)可以是鹽、pH緩沖劑等(統(tǒng)稱為“賦形劑”)。由于本發(fā)明組合物通常用于藥物用途，因此在制備該組合物時(shí)所用的賦形劑可以是藥學(xué)上可接受的賦形劑。然而，也考慮了用藥學(xué)上不能接受的賦形劑來制備組合物。當(dāng)用藥學(xué)上不能接受的賦形劑來制備組合物時(shí)，較佳的是對(duì)該組合物進(jìn)行處理以除去或替換藥學(xué)上不能接受的賦形劑(例如通過滲濾或其它常規(guī)技術(shù))。
本發(fā)明組合物的制備方法可用本領(lǐng)域已知的常規(guī)加工設(shè)備來進(jìn)行，這些設(shè)備例如包括混合器、離心機(jī)、泵和其它液體和/或漿液處理機(jī)器。本發(fā)明的組合物宜在無菌條件下制備，或者在制備后進(jìn)行滅菌(例如無菌過濾)。
免疫調(diào)節(jié)組合物通常是通過混合至少一種IMC、至少一種穩(wěn)定劑和至少一種陽離子縮合劑來制得的。較佳的是，將含有IMC的水溶液與一種或多種穩(wěn)定劑(或是其水溶液、或是純的穩(wěn)定劑，這取決于所用穩(wěn)定劑的物理性質(zhì))以及一種或多種陽離子縮合劑混合。在混合組合物的組分后，認(rèn)為無需進(jìn)一步處理即可形成顆粒組合物。然而，較佳的是使IMC/穩(wěn)定劑/陽離子縮合劑靜置多達(dá)約48小時(shí)，更佳的約12、14或24小時(shí)。
在一些實(shí)施方案中，首先將IMC與一種或多種陽離子縮合劑混合。較佳的是，將含有IMC的水溶液與一種或多種陽離子縮合劑(或是其水溶液、或是純的陽離子縮合劑，這取決于所用陽離子縮合劑的物理性質(zhì))混合。據(jù)信在混合IMC和陽離子縮合劑后無需進(jìn)行培育，但是該混合物可預(yù)先制備并儲(chǔ)存至需要的時(shí)候。
在IMC和陽離子縮合劑的混合物中加入一種或多種穩(wěn)定劑以形成顆粒。據(jù)信無需其它處理即可形成組合物。然而，較佳的是使IMC/穩(wěn)定劑/陽離子縮合劑靜置多達(dá)約48小時(shí)，更佳的約12、14或24小時(shí)。
在一些實(shí)施方案中，首先將IMC與一種或多種穩(wěn)定劑混合。較佳的是，將含有IMC的水溶液與一種或多種穩(wěn)定劑(或是其水溶液、或是純的穩(wěn)定劑，這取決于所用穩(wěn)定劑的物理性質(zhì))混合。據(jù)信在混合IMC和穩(wěn)定劑后無需進(jìn)行培育，但是該混合物可預(yù)先制備并儲(chǔ)存至需要的時(shí)候。
在IMC和穩(wěn)定劑的混合物中加入一種或多種陽離子縮合劑以形成顆粒。本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)IMC/穩(wěn)定劑混合物與陽離子縮合劑混合時(shí)能自發(fā)形成了本發(fā)明的組合物，因此認(rèn)為無需其它處理即可形成組合物。然而，較佳的是使IMC/穩(wěn)定劑/陽離子縮合劑靜置多達(dá)約48小時(shí)，更佳的約12、14或24小時(shí)。
為了制備摻入脂肪酸作為額外組分的那些組合物，可將脂肪酸加入含有IMC的溶液(其本身或與穩(wěn)定劑的混合物)中、加入IMC/穩(wěn)定劑的混合物中、或是和陽離子縮合劑一同加入(或作為與穩(wěn)定劑的混合物形式加入)。
對(duì)于摻入抗原的那些組合物，抗原可在制備方法的任何時(shí)候加入。例如，抗原可以是最初的IMC/穩(wěn)定劑混合物中的組分，或在陽離子縮合劑之前、同時(shí)或之后加入。當(dāng)抗原在加入陽離子縮合劑之后加入時(shí)，抗原可在顆粒的純化或大小分級(jí)步驟之前或之后加入。
IMC/穩(wěn)定劑混合物與陽離子縮合劑的混合通常導(dǎo)致產(chǎn)生了大小在一定范圍內(nèi)的顆粒(“散裝產(chǎn)物”)。由于大顆粒是免疫調(diào)節(jié)用途所不希望的而且較不穩(wěn)定，因此較佳的是對(duì)該散裝產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步處理以除去所需大小范圍外的顆粒?？梢圆捎酶鞣N大小分級(jí)技術(shù)，包括膜過濾、凝膠滲透過濾、離心甚至簡單的沉淀。用于大小分級(jí)的確切技術(shù)和參數(shù)取決于制備散裝顆粒產(chǎn)物時(shí)所用的賦形劑、所需的顆粒大小范圍以及使用者的偏好。
如上所述，用于本發(fā)明方法的最優(yōu)顆粒直徑大小約為0.1-20微米。因此，較佳的是對(duì)顆粒組合物進(jìn)行分級(jí)以除去大顆粒，收集所需的顆粒組合物。大顆粒可用任何常規(guī)技術(shù)除去，這些技術(shù)包括在標(biāo)準(zhǔn)重力下沉降、離心和過濾。本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)，簡單地使散裝顆粒產(chǎn)物沉降(即簡單地使大顆粒在標(biāo)準(zhǔn)重力的影響下沉降下來)15小時(shí)產(chǎn)生了粒徑小于2微米的組合物。如果顆粒大小在15小時(shí)后保持恒定，這大致等價(jià)于在常用的Beckman JA 12 Rotor中以1000RPM離心10分鐘。用2.7微米孔徑濾膜過濾也產(chǎn)生從散裝顆粒產(chǎn)物中除去大顆粒的滿意效果。如果制備方法沒有在無菌條件下進(jìn)行，也沒有使用無菌材料，較佳的是在此時(shí)用例如無菌過濾的方法對(duì)組合物進(jìn)行除菌。
預(yù)計(jì)顆粒組合物的水相懸浮液適合大多數(shù)情況(如果考慮藥物用途，需無菌)。如果制備方法沒有在藥學(xué)上可接受的水溶液中進(jìn)行，那么較佳的是在此時(shí)改變構(gòu)成組合物的賦形劑，以除去藥學(xué)上不能接受的賦形劑。不能接受的賦形劑可用常規(guī)技術(shù)例如滲濾、凝膠滲濾層析的緩沖液交換等方法來除去或替代。當(dāng)大小分級(jí)技術(shù)允許時(shí)，可方便地將大小分級(jí)和緩沖液交換合并在一個(gè)方法中(例如在導(dǎo)致大小分級(jí)和緩沖液交換的條件下進(jìn)行凝膠滲濾層析)。
本發(fā)明的組合物也可經(jīng)處理形成干制劑，例如將顆粒組合物的水性懸浮液凍干(有或沒有賦形劑存在)。較佳的是，在組合物中加入和/或溶解入一種或多種在凍干后產(chǎn)生組合物干粉形式的填充劑?？山邮艿奶畛鋭┌?，但不局限于，碳水化合物(如單糖如右旋糖、核糖、果糖等，醇糖類如甘露糖醇、肌醇和山梨糖醇，二糖類包括海藻糖、蔗糖和乳糖，天然存在的聚合物如淀粉、葡聚糖、殼聚糖、透明質(zhì)酸鹽、蛋白質(zhì)類(例如明膠和血清白蛋白)以及糖原，和合成單體和聚合物。蔗糖是典型填充劑，通常以5-15％(w/v)的濃度使用，典型濃度為10％。
當(dāng)組合物待用作水性懸浮液時(shí)，顆粒產(chǎn)物可以隨后進(jìn)行包裝，較佳的是在無菌條件下進(jìn)行包裝。包裝的確切形式可根據(jù)預(yù)期的用途和經(jīng)銷渠道、以及制造商和/或用戶的偏好而異。對(duì)于作為可注射形式的給藥，可將顆粒產(chǎn)品分配在小瓶、安瓿或柔軟的包裝物中以便取出該產(chǎn)品。如果產(chǎn)品打算通過吸入給藥，在可將產(chǎn)品分配在小瓶、安瓿等中通過噴霧器給藥，或可將其包裝在用作便攜式治療裝置的一次性包裝/噴嘴組合物中，例如AERx@吸入裝置(Aradigm Corp.)?；蛘?，可將組合物分配在適合經(jīng)皮膚或表皮給藥裝置的包裝內(nèi)。該組合物還可在包裝前與其它賦形劑或載體(例如增強(qiáng)滲透性的化合物、洗液、藥膏等)混合。
治療方法 本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)個(gè)體、較佳是哺乳動(dòng)物、更佳是人體內(nèi)免疫反應(yīng)的方法，該方法包括給予該個(gè)體本發(fā)明的組合物。免疫調(diào)節(jié)可包括刺激Th1型免疫反應(yīng)和/或抑制或減少Th2型免疫反應(yīng)。本發(fā)明組合物給予的量足以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。如本文所述，免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)可以是體液和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)，其用本領(lǐng)域已知的以及本文描述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來測(cè)定。
本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)個(gè)體、較佳是哺乳動(dòng)物、更佳是人體內(nèi)免疫反應(yīng)的方法，該方法包括給予該個(gè)體本發(fā)明的組合物。免疫調(diào)節(jié)可包括刺激Th1型免疫反應(yīng)和/或抑制或減少Th2型免疫反應(yīng)。本發(fā)明組合物給予的量足以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。如本文所述，免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)可以是體液和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)，其用本領(lǐng)域已知的以及本文描述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來測(cè)定。
許多個(gè)體適合接受本文所述的免疫調(diào)節(jié)組合物。該個(gè)體宜為但不必定為人。
在某些實(shí)施方案中，該個(gè)體患有與Th2型免疫反應(yīng)相關(guān)的疾病，例如變態(tài)反應(yīng)或過敏誘導(dǎo)的哮喘。本發(fā)明組合物的給予產(chǎn)生了免疫調(diào)節(jié)，增加了一種或多種與Th1型反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子的水平，從而可導(dǎo)致與個(gè)體對(duì)變應(yīng)原反應(yīng)相關(guān)的Th2型反應(yīng)特征減少。免疫調(diào)節(jié)患Th2型反應(yīng)相關(guān)疾病的個(gè)體導(dǎo)致一種或多種疾病癥狀減少或改善。當(dāng)疾病是變態(tài)反應(yīng)或變態(tài)反應(yīng)誘導(dǎo)的哮喘時(shí)，一種或多種癥狀的改善包括一種或多種下列癥狀的減少鼻炎、過敏性結(jié)膜炎、IgE的循環(huán)水平、組胺的循環(huán)水平和/或?qū)Α罢取蔽胫委?例如用計(jì)量吸入器或噴霧器吸入舒喘寧)的需要的減少。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)治療的個(gè)體對(duì)象是接受疫苗的個(gè)體。疫苗可以是預(yù)防性疫苗或治療性疫苗。預(yù)防性疫苗含有一個(gè)或多個(gè)與個(gè)體有可能患的疾病有關(guān)的表位(例如用結(jié)核分枝桿菌抗原作為預(yù)防肺結(jié)核的疫苗)。治療性疫苗包含一個(gè)或多個(gè)與影響個(gè)體的特定疾病有關(guān)的表位，例如在結(jié)核病患者體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌或牛分枝桿菌表面抗原，在過敏個(gè)體內(nèi)對(duì)個(gè)體有變態(tài)反應(yīng)的抗原(即變態(tài)反應(yīng)脫敏治療)、來自癌癥個(gè)體的腫瘤細(xì)胞(例如美國專利No.5,484,596)，或癌癥患者中的腫瘤相關(guān)抗原。如下文實(shí)施例5所述，給予了含有肝炎病毒抗原(乙肝表面抗原HbsAg)的本發(fā)明組合物后，小鼠中的抗HBsAg抗體滴度比單用HBsAg有所增加。
本發(fā)明的組合物可以和疫苗一同給予(例如在同一注射劑中，或同時(shí)但分開注射)，或者，本發(fā)明組合物可以分開給予(例如在給予疫苗之后或之前至少12小時(shí))。在某些實(shí)施方案中，疫苗抗原是組合物的一部分，它可以與IMC共價(jià)或非共價(jià)連接，或是與顆粒組合物混合。與接受沒有本發(fā)明組合物的疫苗的個(gè)體相比，將免疫調(diào)節(jié)組合物治療給予接受疫苗的個(gè)體導(dǎo)致個(gè)體對(duì)疫苗的免疫反應(yīng)向Th1型反應(yīng)偏移。向Th1型反應(yīng)偏移可通過對(duì)疫苗中的抗原有遲發(fā)型超敏(DTH)反應(yīng)、IFN-γ以及其它Th1型反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子增加、疫苗抗原特異性CTL的產(chǎn)生、低的或減少水平的疫苗抗原特異性IgE、疫苗抗原特異的Th2相關(guān)抗體的減少來識(shí)別。在治療性疫苗的情況下，給予本發(fā)明組合物和疫苗導(dǎo)致一種或多種疫苗要治療的疾病癥狀緩解。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，改善的確切癥狀和方式將取決于待治療的疾病。例如，當(dāng)治療性疫苗用于治療結(jié)核病時(shí)，用本發(fā)明組合物加上疫苗的治療導(dǎo)致咳嗽、胸膜或胸壁疼痛、發(fā)熱和/或本領(lǐng)域已知的的其它癥狀減少。當(dāng)疫苗是變應(yīng)反應(yīng)脫敏治療中所用的變應(yīng)原時(shí)，治療導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)癥狀減少(例如鼻炎、過敏性結(jié)膜炎、IgE循環(huán)水平和/或組胺循環(huán)水平減少)。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及對(duì)已患疾病如癌癥或感染性疾病的個(gè)體進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)治療。癌癥是有吸引力的免疫調(diào)節(jié)目標(biāo)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)癌癥表達(dá)了體內(nèi)細(xì)胞上未見的腫瘤相關(guān)抗原和/或腫瘤特異抗原。刺激抗腫瘤細(xì)胞的Th1型反應(yīng)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)直接和/或間接殺傷腫瘤細(xì)胞，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞減少和/或癥狀減少。將本發(fā)明的組合物給予癌癥個(gè)體將激活對(duì)腫瘤細(xì)胞的Th1型免疫應(yīng)答反應(yīng)。這樣的免疫反應(yīng)能夠通過細(xì)胞免疫系統(tǒng)細(xì)胞(例如CTL)或體液免疫系統(tǒng)的組分的直接作用來殺傷腫瘤細(xì)胞，或通過對(duì)接近免疫系統(tǒng)所靶向細(xì)胞的旁路效應(yīng)來殺傷腫瘤細(xì)胞。例如參見，Cho等人(2000)Nat.Biotechnol.18509-514。在癌癥情況下，本發(fā)明組合物的給予進(jìn)一步包括給予一種或多種其它治療劑，例如抗腫瘤抗體、化療方案和/或輻射治療?？鼓[瘤抗體包括但不局限于抗腫瘤抗體片段和/或其衍生物，以及單克隆抗腫瘤抗體、片段和/或其衍生物，它們是本領(lǐng)域已知的用于癌癥治療的抗體制劑(例如RITUXAN(rituximab)；HERCEPTIN(trastuzumab))。一種或多種其它治療劑可在給予顆粒組合物之前、之后和/或同時(shí)給予。
