專利名稱：用作抗病毒劑的防衛(wèi)素的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)涉及2002年9月20日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)60/412,414、2002年8月23日提交的60/405,595、以及2002年5月31日提交的60/384,428，出于所有目的，在此并入這些專利中的技術(shù)以供參考。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及應(yīng)用防衛(wèi)素抑制病毒，如HIV。本發(fā)明還關(guān)于鑒定和應(yīng)用所述試劑(如小型有機(jī)分子、抗體、肽、核酸(如反義核酸和核酶))的方法，其能提高天然存在的防衛(wèi)素的表達(dá)或活性，從而抑制細(xì)胞中的HIV；同時(shí)，還關(guān)于將表達(dá)曲線和組合物用于診斷、預(yù)防和治療與HIV相關(guān)的感染以及相關(guān)的疾病狀態(tài)，如AIDS。
人免疫缺陷病毒(HIV)感染了全球成百上千萬(wàn)的人，據(jù)報(bào)導(dǎo)，全球范圍內(nèi)，幾乎每個(gè)國(guó)家都預(yù)計(jì)有4千萬(wàn)成人和兒童生活在HIV/AIDS的陰影中。在2001年，5百萬(wàn)人新感染上了HIV，并且有3百萬(wàn)成人和兒童死于HIV/AIDS。這些患AIDS的人群中有三分之一的年齡在15-24歲(世界健康組織，2001)。然而，在HIV/AIDS的治療中，目前應(yīng)用在治療療法中的藥物呈現(xiàn)出大量的副作用，包括從頭痛、腹瀉、疲勞、惡心、刺痛感、腹痛、食欲降低到升高腎功能和肝功能等。此外，現(xiàn)有的用于治療HIV/AIDS的藥物需要持久地進(jìn)行治療，經(jīng)常會(huì)誘導(dǎo)藥物抗性，不能從體內(nèi)完全根除所述的病毒。
已知CD8+T淋巴細(xì)胞在免疫應(yīng)答對(duì)抗HIV-1感染方面具有重要的作用。使用CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)直接殺死感染HIV的細(xì)胞在病毒抑制方面是重要的；由CD8+T淋巴細(xì)胞分泌的非細(xì)胞毒性、可溶性因子也能夠在體外抑制HIV的復(fù)制，這在15多年前就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)了。這些非細(xì)胞毒性的可溶因子最初被Walker以及他的同事描述為抗病毒因子(CAF)，一種由來(lái)自于某些HIV-1感染個(gè)體的受激CD8+T細(xì)胞分泌的擴(kuò)散性分子。已經(jīng)證明，CTL依賴的和CAF相關(guān)的抗病毒活性都與高的CD8+T細(xì)胞數(shù)、增進(jìn)的臨床狀態(tài)以及長(zhǎng)期HIV感染后的長(zhǎng)期非進(jìn)展有關(guān)。然而，與CTL不同，CAF的抗病毒活性是非細(xì)胞毒性的，不受主要組織相關(guān)性復(fù)合物1分子或細(xì)胞-細(xì)胞接觸的限制。已證明，來(lái)自于感染HIV-1的人體內(nèi)的受激CD8+T淋巴細(xì)胞可以分泌大量的CAF，所述感染HIV-1的人臨床狀態(tài)良好，特別是那些被描述為長(zhǎng)期非進(jìn)展的人(LTNP)(Levy等，Immunol.Today，17217，1996，Cao等，N.Engl.J.Med.，332201(1995)，Barker等，Blood，923105(1998)，以及Mackewicz等，J.Clin.Invest.，871462(1991))。相反，來(lái)自進(jìn)展者(即帶有明顯免疫缺陷的患者)的受激CD8+T細(xì)胞不常分泌CAF。1999年有報(bào)導(dǎo)稱，當(dāng)應(yīng)用一種單克隆抗體來(lái)消除CD8+T細(xì)胞時(shí)，獼猴中SIV復(fù)制顯著增強(qiáng)(X.Jin等，J.Exp.Med.，189991(1999)和J.E.Schmitz等，Science，283857(1999))。CAF類似活性已經(jīng)在來(lái)自SIV感染的恒河猴、非洲綠猴、HIV-1感染的黑猩猩以及一些非感染健康人類的受激CD8+T細(xì)胞的上清液中被檢測(cè)到了(Kannagi等，J.Immunol.1402237(1998)，Ennen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，917207(1994)，Castro等，Cell.Immunol.，132246(1991)，以及Hsueh等，Cell.Immunol.，159271(1994))。
雖然在過去20年付出了極大的努力，CAF的特性仍然是難以理解的(Levy等，Immunol.Today，17217(1996))。許多研究組試圖鑒定CAF，但都沒有成功。在1995年，Cocchi等指明，受激CD8+T淋巴細(xì)胞可以分泌β-趨化因子(RANTES，MIP-1α和MIP-1β)，其能在體外阻滯HIV-1感染(Science，2701811(1995))。然而，觀察到它們的抗病毒活性是對(duì)抗趨于感染巨噬細(xì)胞的病毒分離物，但不對(duì)抗趨于感染T細(xì)胞系的菌株。這種兩分現(xiàn)象后來(lái)因β-趨化因子受體CCR5的發(fā)現(xiàn)而被解釋，其也用作共同受體使HIV-1進(jìn)入到CD4+T細(xì)胞(Deng等，Nature，381661(1996)，Dragic等，Nature，381667(1996)，Choe等，Cell，851135(1996)，Doranz等，Cell，851149(1996)，以及Alkhatib等，Science，2721955(1996))。因而，顯然β-趨化因子可以競(jìng)爭(zhēng)性阻滯應(yīng)用CCR5作為共同受體的所謂的R5病毒，而不是應(yīng)用一種變更的共同抗體CXCR4的所謂的X4病毒(Feng等，Science，272872(1996))。從而一種抗病毒態(tài)勢(shì)清楚地將β-趨化因子從CAF中區(qū)分開。此外，某些研究繼續(xù)顯示，CAF的活性不會(huì)因移除β-趨化因子或基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(SDF-1α)而消除，所述SDF-1α是CXCR4的配體，帶有特異的單克隆抗體(Barker等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，951725(1998)，Moriuchi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9315341(1996)，以及Lacey等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，949842(1997))。隨后其它的細(xì)胞因子呈現(xiàn)出可作為可能的CAF候選物，包括巨噬細(xì)胞衍生的趨化因子和白細(xì)胞介素-16，但是沒有一個(gè)經(jīng)受住了時(shí)間的考驗(yàn)(Pal等，Science，278695(1997)，以及Baier等，Nature，378563(1995))。
因而，CAF是一種體外抑制HIV復(fù)制的因子，并且由來(lái)自未進(jìn)展到AIDS的感染HIV者的受激CD8細(xì)胞分泌的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于進(jìn)展到了AIDS的人。盡管約在1986年就發(fā)現(xiàn)了所述因子的存在，從那時(shí)起研究者們不斷地進(jìn)行著研究，但沒有人能夠確定CAF的特性。因此，研究及醫(yī)學(xué)團(tuán)體無(wú)法開發(fā)出依賴于個(gè)體自身病毒抑制機(jī)制(CAF分泌)的抗病毒療法。
前述可見，需要進(jìn)行CAF的鑒定，需要開發(fā)出可應(yīng)用于抑制HIV復(fù)制和/或感染的新的治療方法。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了這些目的，還實(shí)現(xiàn)了其它一些需要。
發(fā)明概述現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，防衛(wèi)素即α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2以及α-防衛(wèi)素3，對(duì)于CAF的抗病毒活性是重要的。已知嗜中性粒細(xì)胞能生成α-防衛(wèi)素，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)CD8+細(xì)胞也能生成α-防衛(wèi)素1、2和3。同時(shí)也顯示，α-防衛(wèi)素1、2和3能夠在體外抑制HIV在CD4+細(xì)胞中的復(fù)制。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，α-防衛(wèi)素1與α-防衛(wèi)素2或α-防衛(wèi)素1與α-防衛(wèi)素3的結(jié)合應(yīng)用比單獨(dú)應(yīng)用顯示出更高的HIV抑制活性。
本發(fā)明部分基于發(fā)現(xiàn)防衛(wèi)素(如α-防衛(wèi)素和β-防衛(wèi)素)具有抗病毒活性，并且能夠用于治療患者的病毒性疾病。特別的，也發(fā)現(xiàn)防衛(wèi)素(如α-防衛(wèi)素)與CD8的抗病毒活性特別是抗HIV活性有關(guān)。并且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，兩種防衛(wèi)素的結(jié)合(如α-防衛(wèi)素1與α-防衛(wèi)素2)與單一的應(yīng)用相比具有顯著的活性增強(qiáng)作用。因此，本發(fā)明提供了藥物組合物、預(yù)防和治療方法、診斷和預(yù)后方法及試劑盒，以及利用防衛(wèi)素的抗HIV活性的藥物篩選方法。
伴隨著防衛(wèi)素被發(fā)現(xiàn)與CAF活性相關(guān)，本發(fā)明提供了防衛(wèi)素在HIV治療療法中的應(yīng)用。比如，將防衛(wèi)素預(yù)防性或治療性地給予人體，用于預(yù)防或治療HIV感染。預(yù)防性的治療對(duì)于HIV感染高危人群是特別有用的。本發(fā)明提供了抑制HIV在人體復(fù)制的方法，通過給予人體藥物有效量的防衛(wèi)素，如α-防衛(wèi)素，優(yōu)選地，施用至少兩種防衛(wèi)素，如兩種α-防衛(wèi)素。在某些實(shí)施方案中，所述防衛(wèi)素可以是被修飾的形式，如作為融合蛋白的一部分，所述融合蛋白包含防衛(wèi)素部分以及另一個(gè)多肽部分，所述多肽部分在體內(nèi)可通過如靶向CD4+細(xì)胞、促進(jìn)穩(wěn)定性或生物利用度等來(lái)增強(qiáng)防衛(wèi)素的效果。本發(fā)明還提供了藥物組合物，在一種藥學(xué)上可接受的載體中包含一種或多種防衛(wèi)素或其修飾形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抑制HIV復(fù)制的方法涉及向個(gè)體施用一種可激活CD8+細(xì)胞的組合物，當(dāng)其被刺激時(shí)生成防衛(wèi)素，如α-防衛(wèi)素。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，將CD8+細(xì)胞先體外后體內(nèi)(ex vivo)擴(kuò)展，并檢測(cè)防衛(wèi)素的生成。然后，將能夠生成防衛(wèi)素的細(xì)胞導(dǎo)入到人體用于預(yù)防或治療。
本發(fā)明也提供了涉及防衛(wèi)素基因治療的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種包含可編碼防衛(wèi)素或其修飾形式或至少兩種防衛(wèi)素的核苷酸序列的核酸被給予人體。然后所述核酸進(jìn)入到細(xì)胞并被轉(zhuǎn)錄和翻譯，生成防衛(wèi)素多肽。此外，所述核苷酸序列可以編碼α-防衛(wèi)素、β-防衛(wèi)素或它們的修飾形式，或可施用至少編碼兩種防衛(wèi)素的核酸。在另一個(gè)涉及基因治療應(yīng)用的實(shí)施方案中，用編碼防衛(wèi)素(如α-防衛(wèi)素)的核酸先體外后體內(nèi)轉(zhuǎn)染細(xì)胞(如CD8+細(xì)胞)，以使被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生成防衛(wèi)素，并將被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞導(dǎo)入到受試者。
前述以及這里所描述的抑制HIV復(fù)制的方法可應(yīng)用于體外培養(yǎng)的細(xì)胞。因此，本發(fā)明的方法同時(shí)包括體內(nèi)和體外應(yīng)用。
長(zhǎng)期非進(jìn)展者比那些AIDS進(jìn)展者表達(dá)明顯多量的防衛(wèi)素如α-防衛(wèi)素，這可用于測(cè)定某人的HIV感染狀態(tài)。也就是說，通過檢測(cè)來(lái)自某人的樣品(如血清、尿液、血液或其它體液)中的防衛(wèi)素量，測(cè)定其高于或低于某一量，可以確定該人的HIV感染狀態(tài)，確定其是否向AIDS進(jìn)展。α-防衛(wèi)素的量高于某一給定量(如，存在于大多數(shù)AIDS患者中的平均量)說明其可能保持沒有進(jìn)展到AIDS，當(dāng)?shù)陀谒隽繒r(shí)說明其可能進(jìn)展到了AIDS?？苫谒@得的信息制定治療方案，對(duì)于進(jìn)展者給予更積極的抗HIV治療。在一個(gè)實(shí)施例中，從患者中分離CD8+細(xì)胞，體外刺激，測(cè)定防衛(wèi)素分泌水平?？蛇x擇地，可以檢測(cè)樣品中防衛(wèi)素mRNA(或cDNA)的量，如α-防衛(wèi)素mRNA，確定其高于或低于某一量。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)一種或多種防衛(wèi)素的試劑盒。此外，所述試劑盒對(duì)于本發(fā)明的預(yù)后方法是有用的。所述試劑盒通常包含一種底物，含有用于捕獲一種或多種防衛(wèi)素的物質(zhì)，如衍生化或用抗防衛(wèi)素抗體可衍生化的微量滴定板或SELDI質(zhì)譜生物芯片探針；或帶有結(jié)合防衛(wèi)素的色譜表面的SELDI質(zhì)譜生物芯片探針(如，來(lái)自Ciphergen Biosystem公司的WCX或IMAC ProteinClip陣列，弗里蒙特，CA)。所述試劑盒也可包括第二標(biāo)記抗體，用于夾心免疫測(cè)定和/或指示，以檢測(cè)防衛(wèi)素，將檢測(cè)到的防衛(wèi)素量與可能的HIV感染狀態(tài)預(yù)后和/或AIDS發(fā)展相關(guān)聯(lián)。
對(duì)防衛(wèi)素抑制HIV復(fù)制的認(rèn)識(shí)為找尋調(diào)節(jié)防衛(wèi)素活性的化合物提供了指導(dǎo)。因此，本發(fā)明提供了藥物篩選試驗(yàn)。在這些試驗(yàn)中，將可生成防衛(wèi)素的細(xì)胞(如CD8+細(xì)胞)與被測(cè)化合物接觸，檢測(cè)該化合物對(duì)防衛(wèi)素的mRNA、多肽生成的影響或生物活性的變化。通過該方法被發(fā)現(xiàn)的藥物可作為藥物施用，用于預(yù)防或治療HIV感染。
本發(fā)明還提供了檢測(cè)可結(jié)合到防衛(wèi)素的多肽的方法。所述多肽可以是涉及防衛(wèi)素活性機(jī)制的配體。所述方法包括將細(xì)胞與防衛(wèi)素接觸。然后，將來(lái)自細(xì)胞的防衛(wèi)素以及結(jié)合到其上的多肽捕獲在固相上，并進(jìn)行檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，防衛(wèi)素被固定在固相上，將細(xì)胞內(nèi)容物與之接觸，接著進(jìn)行檢測(cè)。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含一種防衛(wèi)素多肽和一種藥學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述防衛(wèi)素是一種α-防衛(wèi)素多肽，選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2以及α-防衛(wèi)素3。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含一種防衛(wèi)素多肽和一種藥學(xué)上可接受的載體，其中，所述組合物包含至少兩種α-防衛(wèi)素多肽，選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2以及α-防衛(wèi)素3。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含一種防衛(wèi)素多肽和一種藥學(xué)上可接受的載體，其中，所述組合物包含至少兩種α-防衛(wèi)素，選自α-防衛(wèi)素1和α-防衛(wèi)素2。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含一種防衛(wèi)素多肽和一種藥學(xué)上可接受的載體，其中，所述組合物是一種α-防衛(wèi)素多肽，并且所述組合物包含α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2以及α-防衛(wèi)素3。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種在人體內(nèi)治療HIV感染的方法。所述方法包括給予人體一種防衛(wèi)素多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述防衛(wèi)素多肽是一種α-防衛(wèi)素多肽，選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2以及α-防衛(wèi)素3。在第二個(gè)實(shí)施方案中，治療HIV感染的方法還包含施用第二種α-防衛(wèi)素多肽。所述第二種α-防衛(wèi)素多肽選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2以及α-防衛(wèi)素3。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種在人體內(nèi)治療HIV感染的方法，其中，所述方法包括給予人體治療有效量的α-防衛(wèi)素1和α-防衛(wèi)素2。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種方法，包含向HIV感染高危個(gè)體施用預(yù)防量的防衛(wèi)素多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述防衛(wèi)素多肽是一種α-防衛(wèi)素多肽，選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2以及α-防衛(wèi)素3。在第二個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包含向HIV感染高危個(gè)體施用第二種α-防衛(wèi)素多肽。所述α-防衛(wèi)素多肽選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2以及α-防衛(wèi)素3。在第三個(gè)實(shí)施方案中，所述α-防衛(wèi)素多肽是α-防衛(wèi)素1和α-防衛(wèi)素2。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種在正在培養(yǎng)的CD4+細(xì)胞中抑制HIV感染的方法。所述方法包括將所述細(xì)胞與一種防衛(wèi)素多肽接觸的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述防衛(wèi)素多肽是一種α-防衛(wèi)素多肽，選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2以及α-防衛(wèi)素3。