本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)治療還可用于患感染性疾病，尤其是對(duì)體液免疫反應(yīng)有耐受性的感染性疾病(例如由分枝桿菌感染和細(xì)胞病原體引起的疾病)的個(gè)體。免疫調(diào)節(jié)治療可用來治療由細(xì)胞病原體(例如細(xì)菌或原生動(dòng)物)或亞細(xì)胞病原體(例如病毒)引起的感染性疾病。本發(fā)明組合物可給予患有分枝桿菌疾病如結(jié)核病(例如結(jié)核分枝桿菌和/或牛分枝桿菌感染)、麻風(fēng)(即麻風(fēng)分枝桿菌感染)、或瘰疬分枝桿菌或潰瘍分枝桿菌感染的個(gè)體。本發(fā)明組合物還可用于治療病毒性感染，包括流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、乙肝病毒、丙肝病毒、皰疹病毒(尤其是單純皰疹病毒)、和乳頭瘤病毒感染。由細(xì)胞內(nèi)寄生蟲引起的疾病如瘧疾(例如間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)，耶亞瘧原蟲(P.ovale)，惡性瘧原蟲(P.falcparum)和/或三間瘧原蟲(P.malariae)引起的感染)，利什曼(例如杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)，熱袋利什曼原蟲(L.tropica)，墨西哥利什曼原蟲(L.mexicana)，巴西利什曼原蟲(L.braziliensis)，秘魯利什曼原蟲(L.peruviana)，嬰兒利什曼原蟲(L.infantum)，恰加斯利什曼原蟲(L.chagasi)，和/或埃塞俄比亞利什曼原蟲(L.aethiopica)引起的感染，以及弓形蟲病(即，Toxoplasmosis gondii引起的疾病)也可得益于顆粒組合物的治療。免疫調(diào)節(jié)組合物治療還可用于治療寄生蟲疾病，例如血吸蟲病(即，由血吸蟲屬例如埃及血吸蟲S.haematobium，曼氏血吸蟲S.mansoni，日本血吸蟲S.japonicum，和湄公河血吸蟲S.mekongi引起的感染)以及華支睪吸蟲病(即，由華支睪吸蟲Clonorchis sinensis感染引起)。將本發(fā)明的顆粒組合物給予患有感染性疾病的個(gè)體使得這些感染性疾病的癥狀緩解。在一些實(shí)施方案中，感染性疾病不是病毒性疾病。
本發(fā)明還提供了增加或刺激個(gè)體內(nèi)至少一種Th1相關(guān)細(xì)胞因子(包括IL-2，IL-12，TNF-β，IFN-γ和IFN-α)的方法。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了增加或刺激個(gè)體(尤其是需要增加IFN-γ水平的個(gè)體)內(nèi)IFN-γ的方法，該方法是將有效量的免疫調(diào)節(jié)組合物給予該個(gè)體，從而增加IFN-γ。需要增加IFN-γ的對(duì)象是對(duì)IFN-γ的給予通常有反應(yīng)的疾病患者。這些疾病包括許多炎性疾病，包括但不局限于潰瘍性結(jié)腸。這類疾病還包括許多纖維化疾病，包括但不局限于自發(fā)性肺纖維化(IPF)、硬皮病、輻射誘導(dǎo)的皮膚纖維化、肝纖維化(包括血吸蟲誘導(dǎo)的肝纖維化)、腎纖維化以及可通過給予IFN-γ來改善的其它疾病。給予本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)組合物可提高IFN-γ水平，緩解和穩(wěn)定對(duì)IFN-γ反應(yīng)的疾病的一種或多種癥狀、和/或預(yù)防或減緩疾病進(jìn)展(例如減少或消除了額外的病灶或癥狀)。
本發(fā)明方法可以與構(gòu)成該疾病標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理的其它治療方法(例如給予抗炎劑，例如在IPF中的全身皮質(zhì)固醇治療(如可的松))聯(lián)用。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了增加個(gè)體(尤其是需要增加IFN-α水平的個(gè)體)內(nèi)IFN-α的方法，該方法是給予該個(gè)體有效量的免疫調(diào)節(jié)組合物，從而增加IFN-α水平。需要增加IFN-α水平的個(gè)體是患有通常對(duì)IFN-α(包括重組IFN-α)的給予有反應(yīng)的疾病(包括但不局限于病毒感染和癌癥)的個(gè)體。在某些實(shí)施方案中，IMC包括有效誘導(dǎo)IFN-α產(chǎn)生的一種或多種免疫調(diào)節(jié)多核苷酸，包括除5′-CG-3′之外的一種或多種TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列，尤其是在本文所述的免疫調(diào)節(jié)多核苷酸的5′端。所述額外的TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列可在緊靠CG序列的5′端，或是與CG序列的5′端相隔一個(gè)或多個(gè)堿基以隔開TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列與CG序列。在一些實(shí)施方案中，額外的TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列是通過在CG序列的5′端加入T或TC或T，5-溴胞嘧啶，G序列而產(chǎn)生的。某些實(shí)施方案中，當(dāng)通過在免疫調(diào)節(jié)多核苷酸5′端加入T或TC或T，5-溴胞嘧啶，G序列來產(chǎn)生額外的TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列時(shí)，額外的序列可產(chǎn)生含ISS的TCGA或T，5-溴胞嘧啶，G，A序列。
特別有效地誘導(dǎo)IFN-α產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)多核苷酸的例子包括但不局限于，5’-TCGTCGAACGTTCGTTAACGTTCG-3’ (SEQ ID NO27) ， 5’-TCGTCGAACGTTCGTT-3’ (SEQ ID NO17) ， 5’-TCGTCGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO28) ， 5’-TCGTCGGTATCGGTCGGTATGA-3’(SEQ ID NO29) ， 5’-TCGTCGGAACCGTTCGGAATGA-3’(SEQ ID NO30) ， 5’-TCGTCGAACGTTCGAGATG-3’ (SEQ ID NO31)， 5’-TCGTBGAACGTTCGAGATG-3’ (SEQ ID NO32)， 5’-TTCGAACGTTCGTTAACGTTCG-3’(SEQ ID NO33) ， 5’-TCGTCGGAAABGUTCGGAATGA-3’(SEQ ID NO34)，5’- TCGTBGAABGUTCGGAATGA-3’ (SEQ ID NO35)，和 5’- TCGTBGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO36)，其中B＝5-溴胞嘧啶。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員所能理解的，本發(fā)明還提供了本發(fā)明組合物在制備用于本文所述方法的藥物中的用途，包括調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、治療Th2型免疫反應(yīng)相關(guān)疾病以及增加或刺激個(gè)體內(nèi)至少一種Th1型細(xì)胞因子。
本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)組合物的給予導(dǎo)致IFN-α水平增加、緩解和穩(wěn)定了對(duì)IFN-α反應(yīng)的疾病的一種或多種癥狀、和/或預(yù)防或減緩了疾病進(jìn)展(例如減少或消除了額外的病灶或癥狀)。本發(fā)明方法可以與構(gòu)成該疾病標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理的其它治療方法(例如對(duì)于病毒感染給予抗病毒劑)聯(lián)用。
本發(fā)明還提供了減少患IgE相關(guān)疾病的個(gè)體內(nèi)IgE水平、尤其是血清水平的方法，該方法是給予該個(gè)體有效量的顆粒組合物。在這些方法中，免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物可以單獨(dú)給予(例如沒有抗原)或和諸如變應(yīng)原等抗原一起給予。IgE的減少導(dǎo)致IgE相關(guān)疾病的一種或多種癥狀緩解。這些癥狀包括諸如鼻炎、結(jié)膜炎等變態(tài)反應(yīng)癥狀，對(duì)變應(yīng)原的敏感性減少，變態(tài)反應(yīng)個(gè)體體內(nèi)的變態(tài)反應(yīng)癥狀減少，或變態(tài)反應(yīng)嚴(yán)重性減少。因此，本發(fā)明還提供了治療個(gè)體內(nèi)變態(tài)反應(yīng)狀態(tài)的方法。在一些實(shí)施方案中，治療變態(tài)反應(yīng)狀態(tài)的方法包括給予免疫調(diào)節(jié)組合物和特定劑量的抗原。對(duì)于任何其它抗原給藥，給予的抗原劑量在治療期間可以相同、減少或增加(如在常規(guī)脫敏治療中的那樣)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了刺激個(gè)體(尤其是需要增加CTL數(shù)量和/或活性的個(gè)體)的CTL產(chǎn)生的方法，該方法包括給予該個(gè)體有效量的免疫調(diào)節(jié)組合物，從而使CTL的產(chǎn)生增加。需要CTL產(chǎn)生增加的個(gè)體是患有通常對(duì)CTL活性有反應(yīng)的疾病的那些個(gè)體。這些疾病包括，但不局限于，癌癥和0胞內(nèi)感染。本發(fā)明的顆粒組合物的給予導(dǎo)致CTL水平增加、緩解和穩(wěn)定了對(duì)CTL活性反應(yīng)的疾病的一種或多種癥狀、和/或預(yù)防或減緩了疾病進(jìn)展(例如減少或消除了額外的病灶或癥狀)。
本發(fā)明的方法包括本文所述的任何實(shí)施方案，例如和或不和抗原一起給予顆粒組合物。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見的，本發(fā)明方法可以與顆粒組合物所給予的特定適應(yīng)癥的其它治療方案聯(lián)用。例如，免疫調(diào)節(jié)組合物可以和抗瘧疾藥物如氯喹組合給予瘧疾患者，與殺利什曼原蟲藥物(如戊雙脒和/或別嘌醇)組合來給予利什曼病患者，與抗分枝桿菌藥物(如異煙肼、利福平和/或乙胺丁醇)組合給予結(jié)核病患者，或與變應(yīng)原脫敏治療結(jié)合來治療遺傳過敏性(變態(tài)反應(yīng))患者。
如本文所述，給予免疫調(diào)節(jié)組合物還可包括給予一種或多種額外的免疫治療劑(即通過免疫系統(tǒng)作用和/或衍生自免疫系統(tǒng)的制劑)，其包括但不局限于細(xì)胞因子、佐劑和抗體(包括但不局限于抗體片段和/或衍生物和單克隆抗體、其片段和/或衍生物)。治療性抗體例子包括癌癥情況下使用的那些抗體(如抗腫瘤抗體)。這些額外的免疫治療劑的給予適用于本文所述的所有方法。
免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物還可以與佐劑結(jié)合在一起給藥。將抗原與免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物以及佐劑一起給藥導(dǎo)致針對(duì)該抗原的免疫反應(yīng)增強(qiáng)，從而使免疫反應(yīng)比用含顆粒組合物和抗原的組合物所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)有所增強(qiáng)。佐劑是本領(lǐng)域中已知的，其包括但不局限于水包油乳劑、油包水乳劑、明礬(鋁鹽)、脂質(zhì)體和微顆粒(包括但不局限于聚苯乙烯、淀粉、聚磷腈和聚交酯/聚糖苷。其它合適的佐劑還包括但不局限于、MF59、DETOXTM(Ribi)、鯊烯混合物(SAF-1)、胞壁?；?、皂苷衍生物、分枝桿菌細(xì)胞壁制備物、單磷酰脂質(zhì)A、霉菌酸衍生物、非離子型嵌段共聚物表面活性劑、Quil A、霍亂毒素B亞基、聚磷腈和衍生物、以及免疫刺激復(fù)合物(ISCOMs)(例如Takahashi等人(1990)Nature 344873-875中描述的那些)、以及基于脂質(zhì)的佐劑和本文描述的其它物質(zhì)。佐劑還公開在美國專利No.6,406,705中。對(duì)于獸用和動(dòng)物體內(nèi)抗體的產(chǎn)生，可使用Freund’s佐劑的促有絲分裂組分(完整和不完整的部分)。
給藥和免疫反應(yīng)的評(píng)價(jià) 免疫調(diào)節(jié)組合物可以和如本文所述的其它藥物和/或免疫原性制劑和/或免疫刺激劑一同給予，可以和生理上可接受的載體混合給予(因此本發(fā)明包括這些組合物)。因此，免疫調(diào)節(jié)組合物可以和其它免疫治療劑(包括但不局限于細(xì)胞因子、佐劑和抗體)一同給予。
和所有免疫原性組合物一樣，免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物的免疫學(xué)有效量和給藥方法可根據(jù)個(gè)體、待治療的疾病以及本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的其它因素而異。所考慮的因素包括所給予的抗原的抗原性，免疫調(diào)節(jié)組合物是否和佐劑、輸送分子和/或抗原一同給予或共價(jià)相連或以其它方式相連、給藥途徑以及給予的免疫次數(shù)。這些因素是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員無需過多試驗(yàn)就能作這些決定。合適的劑量范圍是提供所需的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)(例如刺激IFN-γ和/或IFN-α)的劑量。當(dāng)需要針對(duì)抗原的免疫反應(yīng)時(shí)，合適的劑量范圍是提供對(duì)抗原的所需免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的劑量范圍。劑量通常用給予患者的IMC的量而不是整個(gè)顆粒組合物的總給藥量來確定。顆粒組合物的有用的劑量范圍(以輸送的IMC的量計(jì))例如在大約下列范圍內(nèi)1至500μg/kg、100至400μg/kg、200至300μg/kg、1至100μg/kg、100至200μg/kg、300至400μg/kg、400至500μg/kg。給予每位患者的絕對(duì)量取決于藥物學(xué)性質(zhì)如生物利用率、清除速率和給藥途徑。
具體的顆粒組合物的有效量和給藥方法根據(jù)個(gè)體患者、所需結(jié)果和/或疾病類型、疾病階段以及本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的其它因素而異。特定用途中的給藥途徑對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。給藥途徑包括但不局限于局部、真皮、經(jīng)皮、經(jīng)粘膜、表皮、腸胃外、腸胃以及鼻咽和肺(包括透支氣管和透過肺泡)給藥。合適的劑量范圍是提供足量顆粒組合物以獲得通過血液水平測(cè)得的約1-10μM組織濃度的劑量。給予每位患者的絕對(duì)量取決于藥物學(xué)性質(zhì)如生物利用率、清除速率和給藥途徑。
如本文所述，APC以及含有高濃度APC的組織是免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物的較佳的靶。因此較佳的是將顆粒組合物給予存在較高濃度APC的哺乳動(dòng)物皮膚和/或粘膜。
本發(fā)明提供了適合局部施用的免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物制劑，其包括但不局限于生理上可接受的植入物、軟膏、乳劑、清洗劑和凝膠。局部給藥靠例如其中含有分散的輸送系統(tǒng)的敷料或繃帶、將輸送系統(tǒng)直接給予切口或敞開的傷口、或通過能導(dǎo)向感興趣部位的透皮給藥裝置來實(shí)現(xiàn)。其中含有分散的免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物的乳劑、清洗劑、凝膠或軟膏適合用作局部用軟膏或傷口填充劑。
較佳的皮膚給藥途徑是侵入性最低的那些途徑。在這些方式中，較佳的是透皮傳遞、表皮給藥和皮下注射。在這些方式中，對(duì)于皮內(nèi)組織所預(yù)期的較高APC濃度，表皮給藥是較佳的。
透皮給藥可通過施用乳劑、清洗劑、凝膠等而實(shí)現(xiàn)，能使免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物滲入皮膚并進(jìn)入血流，但是由于顆粒的大小，透皮給藥應(yīng)和擦皮法或涉及皮膚完整性的其它技術(shù)結(jié)合施用。適合透皮給藥的組合物包括但不局限于藥學(xué)上可接受的懸浮液、油、乳劑和軟膏，其可直接施加在皮膚上或是摻入諸如透皮裝置(所謂的“貼劑”)的保護(hù)性載體中。合適的乳劑、軟膏等的例子可在例如Physician’s Desk Reference中找到。
該方法所用的典型貼劑產(chǎn)品是General Medical Company of Los Angeles的以LECTRO PATCH為商標(biāo)的產(chǎn)品。該產(chǎn)品用電學(xué)方法維持存貯器的電極處于中性pH，能適合提供不同濃度的劑量以便連續(xù)和/或定期給藥。貼劑的制備和使用應(yīng)根據(jù)LECTRO PATCH產(chǎn)品所附的生產(chǎn)商印制的說明書來進(jìn)行，這些說明書納入本文作為參考。其它閉塞性貼劑系統(tǒng)也是合適的。
對(duì)于透皮傳遞，低頻超聲輸送也是合適的方法。Mitragotri等人(1995)Science269850-853。低頻超聲頻率(約1MHz)的施加可以總體控制治療組合物(包括高分子量組合物)的輸送。
表皮給藥基本上涉及用機(jī)械或化學(xué)方法充分刺激表皮最外層以引起對(duì)該刺激的免疫反應(yīng)。具體而言，該刺激應(yīng)當(dāng)充足以將APC吸引至刺激部位。
典型的機(jī)械刺激裝置采用了多個(gè)直徑非常窄的短齒，其可用來刺激皮膚和吸引APC至刺激部位，以吸收從齒端傳遞的顆粒組合物。例如，Pasteur Merieux of Lyon，F(xiàn)rance生產(chǎn)的MONO-VACC舊結(jié)核菌素測(cè)試儀含有適合導(dǎo)入免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物的裝置。
該裝置(在美國由Connaught Laboratories，Inc.of Swiftwater，PA經(jīng)銷)由一端有注射器活塞、另一端有齒盤的塑料容器組成。齒盤上有多個(gè)直徑小的長度剛好擦破最外層表皮細(xì)胞的齒。MONO-VACC藥盒中的每個(gè)齒上涂布了舊結(jié)核菌素；在本發(fā)明中，每個(gè)針上涂布了免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物的藥物組合物。該裝置宜按照該裝置產(chǎn)品內(nèi)包括的生產(chǎn)商的書面說明書來使用。還可用于該實(shí)施方案的類似裝置是目前用來進(jìn)行變態(tài)反應(yīng)測(cè)試的那些裝置。
表皮給予免疫調(diào)節(jié)組合物的另一合適方法是采用能刺激最外層表皮細(xì)胞的化學(xué)物質(zhì)，從而激發(fā)了足以吸引APC至該區(qū)域的免疫反應(yīng)。一個(gè)例子是角質(zhì)水解劑，例如Noxema Corporation以商品名NAIR出售的外用脫毛膏中用的水楊酸。該方法還可用來實(shí)現(xiàn)粘膜內(nèi)的上皮給藥?；瘜W(xué)刺激劑還可與機(jī)械刺激結(jié)合起來應(yīng)用(例如，如果用涂布了化學(xué)刺激物的MONO-VACC齒裝置，會(huì)發(fā)生這種情況)。顆粒組合物可懸浮于另含化學(xué)刺激物的載體內(nèi)或與其一同給藥。
腸胃外給藥途徑包括但不局限于用電子(離子電滲療法)或直接注射(如直接注射入中央靜脈、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、真皮內(nèi)或皮下注射)。適用于腸胃外給藥的免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物制劑通常配制在USP水或注射用水中，其還可包含pH緩沖劑、鹽填充劑、防腐劑和其它藥學(xué)上可接受的賦形劑。用于腸胃外注射的免疫調(diào)節(jié)組合物可配制在藥學(xué)上可接受的無菌等滲溶液如鹽水和注射用磷酸緩沖鹽水中。
腸胃給藥途徑包括但不局限于吞食和直腸給藥。本發(fā)明包括適合腸胃道給藥的免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物制劑，其包括但不局限于，藥學(xué)上可接受的可吞食的粉末、丸劑或液體，以及用于直腸給藥的栓劑。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，丸劑或栓劑還包含藥學(xué)上可接受的固體(如淀粉)以便為組合物提供填充劑。
鼻咽和肺給藥用可通過吸入法來實(shí)現(xiàn)，其包括鼻內(nèi)、透過支氣管和透過肺泡輸送途徑。本發(fā)明包括適合通過吸入給藥的免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物制劑，其包括但不局限于形成氣溶膠的懸浮液以及用于干粉吸入輸送系統(tǒng)的粉末形式。適合吸入給藥的裝置包括但不局限于噴霧器、蒸發(fā)器、噴霧吸入器以及干粉吸入輸送裝置。
如本領(lǐng)域中所熟知的，用于本文所述給藥途徑的溶液或懸浮液可包括一種或多種下列組分無菌稀釋劑如注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā)油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶劑；抗菌藥如芐醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及調(diào)節(jié)張力的試劑如氯化鈉或葡聚糖。pH可用酸或堿(如鹽酸或氫氧化鈉)調(diào)節(jié)。腸胃外制劑可以裝在安瓿、一次性注射器或多個(gè)玻璃或塑料制成的單劑小瓶內(nèi)。
如本領(lǐng)域中所熟知的，適合可注射用的藥物組合物包括無菌水溶液或分散液，以及用于臨時(shí)制備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，無菌粉末通過在給藥前與合適的載體混合來重建。對(duì)于靜脈內(nèi)給藥，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物必須是無菌的，應(yīng)當(dāng)具有很容易注射的流動(dòng)性。它應(yīng)在生產(chǎn)和儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定，必須對(duì)諸如細(xì)菌和真菌等微生物污染作用進(jìn)行防腐。載體可以是溶劑和分散介質(zhì)，其例如含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和聚乙二醇液體等)及其合適的混合物。微生物作用的預(yù)防可用各種抗細(xì)菌和抗真菌劑(例如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等)來實(shí)現(xiàn)。較佳的是該組合物中包括了等滲劑如糖類、多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇，氯化鈉。通過在組合物中加入延遲吸收的物質(zhì)(例如單硬脂酸鋁和明膠)，可使可注射組合物的吸收延長。
如本領(lǐng)域所熟知的，可將所需量的活性化合物以及上述一種組分或諸組分的組合按需摻入合適溶劑中然后過濾除菌，從而制得無菌的可注射溶液。分散液通常是通過將活性化合物摻入含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)以及上述其它組分的無菌載體中來制得的。在制備無菌可注射溶液的無菌粉末情況下，較佳的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，從而從已經(jīng)過無菌過濾的溶液產(chǎn)生活性組分和任何其它所需的組分的粉末。
可通過選擇輸送途徑來調(diào)節(jié)引發(fā)的免疫反應(yīng)。例如，當(dāng)經(jīng)肌內(nèi)或表皮(基因槍)途徑給予流感病毒載體時(shí)，產(chǎn)生的IgG滴度和CTL活性相同。然而，肌肉接種主要產(chǎn)生IgG2a，而表皮途徑主要產(chǎn)生IgGl。Pertmer等人(1996)J.Virol.706119-6125。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能利用本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)多核苷酸的給藥途徑不同而引發(fā)免疫原性的細(xì)微差別。
上述組合物和給藥方法意圖描述但不限制本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)組合物制劑的給藥方法。產(chǎn)生各種組合物和裝置的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員力所能及的，在此不再詳細(xì)描述。
針對(duì)顆粒組合物的免疫反應(yīng)可用本領(lǐng)域已知的任何方法來分析(定量的和定性方法)，其包括但不局限于測(cè)定抗原特異性抗體的產(chǎn)生(包括測(cè)定特異性抗體亞類)、特異性淋巴細(xì)胞群(CD4+T細(xì)胞，NK細(xì)胞或CTLs)的激活，細(xì)胞因子(例如IFN-γ，IFN-α，IL-2，IL-4，IL-5，IL-10或IL-12)的產(chǎn)生和/或組胺的釋放。測(cè)定特異性抗體反應(yīng)的方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，這些方法是本領(lǐng)域熟知的。測(cè)定特定類型淋巴細(xì)胞(如CD4+T細(xì)胞)數(shù)量的方法可以用熒光激活的細(xì)胞分揀術(shù)(FACS)來實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞毒性和CTL試驗(yàn)可按照Raz等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 919519-9523以及Cho等人(2000)的方法進(jìn)行。細(xì)胞因子濃度可用例如EILSA法測(cè)定。評(píng)價(jià)針對(duì)免疫原的免疫反應(yīng)的這些和其它試驗(yàn)是本領(lǐng)域熟知的。例如參見，Selected Methods in CellularImmunology(1980)Mishell和Shiigi編，W.H.Freeman and Co。