在第二個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包含將細(xì)胞與第二種α-防衛(wèi)素多肽接觸，所述α-防衛(wèi)素選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2以及α-防衛(wèi)素3。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種組合物，在一種藥學(xué)上可接受的載體中包含一種編碼第一防衛(wèi)素多肽的第一核酸。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種組合物，在一種藥學(xué)上可接受的載體中包含一種編碼第一防衛(wèi)素多肽的第一核酸，以及一種編碼第二防衛(wèi)素多肽的第二核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二防衛(wèi)素多肽選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2以及α-防衛(wèi)素3。在第二個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二防衛(wèi)素多肽是α-防衛(wèi)素1和α-防衛(wèi)素2。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種在人體內(nèi)抑制HIV感染的方法，包含用一種包含編碼防衛(wèi)素多肽核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種在人體內(nèi)抑制HIV感染的方法，包含用一種包含編碼防衛(wèi)素多肽核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其中，所述的防衛(wèi)素多肽是一種α-防衛(wèi)素多肽，選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2以及α-防衛(wèi)素3。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是肌細(xì)胞。在第二個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是AC133+或CD34+祖細(xì)胞。在第三個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是AC133+或CD34+祖細(xì)胞，且轉(zhuǎn)染先體外后體內(nèi)進(jìn)行。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種在人體內(nèi)抑制HIV感染的方法，包含用一種包含編碼防衛(wèi)素多肽核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其中，所述核酸包含一種可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，操作性地連接到所述編碼防衛(wèi)素的核苷酸序列上。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種測(cè)定個(gè)體HIV狀態(tài)的方法。所述方法包括檢測(cè)來(lái)自所述個(gè)體的樣品中的α-防衛(wèi)素的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包含將防衛(wèi)素的量與至少一種其它指標(biāo)相關(guān)聯(lián)，所述指標(biāo)包括HIV感染狀態(tài)下的CD8+細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)、HIV病毒負(fù)載、總T細(xì)胞計(jì)數(shù)。在第二個(gè)實(shí)施方案中，所述α-防衛(wèi)素通ELISA或質(zhì)譜法(如MALDI或SELDI)來(lái)檢測(cè)。在第三個(gè)實(shí)施方案中，所述α-防衛(wèi)素選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2以及α-防衛(wèi)素3。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種測(cè)定個(gè)體HIV狀態(tài)的方法。所述方法包括檢測(cè)來(lái)自所述個(gè)體的樣品中的α-防衛(wèi)素mRNA的量，并將該量與HIV感染狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述α-防衛(wèi)素mRNA選自α-防衛(wèi)素1mRNA、α-防衛(wèi)素2mRNA以及α-防衛(wèi)素3mRNA。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于測(cè)定一種化合物是否在細(xì)胞中調(diào)節(jié)α-防衛(wèi)素活性方法。所述方法包括將一種可生成α-防衛(wèi)素的細(xì)胞與所述化合物接觸，測(cè)定所述化合物對(duì)于α-防衛(wèi)素活性的功能性影響。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞選自嗜中性粒細(xì)胞、CD8+細(xì)胞和上皮細(xì)胞。在第二個(gè)實(shí)施方案中，通過測(cè)定防衛(wèi)素表達(dá)水平、細(xì)胞增殖或HIV復(fù)制來(lái)確定所述的功能性影響。在第三個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物是一種小型有機(jī)分子。在第四個(gè)實(shí)施方案中，所述α-防衛(wèi)素選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2以及α-防衛(wèi)素3。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種抑制HIV感染的方法，包含給予人體一種可在細(xì)胞中激活防衛(wèi)素活性的化合物，所述細(xì)胞如CD8+細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物通過這里所描述的方法來(lái)鑒定，以確定一種化合物是否能夠在細(xì)胞中調(diào)節(jié)α-防衛(wèi)素的活性。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種方法，包含將細(xì)胞與α-防衛(wèi)素接觸，將固定的抗α-防衛(wèi)素抗體與細(xì)胞溶解產(chǎn)物接觸，由此，來(lái)自細(xì)胞的α-防衛(wèi)素被結(jié)合到固相上，并檢測(cè)結(jié)合到固定的α-防衛(wèi)素上的蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是CD4+細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、HOS細(xì)胞或2B4細(xì)胞。在第二個(gè)實(shí)施方案中，所述α-防衛(wèi)素多肽選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2以及α-防衛(wèi)素3。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種方法，包含將細(xì)胞與α-防衛(wèi)素接觸，將固定的抗α-防衛(wèi)素抗體與細(xì)胞溶解產(chǎn)物接觸，由此，結(jié)合到α-防衛(wèi)素的蛋白被捕獲，并檢測(cè)結(jié)合到固定的α-防衛(wèi)素的蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是CD4+細(xì)胞、HeLa細(xì)胞或HOS細(xì)胞。在第二個(gè)實(shí)施方案中，所述α-防衛(wèi)素多肽選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2以及α-防衛(wèi)素3。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒。所述試劑盒包含一種底物，其中含有可結(jié)合抗體的物質(zhì)；一種抗α-防衛(wèi)素多肽的抗體；以及將在患者樣品中測(cè)得的α-防衛(wèi)素的量與AIDS的預(yù)后相關(guān)聯(lián)的指導(dǎo)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述底物是一種質(zhì)譜探針。在第二個(gè)實(shí)施方案中，所述底物是一種微量滴定板。在第三個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含一種第二抗體，可特異性抗α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2和α-防衛(wèi)素3。在第四個(gè)實(shí)施方案中，所述第二抗體是被標(biāo)記的。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了另一種試劑盒。所述試劑盒包含一種可結(jié)合α-防衛(wèi)素多肽的底物，以及將在患者樣品中測(cè)得的α-防衛(wèi)素的量與AIDS的預(yù)后相關(guān)聯(lián)的指導(dǎo)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了另一種試劑盒，所述試劑盒包含可特異性結(jié)合到一種α-防衛(wèi)素的第一抗體，以及可特異性結(jié)合到α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2或α-防衛(wèi)素3的第二抗體。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種α-防衛(wèi)素融合蛋白，包含第一α-防衛(wèi)素多肽部分以及可結(jié)合CD4+細(xì)胞的第二部分。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種α-防衛(wèi)素融合蛋白，包含第一α-防衛(wèi)素多肽部分以及第二信號(hào)肽部分(如TPA信號(hào)肽)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種包含編碼α-防衛(wèi)素融合蛋白的核苷酸序列的核酸，所述融合蛋白包含第一α-防衛(wèi)素部分以及第二信號(hào)肽部分(如TPA信號(hào)肽)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種α-防衛(wèi)素融合蛋白，包含第一α-防衛(wèi)素多肽部分以及能提高體內(nèi)穩(wěn)定性或生物利用度的第二部分。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含一種PEG化的α-防衛(wèi)素多肽和一種藥學(xué)上可接受的載體。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種α-防衛(wèi)素，包含可刪除蛋白水解切割位點(diǎn)的氨基酸取代，或可提高防衛(wèi)素生物利用度和/或生物活性的氨基酸取代。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種提高內(nèi)源性α-防衛(wèi)素生成的方法，包含給予一種可激活CD8+細(xì)胞的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含抗CD3和其它T細(xì)胞活化劑。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種方法，包括先體外后體內(nèi)擴(kuò)展CD8+細(xì)胞，檢測(cè)由CD8+細(xì)胞生成的α-防衛(wèi)素，將所述CD8+細(xì)胞給予HLA匹配人群。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種方法，包含將一種疫苗以及一種α-防衛(wèi)素多肽或一種編碼α-防衛(wèi)素的核酸給予人體。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含一種疫苗以及一種α-防衛(wèi)素多肽或一種編碼α-防衛(wèi)素的核酸。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含一種α-防衛(wèi)素和一種第二治療劑或試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二治療劑被用于預(yù)防或治療HIV感染。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二治療劑被用于治療與HIV感染相關(guān)的機(jī)會(huì)感染。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二治療劑是蛋白酶抑制劑、非核苷反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、核苷反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、融合抑制劑、抗逆轉(zhuǎn)錄病毒核苷、進(jìn)入抑制劑、或任何其它對(duì)于抑制或治療HIV感染有效的抗病毒劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二治療劑選自齊多夫定、地達(dá)諾新、司他夫定、干擾素、拉米呋啶、阿德福韋、奈韋拉平、地拉韋啶(delaviridine)、洛韋胺、沙奎那韋、茚地那韋、AZT、T20、T22以及T2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的第二治療劑是一種抗生素或無(wú)環(huán)鳥苷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的α-防衛(wèi)素選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2以及α-防衛(wèi)素3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含兩種或多種α-防衛(wèi)素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的α-防衛(wèi)素是α-防衛(wèi)素1、2或3蛋白，編碼所述α-防衛(wèi)素蛋白的核苷酸序列，融合蛋白，或編碼所述融合蛋白的核苷酸序列。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在人體內(nèi)治療或預(yù)防HIV感染的方法，包含給予人體一種防衛(wèi)素多肽以及一種第二治療劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二治療劑被應(yīng)用于預(yù)防或治療HIV感染。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二治療劑被應(yīng)用于治療HIV感染相關(guān)的機(jī)會(huì)感染。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二治療劑是蛋白酶抑制劑、非核苷反轉(zhuǎn)錄抑制劑、核苷反轉(zhuǎn)錄抑制劑、融合抑制劑、抗逆轉(zhuǎn)錄病毒核苷、進(jìn)入抑制劑、或任何其它對(duì)于抑制或治療HIV感染有效的抗病毒劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二抑制劑選自齊多夫定、地達(dá)諾新、司他夫定、干擾素、拉米呋啶、阿德福韋、奈韋拉平、地拉韋啶(delaviridine)、洛韋胺、沙奎那韋、茚地那韋、AZT、T20、T22以及T2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的第二治療劑是一種抗生素或無(wú)環(huán)鳥苷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的α-防衛(wèi)素選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2以及α-防衛(wèi)素3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含兩種或多種α-防衛(wèi)素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的α-防衛(wèi)素是α-防衛(wèi)素蛋白、編碼所述α-防衛(wèi)素蛋白的核苷酸序列、融合蛋白、或編碼所述融合蛋白的核苷酸序列。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種在正在培養(yǎng)的CD4+細(xì)胞中抑制HIV感染的方法，包含將所述細(xì)胞與一種防衛(wèi)素多肽以及一種第二治療劑或其它治療劑的組合接觸的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療劑或試劑被應(yīng)用于治療或預(yù)防HIV感染，在第二個(gè)實(shí)施方案中，所述治療劑選自蛋白酶抑制劑、非核苷反轉(zhuǎn)錄抑制劑、融合抑制劑、核苷反轉(zhuǎn)錄抑制劑、抗逆轉(zhuǎn)錄病毒核苷、進(jìn)入抑制劑、或任何其它對(duì)于抑制或治療HIV感染有效的抗病毒劑。在第三個(gè)實(shí)施方案中，所述治療劑選自齊多夫定、地達(dá)諾新、司他夫定、干擾素、拉米呋啶、阿德福韋、奈韋拉平、地拉韋啶(delaviridine)、洛韋胺、沙奎那韋、茚地那韋、AZT、T20、T22以及T2。
附圖簡(jiǎn)述

圖1來(lái)自受激和非受激的CD8T細(xì)胞的培養(yǎng)上清代表蛋白質(zhì)譜圖，所述細(xì)胞獲自兩位LTNR，一位正常個(gè)體以及一位進(jìn)展者。在刺激后蛋白峰的上調(diào)是明顯的，并且它們的質(zhì)量是標(biāo)示的。
圖22(a)應(yīng)用包被了抗α-防衛(wèi)素-1、2、3的抗體的珠，根據(jù)蛋白峰識(shí)別出人α-防衛(wèi)素2、1和3的分子質(zhì)量為3,371.9Da、3,342.5Da、以及3,486.5Da。2(b)應(yīng)用非串聯(lián)質(zhì)譜儀，在胰酶消化后，對(duì)獨(dú)特的1060.50Da的肽片斷進(jìn)行測(cè)序(上右)。觀察到由撞擊誘導(dǎo)的1060.50Da母離子的解離。NCBI和SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)的ProteinProspector MS-Tag檢索顯示，來(lái)自α-防衛(wèi)素-1、2、3的肽片斷YGTCIYQGR(突出顯示在上左)最匹配1060.50Da的母離子，具有49的Probability Based MowseScore(Matrix Science的Mascot軟件)。接下來(lái)的最接近匹配(β-半乳糖苷酶前體，76，091Da)的分?jǐn)?shù)卻只有17。在該分析中，Mowse分?jǐn)?shù)超過38可認(rèn)為鑒定陽(yáng)性或非常同源。
圖3(a)在從LTNP-3和LTNP-5培養(yǎng)上清中消除α-防衛(wèi)素1、2和3之前(固態(tài))和之后(孵育后)，抗X4和R5 HIV-1的抗病毒活性圖。病毒分離物的名稱如圖顯示，HIV-1的基因型顯示在圓括號(hào)中。誤差條圖指明兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。3(b)在不斷增加抗α-防衛(wèi)素1、2和3(左圖)抗體的量、或抗α-防衛(wèi)素1、2和3抗體與抗β-趨化因子抗體組合物(右圖)的量的情況下，來(lái)自LTNP-3和LTNP-5的受激CD8T細(xì)胞的培養(yǎng)上清的抗病毒活性。