較佳的是，刺激(即引發(fā)和/或增強(qiáng))了Th1型反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明，Th1型免疫反應(yīng)的刺激可通過在體內(nèi)或活體外測(cè)定經(jīng)免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物處理的細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生并與未經(jīng)顆粒組合物處理的情況相比來確定。測(cè)定細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的方法包括本文所述的且本領(lǐng)域已知的那些方法。對(duì)顆粒組合物處理的反應(yīng)中產(chǎn)生的細(xì)胞因子的類型表示了細(xì)胞的免疫反應(yīng)偏向Th1型還是Th2型。本文所用的術(shù)語“偏向Th1型”細(xì)胞因子產(chǎn)生指，在刺激劑存在下與Th1型免疫反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子產(chǎn)生比沒有刺激時(shí)此類細(xì)胞因子的產(chǎn)生有可測(cè)的增加。這些Th1型偏向的細(xì)胞因子包括，但不局限于，IL-2、IL-12、IFN-γ和IFN-α。相反，“Th2型偏向的細(xì)胞因子”指與Th2型免疫反應(yīng)相關(guān)的那些細(xì)胞因子，包括但不局限于IL-4，IL-5和IL-13?？捎糜诖_定顆粒組合物活性的細(xì)胞包括免疫系統(tǒng)的細(xì)胞、分離自宿主和/或細(xì)胞系的原代細(xì)胞，較佳的是APC和淋巴細(xì)胞，更佳的是巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞。
經(jīng)免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物處理的宿主中的Th1型免疫反應(yīng)的刺激還可用本領(lǐng)域已知的任何方法來測(cè)定，這些方法包括但不局限于(1)任選地與接觸過抗原的、或與抗原接觸過并受攻擊的、經(jīng)對(duì)照處理而未用顆粒組合物處理的情況相比，抗原攻擊之前和之后測(cè)得的IL-4或IL-5水平減少；或經(jīng)免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物處理的宿主中的IL-4或IL-5檢測(cè)水平較低；(2)與接觸抗原的、或與抗原接觸并受攻擊的、經(jīng)對(duì)照處理而未用顆粒組合物處理的情況相比，抗原攻擊之前和之后測(cè)得的IL-12、IL-18和/或IFN(α，β或γ)水平增加；或經(jīng)免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物處理的宿主中的IL-12、IL-18和/或IFN(α，β或γ)檢測(cè)水平較高；(3)與經(jīng)對(duì)照而未經(jīng)顆粒組合物處理的情況相比，經(jīng)免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物處理的宿主中有“Th1型偏向”的抗體產(chǎn)生；和/或(4)與接觸抗原的、或與抗原接觸并受攻擊的、經(jīng)對(duì)照處理而未用顆粒組合物處理的情況相比，抗原攻擊之前和之后測(cè)得的抗原特異性IgE水平減少；或經(jīng)免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物處理的宿主中的抗原特異性IgE檢測(cè)水平較低甚至沒有?？赏ㄟ^用本文所述的或本領(lǐng)域已知的方法測(cè)定體內(nèi)或活體外APC和/或淋巴細(xì)胞(較佳的是巨噬細(xì)胞和/或T細(xì)胞)產(chǎn)生的細(xì)胞因子進(jìn)行此類各種測(cè)定。這些測(cè)定中的一些可以是用本文所述或本領(lǐng)域已知的方法來測(cè)定抗原特異性抗體的類別和/或亞類。
對(duì)免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物處理反應(yīng)而產(chǎn)生的抗原特異性抗體的類別和/或亞類表示了細(xì)胞免疫反應(yīng)偏向Th1型還是Th2型。本文所用的術(shù)語“Th1型偏向”的抗體產(chǎn)生指與Th1型免疫反應(yīng)相關(guān)的抗體(即Th1相關(guān)抗體)產(chǎn)生有可測(cè)的增加。可以測(cè)得有一種或多種Th1相關(guān)抗體。這些Th1型偏向抗體的例如包括，但不局限于，人IgG1和/或IgG3(例如參見Widhe等人(1998)Scand.J.Immunol.47575-581以及de Martino等人(1999)Ann.Allergy Asthma Immunol.83160-164)和小鼠IgG2a。相反，“Th2型偏向抗體”指與Th2型免疫反應(yīng)相關(guān)的那些抗體，其包括但不局限于人IgG2，IgG4和/或IgE(例如參見Widhe等人(1998)和de Martino等人(1999))以及小鼠IgG1和/或IgE。
由免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物的給予而誘導(dǎo)產(chǎn)生的Th1型偏向的細(xì)胞因子增強(qiáng)了細(xì)胞免疫反應(yīng)(例如NK細(xì)胞、細(xì)胞毒性殺傷細(xì)胞、Th1輔助和記憶細(xì)胞所進(jìn)行的細(xì)胞免疫反應(yīng))。這些反應(yīng)能特別有利地用于抗病毒、真菌、原生動(dòng)物、寄生蟲、細(xì)菌、變態(tài)反應(yīng)疾病和哮喘以及腫瘤的保護(hù)性或治療性疫苗接種。
在某些實(shí)施方案中，Th2反應(yīng)被抑制(減少)。Th2反應(yīng)的抑制可通過例如Th2相關(guān)細(xì)胞因子(如IL-4和IL-5)水平的減少、Th2相關(guān)抗體水平減少、IgE減少以及對(duì)變應(yīng)原反應(yīng)的組胺釋放減少來確定。
藥盒 本發(fā)明提供了藥盒。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥盒通常包含一個(gè)或多個(gè)含有本文所述任一免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物的容器?；蛘撸撍幒锌砂粋€(gè)或多個(gè)含有本發(fā)明組合物的組分的容器。該實(shí)施方案的配置中包括一個(gè)容器有IMC/穩(wěn)定劑混合物、一個(gè)容器有陽離子縮合劑的藥盒，以及一個(gè)容器有IMC、一個(gè)容器有穩(wěn)定劑、一個(gè)容器有陽離子縮合劑的藥盒。該藥盒還進(jìn)一步包含一組合適的關(guān)于將顆粒組合物用于本文所述任何方法(例如免疫調(diào)節(jié)、緩解感染性疾病的一種或多種癥狀、增加IFN-γ水平、增加IFN-α水平、或緩解IgE相關(guān)疾病)的說明(通常是書面說明)。包含組合物組分的容器的藥盒方案通常包括根據(jù)本文所述方法制備該組合物的說明。除了本發(fā)明的組合物和/或該組合物的組分外，該藥盒方案還可包括根據(jù)本文所述方法制備組合物的說明，以及將免疫調(diào)節(jié)組合物用于本文所述任何方法的說明。
該藥盒可包含包裝在任何方便的、合適的包裝內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物。例如，如果顆粒組合物是干制劑(如冷凍凍干的或干粉)，通常采用了具有彈性塞子的小瓶。這樣，通過彈性塞子注入液體可以容易地重懸該免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物。具有沒有彈性的可除去的封閉件(如密封的玻璃)或彈性塞子的安瓿是最常用于顆粒組合物的液體制劑的，但是也可使用類似于“血液袋”的柔軟的包裝。還打算使用的是用于和特定裝置(如吸入器、經(jīng)鼻給藥裝置(如霧化器)或灌輸裝置(如微型泵))結(jié)合的包裝。
關(guān)于免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物的用途的說明書通常包括對(duì)于預(yù)期的用法的劑量、給藥方案以及給藥途徑的信息。免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物的容器可以單位劑量、散裝(例如多劑包裝)或亞單位劑量。本發(fā)明藥盒中提供的說明書通常是在標(biāo)記或包裝插入物(例如包括在藥盒中的紙張)上的書面說明，但是機(jī)器可讀的說明(例如磁盤或光學(xué)存儲(chǔ)盤上的說明)也是可以接受的。
在一些實(shí)施方案中，藥盒還包括抗原(或一種或多種抗原)，它可以包裝或不包裝在免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物的同一容器(制劑)內(nèi)?？乖诒疚闹幸延忻枋?。
提供下列實(shí)施例是為了描述而非限制本發(fā)明。
實(shí)施例 實(shí)施例1 用顆粒制劑免疫調(diào)節(jié)人細(xì)胞，用白蛋白作為穩(wěn)定劑 將多粘菌素B(PMXB)，多粘菌素E(PMXE，也稱為粘桿菌素)，以及兩性霉素B(AMTB)以及免疫調(diào)節(jié)多核苷酸混合在含血清培養(yǎng)基中(其中有穩(wěn)定劑白蛋白)，以產(chǎn)生顆粒組合物。用測(cè)定人外周血液淋巴細(xì)胞的干擾素(IFN)α和γ產(chǎn)生的試驗(yàn)(“hPBMC”試驗(yàn))測(cè)試制劑的免疫調(diào)節(jié)活性。IMC(“+ISS”)具有序列5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO1)，陰性對(duì)照寡核苷酸(“-ISS”)具有序列5’-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’(SEQ ID NO26)。兩個(gè)寡核苷酸均是全部修飾的硫代磷酸酯寡脫氧核苷酸。
用肝素化注射器通過靜脈穿刺從志愿者收集外周血液。將血液成層于FICOLL(Amersham Pharmacia Biotech)墊上并離心。收集位于FICOLL界面的PBMC，然后用冷的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌兩次。將細(xì)胞以2×106細(xì)胞/毫升重懸并培育在24或48孔板內(nèi)RPMI完全培養(yǎng)基(RPMI 1640，含10％熱滅活人AB型血清加上50單位/毫升青霉素、50微克/毫升鏈霉素、300微克/毫升谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉和1×MEM非必需氨基酸(NEAA))中。
將寡核苷酸(+ISS或-ISS)直接加入孔內(nèi)至20μg/ml，將PMXB直接加入孔內(nèi)至100μg/ml，制得顆粒組合物。細(xì)胞在測(cè)試樣品存在下培育24小時(shí)，然后從各孔收集無細(xì)胞培養(yǎng)液，測(cè)定IFN-γ和IFN-α的濃度。IFN-γ和IFN-α用購自BioSource International，Inc.的CYTOSCREENTM ELISA藥盒根據(jù)生產(chǎn)商說明書測(cè)定。在hPBMC試驗(yàn)中，不同供血者的IFN-γ本底水平可以不同，甚至可以有明顯差別。然而，其它細(xì)胞因子如IFN-α一般表現(xiàn)為穩(wěn)定的活性模式，而且在未刺激條件下通常顯示低本底水平。
在白蛋白存在下PMXB和IMC的組合導(dǎo)致IFN-α和IFN-γ的分泌相對(duì)于顆粒組合物單用IMC或單用-ISS有顯著提高(p＜0.01，p＜0.001)。這一結(jié)果是特別不尋常的，因?yàn)镻MXB本身沒有免疫調(diào)節(jié)活性。結(jié)果歸納在表2中。
表2供血者# IFN-γ 20 75 96 97 37 95 9 94 90 91 88 89 86 87 培養(yǎng)基+ISS -ISSPMXBPMXB/+I PMXB/- SSISS 1 2914 20 2157 250 1 22 1 6 474 127 6 49 9 55 568 41 1 23 5 21 510 151 4 15 5 228 3000 172 4 6 4 17 350 249 0 20 0 153 20 0 30 0 197 42 0 13 0 0 240 25 0 27 30 47 1327 104 9 36770 112 3924 2075 3 1007 3 406 5 6 18212 23 2275 675 4 34112 33 4500 425 平均值 3 10611 47 1434 312 供血者# IFN-α 37 95 9 94 90 91 88 89 86 87 培養(yǎng)基+ISS-ISS PMXBPMXB/+I PMXB/- SSISS 6 70 0 0 1244 0 0 26 0 0 1377 0 0 131 0 318 41 0 274 0 574 182 1 119 0 0 833 0 2 0 0 0 278 0 6 264 19 33 2535 0 1 207 17 9 671 16 165 358 15 353 864 341 113 212 0 326 889 125 平均值 29166 5 90 972 78 進(jìn)行另一實(shí)驗(yàn)以測(cè)試作為陽離子縮合劑的兩性霉素B。將IMC(+ISS)與PMXB(100μg/ml終濃度)或AMTB(10μg/ml終濃度)混合在培育孔內(nèi)含血清培養(yǎng)基(其提供穩(wěn)定的劑白蛋白)中，在hPBMC試驗(yàn)中測(cè)試。和PMXB一樣，AMTB本身沒有活性，但是其導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)活性比單用+ISS增加。結(jié)果歸納在表3中。
表3 IFN-γ(pg/ml)IFN-α(pg/ml) 培養(yǎng)基 +ISS -ISS PMXB PMXB/+ISS/HSA PMXB/-ISS/HSA AMTB AMTB/+ISS/HSA AMTB/-ISS/HSA 供血者1 供血者2 平均值供血者1 供血者2 平均值 0 29 1 23 767 17 0 6 0 0 0 0 6 190 45 0 48 0 0 15 0 15 479 31 0 27 04113158010140 1 2 0 0 90 0 0 2 0 2 6 1 0 335 0 0 8 0 在hPBMC試驗(yàn)中還測(cè)試了采用多粘菌素B(一種與PMXB密切相關(guān)的化合物)作為陽離子縮合劑的顆粒組合物。該顆粒制劑用以下方法預(yù)先制得(a)O/S+C將寡核苷酸和穩(wěn)定劑(人血清白蛋白HAS)或聚乙二醇山梨糖醇酐單油酸鹽(TWEEN80)混合，然后將寡核苷酸/HAS混合物與陽離子縮合劑(PMXE或PMXB)混合；或(b)O/C+S將寡核苷酸與陽離子縮合劑混合，然后與穩(wěn)定劑合并。制劑中組分的終濃度為1mg/mL IMC，5mg/mL PMX，以及20mg/mL HSA或0.4％(v/v)TWEEN80。使用前使制劑在室溫下(約22℃)靜置一天。在加入培養(yǎng)物之前，通過漩渦振蕩使容器底部沉淀的重懸。
將樣品加入培養(yǎng)物中至寡核苷酸終濃度為20微克/毫升(多粘菌素對(duì)照為100微克/毫升多粘菌素)。結(jié)果歸納在表4中。
表4 對(duì)照培養(yǎng)基+ISS-ISSPMXBPMXB/+ISSPMXB/-ISS IFN-γ(pg/ml) IFN-α(pg/ml) 供血者 供血者 平均值 28212 28213 供血者 供血者 平均值 28212 28213 5 5 5 5 17 11 5 7 6 5 4 5 15 21 18 5 15 10 59 32 46 135109122 225156191 268213241 632470551 207142175O/C+SPMXB/+ISS/HSAPMXB/+ISS/TweenPMXE/+ISS/HSAPMXE/+ISS/Tween 1685 67 876 1577 105841 15518 87 14913 81 3303 0394171 32 478255 711699705 32 32 32O/S+CPMXB/+IS S/HSAPMXE/+ISS/HSA 2333 1091221 23012 121 1047 1082 1065 417295356 實(shí)施例2 用顆粒組合物免疫調(diào)節(jié)人細(xì)胞，用非離子型洗滌劑作為穩(wěn)定劑 在hPBMC試驗(yàn)中測(cè)試用聚氧乙烯洗滌劑作為穩(wěn)定劑制得的顆粒組合物。另外，還測(cè)試了摻入脂肪酸的組合物。
將免疫調(diào)節(jié)寡核苷酸+ISS與聚乙二醇山梨糖醇酐單油酸鹽(TWEEN80)混合，然后與PMXB形成顆粒組合物。在hPBMC系統(tǒng)(如實(shí)施例1所述)中試驗(yàn)前，使制備物靜置7天。制劑中組分終濃度為1mg/mL IMC，5mg/mL PMX，以及20mg/mL HSA或0.1％-0.4％(v/v)TWEEN80。使用前使制劑在室溫下(約22℃)靜置一天。在加入培養(yǎng)物之前，通過漩渦振蕩使容器底部沉淀的重懸。
將樣品加入培養(yǎng)物中至寡核苷酸終濃度為20微克/毫升(多粘菌素對(duì)照為100微克/毫升多粘菌素)，如實(shí)施例1所述用hPBMC試驗(yàn)測(cè)試。所有顆粒組合物，包括試驗(yàn)前靜置7天的那些顆粒組合物，都具有活性。結(jié)果歸納在表5中。
表5 樣品 時(shí)間 IFN-γ(pg/ml) IFN-α(pg/ml) 供血者 供血者 平均 198 199 值 供血者 供血者 平均 198 199 值 培養(yǎng)基 +ISS -ISS PMXB/+ISS/HS A PMXB/+ISS/ 0.2％吐溫80 PMXB/+ISS/ 0.3％吐溫80 PMXB/+ISS/ 0.4％吐溫80 PMXB/+ISS/HS A PMXB/+ISS/ 0.1％吐溫80 PMXB/+ISS/ 0.1％吐溫80 PMXB/+ISS/HS A 3小時(shí) 3小時(shí) 3小時(shí) 3小時(shí) 1天 1天 4天 7天 1 7 4 10 167 88 5 18 12 353 939 646 406 1054730 457 877 667 425 729 577 360 776 568 394 824 609 590 300 445 400014552727 173 126 150 224 277 250 151 279 215 1447632 1040 1814790 1302 1617822 1219 1746749 1247 1286456 871 171912071463 901 130 515 1529613 1071 進(jìn)行另一實(shí)驗(yàn)，測(cè)試另一聚氧乙烯非離子型洗滌劑(TWEEN85)作為穩(wěn)定劑和包含脂肪酸(油酸)的組合物。另外，一個(gè)樣品在試驗(yàn)前用2.7微米濾膜過濾。
將免疫調(diào)節(jié)寡核苷酸+ISS與聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐三油酸鹽(TWEEN85)混合，然后與PMXB混合形成顆粒組合物。制劑中組分的終濃度為1mg/mL IMC，5mg/mL PMX，以及0.4％(v/v)TWEEN85+0.4％油酸或20mg/mL HSA。使用前使制劑在室溫下(約22℃)靜置一天。試驗(yàn)前使制劑靜置12天，使用前重新懸浮。
將樣品加入培養(yǎng)物中至寡核苷酸終濃度為20微克/毫升(多粘菌素對(duì)照為100微克/毫升多粘菌素)，如實(shí)施例1所述用hPBMC試驗(yàn)測(cè)試。摻入了聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐三油酸鹽(TWEEN85)(有或沒有油酸)作為穩(wěn)定劑的組合物有活性，即便是在用2.7微米濾膜過濾之后。結(jié)果歸納在表6中。
表6樣品時(shí)間 IFN-γ(pg/ml) 供血者 28232 供血者 28233 平均值培養(yǎng)基PMXB+ISS吐溫85PMXB/+ISSPMXB/+ISS/HSAPMXB/+ISS/吐溫85PMXB/+ISS/吐溫85/油酸PMXB/+ISS/吐溫85PMXB/+ISS/吐溫85PMXB/+ISS/吐溫85 3小時(shí)3小時(shí)3小時(shí)1天1天/濾膜12天 2 8 276 15 458 737 1770 785 2662 4000 4000 9 7 20 6 11 661 492 477 760 33 4000 6 7 148 11 234 699 1131 631 1711 2017 4000樣品時(shí)間 IFN-α(pg/ml) 供血者 28232 供血者 28233 平均值培養(yǎng)基PMXB+ISS吐溫85PMXB/+ISSPMXB/+ISS/HSAPMXB/+ISS/吐溫85PMXB/+ISS/吐溫85/油酸PMXB/+ISS/吐溫85PMXB/+ISS/吐溫85PMXB/+ISS/吐溫85 3小時(shí)3小時(shí)3小時(shí)1天1天/濾膜12天 16 16 9 66 60 2262 2636 2297 4000 115 3382 70 84 103 55 93 474 843 663 768 91 645 43 50 56 60 77 1368 1739 1480 2384 103 2013 實(shí)施例3 顆粒組合物內(nèi)的大小分布 用以下方法制得顆粒組合物將寡核苷酸+ISS(2mg/mL)與預(yù)先混合的0.4％(v/v)聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐三油酸鹽與0.4％(v/v)油酸的組合混合，然后加入PMXB至5mg/mL。使所得懸浮液在室溫下靜置過夜。取出上清后直接使用(Supe1)或用2.7μm濾膜過濾(Whatman GF/D，GMF prefilter；Supe2)。將沉淀物重懸于等體積PBS中。
用Malvern Mastersizer儀器進(jìn)行激光散射測(cè)定三種樣品每一種的等份中的顆粒大小，在用0.1N氫氧化鈉使顆粒解離后用大小排阻層析測(cè)定+ISS濃度。用實(shí)施例1所述的hPBMC試驗(yàn)測(cè)定免疫調(diào)節(jié)活性。
Supe1含有直徑約為0.1-10微米的顆粒，其中+ISS為0.53毫克/毫升。Supe2含有直徑約為0.1-1微米的顆粒，其中+ISS為0.3毫克/毫升。沉淀含有直徑范圍在約0.1-90內(nèi)的顆粒(大多數(shù)的直徑為20-90微米)，其中+ISS為0.95毫克/毫升。所有三種樣品在hPBMC試驗(yàn)中有活性，但是沉淀的活性最低。hPBMC試驗(yàn)的結(jié)果歸納在表7中。
表7樣品IFN-γ(pg/ml)IFN-α(pg/ml)供血者 供血者222 223 224 225 平均 值 222 223 224 225 平均 值沒有1 1 1 1 1 32 107 103 103 86Supe14000 256 404 272 1283 1567 265 327 571 682Supe21757 110 280 294 610 1498 249 344 407 624沉淀311 101 96 74 146 997 144 130 154 356 實(shí)施例4 用摻入各種免疫調(diào)節(jié)多核苷酸的顆粒組合物免疫調(diào)節(jié)人細(xì)胞 將一組IMC摻入顆粒組合物中，在hPBMC試驗(yàn)中測(cè)試免疫調(diào)節(jié)活性。該組IMC列于表8(寡核苷酸骨架是硫代磷酸酯，除非另有所述；較少的情況下堿基通過磷酸二酯鍵連接，用“ds”表示雙鏈)。
表8名稱序列SEQ ID NO+ISS-ISS+ISS(O/S)20-pG(O/S)CICbr-HEG CIC-HEGCIC-C3ds+ISS(P＝O)+ISS(P＝O)16TCG14TCG12TCG10TCG8TCG7TCGTCG25TCG5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’5’-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’5’-TGActgtgaacgttcgAGATGA-3’5’-GGtgcatcgatgcagGGGGG-3’(5’-TCGTCGA-3’-HEG)2-甘油-HEG-5’-AACGTTC-3’5’-TCGTCG-HEG-AACGTT-HEG-AGATGAT-3’5’-TCGTCGA-C3-ACGTTCG-C3-AGATGAT-3’5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’5’-TCGTCGAACGTTCGTT-3’5’-TCGTCGAACGTTCG-3’5’-TCGTCGAACGTT-3’5’-TCGAACGTTC-3’5’-TCGTCGAT-3’5’-TCGTCGA-3’5’-TCGTCG-3’5’-TCGTT-3’12640371117181920 用以下方法制備顆粒制劑首先制備1毫克/毫升寡核苷酸，0.4％TWEEN85，0.4％油酸溶液，然后使該溶液中有5毫克/毫升PMXB。試驗(yàn)前使制劑在室溫下靜置24小時(shí)。
對(duì)制劑進(jìn)行漩渦振蕩以使沉降的沉淀物重新懸浮，然后加入培養(yǎng)物中至寡核苷酸終濃度為20μg/ml(對(duì)于多粘菌素對(duì)照為100μg/ml多粘菌素)，用如實(shí)施例1所述的hPBMC試驗(yàn)測(cè)試。結(jié)果歸納在表9中。
表9樣品 IFN-γ(pg/ml) 149206208平均值對(duì)照培養(yǎng)基PMXB+ISS制劑+ISS/PMXB+ISS(O/S)/PMXB20-pG(O/S)/PMXBCICbr-HEG/PMXBCIC-HEG/PMXBCIC-C3/PMXBds+ISS(P+O)/PMXB+ISS(P+O)5TCG/PMXBTGG2/PMXB7TCG/PMXB8TCG/PMXB10TCG/PMXB12TCG/PMXB14TCG/PMXB16TCG/PMXB 32 4 4 13 19514 171127 78 5 14676 2446 5181377 1447 546134752477 1576 3791179 1045 3604 6602866 2377 2554 2409251240 2596 5141357 1489 1876 186126 1544 202120 23 14 19778 4 5 28999 48 18 22497 1324 188108 1064 320143 16553 189136 1772 7169901159 1719 6781399 1265 樣品 IFN-α(pg/ml) 149208209平均值對(duì)照培養(yǎng)基PMXB+ISS制劑+ISS/PMXB 32 32 32 32 32 32 32 32 59 32 32 41 5298 56619992167+ISS(O/S)/PMXB20-pG(O/S)/PMXBCICbr-HEG/PMXBCIC-HEG/PMXBCIC-C3/PMXBds+ISS(P+O)/PMXB+ISS(P+O)5TCG/PMXBTGG2/PMXB7TCG/PMXB8TCG/PMXB10TCG/PMXB12TCG/PMXB14TCG/PMXB16TCG/PMXB 32 17915 2684 415 3905 32 32 32 32 32 32 32 32 2345 5245 32 2825 412 32 700 32 32 32 32 32 32 32 32 1240 875 277 15336 3183 349 1890 32 32 32 32 32 32 32 32 2189 3175 114 12025 2093 265 2165 32 32 32 32 32 32 32 32 1925 3098實(shí)施例5 多粘菌素結(jié)構(gòu)域和ISS活性的增強(qiáng) PMXB有兩個(gè)主要結(jié)構(gòu)域(1)含有5個(gè)帶正電荷氨基酸殘基的環(huán)狀肽以及(2)N末端親脂性脂肪?；苌铩榱舜_定IMC活性增強(qiáng)是否需要一個(gè)或兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，測(cè)試多粘菌素家族的兩個(gè)衍生物的增強(qiáng)IMC的能力。測(cè)試的衍生物是缺少聚陽離子結(jié)構(gòu)域的粘桿菌素甲磺酸酯(CMS)，以及缺少親脂性結(jié)構(gòu)域的多粘菌素B九肽(PMXB-9)。
用20μg/ml IMC寡核苷酸(5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ IDNO1)或20μg/ml-ISS寡核苷酸(5’-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA-3’(SEQ IDNO38)，陰性對(duì)照)在有或沒有100μg/ml PMXB，粘桿菌素(CLN)，CMS，或PMXB-9下刺激來自6位供血者的PBMC24小時(shí)。對(duì)于這些試驗(yàn)，在含有人血清白蛋白的PBMC細(xì)胞培養(yǎng)物中分別加入ISS和多粘菌素。結(jié)果顯示在表10中。