圖4商業(yè)可用的α-防衛(wèi)素1和2肽(左圖)和純化的α-防衛(wèi)素1、2和3(右圖)的抗HIV-1活性。每張圖中位于右下角的非連接符號(hào)表示當(dāng)也加入抗α-防衛(wèi)素單克隆抗體時(shí)(25μg)，最高濃度的α-防衛(wèi)素的抗病毒活性。
圖5在人嗜中性粒細(xì)胞以及非受激和受激的CD8T淋巴細(xì)胞中，α-防衛(wèi)素1、2和3的免疫熒光印跡。按照所描述的步驟進(jìn)行(33)，α-防衛(wèi)素標(biāo)記為綠色，CD8蛋白為紅色，細(xì)胞核為藍(lán)色。
圖6用二硫蘇糖醇(DTT)還原前和還原后，分子質(zhì)量/電荷的變化。
圖7α-防衛(wèi)素1和2商用制劑與來(lái)自正常個(gè)體-2的受激CD8 T細(xì)胞上清的α-防衛(wèi)素的質(zhì)譜圖的比較。
圖8從正常人嗜中性粒細(xì)胞中純化得到的α-防衛(wèi)素1、2和3實(shí)際上與那些從受激的CD8T細(xì)胞釋放的α-防衛(wèi)素是無(wú)法區(qū)分的。
圖9在受激后的0、1和2天，表達(dá)α-防衛(wèi)素的αβCD8 T細(xì)胞的數(shù)量。Y軸顯示測(cè)得的事件數(shù)目。
圖10已知的來(lái)自人、小鼠、大鼠、豚鼠和兔的α-防衛(wèi)素的比對(duì)。
發(fā)明詳述A.縱覽本發(fā)明提供了新的組合物、測(cè)定法、試劑盒，以及預(yù)防、治療、診斷和預(yù)測(cè)病毒感染(如HIV感染)、殺死病毒感染細(xì)胞(如被HIV感染的細(xì)胞)，以及一般地，抑制病毒特別是HIV病毒的復(fù)制的方法。本發(fā)明部分基于驚人地發(fā)現(xiàn)了天然的防衛(wèi)素在感染HIV疾病的個(gè)體中以高的水平存在，所述個(gè)體的疾病狀態(tài)沒有進(jìn)展到AIDS，盡管感染10年但與感染HIV并具有AIDS的人不同，并且天然存在的防衛(wèi)素在那些雖然長(zhǎng)期感染但沒有完全發(fā)展為AIDS的個(gè)體中可阻止HIV的復(fù)制。因此，本發(fā)明部分基于驚人地發(fā)現(xiàn)無(wú)論通過外源給藥的還是通過內(nèi)源生成，當(dāng)防衛(wèi)素或其片斷的水平在個(gè)體中提高時(shí)，可抑制HIV感染，殺死被HIV感染的細(xì)胞和/或阻止HIV感染。
本發(fā)明提供了在個(gè)體中提高外源性防衛(wèi)素水平的方法，通過向HIV感染者或HIV感染高危個(gè)體施用治療化合物，如防衛(wèi)素蛋白(合成的、重組的或天然存在的)、防衛(wèi)素核酸，以及包含一種或多種防衛(wèi)素的藥物組合物。
本發(fā)明還提供了抑制HIV感染或復(fù)制的方法，通過提供提高內(nèi)源防衛(wèi)素活性的各種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。比如，本發(fā)明提供了用于識(shí)別防衛(wèi)素活性的調(diào)節(jié)劑的試驗(yàn)。所述防衛(wèi)素活性的調(diào)節(jié)劑對(duì)于在體內(nèi)提高內(nèi)源防衛(wèi)素以抑制HIV感染和復(fù)制是有用的。
本發(fā)明還提供了確定感染HIV個(gè)體的預(yù)后的方法。通過檢測(cè)個(gè)體中內(nèi)源防衛(wèi)素的水平(如嗜中性粒細(xì)胞中的防衛(wèi)素水平)，可對(duì)個(gè)體中的HIV感染是否進(jìn)展到AIDS作出結(jié)論。所述的結(jié)論有助于給予藥物、治療策略以及治療期限的選擇。
本發(fā)明還提供了包含一種防衛(wèi)素多肽和一種藥學(xué)上可接受的載體的組合物，所述藥學(xué)上可接受的載體用于遞送到感染HIV或HIV感染高危的個(gè)體。所述組合物可應(yīng)用于在個(gè)體中治療HIV感染。
本發(fā)明還提供了用于診斷和預(yù)后個(gè)體中HIV感染以及AIDS發(fā)展進(jìn)程的試劑盒。
B.定義在這里，短語(yǔ)“HIV感染相關(guān)的病癥”或“HIV感染相關(guān)的疾病”是指一種具有HIV感染的特征的疾病狀態(tài)。所述的病癥與HIV感染相關(guān)，包括但不限于AIDS；Kaposi’s肉瘤；機(jī)會(huì)感染，如那些由卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)和結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的感染；口腔病害，包括鵝口瘡、黏膜白斑病和口腔潰瘍；非特異淋巴結(jié)?。粠畎捳?；血小板減少癥；非細(xì)菌性腦膜炎；神經(jīng)疾病，如弓形體病、隱球菌病、CMV感染、原發(fā)性CNS淋巴瘤和HIV相關(guān)的癡呆；外周神經(jīng)病發(fā)作；以及肌病。
短語(yǔ)“長(zhǎng)期非進(jìn)展者”是指已經(jīng)感染HIV大約10年或更久的個(gè)體，他們具有正常和穩(wěn)定水平的CD4+T細(xì)胞，并且他們沒有用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法治療過。
如果某人屬于一個(gè)HIV感染危險(xiǎn)性高于總體人群感染危險(xiǎn)性的團(tuán)體，則其屬于HIV感染“高?！闭?。
在測(cè)定可調(diào)節(jié)防衛(wèi)素多肽活性的化合物的試驗(yàn)中，短語(yǔ)“功能性影響”包括確定一個(gè)間接或直接在防衛(wèi)素影響下的參數(shù)，如一種表型或化學(xué)的影響，例如提高或降低HIV感染、HIV復(fù)制的能力，通過HIV感染細(xì)胞顯示HIV標(biāo)記，或細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞，特別是CD4+淋巴細(xì)胞)的增殖、凋亡；或如一種物理影響，例如配體結(jié)合或配體結(jié)合抑制。因而，一種功能性影響包括配體結(jié)合活性、細(xì)胞增殖能力、HIV感染細(xì)胞能力和表達(dá)病毒蛋白能力、凋亡、以及酶活性。“功能性影響”包括體外(in vitro)、體內(nèi)(in vivo)以及先體外后體內(nèi)(ex vivo)活性。
短語(yǔ)“確定功能性影響”是指試驗(yàn)一種化合物，看其提高還是降低某個(gè)間接或直接在防衛(wèi)素蛋白影響下的參數(shù)，如測(cè)定物理和化學(xué)或表型影響。所述功能性影響可以通過任何本技術(shù)領(lǐng)域人員已知的技術(shù)進(jìn)行測(cè)定，如測(cè)定分光特性的改變(如熒光、吸光率、折射率)；測(cè)定流體動(dòng)力學(xué)(如外形)；色譜分析；或蛋白的溶解特性；測(cè)定可誘導(dǎo)的標(biāo)記或蛋白的轉(zhuǎn)錄活性；測(cè)定結(jié)合活性或結(jié)合試驗(yàn)，如結(jié)合到抗體的能力；測(cè)定配體或底物結(jié)合活性的改變；測(cè)定細(xì)胞增殖；測(cè)定凋亡；測(cè)定病毒蛋白表達(dá)；測(cè)定病毒復(fù)制；測(cè)定在血清中的病毒滴度或病毒RNA拷貝數(shù)；測(cè)定防衛(wèi)素的蛋白水平或防衛(wèi)素相關(guān)序列的變化；測(cè)定RNA穩(wěn)定性；下游或報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)(CAT，熒光素酶，β-gal，GFP，以及類似物)的識(shí)別，如可通過化學(xué)發(fā)光、熒光、比色反應(yīng)、抗體結(jié)合和可誘導(dǎo)標(biāo)記來(lái)進(jìn)行。
防衛(wèi)素多核苷酸和多肽序列的“抑制劑”、“活化劑”和“調(diào)節(jié)劑”用于指使用防衛(wèi)素多核苷酸和多肽序列進(jìn)行體外和體內(nèi)試驗(yàn)所鑒定的活化、抑制或調(diào)節(jié)分子。抑制劑是那些部分或全部與阻滯活性、降低、阻止、延遲活性、失活、脫敏、下調(diào)活性或下調(diào)防衛(wèi)素蛋白表達(dá)相關(guān)的化合物，如拮抗劑?；罨瘎┦悄切┨岣?、打開、活化、促進(jìn)、增強(qiáng)活性、敏化、激動(dòng)、上調(diào)防衛(wèi)素蛋白活性或防衛(wèi)素表達(dá)的化合物，如激動(dòng)劑。抑制劑、活化劑或調(diào)節(jié)劑也包括遺傳學(xué)修飾形式的防衛(wèi)素蛋白，如改變活性的形式，以及天然存在和合成的配體、拮抗劑、激動(dòng)劑、抗體、肽、環(huán)肽、核酸、反義分子、核酶、小型化學(xué)分子以及它們的類似物。所述用于抑制劑和活化劑的試驗(yàn)包括如在體外、在細(xì)胞中或細(xì)胞膜上表達(dá)防衛(wèi)素蛋白，應(yīng)用推定的調(diào)節(jié)劑化合物，然后確定關(guān)于活性的功能性影響，如上所述。
經(jīng)潛在的活化劑、抑制劑或調(diào)節(jié)劑處理的包含防衛(wèi)素蛋白的樣品或試樣被用于與不含活化劑、抑制劑或調(diào)節(jié)劑的對(duì)照樣品作比較，檢測(cè)抑制程度。給予對(duì)照樣品(沒有用抑制劑處理)一個(gè)相對(duì)的蛋白活性值100％。相對(duì)于對(duì)照，當(dāng)所述活性值約為80％、特別為50％、更特別為25-0％時(shí)，防衛(wèi)素的抑制成立。相對(duì)于對(duì)照(沒有用抑制劑處理)，當(dāng)所述活性值為110％，特別為150％，更特別為200-500％(即比對(duì)照高2倍至5倍)，更特別為1000-3000％或更高時(shí)，防衛(wèi)素的活化成立。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“測(cè)試化合物”、“候選藥物”或“調(diào)節(jié)劑”描述任何分子，天然存在的或合成的，如蛋白、寡肽(如長(zhǎng)度約5至25個(gè)氨基酸，優(yōu)選長(zhǎng)度約10至20個(gè)氨基酸或12至18個(gè)氨基酸，更優(yōu)選長(zhǎng)度為12、15或18個(gè)氨基酸)、小型有機(jī)分子、多糖、脂類、脂肪酸、多核苷酸、寡核苷酸等?？梢詼y(cè)定所述分子直接或間接調(diào)節(jié)病毒感染(如HIV感染)的能力。所述測(cè)試化合物可以是測(cè)試化合物文庫(kù)的形式，如組合的或隨機(jī)的文庫(kù)，提供足夠的多樣性數(shù)據(jù)?？扇芜x地，測(cè)試化合物可連接到一種融合配偶上，如靶向化合物、拯救(rescue)化合物、二聚化合物、穩(wěn)定化化合物、定址化合物以及其它功能性結(jié)構(gòu)。常規(guī)地，具有有用特性的新的化學(xué)實(shí)體通過鑒定具有某些所需特性或活性(如抑制活性)的測(cè)試化合物(稱為“先導(dǎo)化合物”)、創(chuàng)造先導(dǎo)化合物的變體、以及評(píng)估所述變體化合物的特性和活性而產(chǎn)生。一般可將高通量篩選(HTS)的方法應(yīng)用于這種分析。
“小型有機(jī)分子”是指一種天然存在或合成的有機(jī)分子，其分子量高于約50道爾頓低于約2500道爾頓，優(yōu)選低于2000道爾頓，更優(yōu)選在約100至約1000道爾頓之間，更優(yōu)選在約200至約500道爾頓之間。這里所描述的“小型有機(jī)分子”與肽是不同的。
“生物樣品”包括組織部件如活組織部件和死組織部件樣品，以及為組織學(xué)目的而提取的冰凍樣品。所述樣品包括血液、唾液、組織、培養(yǎng)細(xì)胞如初級(jí)培養(yǎng)、外植體、轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、糞便、尿液等。一種生物樣品通常獲自真核有機(jī)體，最優(yōu)選哺乳動(dòng)物如黑猩猩或人；牛；狗；貓；嚙齒動(dòng)物如豚鼠、大鼠、小鼠；兔；或鳥類；爬蟲類；或魚。
在兩條或多條核酸或多肽序列中，術(shù)語(yǔ)“相同的”或百分?jǐn)?shù)“相同的”是指兩條或多條序列或亞序列是相同的或具有一定百分比的氨基酸殘基或核苷酸是相同的(即當(dāng)在一個(gè)比較窗口或指定區(qū)域?qū)Ρ燃芭帕凶畲笠恢滦詴r(shí)，在某一特定區(qū)域(如編碼這里所描述的防衛(wèi)素的核苷酸序列，或這里所描述的防衛(wèi)素的氨基酸序列)約60％相同，優(yōu)選65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)，應(yīng)用BLAST或BLAST2.0序列比較算法進(jìn)行對(duì)比測(cè)定，默認(rèn)參數(shù)將在下文描述，或通過人工排列和目視觀察(參見如NCBI網(wǎng)站站點(diǎn))進(jìn)行。然后，所述序列可稱為“實(shí)質(zhì)上相同的”。所述定義也包括具有缺失子和/或插入子的序列，以及那些帶有取代物的序列。如下文所要描述的，優(yōu)選的算法可以計(jì)算出缺口及其類似。優(yōu)選地，相同存在于一段長(zhǎng)度至少約25個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域，或更優(yōu)選地，相同存在于一段長(zhǎng)度至少約50-100氨基酸或核苷酸的區(qū)域。
在序列比較時(shí)，一般用一條序列作為參照序列，將測(cè)定序列與之比較。當(dāng)使用一種序列比較算法時(shí)，測(cè)定和參考序列被輸入到一個(gè)計(jì)算機(jī)，接著指定同位體，在必要時(shí)，需要指定序列算法程序參數(shù)。優(yōu)選地，可以應(yīng)用默認(rèn)的程序參數(shù)，或指定選擇性參數(shù)。然后，基于程序參數(shù)，所述的序列比較算法可計(jì)算出測(cè)定序列與參考序列相同的百分?jǐn)?shù)。
這里使用的“比較窗口”包括當(dāng)兩條序列被最佳排列后，參照任一數(shù)目的臨近位置，測(cè)定序列與參考序列相比具有相同數(shù)目的臨近位置，所述數(shù)目選自20-600，通常約50-約200，更常見約100-約150。用于比較的序列的排列方法是本領(lǐng)域已知的。最佳的序列排列是可以導(dǎo)出的，如通過Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.，2482(1981)的局部同源算法；通過Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48443(1970)的同源排列算法；通過Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，852444(1988)的檢索相似點(diǎn)方法；通過這些算法的計(jì)算機(jī)化執(zhí)行(Wisconsin Genetics SoftwarePackage中的GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science，Madison博士，WI)，或通過人工排列和目視觀察(參見如Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等編，1995增刊))。
一種適于確定序列相同百分?jǐn)?shù)和序列相似性的優(yōu)選的算法是BLAST和BLAST2.0算法，其分別描述在Altschul等，Nuc.Acids Res.，253389-3402(1977)以及Altschul等，J.Mol.Biol.，215403-410(1990)。BLAST和BLAST2.0以及這里所描述的參數(shù)被用于確定本發(fā)明的核酸和蛋白的序列相同百分?jǐn)?shù)。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件是公眾通過國(guó)家生物信息中心(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)得到的。所述算法包括通過鑒定待查詢序列中的短詞長(zhǎng)度W，初次鑒定高分?jǐn)?shù)序列對(duì)(HSPs)，當(dāng)與一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中一個(gè)相同長(zhǎng)度的詞排列時(shí)，其匹配或滿足一些陽(yáng)性值低限分?jǐn)?shù)T。T作為臨近詞分?jǐn)?shù)低限(Altschul等，同上)。這些初始臨近詞采樣數(shù)延伸入每一序列方向，直到累積排列分?jǐn)?shù)被提高。用于核苷酸序列的累積分?jǐn)?shù)使用參數(shù)M(一對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)勵(lì)分；總是＞1)以及N(不匹配殘基的處罰分，總是＜1)來(lái)計(jì)算。對(duì)于氨基酸序列，使用記分矩陣來(lái)計(jì)算累積分?jǐn)?shù)。當(dāng)累積排列分?jǐn)?shù)因數(shù)量X而從其最大可實(shí)現(xiàn)值下降、因一個(gè)或多個(gè)陰性分?jǐn)?shù)殘基排列的積累使累積分?jǐn)?shù)達(dá)到0或更低、或到達(dá)了每條序列的末尾時(shí)，在每一方向上詞采樣數(shù)的延伸停止。BLAST算法的參數(shù)W、T和X確定算法的敏感性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默認(rèn)的詞長(zhǎng)(W)為11，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4，并且兩條鏈相似。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默認(rèn)詞長(zhǎng)為3，期望值(E)為10，并且BLOSUM62記分矩陣(參見Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8910915(1989))排列(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝4，并且兩條鏈相似。
術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白”在這里可交替地用于指氨基酸殘基聚合體。所述術(shù)語(yǔ)也適用于一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為天然氨基酸人工化學(xué)模擬物的氨基酸聚合體，以及天然存在的氨基酸聚合體和非天然存在的氨基酸聚合體。
術(shù)語(yǔ)“氨基酸”是指天然存在和合成的氨基酸，以及具有與天然存在的氨基酸相同功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是那些通過遺傳密碼子編碼的，以及那些后來(lái)經(jīng)過修飾的氨基酸，如羥脯氨酸、γ-羧谷氨酸以及0-磷絲氨酸。氨基酸類似物是指與天然存在的氨基酸具有相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)，即具有一個(gè)α碳結(jié)合到氫、一個(gè)羧基基團(tuán)、一個(gè)氨基基團(tuán)以及一個(gè)R基團(tuán)的化合物，如高絲氨酸、正亮氨酸、亞砜蛋氨酸(methionine sulfoxide)、甲基锍蛋氨酸。所述類似物具有經(jīng)修飾的R基團(tuán)(如正亮氨酸)或經(jīng)修飾的肽骨架，但保留了與天然存在氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物是指化學(xué)化合物，其具有的結(jié)構(gòu)與氨基酸通常的化學(xué)結(jié)構(gòu)是不同的，但是其作用方式和功能與天然存在氨基酸相似。
這里氨基酸可使用通常已知的三字母表示法，也可采用依據(jù)IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的一字母表示法。同樣的，核苷酸可使用通常被人們所接受的單字母代碼。