表10IFN-γ(pg/ml)刺激物供血者1供血者2供血者3供血者4供血者5供血者6平均值SEM培養(yǎng)基IMCIMC+PMXBIMC+CLNIMC+CMSIMC+PMXB-9213432858147322357720002222216218222233338622299200054137210721446149631911222670750141260162712646917-ISS-ISS+PMXB-ISS+CLN-ISS+CMS-ISS+PMXB-9294222284572227431222322210225299152125022231038869871304743IFN-α(pg/ml)刺激物供血者1供血者2供血者3供血者4供血者5供血者6平均值SEM培養(yǎng)基IMCIMC+PMXBIMC+CLNIMC+CMSIMC+PMXB-95226381481029149218815222532751972336529525236571259525252521003115525226218807441872152831262613160402029026431396220364156256254418051478325295-ISS-ISS+PMXB-ISS+CLN-ISS+CMS-ISS+PMXB-9525252525252525252525252525252525252525226262626262626262626434343434355555如表10所示，盡管CMS和PMXB-9都增強(qiáng)了IMC的IFN-γ/α-刺激活性，但是CMS和PMXB-9表現(xiàn)出的IFN-γ/α-增強(qiáng)活性顯著低于PMXB或CLN。這些數(shù)據(jù)表明多粘菌素分子中的聚陽離子結(jié)構(gòu)域和親脂結(jié)構(gòu)域都是多粘菌素最佳IMC增強(qiáng)活性所必需的。實(shí)施例6 多粘菌素顆粒制劑和ISS活性 在人PBMC中，IMC刺激誘導(dǎo)了熟知的和特異性的基因活化模式(包括細(xì)胞因子、趨化因子和抗病毒因子)。檢查了PMXB增強(qiáng)IMC活性期間的這種模式。用有或沒有PMXB的IMC刺激4位供血者的人PBMX4-10小時(shí)。測(cè)試兩種不同的IMC(5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO1)和(5’-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT-3’(SEQ ID NO39)。對(duì)于這些試驗(yàn)，在含有人血清白蛋白的PBMC細(xì)胞培養(yǎng)物中分別加入ISS和多粘菌素。為了評(píng)價(jià)基因表達(dá)，從細(xì)胞懸浮液分離的RNA合成cDNA，用TAQMAN技術(shù)對(duì)RNA定量測(cè)定。在這些時(shí)間點(diǎn)評(píng)價(jià)下列基因的表達(dá)IFN-γ和IFN-α，干擾素可誘導(dǎo)的蛋白-10(IP-10)，IFN-γ誘導(dǎo)的單核因子(MIG)，2，5-寡腺苷酸合成酶(2，5-OAS)以及干擾素刺激基因-54K(ISG-54K)。這些結(jié)果顯示在表11中。
表11 誘導(dǎo)倍數(shù)IFN-α2，5-OASISG-54KIFN-γIP-10MIG時(shí)間刺激物平均值SEM平均值SEM平均值SEM平均值SEM平均值SEM平均值SEM 4hSEQ IDNO1 0.8 2.4 2.3 155.1 0.1 1.1 1.1 83.3 0.9 1.4 1.0 10.5 0.2 0.4 0.3 4.7 1.1 2.5 1.4 24.7 0.3 0.7 0.4 11.0 0.9 5.0 0.9 37.9 0.2 3.0 0.3 32.1 0.6 7.7 0.7 45.4 0.2 4.1 0.3 37.6 1.3 14.0 1.2 33.9 0.8 7.7 0 .5 25.1SEQ IDNO1 +PMXBSEQ IDNO39SEQ IDNO39+PMXB 10h SEQ IDNO1 76.9 239365523463 64.7 121741561146 13.5 29.0105.318.6 2.9 3.216.03.1 34.8 105.1455.365.9 10.6 21.3129.610.8 18.7 461.8100.4273.3 5.7 183.910.3117.2 49.2 105.0512.675.9 32.9 64.8169.847.1 4.6 34.647.335.5 1.2 14.817.120.2SEQ IDNO1 +PMXBSEQ IDNO39SEQ IDNO39+PMXB 通過10小時(shí)的刺激，PMXB明顯增強(qiáng)了IMC SEQ ID NO1誘導(dǎo)各種基因(包括IFN-γ和IFN-α、趨化因子如IP-10和MIG以及抗病毒劑2，5-OAS和ISG-54K)表達(dá)的能力。IMC SEQ ID NO39顯示出比IMC SEQ ID NO1加速的基因誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)，因此選擇較早的時(shí)間點(diǎn)來觀察PMXB的增強(qiáng)作用。在4小時(shí)時(shí)，PMXB顯著增強(qiáng)了IMCSEQ ID NO39的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)活性(類似于10小時(shí)時(shí)的IMC SEQ ID NO1)。因此，PMXB似乎從量上增加了基因活化的IMC轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，但不引起性質(zhì)上的改變。
實(shí)施例7 IMC顆粒制劑增強(qiáng)漿細(xì)胞狀(plasmacytoind)樹突細(xì)胞的IFN-α產(chǎn)生 用胞內(nèi)染色試驗(yàn)和FACS分析檢查人PBMC漿細(xì)胞狀(plasmacytoind)樹突細(xì)胞的IFN-α產(chǎn)生。這些試驗(yàn)用20μg/ml IMC寡核苷酸5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO1)或5’-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT-3’(SEQ ID NO39)或20μg/ml-ISS寡核苷酸(5’-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA-3’(SEQ ID NO38)，陰性對(duì)照)進(jìn)行。對(duì)于這些試驗(yàn)，在含人血清白蛋白的PBMC細(xì)胞培養(yǎng)物中分別加入IMC或-ISS。
人PBMC用20μg/mL IMC或-ISS(有或沒有100μg/mL PMXB)刺激6小時(shí)，最后兩小時(shí)還存在布雷菲德菌素A(防止高爾基體釋放新合成的蛋白質(zhì)的試劑)。6小時(shí)后，用熒光標(biāo)記的PDC標(biāo)記物、FITC標(biāo)記的抗BCDA-2以及PE標(biāo)記的抗-IFN-α對(duì)細(xì)胞染色。對(duì)標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行FACS分析。用2種不同的IMC進(jìn)行試驗(yàn)，雙染色細(xì)胞群(BCDA-2+，IFN-α+)在總PBMC中的百分?jǐn)?shù)列于表12中。
表12BCDA-2/IFN-αd.p.％樣品刺激物供血者1供血者2平均值1 2 3 4 5 6 7培養(yǎng)基IMC SEQ IDNO1-ISS SEQ IDNO38IMC SEQ IDNO39IMC SEQ IDNO1+PMXB-ISS SEQ IDNO38+PMXBIMC SEQ IDNO39+PMXB0.00 0.01 0.00 0.08 0.06 0.00 0.210.00 0.03 0.00 0.14 0.35 0.00 0.390.00 0.02 0.00 0.11 0.21 0.00 0.30 如表12所示，當(dāng)存在PMBX下用兩種IMC處理PBMC時(shí)，雙染色細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)顯著增加，但是在PMXB存在下用-ISS寡核苷酸處理則沒有。該結(jié)果表明在IMC/PMXB制劑存在下觀察到的PBMC產(chǎn)生IFN-α的增強(qiáng)衍生自PDC。另外，在BCDA-2-(非-PDC)細(xì)胞組分中沒有觀察到可檢測(cè)的IFN-α產(chǎn)生。 實(shí)施例8 用顆粒組合物誘導(dǎo)人細(xì)胞的天然殺傷細(xì)胞活性 天然殺傷(NK)細(xì)胞的裂解活性被免疫調(diào)節(jié)多核苷酸激活。NK細(xì)胞通過漿細(xì)胞狀樹突細(xì)胞(PDC)傳遞的信號(hào)被IMC間接激活。該信號(hào)的確切性質(zhì)還未被鑒定，但是IFN-α似乎在該信號(hào)傳導(dǎo)中起了主要作用。
測(cè)試IMC顆粒制劑的NK細(xì)胞刺激活性。用10μg/mL IMC(“+ISS”)5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQ ID NO1)(有或沒有100μg/mL PMXB)刺激兩位供血者的PBMC48小時(shí)。然后，測(cè)試PMXB對(duì)于作為靶細(xì)胞的51Cr標(biāo)記的K562細(xì)胞的裂解活性。對(duì)照是單獨(dú)培育K562細(xì)胞，用Triton裂解K562細(xì)胞，以及用未處理的PBMC細(xì)胞刺激K562細(xì)胞。通過測(cè)定釋放到培養(yǎng)基中的51Cr來測(cè)定靶細(xì)胞裂解的程度。PMXB的存在增加了單用IMC刺激的NK細(xì)胞裂解活性。結(jié)果歸納在表13中。
表13效靶比 供血者1 供血者2兩者的平均值刺激cpm1cpm2cpm3平均值cpm1cpm2cpm3平均值單用K562K562+Triton--415517136437817476430317576427917396435217701426217666453718231438417866433117631未用PBMC處理未用PBMC處理未用PBMC處理未用PBMC處理50∶125∶112.5∶16∶1604357646343666859535980665968955810592466656643593558896556673574827124570963198103796261906630791877206694667178347602619865406885674663776638PBMC+IMCPBMC+IMCPBMC+IMCPBMC+IMC50∶125∶112.5∶16∶1766082057412693575868408724066899169804873446473813882207332669999759263837071819623964283707060966091497745712297539351816271218946878677476910PBMC+IMC+PMXBPBMC+IMC+PMXBPBMC+IMC+PMXBPBMC+IMC+PMXB50∶125∶112.5∶16∶110888110488549699910634104967582695211205998176747227109091050879357059113791183510762847111292109481031181751106211935947491851124411573101828610110771104190597835 實(shí)施例9 顆粒組合物在小鼠體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)作用 測(cè)定小鼠對(duì)乙肝表面抗原(HBsAg)以及IMC(“+ISS”)顆粒制劑或空白+ISS的免疫應(yīng)答反應(yīng)。IMC(“+ISS”)具有序列5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’(SEQID NO1)，它是完全修飾的硫代磷酸酯寡脫氧核苷酸。
用以下方法制得顆粒制劑首先制備1毫克/毫升寡核苷酸，0.4％TWEEN85，0.4％油酸鹽溶液，或1毫克/毫升寡核苷酸，20毫克/毫升HSA溶液，然后使該溶液中的PMXB為5毫克/毫升。使用前使制劑在室溫下靜置24小時(shí)。注射前將HBsAg加入制劑中。將單獨(dú)HBsAg以及HBsAg加+ISS作為對(duì)照。
將小鼠(BALB/c)分成10個(gè)一組，在第0周和第2周通過肌內(nèi)注射給予測(cè)試制品(5μg+ISS和1μg HBsAg)。在第2周和第4周通過尾部取血獲得血清樣品。所有小鼠在第6周處死。
用ELISA測(cè)定血清樣品的IgG1和IgG2a滴度。接受顆粒制劑的小鼠顯示出明顯較高的IgG2a滴度，表明是Th1應(yīng)答反應(yīng)。第2周和第4周的抗體滴度(截?cái)郞D值時(shí)的樣品稀釋度的倒數(shù))以滴度±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式歸納在表14中。
表14測(cè)試品 IgG1滴度(×103) IgG2a滴度(×103) 第2周第4周 第2周 第4周單用HBsAg 0.06±0.096±6 0.03±.002 2.5±2.6HBsAg/+ISS 0.09±0.123.8±3.6 0.23±0.25 43.6±35.9HBsAg/+ISS/HSA/PMXB 0.46±0.6629.3±18.5 3.8±3.3 217.7±261.1HBsAg/+ISS/Tween/油酸鹽/PMXB 0.58±0.8724.9±10.2 6.3±3.8 351.2±207.9 分離得到處死小鼠脾臟的脾細(xì)胞，分別測(cè)試抗原刺激的細(xì)胞因子釋放或肽刺激的細(xì)胞裂解活性。
細(xì)胞因子釋放用以下方法測(cè)定將每組10只動(dòng)物的細(xì)胞培育在96孔平底板內(nèi)RPMI 1640加10％FCS中(5×105脾細(xì)胞/孔)。在5μg/mL HBsAg、單獨(dú)培養(yǎng)基(陰性對(duì)照)或PMA/離子霉素(陽性對(duì)照)存在下培養(yǎng)細(xì)胞4天。收集培養(yǎng)液并測(cè)定IFN-γ和IL-5水平。經(jīng)任一免疫調(diào)節(jié)制劑處理的動(dòng)物脾細(xì)胞顯示出IFN-γ釋放增加和IL-5釋放減少。結(jié)果歸納在表15。免疫原 IFN-γ(ng/ml) 培養(yǎng)基 HBsAg IL-5(ng/ml) 培養(yǎng)基 HBsAg 單用HBsAg HBsAg/+ISS HBsAg/+ISS/HSA/PMX B HBsAg/+ISS/Tween/油酸 鹽/PMXB 1.4±1.54.7±6.8 1.6±1.542±23 3.1±2.535.7±17.8 1.4±0.727.5±22.7 0.1±0.11±1.7 0.1±0.06 0.1±0.1 0.3±0.30.6±0.5 0.1±0.20.1±0.2 將每組5只動(dòng)物的脾細(xì)胞重懸于RPMI 1640加10％FCS(3×107細(xì)胞/孔)中，在有或沒有1微克/毫升的肽IPQSLDSWWTSL(SEQ ID NO41)(乙肝病毒CTL表位)下培育4天。洗滌細(xì)胞并稀釋至4×106細(xì)胞/毫升，轉(zhuǎn)移到抗體包被的ELISPOT平板上，然后培育5-7小時(shí)。培育后，用去離子水裂解細(xì)胞，與抗-IL4或抗-IFN-γ抗體反應(yīng)，給陽性細(xì)胞評(píng)分(斑點(diǎn)形成單位，SFU)。用該顆粒制劑處理的動(dòng)物脾細(xì)胞有增加數(shù)量的IFN-γ陽性細(xì)胞，且產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞產(chǎn)生IL-4的細(xì)胞的比例增加。結(jié)果歸納在表16中(表示成陽性細(xì)胞/105細(xì)胞)。