“保守性改變的變體”同時(shí)適用于氨基酸和核苷酸序列。針對(duì)特定的核酸序列，保守性改變的變體是指那些編碼相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或不編碼氨基酸序列的核酸。由于基因代碼的簡(jiǎn)并性，很多功能性相同的核酸編碼任一給定的蛋白。比如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼丙氨酸。因而，在任何一個(gè)丙氨酸位置上具有一個(gè)指定的密碼子，該密碼子可以被任何其它相應(yīng)的密碼子取代，而不會(huì)改變所編碼的多肽。所述核酸變異是“沉默變異”，其是保守性改變變異的一種。這里每條編碼多肽的核酸序列也包括所述核酸的每條可能的沉默變異。技術(shù)人員可認(rèn)識(shí)到，核酸中的每個(gè)密碼子(除了AUG，其通常是編碼蛋氨酸的唯一密碼子；以及TGG，其通常是編碼色氨酸的唯一密碼子)可以被改變，而獲得功能性相同的分子。
因此，每個(gè)編碼多肽的核酸的沉默變異隱含在每條與表達(dá)產(chǎn)物相應(yīng)的序列中，而并非與實(shí)際的探針序列相應(yīng)。
至于氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可認(rèn)識(shí)到，核酸、肽、多肽或蛋白序列中獨(dú)特的取代、缺失或插入將變更、增加或刪除編碼序列中一個(gè)氨基酸或低百分率的氨基酸，當(dāng)用一個(gè)化學(xué)相似的氨基酸取代某個(gè)氨基酸，獲得的變更結(jié)果稱為“保守性改變變體”。提供了功能相似氨基酸的保守取代表格是本領(lǐng)域中公知的。所述保守性改變變體包括而不排除多態(tài)變體、種群同族體、以及等位基因。
以下八組中每組包含了互為保守取代物的氨基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天門冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)(參見如Creighton，Proteins(1984))。
大分子結(jié)構(gòu)如多肽結(jié)構(gòu)可以以不同水平的有機(jī)體的方式描述。如需全面討論有機(jī)體的結(jié)構(gòu)，可參見如Alberts等，Molecular Biology of the Cell(第三版，1994)，以及Cantor和Schimmel，Biophysical Chemistry Part IThe Conformation ofBiological Macromolecules(1980)?！耙患?jí)結(jié)構(gòu)”是指特定的肽的氨基酸序列?！岸?jí)結(jié)構(gòu)”是指在多肽中局部有規(guī)則的三維結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)通常被稱為區(qū)域，如酶區(qū)域、細(xì)胞外區(qū)域、跨膜區(qū)域、孔隙區(qū)域以及細(xì)胞質(zhì)尾部區(qū)域。區(qū)域是多肽的一部分，形成多肽上一個(gè)緊湊的單位，長(zhǎng)度一般為15至350個(gè)氨基酸。典型的區(qū)域包括具有酶活性的區(qū)域，如激酶區(qū)域。典型的區(qū)域由更少的有機(jī)體部分組成，如β-折疊和α-螺旋?！叭?jí)結(jié)構(gòu)”是指多肽單體完整的三維結(jié)構(gòu)?！八募?jí)結(jié)構(gòu)”是指由獨(dú)立的三維單位非共價(jià)結(jié)合形成的三維結(jié)構(gòu)。非均質(zhì)項(xiàng)也稱為能量項(xiàng)。
一種特定的核酸序列也隱含地包括“剪接變體”。類似地，由核酸編碼的特定蛋白隱含地包括任何由所述核酸的剪接變體所編碼的蛋白。如其名字所表示的，“剪接變體”是基因選擇性剪接的產(chǎn)物。在轉(zhuǎn)錄后，起始核酸轉(zhuǎn)錄子可被剪接，以使不同的(交替的)核酸剪接產(chǎn)物編碼不同的多肽。產(chǎn)生剪接變體的機(jī)制是不同的，但包括外顯子的交替剪接。通過通讀(read-through)轉(zhuǎn)錄衍生自同一核酸的變更的多肽也包含在本定義中。任何剪接反應(yīng)的產(chǎn)物，包括所述剪接產(chǎn)物的重組形式都包含在本定義中。
“標(biāo)記”或“可檢測(cè)的部分”是一種通過分光鏡、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、化學(xué)或其他物理手段可檢測(cè)到的組合物。比如，有用的標(biāo)記包括32P、熒光燃料、電子密度試劑、酶(如在ELISA中一般應(yīng)用的)、生物素、地高辛、或可檢測(cè)的半抗原和蛋白，如通過將一種放射標(biāo)記加入到肽或用于檢測(cè)與所述肽特異性反應(yīng)的抗體。
術(shù)語(yǔ)“重組體”當(dāng)被應(yīng)用于如細(xì)胞、核酸、蛋白或載體時(shí)，指通過導(dǎo)入異源核酸或蛋白或天然核酸或蛋白的變體而發(fā)生了改變，或所述細(xì)胞衍生自經(jīng)過前述改變的細(xì)胞。因而，重組細(xì)胞可表達(dá)天然形式的細(xì)胞(沒有重組)中沒有的基因，或可表達(dá)天然基因異常表達(dá)、低表達(dá)或不表達(dá)的基因。重組細(xì)胞也可表達(dá)天然基因，通過插入調(diào)節(jié)DNA序列起始這種表達(dá)，所述調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。
術(shù)語(yǔ)“異源的”當(dāng)被應(yīng)用于核酸相關(guān)的部分時(shí)，表示所述核酸包含兩種或多種在天然狀態(tài)下并非來(lái)自相同種屬的亞序列。例如，通常將兩條或多條來(lái)自不相關(guān)的基因的序列排列制成新的功能性核酸，重組地生產(chǎn)核酸，如啟動(dòng)子來(lái)自一個(gè)來(lái)源，而編碼區(qū)域來(lái)自另一個(gè)來(lái)源。類似地，異源蛋白表示所述蛋白包含兩種或多種在天然狀態(tài)下并非來(lái)自相同種屬的亞序列(如融合蛋白)。
短語(yǔ)“嚴(yán)緊雜交條件”是指在核酸的混合物中，所述條件下探針將雜交到其靶序列上而不會(huì)雜交到其他序列。嚴(yán)緊條件是序列依賴的，并且在不同環(huán)境下是不同的。越長(zhǎng)的序列在越高的溫度下進(jìn)行雜交。關(guān)于核酸雜交更詳盡的指導(dǎo)可參考Tijssen，生物化學(xué)和分子生物學(xué)疫術(shù)-核酸探針雜交，“雜交原理概觀以及核酸試驗(yàn)策略”(1993)。通常，嚴(yán)緊條件選擇在某一給定的離子強(qiáng)度pH下，低于特定序列的熱熔點(diǎn)(Tm)約5-10℃。Tm是一個(gè)溫度(在給定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)，該溫度使得均衡狀態(tài)下50％的探針互補(bǔ)地結(jié)合到靶序列上(靶序列過量存在，在Tm，均衡狀態(tài)下50％的探針被占用)。嚴(yán)緊條件也可通過加入破壞穩(wěn)定劑如甲酰胺來(lái)實(shí)現(xiàn)。為了選擇性或特異性雜交，陽(yáng)性信號(hào)經(jīng)過至少兩次背景雜交，優(yōu)選進(jìn)行10次背景雜交?？尚械膰?yán)緊雜交條件可以是50％甲酰胺，5×SSC，以及1％SDS，在42℃孵育，或5×SSC，1％SDS，在65℃孵育，在65℃、0.2×SSC以及0.1％SDS中洗滌。
如果它們編碼的多肽實(shí)質(zhì)上相同的話，在嚴(yán)緊條件下沒有相互雜交的核酸仍然是實(shí)質(zhì)上相同的。比如，這發(fā)生在當(dāng)一個(gè)拷貝的核酸利用遺傳代碼所允許的最大密碼子簡(jiǎn)并性被創(chuàng)造出來(lái)時(shí)。在這種情況下，所述核苷酸通常在中等嚴(yán)緊雜交條件下雜交?？尚械摹爸械葒?yán)緊雜交條件”包括在37℃，40％甲酰胺緩沖液，1M NaCl、1％SDS下雜交，在45℃、1×SSC下洗滌。陽(yáng)性雜交經(jīng)過至少兩次背景雜交。普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，選擇性的雜交和洗滌條件可被用于提供相似的嚴(yán)緊的條件。用于確定雜交參數(shù)的其它指導(dǎo)存在于大量的參考文獻(xiàn)，如分子生物學(xué)最新方案，Ausubel等編。
對(duì)于PCR，36℃的溫度典型用于低嚴(yán)緊擴(kuò)增，盡管根據(jù)引物長(zhǎng)度不同退火溫度可以在約32℃-48℃之間不等。對(duì)于高嚴(yán)緊PCR擴(kuò)增，典型的溫度為62℃，盡管高嚴(yán)緊退火溫度在約50℃-約65℃的范圍內(nèi)，根據(jù)引物長(zhǎng)度和特異性而不同。高和低嚴(yán)緊擴(kuò)增的典型的循環(huán)條件中包括在90℃-95℃退火30秒-2分鐘的階段，退火階段持續(xù)30秒-2分鐘，以及包括延伸階段，在72℃進(jìn)行1-2分鐘。低和高嚴(yán)緊擴(kuò)增反應(yīng)的方案和指導(dǎo)是公開的(如Innis等(1990)，PCR方案，及其方法和應(yīng)用指導(dǎo)，學(xué)術(shù)出版社，紐約)。
“抗體”是指包含來(lái)自免疫球蛋白基因或其片斷的框架區(qū)的多肽，特異性結(jié)合和識(shí)別抗原。公認(rèn)的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因，以及許多免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分為κ或λ。重鏈分為γ、μ、α、δ或ε，它們依次限定免疫球蛋白的類型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型地，抗體中抗原結(jié)合區(qū)域的結(jié)合特異性和親和力是最關(guān)鍵的。
一種可行的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單位包含一種四聚體。每個(gè)四聚體有兩對(duì)相同的多肽鏈，每對(duì)具有一條“輕”鏈(約25kD)以及一條“重”鏈(約50-70kD)。每條鏈的N末端具有一段約100-110或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)，主要用于抗原的識(shí)別。術(shù)語(yǔ)可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)分別指這些輕鏈和重鏈。
抗體的存在，如可作為完整的免疫球蛋白存在，或作為一些通過不同肽酶消化獲得的充分定性的片斷存在。因而，比如胃蛋白酶在鉸鏈區(qū)二硫鍵以下進(jìn)行消化，生成F(ab)’2，自身是輕鏈的Fab二聚體通過二硫鍵連接到VH-CH1。在溫和條件下斷裂位于鉸鏈區(qū)的二硫鍵，可將F(ab)’2降解，從而將F(ab)’2二聚體轉(zhuǎn)變?yōu)镕ab’單體。Fab’單體是帶有部分鉸鏈區(qū)的基本Fab(參見基礎(chǔ)免疫學(xué)(FundamentalImmunology)(Paul編，第三版，1993))。當(dāng)不同抗體片斷以完整的抗體被消化的方式限定時(shí)，技術(shù)人員應(yīng)理解，所述片斷可通過化學(xué)方法或重組DNA方法被重新合成。因此，這里應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)抗體也包括通過對(duì)完整抗體進(jìn)行修改、或通過重組DNA技術(shù)(如單鏈Fv)重新合成、或通過噬菌體展示文庫(kù)鑒定(參見如McCafferty等，Nature，348552-554(1990))所獲得的抗體片斷。
對(duì)于抗體(如重組的、單克隆的或多克隆的抗體)的制備，可應(yīng)用許多本領(lǐng)域已知的技術(shù)(參見如Kohler和Milstein，Nature 256495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today，472(1983)；Cole等，單克隆抗體和癌癥治療(MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy)，77-96頁(yè)，Alan R.Liss，Inc.(1985)；Coligan，Current Protocols in Immunology(1991)；Harlow和Lane，Antibodies，ALaboratory Manual(1988)；以及Goding，Monoclonal AntibodiesLPriciples andPractice(第二版，1986))。編碼抗體的重和輕鏈的基因可以從細(xì)胞中克隆出，如編碼一種單克隆抗體的基因可以從雜交瘤中克隆出并用于生成重組單克隆抗體。編碼單克隆抗體重和輕鏈的基因文庫(kù)也可從雜交瘤或漿細(xì)胞中獲得。重和輕鏈基因產(chǎn)物的隨機(jī)結(jié)合生成大量具有不同抗原特異性的抗體(參見如Kuby，免疫學(xué)(第三版，1997))。用于制備單鏈抗體或重組抗體的技術(shù)(美國(guó)專利號(hào)4,946,778，美國(guó)專利號(hào)4,816,567)適合于生產(chǎn)本發(fā)明的抗體多肽。同樣，轉(zhuǎn)基因小鼠或其它有機(jī)體(如其它哺乳動(dòng)物)可應(yīng)用于表達(dá)人源化或人抗體(參見如美國(guó)專利號(hào)5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；Marks等Bio/Technology，10779-783(1992)；Lonberg等，Nature，368856-859(1994)；Morrison，Nature368812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology，14845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology，14826(1996)；以及Lonberg和Huszar，Intern.Rev. Immunol.，1363-93(1995))?？蛇x擇地，噬菌體展示技術(shù)可以應(yīng)用于鑒定特異性結(jié)合到給定抗原的抗體以及異聚Fab片斷(參見如McCafferty等，Nature，348552-554(1990)；Marks等，Biotechnology，10779-783(1992))?？贵w也可制成雙特異的，即能夠識(shí)別兩種不同的抗原(參見如WO93/08829，Traunecker等，EMBOJ.，103655-3659(1991)；以及Suresh等，Methods in Enzymology，121210(1986))?？贵w也可以是異源共軛物，如兩個(gè)共價(jià)結(jié)合的抗體，或免疫毒素(參見如美國(guó)專利號(hào)4,676,980，WO91/00360；WO92/200373；以及EP 03089)。
人源化或靈長(zhǎng)類化(primatizing)非人抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。通常，人源化的抗體被引入一個(gè)或多個(gè)非人來(lái)源的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基經(jīng)常作為引入殘基，典型地被引入可變區(qū)域。人源化基本上可根據(jù)Winter及其同事的方法進(jìn)行(參見如Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-1536(1988)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992))，通過用嚙齒動(dòng)物CDRs或CDR取代人抗體的相應(yīng)序列。因此，所述人源化抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利號(hào)4,816,567)，其本質(zhì)上少于整個(gè)人可變區(qū)被來(lái)自非人種屬的相應(yīng)序列取代。實(shí)際上，人源化抗體是人抗體，其中一些CDR殘基以及可能一些FR殘基被來(lái)自相似位點(diǎn)的嚙齒動(dòng)物抗體殘基所取代。
“嵌合抗體”是一種抗體分子，其中(a)恒定區(qū)或其部分被變更、取代或交換，使抗原結(jié)合位點(diǎn)(可變區(qū))連接到不同或變更類型的恒定區(qū)，效應(yīng)物和/或核素，或完全不同的分子，給予嵌合抗體新的特性，如酶、毒素、激素、生長(zhǎng)因子、藥物等；或(b)可變區(qū)或其部分被變更、取代或交換，使可變區(qū)具有不同或變更的抗原特異性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體結(jié)合到“效應(yīng)物”結(jié)構(gòu)上。所速效應(yīng)物結(jié)構(gòu)可以是任何數(shù)量的分子，包括標(biāo)記結(jié)構(gòu)如放射活性標(biāo)記或熒光標(biāo)記，或可以是治療結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)方面所述抗體調(diào)節(jié)蛋白的活性。
當(dāng)涉及到蛋白或肽時(shí)，短語(yǔ)“特異性(或選擇性)結(jié)合”到抗體或“特異性(或選擇性)與…免疫反應(yīng)”指確定蛋白是否存在的結(jié)合反應(yīng)，經(jīng)常用在蛋白和其它生物制劑的異質(zhì)種群中。因而，在指定的免疫試驗(yàn)條件下，特異的抗體以至少兩倍于背景結(jié)合到一種特定蛋白，更典型地為多于10-100倍背景。在這種條件下，特異結(jié)合到抗體要求該抗體經(jīng)過針對(duì)特定蛋白的特異性選擇。比如，多克隆抗體提出了可結(jié)合防衛(wèi)素蛋白、多態(tài)變體、等位基因、直向同源物，以及保守性改變變體，或剪接變體、或其部分，可進(jìn)行選擇以獲得僅僅與防衛(wèi)素蛋白特異性免疫反應(yīng)而不與其它蛋白反應(yīng)的多克隆抗體。所述選擇可通過減除與其它分子交叉反應(yīng)的抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)。可采用許多免疫測(cè)定方式來(lái)選擇可與特定蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體。比如，常規(guī)可使用固相ELISA免疫測(cè)定來(lái)選擇可與蛋白發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體(參見如Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(1988)，描述了可用于確定特異免疫反應(yīng)的免疫測(cè)定形式及條件)。
“治療有效劑量”這里指一種劑量，能在給藥個(gè)體上產(chǎn)生所需的效應(yīng)。精確的劑量根據(jù)治療目的而定，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)用已有技術(shù)能夠確定的(參見如Lieberman，藥物劑量方式(1-3卷，1992)；Lloyd，藥物配制的技術(shù)、科學(xué)和工藝(1999)；以及Picker，劑量計(jì)算(1999))。在治療有效量的防衛(wèi)素用于作為抗HIV劑的情況下，治療有效量是一個(gè)量，所述量必須達(dá)到任何表示成功治療HIV感染的標(biāo)志，包括任何客觀的或主觀的標(biāo)準(zhǔn)，如HIV病毒抑制，HIV感染和AIDS癥狀消失，或患者身體或精神提高。比如，對(duì)于一些患者，治療有效量從1微克每千克體重至1克每千克體重。
C.防衛(wèi)素制備和純化1.防衛(wèi)素防衛(wèi)素是本領(lǐng)域已知的抗細(xì)菌和抗真菌劑(參見美國(guó)專利號(hào)5,242,902，其授權(quán)于Murphy等)。防衛(wèi)素已經(jīng)在許多動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)和描述，包括人、豚鼠、大鼠、兔、恒河猴以及小鼠，也存在于植物和昆蟲中。