表16IL-4(SFU/105細(xì)胞)+肽 -肽 (單用細(xì)胞)IFN-γ(SFU/105細(xì)胞)+肽 -肽 (單用細(xì)胞)對(duì)照單用HBsAgHBsAg/+ISS制劑HBsAg/+ISS/HSA/PMXBHBsAg/+ISS/Tween/油酸鹽/PMXB 8±54±22±16±3 20±14 22±134±14±1 38±17 46±2738±22 34±20 63±24 32±1849±10 10±3 將每組其余5只動(dòng)物的脾細(xì)胞懸浮在15毫升的RPMI 1640加10％FCS中。將12毫升的懸浮液分在12孔板的6個(gè)孔內(nèi)。將其余的細(xì)胞懸浮液與1微克/毫升CTL肽IPQSLDSWWTSL(SEQ ID NO41)混合，用三倍體積的5.33％大鼠T-Stim稀釋，然后均分到已接種的但未刺激的細(xì)胞中。培育培養(yǎng)物4天，用2％大鼠T-Stim洗滌，重新涂板接種，然后再培育2天。測(cè)丁該方法所產(chǎn)生的針對(duì)有Cr51的MHC匹配的細(xì)胞或Cr51以及CTL肽IPQSLDSWWTSL(SEQ ID NO41)的效應(yīng)細(xì)胞。經(jīng)+ISS(在溶液中或在顆粒制劑中)加上HBsAg處理的動(dòng)物細(xì)胞顯示出殺死70％以上的靶細(xì)胞。結(jié)果歸納在表17中。
表17免疫組 裂解百分?jǐn)?shù)效靶比MHC-匹配的，沒有肽 40∶1 10∶1 2.5∶1 40∶1單用HBsAg 1±3 0±0 0±0 0±0HBsAg/+ISS 91±42 38±22 7±7 0±0HBsAg/+ISS/HSA/PMXB 71±35 30±26 4±3 0±0HBsAg/+ISS/Tween/油酸鹽/PMXB 87±13 33±16 3±2 0±0 實(shí)施例10 用顆粒組合物免疫調(diào)節(jié)小鼠肺細(xì)胞 測(cè)定小鼠肺細(xì)胞中對(duì)免疫調(diào)節(jié)制劑反應(yīng)的各種基因的調(diào)節(jié)。
用以下方法制備顆粒制劑首先，制備含1毫克/毫升+ISS，0.4％TWEEN85，0.4％油酸鹽的溶液或20毫克/毫升HSA溶液，然后使該溶液中有5毫克/毫升PMXB。使制劑在室溫下靜置24小時(shí)，然后用10kDa膜透析。通過鼻內(nèi)灌輸給予輕度麻醉小鼠(每組5只小鼠)顆粒組合物和單獨(dú)+ISS(50μL劑量)。給藥后6小時(shí)處死動(dòng)物，用外科手術(shù)取出肺組織，通過對(duì)肺組織勻漿制得細(xì)胞懸浮液。從分離自細(xì)胞懸浮液的RNA合成cDNA，用TAQMAN技術(shù)對(duì)RNA定量。顆粒制劑誘導(dǎo)了大多數(shù)受測(cè)基因顯著增加。結(jié)果歸納在表18。
表18相對(duì)的循環(huán)臨界值(CTs)基因+ISS+ISS/HSA+ISS/Tween +ISS/Tween/油酸 鹽IL-1aIL-1b1L-6IL-10IL-12p40IL-23IFN-α2IFN-γTNF-αG-CSFBCA-1EotaxinIP-10LPTNMCP-1MCP-3MDCMIGMIP-1aMIP-1bMIP-2MIP-3aMIP-3bTARCTCA-3NOS2COX-1COX-27523164375546266325717092502627323436976526539052869341161561291817928852030150516308214544619808522410222140322710514367102610283870759225410897654966421097175572232635451699833382732401038204113801631838158281625269275110041116025649349961742962964194217582664491823534141594281532023266915541475 6487 1496 329 7 9 85 2 25 3095 29 2711 350 17925 816 4102 2596 1967 2389 2553 6117 1201 684 1411 1286 10 354 1262 642 12/13-lipoxg CD80 CD86 MMP-8 65 205 103 150524976342919281664532541499179256231653 實(shí)施例11 顆粒制劑和靈長動(dòng)物體內(nèi)的HBsAg抗體反應(yīng) 測(cè)定狒狒對(duì)乙肝病毒表面抗原(HBsAg)結(jié)合PMXB/+ISS/Tween/油酸鹽(Tween)顆粒制劑的免疫反應(yīng)。顆粒制劑用以下方法制得首先制備1毫克/毫升寡核苷酸、0.4％TWEEN85、0.4％油酸鹽溶液，然后使溶液中PMXB為5毫克/毫升。在給藥前使制劑在室溫下靜置24小時(shí)。注射前將HBsAg(20μg)加入制劑中。用單用HBsAg和HBsAg與+ISS作為對(duì)照。
在第0周和第8周用HBsAg(20μg，n＝5)，HBsAg(20μg)+ISS(SEQ ID NO1)(1000μg，n＝5)，或HBsAg 20μg+吐溫制劑(1000μg+ISS(SEQ ID NO1)，n＝10)給每組5-10只動(dòng)物進(jìn)行肌內(nèi)免疫。各免疫的兩周后，對(duì)狒狒取血，收集血清樣品。
用Abbott Laboratories的AUSAB酶免疫試驗(yàn)對(duì)來自血清樣品的HBsAg特異性抗體反應(yīng)定量。在人體內(nèi)，10mIU/毫升的滴度被認(rèn)為有保護(hù)力。結(jié)果歸納在表19中(每組的幾何平均值(geomean)±SE)。
表19免疫組第一次免疫后抗-HBsAg(mIU/毫升)第2次免疫后抗-HBsAg(mIU/毫升)單用HBsAg(20μg)0±24±24HBsAg(20μg)++ISS(1000μg)8±6260±3,939HBsAg(20μg)+吐溫制劑(1000μg+ISS)*26±269*797±1,326 *p＜0.05，與單用HbsAg相比，用Kruskal-Wallis測(cè)試 在第一次和第二次免疫后，經(jīng)HBsAg和吐溫制劑免疫的狒狒誘導(dǎo)出統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于單用HBsAg免疫的動(dòng)物的HBsAg特異性抗體反應(yīng)。該數(shù)據(jù)表明，除了前面所示的增強(qiáng)小鼠內(nèi)免疫反應(yīng)外，顆粒吐溫制劑還增強(qiáng)了靈長動(dòng)物體內(nèi)的免疫反應(yīng)。 實(shí)施例12 免疫調(diào)節(jié)組合物的凍干 用以下方法制備一批10mL的免疫調(diào)節(jié)組合物將0.4mL 10％油酸(在水中)，4mL 1％吐溫85(在水中)，1mL 20毫克/毫升+ISS(SEQ ID NO1)和3.6mlDulbecco經(jīng)修飾的磷酸酯緩沖鹽水混合。充分混合后，邊振蕩混合邊緩慢加入1mL50毫克/毫升PMXB硫酸鹽。將816mg蔗糖溶解在8mL懸浮液中，使其靜置過夜。通過漩渦振蕩重新懸浮顆粒，將材料分成2毫升等份。將小管浸在干冰/乙醇中使兩個(gè)等份凍結(jié)。一個(gè)等份在LABCONCO Freezone 4.5冷凍干燥機(jī)中約0.06mBar壓力下凍干。在重新懸浮于去離子水中之前將樣品室溫保存2周。重建組合物的分析結(jié)果表明懸浮液中的顆粒大小分布與未經(jīng)凍干的0時(shí)的對(duì)照樣品相等。
實(shí)施例13 對(duì)凍干的顆粒制劑的抗體應(yīng)答反應(yīng) 測(cè)定小鼠對(duì)HBsAg結(jié)合凍干的吐溫(PMX/+ISS/Tween/油酸鹽)顆粒制劑的免疫反應(yīng)。用1μg劑量的單獨(dú)HBsAg、HBsAg與1或5μg+ISS(SEQ ID NO1)的混合物，或HBsAg與實(shí)施例12所述的凍干的(1yoTween)制劑(但有1或5μg+ISS寡核苷酸(SEQID NO1))對(duì)每組10BALB/c小鼠真皮內(nèi)免疫。動(dòng)物以2周的間隔接受兩次免疫。每次免疫的兩周后，小鼠取血，收集血清樣品。
用ELISA測(cè)試血清樣品的HBsAg-特異性IgG1和IgG2a反應(yīng)。小鼠的Th1反應(yīng)誘導(dǎo)了IgG2a亞類?？贵w滴度歸納在表20中(每組的平均滴度±SD)。
表20免疫組IgG1滴度第一次免疫后IgG2a滴度第一次免疫后IgG1滴度第二次免疫后IgG2a滴度第二次免疫后單用HBsAg(1μg)71±7346±4710,345±8,3972,122±2,479HBsAg(1μg)++ISS(1μg)84±98324±3315,797±5,25625,561±35,909HBsAg(1μg)+1yo吐溫制劑(1μg+ISS)282±348**1，583±1,35917,257±15,405**81,280±47,435HBsAg(1μg)++ISS(5μg)44±26171±2344,179±3,49431,323±29,455HBsAg(1μg)+1yo吐溫制劑(5μg+ISS)*739±604**7,461±7,004*30,498±16,940**274,491±243,949 *p＜0.01，**p＜0.001，與單用HbsAg相比，用Kruskal-Wallis測(cè)試 p＜0.05，p＜0.001，與HBsAg+ISS相比，用Kruskal-Wallis測(cè)試 與經(jīng)單用HBsAg免疫的動(dòng)物相比，接受HBsAg+凍干吐溫制劑的小鼠第一和第二次免疫后的IgG1、尤其是IgG2a滴度顯著增加，這表明凍干的吐溫制劑具有與非凍干吐溫制劑相同的增強(qiáng)免疫反應(yīng)的能力。
序列表
<110>戴納伐克斯技術(shù)股份有限公司(Dynavax Technologies Corporation)
G.馮內(nèi)斯特
S.特克
<120>免疫調(diào)節(jié)組合物，其制備方法和使用方法
<130>377882001940
<140>PCT/US03/25415
<141>2003-08-12
<150>60/402,968
<151>2002-08-12
<160>41
<170>PastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>1
tgactgtgaa cgttcgagat ga 22
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>2
tgaccgtgaa cgttcgagat ga 22
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>3
tcatctcgaa cgttccacag tca 23
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>4
tgactgtgaa cgttccagat ga 22
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>5
tccataacgt tcgcctaacg ttcgtc 26
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>變異
<222>(0)...(0)
<223>b＝5-溴胞嘧啶
<400>6
tgactgtgaa bgttceagat ga 22
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>變異
<222>(0)...(0)
<223>b＝5-溴胞嘧啶
<400>7
tgactgtgaa bgttcgagat ga 22
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>變異
<222>(0)..(0)
<223>b＝5-溴胞嘧啶
<400>8
tgactgtgaa bgttbgagat ga 22
<210>9
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>變異
<222>(6)...(0)
<223>b＝5-溴胞嘧啶
<400>9
gaaabgutcg 10
<210>10
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>變異
<222>(0)...(0)
<223>b＝5-溴胞嘧啶
<400>10
bgaabgutcg 10
<210>11
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>11
tcgagcgttc t 11
<210>12
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>12
tgaacgutcg 10
<210>13
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>13
gaaccgttcg 10
<210>14
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>14
cgaacgttcg 10
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>15
atcgactctc gagcgttctc 20
<210>16
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>16
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210>17
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>17
tcgtcgaacg ttcgtt 16
<210>18
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>18
tcgtcgaacg ttcg14
<210>19
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>19
tcgtcgaacg tt 12
<210>20
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>20
tcgaacgttc 10
<210>21
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>變異
<222>1
<223>x＝t，g，c or b b＝5-溴胞嘧啶
<221>變異
<222>2
<223>x＝t，g，a，或u
<221>變異
<222>3
<223>X＝t，a，或c
<221>變異
<222>6
<223>X＝t，9，或u
<400>21
nnancgntcg 10
<210>22
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>多核苷酸