有兩種結(jié)構(gòu)類型的哺乳動(dòng)物防衛(wèi)素α、β被用于本發(fā)明的目的。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“防衛(wèi)素”同時(shí)包括α和β防衛(wèi)素，特別是α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2和α-防衛(wèi)素3。編碼所述人防衛(wèi)素的基因位于單一的染色體區(qū)域，8p21-31(Kaiser等，Journalof Leukocyte Biology，68779-784(2000))。在結(jié)構(gòu)上，防衛(wèi)素是陽(yáng)性分子，具有空間上分離的疏水和帶電區(qū)域。已知的防衛(wèi)素都有一個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)，6個(gè)或8個(gè)半胱氨酸殘基形成分子內(nèi)半胱氨酸二硫鍵。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“α-防衛(wèi)素”涉及一種多肽，根據(jù)HIV病毒抑制試驗(yàn)(如這里描述的病毒抑制試驗(yàn))的測(cè)定，其生物學(xué)活性被判定為具有抗-HIV活性。α-防衛(wèi)素的長(zhǎng)度通常少于100個(gè)氨基酸，一般約25-35個(gè)氨基酸，其結(jié)構(gòu)中具有6個(gè)半胱氨酸，它們?cè)诜N間是保守的。(所述保守的結(jié)構(gòu)顯示在SEQ ID NO3至SEQ ID NO8中，也可參考Liu和Ganz，Genomics，43316-320(1997))；以及美國(guó)專利號(hào)4,705,777(Lehrer等))。α-防衛(wèi)素在生理pH時(shí)具有凈陽(yáng)電荷，通常這是帶陽(yáng)性電荷的精氨酸產(chǎn)生的。因此，術(shù)語(yǔ)“α-防衛(wèi)素”包含同時(shí)具有高半胱氨酸含量和高精氨酸含量的陽(yáng)性蛋白。在一些實(shí)施方案中，α-防衛(wèi)素被描述為具有六個(gè)半胱氨酸以及二至四個(gè)精氨酸，它們是基本保守的。半胱氨酸和精氨酸在整個(gè)寡肽上是分散的，使得半胱氨酸可進(jìn)行分子內(nèi)和分子外、共價(jià)和非共價(jià)的交聯(lián)，并且精氨酸在一個(gè)寬的pH范圍上給予整個(gè)分子陽(yáng)性電荷，使分子高度陽(yáng)性。例如，在一些實(shí)施方案中，α-防衛(wèi)素包含3個(gè)由半胱氨酸形成的二硫鍵。本發(fā)明的α-防衛(wèi)素也可形成一個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中包含一個(gè)β發(fā)夾構(gòu)象，比如形成一個(gè)β折疊，如三鏈反平行β折疊(Mandal等，J.Peptide Researsh，5995-104(2002))。術(shù)語(yǔ)“α-防衛(wèi)素”包含天然存在的α-防衛(wèi)素，即從天然來(lái)源分離的多肽；合成的α-防衛(wèi)素，即化學(xué)合成或通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的多肽，具有與天然存在的α-防衛(wèi)素相同的氨基酸序列；以及α-防衛(wèi)素類似物，即具有α-防衛(wèi)素的生物活性的多肽，具有的氨基酸序列并非是天然存在的。所述術(shù)語(yǔ)也包含α-防衛(wèi)素的前-前體蛋白形式，在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過處理形成具有生物學(xué)活性的形式。
α-防衛(wèi)素在體內(nèi)多處位置上有表達(dá)。然而，發(fā)現(xiàn)α-防衛(wèi)素1-4在多形核嗜中性粒細(xì)胞中有突出表達(dá)，而α-防衛(wèi)素5-6在小腸Paneth細(xì)胞的分泌顆粒中高度表達(dá)?，F(xiàn)在已經(jīng)鑒定出，人α-防衛(wèi)素1-3可由CD8+T細(xì)胞分泌。三種防衛(wèi)素，即α-防衛(wèi)素1-3的不同點(diǎn)僅僅在于N末端的一個(gè)氨基酸不同(Linzmeier等，F(xiàn)EBS LETT.，321(2-3)267-273(1993)；Palfree等，Mol.Endocrin.，7(2)199-205(1993)；Mallow等，J.Biol.Chem.，271(8)4038-4045(1996)；Mars等，J.Biol.Chem.，270(51)30371-30376；以及Quayle等，Am.J.Pathol.，152(5)1247-1258)。
在某些實(shí)施方案中，如前面所定義的，α-防衛(wèi)素包括多肽、前-前體蛋白、加工蛋白、多態(tài)變體、等位基因、以及突變體，它們與如這里所描述的由人α-防衛(wèi)素核酸所編碼的氨基酸序列(如α-防衛(wèi)素1-6，特別是α-防衛(wèi)素1-3)相比，具有高于60％的氨基酸序列相同性，如65％、70％、75％、80％、85％、90％，優(yōu)選地，具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％、或更高的氨基酸序列相同性，優(yōu)選地，在一個(gè)至少約15、20、25、30或更多個(gè)氨基酸的區(qū)域上具有相同性。
在其它一些實(shí)施方案中，如前面所描述的，α-防衛(wèi)素包括多肽、前-前體蛋白、加工蛋白、多態(tài)變體、等位基因、突變體、以及種間同源物，它們與如這里所描述的由來(lái)自人或其他動(dòng)物的α-防衛(wèi)素核酸所編碼的氨基酸序列(如兔防衛(wèi)素1-5，大鼠防衛(wèi)素1-4和豚鼠)相比，具有高于60％的氨基酸序列相同性，如65％、70％、75％、80％、85％、90％，優(yōu)選地，具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％、或更高的氨基酸序列相同性，優(yōu)選地，在一個(gè)至少約15、20、25、30或更多個(gè)氨基酸的區(qū)域上具有相同性。
在其他一些實(shí)施方案中，如前面所描述的，α-防衛(wèi)素包括多肽、前-前體蛋白、加工蛋白、多態(tài)變體、等位基因、突變體、以及種間同源物，它們與由在Paneth細(xì)胞中高度表達(dá)的α-防衛(wèi)素核酸所編碼的氨基酸序列(如人α-防衛(wèi)素5-6，小鼠α-防衛(wèi)素1、2和1α，以及兔α-防衛(wèi)素6)相比，具有高于60％的氨基酸序列相同性，如65％、70％、75％、80％、85％、90％，優(yōu)選地，具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％、或更高的氨基酸序列相同性，優(yōu)選地，在一個(gè)至少約15、20、25、30或更多個(gè)氨基酸的區(qū)域上具有相同性。
選擇性地，如前面所描述的，α-防衛(wèi)素包括具有不多于35個(gè)氨基酸的陽(yáng)性寡肽，具有以下通式的序列Z0-2-(aa1)a-(aa2)b-cys-aa4-cys-arg-aa7-aa8-aa9-cys-aa11-aa12-aa13-glu-arg-aa16-aa17-gly19-cys-aa21-aa22-aa23-gly-aa25-aa26-aa27-aa28-aa29-cys-cys-(aa32)c-w(SEQ ID NO1)，其中，Z(如果存在的話)化學(xué)偶聯(lián)到末端氨基上，它可以是具有1至6個(gè)碳原子的?；?具有0至1個(gè)氨基取代基)、具有1至3個(gè)碳原子的烷基、或是一個(gè)保護(hù)基團(tuán)；a、b和c是各自獨(dú)立的，它們可以是0或1；寫在aa上角的數(shù)字定義了所述氨基酸在多肽中的號(hào)碼，除了aa9，其傾向于存在兩個(gè)氨基酸，然后使所有后續(xù)的號(hào)碼均上升1號(hào)；氨基酸1、7、8、11、13、21、23、25、26和28是脂肪族氨基酸；氨基酸2、4、9、12、16、17、19、22、27、29和32可以是脂肪族氨基酸或芳香族氨基酸；w是末端羥基、氨基或是1至6個(gè)氨基酸的肽，在N末端具有一個(gè)堿性氨基酸。在一些實(shí)施方案中aa1是val或gly；aa2是val、ile、arg、ser、phe、ala或asp；aa4是ala、val、thr或tyr；aa7是arg、lys、gly或ile；aa8是ala、arg、gln、phe或pro；aa9是兩個(gè)leu、phe、ser或ala；aa11是leu、pro、ser、gly或ile；aa12是pro、asn、lys、phe、ser或ala；aa13是arg、leu、ser或gly；aa16是arg、phe或ala；aa17是ala、ser、ile或tyr；aa19是phe、tyr、asp、ser或thr；aa21是arg、lys、thr或ile；aa22是ile、val或tyr；aa23是arg、asn或gln；aa25是arg、ala或val；aa26是ile、leu或arg；aa27是his、val、phe或trp；aa28是pro、tyr、ala或thr；aa29是leu、arg或phe；aa32是arg、ser、pro或trip；w是0至2個(gè)arg。在其它一些實(shí)施方案中，取代物如aa1、aa2和aa4是隱藏的，因此它們具有除了天然存在的序列以外的序列，這里稱為類似物。
此外，如前面所描述的，α-防衛(wèi)素包括具有不多于35個(gè)氨基酸的陽(yáng)性寡肽，具有以下通式的序列Z’0-2-val-aa2-cys4-cys-arg-arg-aa8-aa9-cys-aa11-aa12-aa13-glu-arg-arg-aa17-gly-aa19-cys-arg-aa22-arg-gly-arg-aa26-his-aa28-leu-cys-cys-(arg)0-1(SEQ ID NO2)，并且其中，Z’是甲基、乙酰基或是一個(gè)氨基酸；氨基酸2、4、8、9、11、17和22是中性氨基酸；氨基酸12和28是雜環(huán)氨基酸或中性氨基酸；氨基酸19是芳香族氨基酸或羥基取代的脂肪族氨基酸；氨基酸13和26是脂肪族氨基酸或堿性氨基酸；或具有以下通式的序列Z’0-2-val-aa2-cys-thr-cys-arg-aa7-phe-aa9-cys-gly-aa12-gly-glu-arg-ala-aa17-gly-aa19-cys-thr-aa22-asn-gly-val-arg-his-aa28-leu-cys-cys-arg-(arg)0-1，并且其中aa2和aa12是phe或ser；aa7是arg或gly；aa9是羥基取代或非取代的脂肪族氨基酸；aa17、aa19和aa28是羥基取代的氨基酸；aa22是5至6個(gè)碳原子的脂肪族氨基酸；或具有以下通式的序列ala-cys-tyr-cys-arg-ile-pro-ala-cys-ile-ala-asp-gly-glu-arg-arg-tyr-gly-thr-cys-ile-tyr-gln-gly-arg-leu-trp-ala-phe-cys-cys，其中ala和asp表示沒有氨基酸或一個(gè)所示的氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，取代物，如aa2、aa7和aa9是隱藏的，因此它們具有除了天然存在的序列以外的序列，這里稱為類似物。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)α-防衛(wèi)素存在于人、兔、豚鼠、大鼠、恒河猴和倉(cāng)鼠的嗜中性粒細(xì)胞以及人和嚙齒動(dòng)物的小腸Paneth細(xì)胞中(Daher等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，857327-7331；Lehrer等，Infect.Immun.，111226-1234；Selsted等，Infect.Immun.，552181-2186；Eisenhauer等，Infect.Immun.，572021-2027；Tang等，Infect.Immun.，676139-6144；Mak等，Infect.Immun.，644444-4449；Ganz等，J.Immunol.，1431358-1365；Mallow等，J.Biol.Chem.，2714038-4045；Quellette等，J.Cell.Biol.，1081687-1695；以及Qu等，Infect.Immun.，645161-5165)。
如這里所應(yīng)用的，術(shù)語(yǔ)“人α-防衛(wèi)素”是指一種多肽，其具有以下氨基酸序列及其等位變體和前-前體蛋白的一種。人α-防衛(wèi)素1-6的序列如下α-防衛(wèi)素1(HNP1)ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC(SEQ ID NO3)；α-防衛(wèi)素2(HNP2)CYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC(SEQ ID NO4)；α-防衛(wèi)素3(HNP3)DCYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC(SEQ ID NO5)；α-防衛(wèi)素4(HNP4)VCSCRLVFCRRTELRVGNCLIGGVSFTYCCTRV(SEQ ID NO6)；α-防衛(wèi)素5(HD5)ARATCYCRTGRCATRESLSGVCEISGRLYRLCCR(SEQ ID NO7)；α-防衛(wèi)素6(HD6)TRAFTCHCRRSCYSTEYSYGTCTVMGINHRFCCL(SEQ ID NO8)。α-防衛(wèi)素被描述在美國(guó)專利號(hào)4,705,777(Lehrer等)中。
如這里所應(yīng)用的，術(shù)語(yǔ)“兔α-防衛(wèi)素”是指一種多肽，其具有以下氨基酸序列及其等位變體和前-前體蛋白的一種。兔α-防衛(wèi)素1-6的序列如下α-防衛(wèi)素1(NP1)VVCACRRALCLPR ERRAGFCRIRGRIHPLCCRR(SEQ ID NO9)；α-防衛(wèi)素2(NP2)VVCACRRALCLPLERRAGFCRIRGRIH PLCCRR(SEQ ID NO10)；α-防衛(wèi)素3a(NP3a)GICACRRRFCPNSERFSGYCRVNGARYVRCCSRR(SEQID NO11)；α-防衛(wèi)素3b(NP3b)GRCVCRKQLLCSYRERRIGDCKIRGVRFPFCCPR(SEQ ID NO12)；α-防衛(wèi)素4(NP4)VSCTCRRFSCGFGERASGSCTVNGVRHTLCCRR(SEQ ID NO1 3)；α-防衛(wèi)素5(NP5)VFCTCRGFLCGSGERASGSCTINGVRHTLCCRR(SEQ ID NO14)；以及α-防衛(wèi)素6(NP6)GICACRRRFCLNFEQFSGYCRVNGARYVRCCSRR(SEQ ID NO15)。
如這里所應(yīng)用的，術(shù)語(yǔ)“大鼠α-防衛(wèi)素”是指一種多肽，其具有以下氨基酸序列及其等位變體和前-前體蛋白的一種。大鼠α-防衛(wèi)素的序列如下α-防衛(wèi)素1(RtNP1)VTCYCRRTRCGFRERLSGACGYRGRIYRLCCR(SEQ ID NO16)；α-防衛(wèi)素2(RtNP2)VTCYCRSTRCGF RERLSGACGYRGRIYRLCCR(SEQ ID NO17)；α-防衛(wèi)素3(RtNP3)CSCRTSSCRFGERLSGACRLNGRIY RLCC(SEQ ID NO18)；以及α-防衛(wèi)素4(RtNP4)ACYCRIGACVSGERLTGACGLNGRIYRLCCR(SEQ ID NO19)。
如這里所應(yīng)用的，術(shù)語(yǔ)“小鼠α-防衛(wèi)素”是指一種多肽，其具有以下氨基酸序列及其等位變體和前-前體蛋白的一種。小鼠α-防衛(wèi)素的序列如下α-防衛(wèi)素1(MuCr1)LRDLVCYCRT RGCKRRERMNGTCRKGHLMYTLCCR(SEQID NO20)；α-防衛(wèi)素2(MuCr2)LRDLVCYCRARGCKGRE RMNGTCRKGHLLYMLCCR(SEQ ID NO21)；以及α-防衛(wèi)素1α(MuCr1α)LRDLVCYCRTRGCKRRER MNGTCRKGHLMYTLCCR(SEQ ID NO22)。
如這里所應(yīng)用的，術(shù)語(yǔ)β-防衛(wèi)素涉及一種多肽，根據(jù)HIV病毒抑制試驗(yàn)(如這里描述的病毒抑制試驗(yàn))的測(cè)定，被判定為具有抗-HIV活性。β-防衛(wèi)素的長(zhǎng)度通常少于100個(gè)氨基酸，一般約32-45個(gè)氨基酸，具有保守的半胱氨酸結(jié)構(gòu)和陽(yáng)性電荷(所述保守的結(jié)構(gòu)顯示在SEQ ID NO23至SEQ ID NO24中)。β-防衛(wèi)素與α-防衛(wèi)素的不同在于它們特定的氨基酸模式、半胱氨酸間隔、以及二硫鍵連接(Kaiser等，Leukocyte Biology，68779-784(2000))。與α-防衛(wèi)素相似，β-防衛(wèi)素的半胱氨酸在整個(gè)寡肽上是分散的，使得半胱氨酸可進(jìn)行分子內(nèi)和分子外、共價(jià)和非共價(jià)的交聯(lián)。術(shù)語(yǔ)“β-防衛(wèi)素”包含天然存在的β-防衛(wèi)素，即從天然來(lái)源分離的多肽；合成的β-防衛(wèi)素，即化學(xué)合成或通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的多肽，具有與天然存在的β-防衛(wèi)素相同的氨基酸序列；以及β-防衛(wèi)素類似物，即具有β-防衛(wèi)素的生物活性的多肽，具有的氨基酸序列并非是天然存在的。所述術(shù)語(yǔ)也包含β-防衛(wèi)素的前-前體蛋白形式，在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過處理形成具有生物學(xué)活性的形式。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)β-防衛(wèi)素存在于人、牛、綿羊、小鼠、豬、家禽、昆蟲和植物中，尤其在牛氣管黏膜、牛嗜中性粒細(xì)胞、牛舌頭、人嗜中性粒細(xì)胞、陰道和腎組織、上皮細(xì)胞如皮膚、腎、以及氣管-支氣管內(nèi)層(Diamond等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，954596-4600；Selsted等，J.Biol.Chem.，2686641-6648；Singh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9514961-14966；Bensch等，F(xiàn)EBS.Lett.，368331-335；Schonwetter等，Science，3267 1645-1648；以及Lehrer等，Annals New York Academyof Science，228-239)。
在某些實(shí)施方案中，如前面所定義的，β-防衛(wèi)素包括多肽、前-前體蛋白、加工蛋白、多態(tài)變體、等位基因、種間同源物、以及突變體，它們與如這里所描述的由β-防衛(wèi)素核酸所編碼的氨基酸序列(如人β-防衛(wèi)素1或2)相比，具有高于60％的氨基酸序列相同性，如65％、70％、75％、80％、85％、90％，優(yōu)選地，具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％、或更高的氨基酸序列相同性，優(yōu)選地，在一個(gè)至少約15、20、25、30或更多個(gè)氨基酸的區(qū)域上具有相同性。
如這里所應(yīng)用的，術(shù)語(yǔ)“人β-防衛(wèi)素”是指一種多肽，，其具有以下氨基酸序列及其等位變體和前-前體蛋白的一種。人β-防衛(wèi)素1和2的序列如下β-防衛(wèi)素1(hBD-1)DHYNCVSSGGQCLYSACPIFTKIQGTCYRGKAKCC(SEQ ID NO23)；β-防衛(wèi)素2(hBD-2)TCLKSGAICHPVFCPRRYKQIGTCGLPGTKCC(SEQ ID NO24)。β-防衛(wèi)素序列描述于PCT公開號(hào)WO 02/22686和Kaiser等，Journal of Leukocyte Biology，68779-784(2000))。
本發(fā)明的防衛(wèi)素可通過功能進(jìn)行進(jìn)一步的描述，所述功能包括(1)結(jié)合到抗體，如多克隆抗體，其可對(duì)應(yīng)某個(gè)免疫原而升高，所述免疫原含有防衛(wèi)素蛋白和其保守性改變變體的氨基酸序列；(2)在嚴(yán)緊雜交條件下，能與編碼防衛(wèi)素蛋白和其保守性改變變體的核酸序列相應(yīng)的反義鏈特異性雜交；或(3)與防衛(wèi)素核酸具有高于95％，優(yōu)選地高于96％、97％、98％、99％、或更高的氨基酸序列相同性，優(yōu)選地，在一個(gè)含有至少約25、50、100、200、500、1000或更多個(gè)核苷酸序列的區(qū)域上具有相同性。如前所述，防衛(wèi)素多核苷酸或多肽序列通常來(lái)自哺乳動(dòng)物，包括但不限于靈長(zhǎng)動(dòng)物如人；嚙齒動(dòng)物如大鼠、小鼠、倉(cāng)鼠、牛、豬、馬、羊或任何哺乳動(dòng)物。在一個(gè)可行的實(shí)施方案中，所述防衛(wèi)素是人α-防衛(wèi)素1、2或3。本發(fā)明的核酸和蛋白包括天然存在的或重組的分子。本發(fā)明的防衛(wèi)素蛋白具有抗病毒活性?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法以及這里所描述的方法進(jìn)行抗病毒試驗(yàn)。
在體內(nèi)，防衛(wèi)素以前體的方式被生成，并且從前肽經(jīng)加工獲得成熟肽，通常帶有二硫鍵橋。防衛(wèi)素前-前肽存在于GenBank登錄號(hào)NP_525128，AAH27917，CAC85520，CAC85511，AAG02237，CAC03097，AAF73853，NP_066290，NP_005208，NP_001917，NP_001916，NP_004075，CAB65126，AAG22030，AAC69554，AAC51728，AAC50382，AAC33549，AAB59357，AAB49758，AAA52303，AAA35754，以及AAM62424。前-前肽加工成成熟肽的方法描述在Garcia等，Cell Tissue Res.，306(2)257-264(2001)；Harder等，J.Biol.Chem.，276(8)5707-5713(2001)；Jia等，Gene，263(1-2)211-218(2001)；Am.J.Pathol.，152(5)1247-1258(1998)；Daher等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85(19)7327-7331(1998)；Mallow等，J.Biol.Chem.，271(8)4038-4045(1996)；Wilde等，J.Biol.Chem.，264(19)11200-11203(1989)；Gabay等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86(14)5610-5614(1989)；Palfree等，Mol.Endocrinol.，7(2)199-205(1993)；Selsted等，J.Clin.Invest.，76(4)1436-1439(1985)；Mars等，Blood，71(6)1713-1719(1988)；Daher等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85(19)7327-7331(1988)；Sparkes等，Genomics，5(2)240-244(1989)；Bateman等，J.Biol.Chem.，266(12)7524-7530(1991)；Wagner等，Genomics，10(1)114-125(1991)；Valore等，Blood，79(6)1538-1544(1992)；Lehrer等，Annu.Rev.Immunol.，11105-128(1993)；Linzmeier等，F(xiàn)EBS Lett.，321(2-3)267-273(1993)；Harder等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，22(6)714-721(2000)；Infect.Immun.，68(1)113-119(2000)；Genomics，43(3)316-320(1997)；Mallow等，J.Biol.Chem.，271(8)4038-4045(1996)；FEBS Lett.，315(2)187-192(1993)；McCray等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，16343-349(1997)；Blood，71(6)1713-1719(1988)；Jones等，Biol.Chem.，267(32)23216-23225(1992)；Raj等，F(xiàn)EMS MicrobiologyLetters，2069-18(2002)；Schutte等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2129-2133(2002)；Hoover等，J.Biol.Chem.，276(42)39021-39026；以及Ganz等，Eur.J.Haematol.，44(1)1-8。
在功能上，已知防衛(wèi)素具有抗細(xì)菌和抗真菌的活性，可對(duì)抗許多的微生物(Raj等，F(xiàn)EMS Microbiology Letters，2069-18(2002))。帶陽(yáng)性電荷的防衛(wèi)素能夠與帶陰性電荷的微生物細(xì)胞膜組分發(fā)生反應(yīng)，包括革蘭氏陰性菌中的脂多糖、革蘭氏陽(yáng)性菌中的多糖、以及磷脂。已知防衛(wèi)素可由噬菌白細(xì)胞分泌，對(duì)抗細(xì)菌和真菌。盡管α-防衛(wèi)素是高度保守的，較小的變化也足以改變不同防衛(wèi)素的微生物殺滅潛能以及特異性(Mandal等，J.Pept.Res.，59(3)95-104(2002)；Schibli等，J.Biol.Chem.，277(10)8279-89(2002)；Garcia等，Cell Tissue Res.，306(2)257-64；Fellermann等，Eur.J.Gastroentero Hepatol.，13(7)771-776；Kangan等，Toxicology，87(1-3)131-149(1994))。
研究也顯示，防衛(wèi)素在對(duì)抗感染和刺激免疫應(yīng)答方面具有重要的作用。例如，已經(jīng)證明防衛(wèi)素(特別是β-防衛(wèi)素1和2)可以吸引涉及初級(jí)和二次免疫應(yīng)答的未成熟樹突細(xì)胞以及記憶T細(xì)胞(Ganz，Science，286420-421(1999))；Lillard等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96651-656(1999))。在本發(fā)明中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)防衛(wèi)素可作為抗病毒劑對(duì)抗HIV，并能應(yīng)用于治療和/或預(yù)防HIV感染以及其它病毒感染。
如前面所解釋的，天然存在的、化學(xué)合成的、商業(yè)可用的以及重組生產(chǎn)的防衛(wèi)素多肽可應(yīng)用在本發(fā)明的組合物以及方法中。
已知的天然防衛(wèi)素多肽被描述在本申請(qǐng)中?？梢岳斫?，將來(lái)可能會(huì)鑒定出其它對(duì)于本發(fā)明的方法有用的天然防衛(wèi)素多肽，它們可以是與這里所述的防衛(wèi)素同種類的，也可以是其它種類的。
從天然存在的來(lái)源分離天然存在的防衛(wèi)素可從任何防衛(wèi)素來(lái)源純化獲得，比如來(lái)自骨髓、氣管和腸細(xì)胞，來(lái)自嗜中性粒細(xì)胞、多形核白細(xì)胞、PBMC或其它噬菌細(xì)胞；來(lái)自上皮組織和其它表達(dá)防衛(wèi)素的組織(參見如van Wetering等，Am.J.Physiol.272L888(1997)；Chertov等，J.Biol.Chem.，2712935-2940(1996)；以及Raj等，Biochem.J.，347633-641(2000))，以及來(lái)自其它表達(dá)防衛(wèi)素的哺乳動(dòng)物，如大鼠和豚鼠。在一個(gè)可行的實(shí)施方案中，天然存在的防衛(wèi)素純化自嗜中性粒細(xì)胞和巨噬骨髓細(xì)胞。所述純化方法包括大規(guī)模純化，如從全血(如來(lái)自血庫(kù)，或從來(lái)自急性骨髓性白血病患者的藥用廢品如沖擊-釋放分離術(shù)中獲得)中分離嗜中性粒細(xì)胞，應(yīng)用已知的肽純化方法進(jìn)行純化。例如，多肽可應(yīng)用色譜法(如反相HPLC)，凝膠滲透、離子交換(如陰離子交換)、尺寸排除、親和吸附、分隔或逆流分配來(lái)純化。純化防衛(wèi)素的方法描述于Raj等，同上；以及Ganz等，J.Clin.Invest.，761427-1435(1985)。
防衛(wèi)素也可應(yīng)用已知的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來(lái)獲得，培養(yǎng)防衛(wèi)素-生成細(xì)胞，并且使用這里所描述的方法分離出防衛(wèi)素分子。合適的防衛(wèi)素-生成細(xì)胞系包括但不限于用于生成人α-防衛(wèi)素1-3的CD8+T淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和骨髓細(xì)胞系；用于生成人α-防衛(wèi)素5-6的腸細(xì)胞系；以及用于生成人β-防衛(wèi)素1-2的內(nèi)皮細(xì)胞系。普通的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可參見Freshney等，Culture of Animal Cells(第三版，1994)。
防衛(wèi)素分子可能從商業(yè)來(lái)源獲得，如Peptides International、AmericanPeptides和NJ Research公司。
本發(fā)明部分依賴于常規(guī)的用于基因重組領(lǐng)域的技術(shù)。公開有適用于本發(fā)明的一般重組方法的基本書籍包括但不限于Sambrook等，Molecular Cloning，A LaboratoryManual(第二版，1989)；Kriegler，Gene Transfer and ExpressionA LaboratoryManual(1990)；以及分子生物學(xué)最新方案(Ausubel等編，1994))。
實(shí)質(zhì)上等同于這里所述的氨基酸序列的防衛(wèi)素核酸，多態(tài)變體、直向同源物以及等位基因可以用防衛(wèi)素核酸探針和寡核苷酸在嚴(yán)緊雜交條件下進(jìn)行分離?？蛇x擇地，可應(yīng)用表達(dá)文庫(kù)來(lái)克隆防衛(wèi)素蛋白、前-前體蛋白、多態(tài)變體、直向同源物以及等位基因，通過檢測(cè)所表達(dá)的同源物與抗血清或純化的抗人防衛(wèi)素抗體或其部分的免疫反應(yīng)性來(lái)確定。
為了制備一個(gè)cDNA文庫(kù)，需要選擇一種富含防衛(wèi)素RNA的制備來(lái)源，如PBMC、多形核白細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、淋巴母細(xì)胞系、以及其它噬菌細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是初級(jí)細(xì)胞或細(xì)胞系。然后通過反轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)換成cDNA，連接到一種重組載體上，并轉(zhuǎn)化入一種重組宿主，進(jìn)行增殖、篩選核克隆。制備和篩選cDNA的方法是已知的(參見如Gubler等，Gene，25263-269(1983)；Sambrook等，同上；Ausubel等，同上)。
在制備基因組文庫(kù)時(shí)，從組織中抽提DNA，用機(jī)械剪切或用酶消化，形成約12-20kb的片斷。然后通過梯度離心進(jìn)行選擇，并重新構(gòu)建入噬菌體λ載體。這些載體和噬菌體在體外(in vitro)組裝。通過如Benton和Davis，Science196180-182(1977)所描述的噬菌斑雜交方法來(lái)分析重組噬菌體。菌落雜交按照描述在Grunstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，723961-3965(1975)中的方法進(jìn)行。
分離防衛(wèi)素核酸、直向同源物、等位基因、突變體、多態(tài)變體以及保守性改變變體的一種可選擇的方法還結(jié)合應(yīng)用合成的寡核苷酸引物，以及擴(kuò)增RNA或DNA模板(參見美國(guó)專利號(hào)4,683,195和4,683,202；PCR方案方法和應(yīng)用指導(dǎo)(Innis等編，1990))。諸如多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)和連接酶鏈反應(yīng)(LCR)等方法可用于直接從人mRNA、cDNA、基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出人防衛(wèi)素核酸序列。應(yīng)用這里所提供的序列，可設(shè)計(jì)變性寡核苷酸來(lái)擴(kuò)增防衛(wèi)素同源物?？蓪⑾拗菩院怂醿?nèi)切酶位點(diǎn)加入到引物上。例如，多聚酶鏈反應(yīng)以及其它體外(in vitro)擴(kuò)增方法可用于克隆編碼所需蛋白的核酸序列；可用于制備用作探針的核酸，在生理樣品中檢測(cè)編碼防衛(wèi)素的mRNA是否存在；或用于其它目的。通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增的基因可以用瓊脂糖凝膠純化，克隆入相應(yīng)的載體。
典型地，在轉(zhuǎn)化入原核或真核細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制和/或表達(dá)之前，將用于編碼防衛(wèi)素多肽的基因克隆入中間載體。好些中間載體通常是原核載體，如質(zhì)?；虼┧筝d體?？蛇x擇地，可應(yīng)用同源重組來(lái)激活原生的防衛(wèi)素基因。
3.防衛(wèi)素多肽的化學(xué)合成和純化由于本發(fā)明的防衛(wèi)素多肽的長(zhǎng)度是相對(duì)短的，它們可應(yīng)用許多對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說熟悉的化學(xué)肽合成技術(shù)中的任何一種來(lái)制備，包括溶液方法和固相方法，固相合成是優(yōu)選的方法?；瘜W(xué)合成防衛(wèi)素多肽的合適的方法公開在Raj等，Biochem.J.，347633-641(2000)中，其中的指導(dǎo)引用在此作為參考。
特別地，固相合成中，肽序列的C末端氨基酸被吸附到一種不溶的支持物上，接著依次地將序列中剩余的其它氨基酸添加上去，這是本發(fā)明優(yōu)選的制備防衛(wèi)素多肽的方法。固相合成技術(shù)描述于Barany和Merrifield，Solid-Phase Peptide Synthesis，in The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology(Gross和Meienhofer(編)，學(xué)術(shù)出版社，紐約，卷2，pp.3-284(1980))；Merrifield等，J.Am Chem.Soc.，852149-2156(1963)；以及Stweart等，Solid-Phase Peptide Synthesis(第二版，Pierce Chem.Co.，Rockford，I11.(1984))。
固相合成從肽的羧基末端(即C-末端)起始，通過偶連一個(gè)保護(hù)氨基酸，使該保護(hù)氨基酸的羧基固定于合適的固相支持物上。所用的固相支持物在本發(fā)明中不是關(guān)鍵所在，只要其能夠結(jié)合羧基基團(tuán)，并對(duì)在肽合成步驟中所用的試劑惰性就可以了。比如，一種起始材料可連接一個(gè)氨基保護(hù)性氨基酸，通過苯甲基酯連接到氯甲基化或羥甲基化的樹脂上，或通過醯胺連接到二苯甲基氨(BHA)或p-甲基二苯甲基胺(MBHA)樹脂上。適用于作為固相支持物的材料對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說是熟悉的，包括但不限于以下材料鹵甲基化樹脂，如氯甲基化樹脂或溴甲基化樹脂；羥甲基化樹脂；苯酚樹脂，如4-(α-[2，4-二甲氧基苯基]-Fmoc-氨甲基)苯氧基樹脂；第三-烷氧羰基-酰肼化的樹脂，以及類似物。所述的樹脂是商業(yè)可用的，它們的制備方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的。
本發(fā)明的肽的酸形式可以通過固相肽合成步驟來(lái)制備，應(yīng)用苯甲基酯樹脂作為固體支持物。相應(yīng)的醯胺可通過應(yīng)用二苯甲基胺或甲基二苯甲基胺樹脂作為固體支持物來(lái)制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到，當(dāng)應(yīng)用BHA或MBHA樹脂時(shí)，用無(wú)水氫氟酸處理以使多肽從固相支持物上分離，生成具有一個(gè)末端氨基基團(tuán)的多肽。
在偶連反應(yīng)時(shí)，每個(gè)在合成中被用到的氨基酸的α-氨基基團(tuán)都必須被保護(hù)，以防止發(fā)生涉及反應(yīng)性α-氨基功能的副反應(yīng)。某些氨基酸也包含反應(yīng)性側(cè)鏈功能基團(tuán)(如巰基、氨基、羧基、羥基等)，它們也必須用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，以防止在多肽合成過程中發(fā)生在這些位點(diǎn)上的化學(xué)反應(yīng)。保護(hù)性基團(tuán)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說是熟知的，比如參見多肽分析、合成、生物學(xué)，卷3在肽合成中保護(hù)功能基團(tuán)(Gross和Meienhofer(編)，學(xué)術(shù)出版社，紐約(1981))。
在苯甲醚和二甲基硫存在下，通過將不溶性載體或固相支持物在無(wú)水的、液體氟化氫(HF)中振蕩，從支持物上分離肽并移除保護(hù)性基團(tuán)，該過程在約0℃進(jìn)行約20至90分鐘，優(yōu)選60分鐘；通過發(fā)泡溴化氫(HBr)，連續(xù)穿過以1mg/10mL懸浮在三氟醋酸(TFA)中的樹脂，在室溫下持續(xù)30至360分鐘，主要根據(jù)所選擇的保護(hù)性基團(tuán)定時(shí)間；或，通過將反應(yīng)柱中用于固相合成的固相支持物與90％三氟乙酸、5％水和5％三乙基硅烷共同孵育30至60秒。也可應(yīng)用其它苯領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的去保護(hù)方法。
在已知的天然存在的α-防衛(wèi)素中存在六個(gè)半胱氨酸殘基。由半胱氨酸產(chǎn)生的二硫鍵連接發(fā)生在第一個(gè)和第六個(gè)半胱氨酸之間、第二個(gè)和第四個(gè)半胱氨酸之間以及第三和第五個(gè)半胱氨酸之間。其中，所述的半胱氨酸從肽的N末端至C末端分別編號(hào)為一至六。此外，在大多數(shù)已知的β-防衛(wèi)素中存在六個(gè)半胱氨酸殘基。β-防衛(wèi)素的半胱氨酸連接發(fā)生在第一個(gè)和第五個(gè)半胱氨酸之間、第二個(gè)和第四個(gè)半胱氨酸之間以及第三個(gè)和第六個(gè)半胱氨酸之間，其中，所述的半胱氨酸從肽的N末端至C末端分別編號(hào)為一至六。