<400>22
tgaacgttcg 10
<210>23
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>多核苷酸
<400>23
ggaacgttcg 10
<210>24
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>變異
<222>1
<223>x＝t，g，C，或b b＝5-溴胞嘧啶
<221>變異
<222>2
<223>x＝t，g，a，或u
<221>變異
<222>4
<223>x＝t，a，或c
<221>變異
<222>5
<223>b＝5-溴胞嘧啶
<221>變異
<222>7
<223>x＝t，9，或u
<400>24
nnanbgntcg 10
<210>25
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>變異
<222>(0)...(0)
<223>b＝5-溴胞嘧啶
<400>25
tgaabgttcg 10
<210>26
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>無活性對(duì)照化合物
<400>26
tgactgtgaa ccttagagat ga 22
<210>27
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>免疫調(diào)節(jié)多核苷酸
<400>27
tcgtcgaacg ttcgttaacg ttcg 24
<210>28
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>免疫調(diào)節(jié)多核苷酸
<400>28
tcgtcgtgaa cgttcgagat ga 22
<210>29
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>免疫調(diào)節(jié)多核苷酸
<400>29
tcgtcggtat cggtcggtat ga 22
<210>30
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>免疫調(diào)節(jié)多核苷酸
<400>30
tcgtcggaac cgttcggaat ga 22
<210>31
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>免疫調(diào)節(jié)多核苷酸
<400>31
tcgtcgaacg ttcgagatg 19
<210>32
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>變異
<222>(0)...(0)
<223>b＝5-溴胞嘧啶
<400>32
tcgtbgaacg ttcgagatg 19
<210>33
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>免疫調(diào)節(jié)多核苷酸
<400>33
ttcgaacgtt cgttaacgtt cg 22
<210>34
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>變異
<222>(0)...(0)
<223>b＝5-溴胞嘧啶
<400>34
tcgtcggaaa bgutcggaat ga 22
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>變異
<222>(0)...(0)
<223>b＝5-溴胞嘧啶
<400>35
tcgtbgaabg utcggaatga 20
<210>36
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>變異
<222>(0)...(0)
<223>b＝5-溴胞嘧啶
<400>36
tcgtbgtgaa cgttcgagat ga 22
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>37
ggtgcatcga tgcagggggg 20
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>ISS寡核苷酸
<400>38
tgcttgcaag cttgcaagca 20
<210>39
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>39
tcgtcgaacg ttcgagatga t21
<210>40
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>IMC多核苷酸
<400>40
tgactgtgaa cgttcgagat ga 22
<210>41
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CTL肽
<400>41
Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu
1 10
權(quán)利要求
1.一種免疫調(diào)節(jié)組合物，它包含免疫調(diào)節(jié)顆粒，所述顆粒組合物是通過混合陽離子縮合劑、包含核苷酸序列5′-CG-3′的免疫調(diào)節(jié)化合物以及非離子型洗滌劑而制得的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述陽離子縮合劑選自多粘菌素、環(huán)桿菌素、八肽素或兩性霉素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述陽離子縮合劑是多粘菌素。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述陽離子縮合劑是多粘菌素B。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述非離子型洗滌劑是聚氧乙烯山梨糖醇酐洗滌劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述聚氧乙烯山梨糖醇酐洗滌劑是聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述顆粒組合物是通過進(jìn)一步混合脂肪酸而制得的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述脂肪酸是油酸的鹽。
9.一種藥物組合物，它包含
免疫調(diào)節(jié)顆粒水性懸浮液，所述顆粒是通過混合陽離子縮合劑、包含序列5′-CG-3′的免疫調(diào)節(jié)化合物以及和非離子型洗滌劑而制得的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述陽離子縮合劑選自多粘菌素、環(huán)桿菌素、八肽素和兩性霉素。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述陽離子縮合劑是多粘菌素。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述陽離子縮合劑是多粘菌素B。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述非離子型洗滌劑是聚氧乙烯山梨糖醇酐洗滌劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述聚氧乙烯山梨糖醇酐洗滌劑是聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯。
15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述顆粒組合物是通過進(jìn)一步與脂肪酸混合而制得的。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述脂肪酸是油酸的鹽。
17.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，它還包含抗原。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述抗原選自變應(yīng)原和感染因子相關(guān)抗原。
19.一種用以下方法制得的顆粒懸浮液，該方法包括
(a)將包含序列5′-CG-3′的免疫調(diào)節(jié)化合物IMC和非離子型洗滌劑混合，從而形成了IMC/非離子型洗滌劑混合物，
(b)將陽離子縮合劑和所述IMC/非離子型洗滌劑混合物混合，然后
(c)收集顆粒懸浮液。
20.一種調(diào)節(jié)個(gè)體內(nèi)免疫反應(yīng)的方法，該方法包括
給予該個(gè)體足以調(diào)節(jié)所述個(gè)體內(nèi)免疫反應(yīng)的量的免疫調(diào)節(jié)組合物，其中所述組合物包含在水性懸浮液中的免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物，所述免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物是通過混合陽離子縮合劑、包含核苷酸序列5′-CG-3′的免疫調(diào)節(jié)化合物以及非離子型洗滌劑而制得的。
21.一種免疫調(diào)節(jié)組合物，它包含免疫調(diào)節(jié)顆粒，所述顆粒組合物是通過混合多粘菌素、包含核苷酸序列5′-CG-3′的免疫調(diào)節(jié)化合物IMC和穩(wěn)定劑而制得的，其中所述穩(wěn)定劑不是牛血清蛋白。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述穩(wěn)定劑選自蛋白質(zhì)、非離子型洗滌劑、聚合物表面活性劑、陽離子洗滌劑、陰離子洗滌劑和脂肪酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的組合物，其中所述穩(wěn)定劑是非離子型洗滌劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，其中所述非離子型洗滌劑是聚氧乙烯山梨糖醇酐洗滌劑。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，其中所述聚氧乙烯山梨糖醇酐洗滌劑是聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯。
26.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述多粘菌素是多粘菌素B。
27.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述顆粒組合物是通過進(jìn)一步和脂肪酸混合而制得的。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的組合物，其中所述脂肪酸是油酸的鹽。
29.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述IMC包含核苷酸序列5’-TCG-3’。
30.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述IMC包含核苷酸序列5’-嘌呤，嘌呤，C，G，嘧啶，嘧啶-3’。
31.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述IMC包含至少14核苷酸。
32.一種藥物組合物，它包含
免疫調(diào)節(jié)顆粒的水性懸浮液，所述顆粒是通過混合多粘菌素、包含核苷酸序列5′-CG-3′的免疫調(diào)節(jié)化合物和穩(wěn)定劑而制得的，其中所述穩(wěn)定劑不是牛血清蛋白質(zhì)。
33.一種用以下方法制得的顆粒懸浮液，該方法包括
(a)將包含序列5′-CG-3′的免疫調(diào)節(jié)化合物IMC和穩(wěn)定劑混合，從而形成IMC/穩(wěn)定劑混合物，
(b)將多粘菌素和所述IMC/穩(wěn)定劑混合物混合，然后
(c)收集顆粒懸浮液。
34.一種調(diào)節(jié)個(gè)體內(nèi)免疫反應(yīng)的方法，該方法包括
給予該個(gè)體足以調(diào)節(jié)所述個(gè)體內(nèi)免疫反應(yīng)的量的免疫調(diào)節(jié)組合物，其中所述組合物包含水性懸浮液中的免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物，所述免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物是通過混合多粘菌素、包含核苷酸序列5′-CG-3′的免疫調(diào)節(jié)化合物和穩(wěn)定劑而制得的。
35.一種免疫調(diào)節(jié)組合物，它包含免疫調(diào)節(jié)顆粒，所述顆粒組合物是通過混合陽離子縮合劑、包含序列5′-CG-3′的免疫調(diào)節(jié)多核苷酸、抗原和穩(wěn)定活性制劑而制得的。
36.一種藥物組合物，它包含
抗原；以及
免疫調(diào)節(jié)顆粒的水性懸浮液，所述顆粒是通過混合陽離子縮合劑、包含序列5′-CG-3′的免疫調(diào)節(jié)多核苷酸和穩(wěn)定劑而制得的。
37.一種調(diào)節(jié)個(gè)體內(nèi)免疫反應(yīng)的方法，該方法包括
給予該個(gè)體足以調(diào)節(jié)所述個(gè)體內(nèi)免疫反應(yīng)的量的免疫調(diào)節(jié)組合物，其中所述組合物包含在水性懸浮液中的免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物和抗原，所述免疫調(diào)節(jié)顆粒組合物是通過混合陽離子縮合劑、包含核苷酸序列5′-CG-3′的免疫調(diào)節(jié)多核苷酸和穩(wěn)定劑而制得的。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的免疫調(diào)節(jié)組合物，它包含陽離子縮合劑、免疫調(diào)節(jié)化合物和穩(wěn)定劑。與沒有配制在本發(fā)明組合物中的免疫調(diào)節(jié)化合物相比，本發(fā)明的組合物通常形成了免疫調(diào)節(jié)活性提高的顆粒。本發(fā)明還提供了制備該組合物的方法以及該組合物的治療用途方法。
文檔編號(hào)A61K47/42GK1674878SQ0381949
公開日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2003年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月12日
發(fā)明者G·馮內(nèi)斯特, S·特克 申請(qǐng)人:戴納伐克斯技術(shù)股份有限公司