防衛(wèi)素分子中半胱氨酸之間二硫鍵的形成可以用已知的方法實(shí)現(xiàn)。比如，在Raj等，同上中，三個(gè)分別的硫醇保護(hù)基團(tuán)和一個(gè)三階段處理過程被用于生成二硫鍵，以最小化不必要的副反應(yīng)。為了給鍵的形成提供適當(dāng)?shù)姆较?，首先在N末端和C末端的半胱氨酸之間生成一個(gè)二硫鍵橋(參見Hill等，Science，251481-1485，和Pardi等，Biochemistry，3111357-11364)。在其它方法中，六個(gè)硫醇基團(tuán)同步氧化，或進(jìn)行二階段處理，生成二硫鍵(參見Khan，Methods Enzymol.，61339-378和Lauth等，Insect Biochem.Mol.Biol.，281059-1066)。
陽(yáng)性多肽(即本發(fā)明的防衛(wèi)素多肽)可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的肽純化方法從反應(yīng)混合物中分離和純化，如前述的純化方法。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說，顯然可以對(duì)本發(fā)明的組合物和方法中所用到的防衛(wèi)素多肽作出很多種改變(如增加、刪除或取代)。比如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，額外的氨基酸可以加入到防衛(wèi)素多肽的N末端和/或C末端，以提高它們的活性(參見Raj等，Biochem.J.，347633-641(2000))。而且，可以修改防衛(wèi)素多肽以去除蛋白酶裂解位點(diǎn)(如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶裂解位點(diǎn))(參見如Selsted等，J.Clin.Invest.，761436-143991985)。典型地，可以用不能被蛋白酶識(shí)別的類似氨基酸來(lái)取代所述能被蛋白酶識(shí)別的氨基酸。由于這種經(jīng)改變的防衛(wèi)素多肽可應(yīng)用于本發(fā)明的組合物和方法，因此這種改變(如添加、刪除和取代)也落入本發(fā)明的范圍。
對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說很顯然，已知的改變方法也能用于生成活性防衛(wèi)素多肽，它們中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸與已知天然存在的防衛(wèi)素多肽不同?？蓱?yīng)用這里描述的一種試驗(yàn)方法來(lái)測(cè)定防衛(wèi)素的活性。那些具有抗HIV活性的防衛(wèi)素多肽可被應(yīng)用于本發(fā)明的方法和組合物中?？尚械母淖兎椒ㄊ嵌c(diǎn)突變、點(diǎn)錯(cuò)配修復(fù)、或寡核苷酸定向突變。
定點(diǎn)突變?cè)诒绢I(lǐng)域中是眾所周知的，描述在以下的參考文獻(xiàn)中，如Ling等，Anal，Biochem.，254(2)157-178(1997)；Dale等，Methods Mol.Biol.，57369-374(1996)；Smith，Ann.Rev.Genet.，19423-462(1985)；Botstein等，Science，2291193-1201(1985)；Carter，Biochem.J.，2371-7(1986)；以及Kunkel，NucleicAcids & Molecular Biology(Eckstein，F(xiàn).和Lilley，D.M.J.編，Springer Verlag，柏林(1987))；應(yīng)用包含尿嘧啶的模板的突變(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488-492(1985)；Kunkel等，Methods in Enzymol.，154367-382(1987)；以及Bass等，Science，242240-245(1988))；寡核苷酸定向突變(Methods in Enzymol.，100468-500(1983)；Methods in Enzymol.，154329-350(1987)；Zoller等，NucleicAcids Res.，106487-6500；Zoller等，Methods in Enzymol.，100468-500；以及Zoller等，Methods in Enzymol.，154329-350；硫代磷酸酯-改變的DNA突變(Taylor等，Nucl.Acid.Res.，138749-8764(1985)；Taylor等，Nucl.Acid.Res.，138765-8787(1985)；Nakamaye等，Nucl.Acids Res.，149679-9698(1986)；Sayers等，Nucl.AcidsRes.，16791-802(1988)；以及Sayers等，Nucl.Acids Res.，16803-814(1988))；應(yīng)用缺口的雙股DNA的突變(Kramer等，Nucl.Acids Res.，129441-9456(1984)；Kramer等，Methods in Enzymol.，154350-367(1987)；Kramer等，Nucl.Acids Res.，167207(1988)；以及Fritz等，Nucl.Acids Res.，166987-6999(1988))。
另一種本領(lǐng)域已知的改變方法是定點(diǎn)錯(cuò)配修復(fù)，如(Kramer等，Cell，38879-887(1984))，應(yīng)用修復(fù)缺陷宿主菌株的突變(Carter等，Nucl.Acids Res.，134431-4443(1985)；以及Carter，Methods in Enzymol.，154382-403(1987))，刪除突變(Eghtedarzadeh等，Nucl.Acids Res.，145115(1986))，限制-選擇和限制-純化(Wells等，Phil.Trans.R.Soc.Lond.，A317415-423(1986))，通過全基因合成的突變(Nambiar等，Science，2231299-1301(1984)；Sakamer等Nucl.AcidsRes.，146361-6372(1988)；Wells等，Gene，34315-323(1985)；以及Grundstrom等，Nucl.Acids Res.，133305-3316(1985))，雙鏈斷裂修復(fù)(Mandecki(1986)；Arnold，Current Opinion in Biotechnology，4450-455(1993)。“在大腸桿菌(Escherichia coli)質(zhì)粒中寡核苷酸定向的雙鏈斷裂修復(fù)一種用于點(diǎn)特異性突變的方法”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，837177-7181)。上述許多方法的更詳細(xì)的資料可參照酶學(xué)方法，卷54，其中也描述了有用的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，用于發(fā)現(xiàn)和解決不同突變方法中產(chǎn)生的問題。
寡核苷酸定向突變也可用于在核酸序列中引入位點(diǎn)-特異性突變。這方面技術(shù)的例子描述在前述的參考文獻(xiàn)中以及這里，如Reihaar-Olson等，Science，24153-57(1988)。類似地，卡式突變也可用于將不同于天然序列的合成寡核苷酸卡替換小區(qū)域的雙鏈DNA分子的過程。所述寡核苷酸可包含如完全和/或部分隨機(jī)的天然序列。
4.重組防衛(wèi)素的純化重組防衛(wèi)素可從任何適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)中純化，如下面所描述的。防衛(wèi)素蛋白可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化至基本純，包括應(yīng)用如硫酸銨等物質(zhì)的選擇性沉淀法，柱層析法，免疫純化法以及其它方法(參見如Scopes，Protein PurificationPrinciples andPractice(1982)；美國(guó)專利號(hào)4,673,641；Ausubel等，同上；以及Sambrook等，同上)。
當(dāng)進(jìn)行重組防衛(wèi)素純化時(shí)，可應(yīng)用許多種方法。比如，可將具有分子黏附特性的蛋白可逆地融合到防衛(wèi)素蛋白上；用適當(dāng)?shù)呐潴w或底物(如抗防衛(wèi)素抗體或帶陰性電荷的底物)將防衛(wèi)素蛋白選擇性吸附到純化柱上，接著以相對(duì)純的形式從柱上洗下；然后通過酶的作用將融合的蛋白去除；最后，可應(yīng)用免疫親和柱純化防衛(wèi)素蛋白。重組防衛(wèi)素蛋白可從任何合適的來(lái)源中純化獲得，包括酵母、昆蟲、細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
重組蛋白可通過轉(zhuǎn)化的細(xì)菌進(jìn)行大量表達(dá)，通常在啟動(dòng)子誘導(dǎo)后產(chǎn)生；但是表達(dá)可以是結(jié)構(gòu)性的。用IPTG進(jìn)行啟動(dòng)子誘導(dǎo)是可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子系統(tǒng)的一個(gè)例子。根據(jù)本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的方法生產(chǎn)細(xì)菌。新鮮的或冰凍的細(xì)菌細(xì)胞被用于分離蛋白。
在細(xì)菌中表達(dá)的蛋白可形成不溶性聚集體(包涵體)。有些方法適于純化防衛(wèi)素蛋白的包涵體。比如，包涵體的純化包括通過破壞細(xì)菌細(xì)胞(如將細(xì)胞在含50mMTRIS/HCl、pH7.5、50mM NaCl、5mM MgCl2、1mM DDT、0.1mM ATP，以及1mM PMSF的緩沖液中孵育)來(lái)抽提、分離和/或純化包涵體。可通過2-3次穿過French Press來(lái)溶解細(xì)胞懸浮，用Polytron(Brinkman Instruments)均質(zhì)化，或在冰上超聲降解。溶解細(xì)菌的其它可替代方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說是顯而易見的(參見如Sambrook等，同上；Ausubel等，同上)。
如必要，將所述包涵體溶解，將溶解的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行離心，去除不需要的不溶物質(zhì)。通過用適當(dāng)?shù)木彌_液稀釋或透析，形成包涵體的蛋白可被復(fù)性。合適的溶劑包括但不限于尿素(約4M-約8M)、甲酰胺(至少約80％，體積/體積)、以及氫氯化胍(約4M-約8M)。一些能夠溶解聚集體-形成蛋白的溶劑(比如SDS(十二烷基磺酸鈉)、70％蟻酸)不適于應(yīng)用在這里，因?yàn)榭赡茉斐傻鞍椎牟豢赡孀冃裕蛊淙鄙倜庖咴院?或活性。盡管氫氯化胍以及類似試劑是變性劑，其產(chǎn)生的蛋白變性并非是不可逆的，當(dāng)將所述變性劑移走(比如通過透析)后，蛋白會(huì)復(fù)性，重新形成具有免疫活性和/或生物學(xué)活性的蛋白。其它合適的緩沖液對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說是已知的。人防衛(wèi)素蛋白通過標(biāo)準(zhǔn)的分離技術(shù)從其它細(xì)菌蛋白中分離，如使用Ni-NTA瓊脂糖樹脂。
可選擇地，從細(xì)菌周質(zhì)中純化防衛(wèi)素蛋白也是可能的。在細(xì)菌溶解后，當(dāng)防衛(wèi)素蛋白被釋放到細(xì)菌的周質(zhì)時(shí)，細(xì)菌的周質(zhì)片斷可通過冷滲壓休克以及其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)分離。為了從周質(zhì)中分離重組蛋白，將細(xì)菌細(xì)胞離心以形成沉淀。所述沉淀在包含20％蔗糖的緩沖液中重懸。為了溶約10解細(xì)胞，將細(xì)菌離心并將沉淀物重懸在冰冷的5mM MgSO4中，置于冰上分鐘。將細(xì)胞懸浮液離心，移出上清備用。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)分離技術(shù)，可將存在于上清中的重組蛋白從宿主蛋白中分離。
5.用于純化重組防衛(wèi)素蛋白的標(biāo)準(zhǔn)蛋白分離技術(shù)a)溶解分離作為初始步驟，特別是當(dāng)防衛(wèi)素蛋白混合物很復(fù)雜時(shí)，初始的鹽分離可以從重組蛋白中分離出許多不需要的宿主細(xì)胞蛋白。優(yōu)選的鹽是硫酸銨。硫酸銨通過有效地減少蛋白混合物中的水含量來(lái)沉淀蛋白。然后蛋白基于各自不同的溶解性而被沉淀，越是疏水的蛋白越容易在低的硫酸銨濃度下沉淀。常用的方法包括在蛋白溶液中加入飽和的硫酸銨，以使硫酸銨的終濃度為20-30％。在該濃度上將能沉淀最多量的疏水蛋白。然后棄去沉淀(除非所需的蛋白是疏水的)，在上清中加入硫酸銨至可沉淀所需蛋白的濃度。然后將沉淀溶解在緩沖液中，如需要可將過量的鹽通過透析或過濾移走。其它依賴于蛋白溶解性的方法(如冷乙醇沉淀)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，可用于分離復(fù)雜的蛋白混合物。
b)尺寸差別過濾可利用防衛(wèi)素蛋白的分子量來(lái)將其與更大的或更小的蛋白分離，在具有不同孔徑的膜(如Amicon或Millipore的膜)上超濾。如第一步，使蛋白混合物在具有一定孔徑的膜上超濾，所述孔徑可使分子量低于所需蛋白的蛋白去除。然后將滯留物在一定孔徑的膜上再次超濾，所述孔徑可使分子量高于所需蛋白的蛋白去除，重組防衛(wèi)素蛋白將穿過該膜被濾出。然后可將濾出物進(jìn)行層析，如下面所描述的。
c)柱層析防衛(wèi)素蛋白也可基于其大小、凈表面電荷、疏水性以及配體親和力而與其它蛋白分離。此外，可將抗防衛(wèi)素蛋白的抗體結(jié)合到柱基質(zhì)上，使蛋白被免疫純化。所有這些方法都是本領(lǐng)域所熟知的。對(duì)于本領(lǐng)域人員來(lái)說，很顯然層析技術(shù)可在任何規(guī)模下進(jìn)行，并可使用來(lái)自不同廠家的設(shè)備(如Pharmacia Biotech)。
D.抑制HIV和病毒感染和復(fù)制的方法一“治療HIV感染和AIDS”如這里所描述的，防衛(wèi)素蛋白、編碼防衛(wèi)素蛋白的核酸、以及小型有機(jī)分子或其片斷，提高防衛(wèi)素活性或表達(dá)可抑制HIV，如通過殺死被HIV感染的細(xì)胞或通過抑制HIV復(fù)制來(lái)實(shí)現(xiàn)。防衛(wèi)素可在人體中用于治療或預(yù)防。比如，可應(yīng)用防衛(wèi)素來(lái)抑制受感染CD4+細(xì)胞生成HIV。所述防衛(wèi)素蛋白、編碼防衛(wèi)素蛋白的核酸、以及小型有機(jī)分子可用于使HIV感染者停止向AIDS進(jìn)展。所述防衛(wèi)素蛋白、編碼防衛(wèi)素蛋白的核酸、以及小型有機(jī)分子也可用于預(yù)防，如在接觸過或疑為接觸過HIV后防止感染或殺死已感染細(xì)胞，或防止傳播，如通過母嬰途徑將病毒傳播給嬰兒。
在本發(fā)明的方法中，可應(yīng)用本領(lǐng)域已知的用于向個(gè)體進(jìn)行核酸和蛋白治療性給藥的方法，來(lái)治療或預(yù)防HIV感染，如細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染、基因治療、用給藥媒介物或藥學(xué)上可接受的載體直接給藥、或調(diào)節(jié)序列以提高內(nèi)源蛋白的生成。比如，如前面所解釋的，本發(fā)明第一次證明了CD8+細(xì)胞能生成α-防衛(wèi)素，其以前被認(rèn)為是由CAF活性引起的。同樣地，可通過施用受激的能生成防衛(wèi)素的CD8+細(xì)胞來(lái)將防衛(wèi)素輸送到人體。在一種方法中，通過已知的擴(kuò)展細(xì)胞的方法先體外后體內(nèi)擴(kuò)展CD8+細(xì)胞。然后測(cè)定所述細(xì)胞培養(yǎng)物能否生成防衛(wèi)素。其后，將能夠生成一定量防衛(wèi)素的細(xì)胞引入到人體。所述細(xì)胞可獲自所需治療的人體內(nèi)，或可選擇地，所述細(xì)胞可來(lái)自其他個(gè)體。然而，優(yōu)選施用的細(xì)胞是HLA-匹配的，以避免引起對(duì)抗細(xì)胞的免疫應(yīng)答。
可使用檢測(cè)HIV感染及AIDS進(jìn)展的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法來(lái)測(cè)定受試者對(duì)于防衛(wèi)素治療是否呈現(xiàn)陽(yáng)性。比如，在施用防衛(wèi)素后，監(jiān)控受試者的T細(xì)胞數(shù)，T細(xì)胞數(shù)升高表明受試者是受益于防衛(wèi)素治療的。此外，如Levy等，Immunology Today1 7，5223(1996)中所描述的“內(nèi)源性試驗(yàn)”或“急性感染試驗(yàn)”可被用于檢測(cè)受試者體內(nèi)CD8+細(xì)胞的抗HIV應(yīng)答。比如，在急性感染試驗(yàn)中，來(lái)自非感染個(gè)體的CD4+細(xì)胞被急性HIV感染，與來(lái)自感染個(gè)體的CD8+細(xì)胞以不同的CD8+/CD4+細(xì)胞比率一起培養(yǎng)。通過測(cè)定病毒生成的降低程度來(lái)確定抗病毒有效性。通過測(cè)定本發(fā)明的重組CD8+細(xì)胞所引起的病毒生成的降低程度，可進(jìn)一步確定哪一種本發(fā)明的方法在抑制病毒生成方面是最有效的。
如前面所解釋的，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)防衛(wèi)素多肽具有抗病毒活性。同樣地，可應(yīng)用防衛(wèi)素多肽抑制大量的不同病毒，因而，可治療人體內(nèi)的許多種病毒感染。防衛(wèi)素多肽可抑制的病毒包括但不限于DNA病毒、RNA病毒以及反轉(zhuǎn)錄病毒。防衛(wèi)素多肽可抑制的病毒的例子包括但不限于皰疹病毒、肝炎(A、B和C)病毒、流感病毒、POX病毒、Rhino病毒以及HTLV(人T細(xì)胞白細(xì)胞)病毒(如HTLV 1和2)?；谄淇共《净钚?，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以意識(shí)到可被防衛(wèi)素多肽所抑制的其它病毒)。
1.細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化和基因治療本發(fā)明提供了防衛(wèi)素蛋白的核苷酸序列，可用于體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。這些核酸可被插入到許多已知載體的任何一種中，用于轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞和有機(jī)物，如下面所描述的。核酸在先體外后體內(nèi)或體內(nèi)通過載體與靶細(xì)胞的相互作用被轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。然后核酸在啟動(dòng)子的控制下，表達(dá)本發(fā)明的蛋白，從而減輕因防衛(wèi)素基因含量低、缺少、部分失活或不正常表達(dá)所造成的影響，由于當(dāng)與病毒感染相關(guān)時(shí)，如HIV感染。所述組合物以足以在體內(nèi)引起治療反應(yīng)的量給予患者，一種足夠?qū)崿F(xiàn)該目標(biāo)的量被定義為“治療有效劑量或量”。
在另一方面，本發(fā)明提供了在人體內(nèi)抑制HIV感染的方法，包括向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染包含編碼防衛(wèi)素多肽核苷酸序列的核酸，其中，所述核酸包含一個(gè)可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，操作性連接到編碼防衛(wèi)素的核苷酸序列上。在一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自真核載體的防衛(wèi)素的表達(dá)可應(yīng)用誘導(dǎo)性啟動(dòng)子來(lái)調(diào)節(jié)，由于是誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，表達(dá)水平依賴于誘導(dǎo)劑(如四環(huán)素或蛻化素)的濃度，通過在啟動(dòng)子中結(jié)合入這些試劑的反應(yīng)因子來(lái)調(diào)節(jié)。通常，僅僅當(dāng)誘導(dǎo)劑存在時(shí)才能獲得高水平表達(dá)；基本表達(dá)水平是最低的。當(dāng)所需蛋白不利于在真核細(xì)胞表達(dá)時(shí)，選擇可誘導(dǎo)性表達(dá)載體。其它調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)，如增強(qiáng)子，可用于提高防衛(wèi)素多肽的表達(dá)。
所述基因治療方法已經(jīng)被用于糾正獲得性和遺傳性缺陷、癌癥以及其它許多疾病。在人體表達(dá)人造基因的能力使本發(fā)明能夠預(yù)防和/或治療許多重要的人類疾病，包括許多對(duì)其它治療方法無(wú)反應(yīng)的疾病(如需回顧基因治療方法，可參見Aderson，Science，256808-813(1992)；Nabel等，TIBTECH，11 211-217(1993)；Mitani等，TIBTECH，11162-166(1993)；Mulligan，Science，926-932(1993)；Dillon，TIBTECH，11167-175(1993)；Miller，Nature，357455-460(1992)；Van Brunt，Biotechnology，6(10)1149-1154(1998)；Vigne，Restorative Neurology and Neuroscience，835-36(1995)；Kremer等，British Medical Bulletin，51(1)31-44(1995)；Haddada等，在微生物學(xué)和免疫性近期熱點(diǎn)(Doerfler和Bohm編，1995)中；以及Yu等，GeneTherapy，113-26(1994))。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，防衛(wèi)素核酸沒有通過轉(zhuǎn)染被引入到細(xì)胞，取而代之的是一個(gè)內(nèi)源性調(diào)節(jié)子序列，如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子、一種編碼或非編碼的外源外顯子、一種接合供體位點(diǎn)被引入基因組中預(yù)先選擇的位置，用于與防衛(wèi)素基因同源重組。應(yīng)用這些方法，外源提供的表達(dá)序列與基因組DNA進(jìn)行重組，使防衛(wèi)素能在人的細(xì)胞中生成，應(yīng)用天然存在的內(nèi)源外顯子編碼這些蛋白。所述方法描述于美國(guó)專利號(hào)5,733,746中，該專利已授權(quán)于Treco等。
2.藥物組合物以及給藥藥學(xué)上可接受的載體部分由所需給藥的特定組合物(如核酸、蛋白、調(diào)節(jié)化合物如小型有機(jī)分子或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞)，以及用于該組合物的特定給藥方法來(lái)決定。本發(fā)明所需給藥的藥物組合物包含蛋白、核酸小型分子、以及類似物。因此，有許多合適的配方都可用于本發(fā)明的藥物組合物(參見如Remington’s Pharmaceutical，第17版，1989)?？梢杂萌魏伪憷姆绞竭M(jìn)行給藥，如注射、口服、吸入、透皮或直腸給藥。
適用于口服給藥的制劑可包括(a)液體溶液，如有效量的經(jīng)包裝的核酸懸浮在稀釋液中，如水、鹽水或PEG 400；(b)膠囊、軟囊或片劑，各自包含給定量的活性組分，如液體、固體、顆粒或明膠；(c)選用合適液體的懸浮液；以及(d)合適的乳劑。片劑形式可包括一種或多種乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸鈣、玉米淀粉、土豆淀粉、微晶纖維素、明膠、膠質(zhì)二氧化硅、滑石粉、硬脂酸鎂、硬脂酸、以及其他賦形劑、著色劑、填充劑、粘合劑、稀釋劑、緩沖劑、濕潤(rùn)劑、防腐劑、調(diào)味劑、染料、分解劑、以及藥學(xué)相容性載體。錠劑形式可包含具有一種味道的活性組分，如蔗糖，并且，錠劑包含在惰性基質(zhì)上的活性組分，惰性基質(zhì)如明膠和甘油和阿拉伯樹膠乳劑、凝膠、以及類似物，以及本領(lǐng)域已知的活性成分、載體。
所選擇的化合物可以單獨(dú)或與其他適當(dāng)組分組合的方式制成氣霧劑(即它們可被“氣霧化”)，以通過吸入的方式給藥。氣霧劑中可加入加壓可接受的推進(jìn)物，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮以及它們的類似物。
適于腸胃外給藥(如通過關(guān)節(jié)內(nèi)(在關(guān)節(jié)中)、靜脈內(nèi)、肌肉、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下途徑給藥)的制劑包括水溶液和非水溶液的等滲無(wú)菌注射溶液，其中可包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑以及使制劑與接受者血液等滲的溶質(zhì)；以及水溶液和非水溶液的無(wú)菌懸浮液，其中可包含懸浮劑、增溶劑、增厚劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。在本發(fā)明的實(shí)踐中，比如，組合物可通過靜脈灌輸、口服、局部、腹膜內(nèi)、膀胱內(nèi)或胸內(nèi)給藥。腸胃外給藥和靜脈內(nèi)給藥是優(yōu)選的給藥方式。制劑可以以單位劑量或多劑量存在于密封的容器中，如安瓿瓶和小瓶。
注射溶液和懸浮液可從前述形式的無(wú)菌粉末、顆粒和片劑來(lái)制備。用于體內(nèi)治療的轉(zhuǎn)導(dǎo)了核酸的細(xì)胞也可采用如前所述的靜脈內(nèi)或腸胃外給藥。
在多肽化合物的施用中，一個(gè)重要因素是確保所述多肽能夠穿透細(xì)胞質(zhì)膜或細(xì)胞內(nèi)組件(如細(xì)胞核)的膜。細(xì)胞膜包含脂蛋白雙層膜，其允許小的非離子親脂性化合物自由穿透，本能地不允許極性化合物、大分子和治療或診斷劑穿透。然而，蛋白和其他化合物如脂質(zhì)體具有轉(zhuǎn)運(yùn)多肽使其穿過細(xì)胞膜的能力。
此外，改變多肽的特性是重要的，使多肽降低“粘性”而不形成聚集體或不結(jié)合到其它蛋白，或使多肽提高藥效(如具有長(zhǎng)的半衰期)并更穩(wěn)定(如在血清中更穩(wěn)定或便于儲(chǔ)存)，如可通過PEG化所述蛋白或?qū)⑺龅鞍着c脂質(zhì)體或其它結(jié)構(gòu)域偶連。給予蛋白信號(hào)肽、前導(dǎo)序列或用于在體內(nèi)或體外分泌的分泌肽也是重要的。應(yīng)用一個(gè)靶向結(jié)構(gòu)也可使本發(fā)明的防衛(wèi)素多肽特異性靶向到細(xì)胞上，比如應(yīng)用可結(jié)合到CD4+細(xì)胞的細(xì)胞表面分子上的配體，如抗體、配體、受體等。因此，本發(fā)明提供了所述防衛(wèi)素的輸送載體，以及帶有異源結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，所述異源結(jié)構(gòu)域具有穩(wěn)定化、特異輸送或靶向、分泌、提供檢測(cè)標(biāo)記等能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含一個(gè)白蛋白結(jié)構(gòu)域和一個(gè)防衛(wèi)素結(jié)構(gòu)域。所述白蛋白結(jié)構(gòu)域至少是白蛋白的一部分(如人白蛋白)，足以延長(zhǎng)防衛(wèi)素的生存期。這種結(jié)構(gòu)在國(guó)際PCT公開號(hào)WO01/79480，2001年10月5日(Rosen等，“白蛋白融合蛋白”)中有更詳細(xì)的描述。
例如，“膜置換多肽”具有兩性的或疏水的氨基酸亞序列，具有作為膜轉(zhuǎn)運(yùn)載體的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，同源結(jié)構(gòu)域蛋白具有穿過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。已發(fā)現(xiàn)，最短的同源結(jié)構(gòu)域蛋白Antennapedia的可內(nèi)化肽是所述蛋白的第三個(gè)螺旋，從氨基酸位置43至58(參見如Prochiantz，Current Opinion in neurobiology，6629-634(1996))。發(fā)現(xiàn)另一條亞序列，即信號(hào)肽的h(疏水)區(qū)域，具有相似的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)特性(參見如Lin等，J.Biol.Chem.，270(1)14255-14258(1995))。
肽序列的例子包括但不限于HIV轉(zhuǎn)移活化蛋白的11個(gè)氨基酸的肽；一20個(gè)殘基的肽序列，其相應(yīng)于p16蛋白的氨基酸84-103(參見Fahraeus等，Current Biology，684(1996))；Antennapedia的60氨基酸長(zhǎng)同源結(jié)構(gòu)域的第三個(gè)螺旋(Derossi等，J.Biol.Chem.，26910444(1994))；信號(hào)肽的h區(qū)域，如Kaposi成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(K-FGF)的h區(qū)域(Lin等，同上)；或來(lái)自HSV的VP22轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域(Elliot等，Cell，88223-233(1997))。其它可提高細(xì)胞吸收的合適的化學(xué)部分也可化學(xué)性連接到本發(fā)明的防衛(wèi)素上。
毒素分子也具有運(yùn)輸多肽穿過細(xì)胞膜的能力。這種分子(稱為“雙體毒素”)經(jīng)常由至少兩部分組成(1)一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)或結(jié)合區(qū)域或多肽，以及(2)一個(gè)分離的毒素區(qū)域或多肽。典型地，轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域或多肽結(jié)合到細(xì)胞受體上，然后所述毒素被運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞。一些細(xì)菌毒素，包括產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringen.s)ι毒素、白喉毒素(DT)、假單胞菌(pseudomonas)外毒素A(PE)、百日咳毒素(PT)、炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)毒素、以及百日咳腺苷環(huán)化酶(CYA)，已經(jīng)被嘗試用于遞送肽到細(xì)胞質(zhì)中，作為內(nèi)部或氨基末端融合物(Arora等，J.Biol.Chem.，2683334-3341(1993)；Perelle等，Infect.Immun.，615147-5156(1993)；Stenmark等，J.Cell.Biol.，1131025-1032(1991)；Donnelly等，PBAS，903530-3534(1993)；Carbonetti等，Abstr.Annu.Meet.Am.Soc.Microbiol.，95295(1995)；Sebo等，Infect Innum.，633851-3857(1995)；Klimpel等，PNAS U.S.A.，8910277-10281(1992)；Novak等，J.Biol.Chem.，26717186-17193(1992)；以及美國(guó)專利號(hào)5,602,095、4,892,827和5,608,039)。
所述亞序列可被用于轉(zhuǎn)運(yùn)防衛(wèi)素穿過細(xì)胞。防衛(wèi)素可方便地與所述序列融合或衍生化。典型地，轉(zhuǎn)運(yùn)序列以融合蛋白的一部分來(lái)提供?？蛇x擇地，可用連接序列來(lái)連接防衛(wèi)素和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白?？蓱?yīng)用任何合適的連接序列，如肽連接序列或其它化學(xué)連接序列。
防衛(wèi)素也可被導(dǎo)入到動(dòng)物細(xì)胞中，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞，通過微粒和脂質(zhì)體以及脂質(zhì)體衍生物如免疫脂質(zhì)體導(dǎo)入。術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)體”是指包含一個(gè)或多個(gè)共中心排列的脂質(zhì)雙層的運(yùn)輸載體，其中封裝了一個(gè)水相，水相中通常包含需要輸送到細(xì)胞的化合物。
脂質(zhì)體與質(zhì)膜融合，從而將藥物釋放到細(xì)胞質(zhì)中?？蛇x擇地，脂質(zhì)體被細(xì)胞吞噬或吸收。一旦在內(nèi)涵體或吞噬體中，脂質(zhì)體或者被降解或者與細(xì)胞膜融合，釋放出其內(nèi)容物。
在現(xiàn)在的借助脂質(zhì)體的藥物遞送方法中，脂質(zhì)體最終變成為可滲透的并釋放出封裝在內(nèi)的化合物至靶組織或細(xì)胞。對(duì)于系統(tǒng)性或組織特異性遞送，這可以通過被動(dòng)的方式來(lái)完成，脂質(zhì)體雙層通過體內(nèi)的不同試劑的作用發(fā)生降解?？蛇x擇地，活性藥物的釋放包括應(yīng)用一種試劑來(lái)誘導(dǎo)脂質(zhì)體運(yùn)載體中的滲透性改變?？蓸?gòu)建脂質(zhì)體膜，使它們?cè)谥|(zhì)體膜周圍的環(huán)境變成酸性后變得不穩(wěn)定(參見如PNAS，847851(1987)；Biochemistry，28908(1989))。比如，當(dāng)脂質(zhì)體被靶細(xì)胞內(nèi)吞時(shí)，它們變得不穩(wěn)定并釋放出內(nèi)容物。所述不穩(wěn)定化被稱為融合。二硫酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)是許多“融合”系統(tǒng)的基礎(chǔ)。
所述脂質(zhì)體通常包含一種被選擇的防衛(wèi)素以及一種脂質(zhì)組分，如中性和/或陽(yáng)性脂質(zhì)，可選擇地，包括一種受體識(shí)別分子如抗體，結(jié)合到預(yù)先確定的細(xì)胞表面受體或配體(如抗原)上。許多方法可用于制備脂質(zhì)體，如以下所描述的Szoka等，Ann.Rev.Biophys.bioeng.，9467(1980)；美國(guó)專利號(hào)4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,744,085、4,837028、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,744,085、4,837,028、4,946,787；PCT公開號(hào)WO91/17424；Deamer等，Biochem.Biophys.Acta.，443629-634(1976)；Fraley等，PNAS，763348-3352(1979)；Hope等，Biochem.Biophys.Acta.，81255-65(1985)；Mayer等，Biochem.Biophys.Acta.，858161-168(1986)；Willians等，PNAS，85242-246(1988)；脂質(zhì)體(Ostro(編)，1983，第一章)；Hope等，Chem.Phys.Lip.，4089(1986)；Gregoriadis，脂質(zhì)體技術(shù)(1984)以及Lasic，脂質(zhì)體從物理學(xué)到應(yīng)用(1993))。合適的方法包括比如超聲波降解法、擠壓法、高壓/均質(zhì)化、微流化、去垢劑透析、鈣誘導(dǎo)的小脂質(zhì)體運(yùn)載體融合和醚融合，所有這些都是本領(lǐng)域熟知的。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以靶向本發(fā)明的脂質(zhì)體，應(yīng)用對(duì)特定細(xì)胞型、組織和類似物特異的靶向結(jié)構(gòu)域。引用不同靶向結(jié)構(gòu)域(如配體、受體和單克隆抗體)的脂質(zhì)體的靶向在以前已經(jīng)被描述過了(參見如美國(guó)專利號(hào)4,957,773和4,603,044)。
可應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的方法將靶向試劑偶連到脂質(zhì)體。這些方法通常包括在脂質(zhì)體中合并入脂質(zhì)組分，如磷脂醯乙醇胺，其能被活化，用于附著到靶向試劑；或衍生化的親脂性化合物，如脂質(zhì)衍生化的博萊霉素。也可構(gòu)建抗體靶向的脂質(zhì)體，比如應(yīng)用合并入蛋白A的脂質(zhì)體(參見Renneisen等，J.Biol.Chem.，26516337-16342(1990)以及Leonetti等，PNAS，872448-2451(1990))。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的防衛(wèi)素多肽可被用作佐劑。更特別地，防衛(wèi)素多肽可被用作佐劑來(lái)推進(jìn)免疫原性。同樣的，防衛(wèi)素多肽或編碼所述防衛(wèi)素多肽的核酸可被用于與疫苗或其它抗原結(jié)合，以提高抗原性應(yīng)答。
本發(fā)明的方法能在受試者中治療或預(yù)防HIV感染。足夠?qū)崿F(xiàn)所述目的防衛(wèi)素的量定義為“治療有效量”。防衛(wèi)素或防衛(wèi)素制劑的單次或多次給藥依賴于所需的劑量和頻率以及患者的耐藥能力。所述制劑中應(yīng)含有足夠量的活性試劑，即防衛(wèi)素，以有效地治療或預(yù)防HIV感染和AIDS。
在本發(fā)明的上下文中，給予患者的劑量應(yīng)在一段時(shí)間內(nèi)在患者體內(nèi)產(chǎn)生足夠有益的治療反應(yīng)。劑量將由所使用的特定給藥方法的效力，施用的組合物如核酸、多肽或小型分子，患者的狀況，以及患者的體重和表面面積來(lái)決定。劑量的大小也將由存在狀態(tài)，特征，伴隨特定防衛(wèi)素組合物的給藥所產(chǎn)生的任何有害副作用的程度，或特定患者中轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞類型來(lái)決定。
在給藥時(shí)，本發(fā)明的組合物以由候選化合物的LD-50、以及在不同濃度上候選化合物的副作用所確定的給藥率給藥，以施用于體質(zhì)整體健康的患者來(lái)計(jì)算。通常，所述劑量的范圍為從1μg至100mg每kg體重，從1μg至1mg每kg體重，或從10μg至10mg每kg體重。普通技術(shù)人員將理解，其它劑量范圍也可能是合適的并可能被發(fā)現(xiàn)。比如，一種特定的組合物可能在更高或更低的劑量時(shí)更有效。通過應(yīng)用這里描述的方法來(lái)評(píng)估受試者，一個(gè)熟練的從業(yè)者將能夠確定受試者是否對(duì)治療產(chǎn)生反應(yīng)，并將得知如何調(diào)節(jié)相應(yīng)的劑量水平。
聯(lián)合治療在眾多實(shí)施方案中，本發(fā)明的防衛(wèi)素蛋白可與其它一種或多種附加化合物或療法結(jié)合給藥。比如，可共同施用多種防衛(wèi)素多肽，或者一種或多種防衛(wèi)素多肽可與一種或多種治療化合物連接。在一種實(shí)施方案中，其它治療劑是一種用于預(yù)防或治療HIV感染的治療劑。在另一種實(shí)施方案中，其它治療劑是一種用于治療與HIV感染相關(guān)的機(jī)會(huì)感染和/或用于治療或預(yù)防HIV感染的試劑。
用于與本發(fā)明的防衛(wèi)素多肽結(jié)合的合適的治療試劑包括但不限于蛋白酶抑制劑、非核苷反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、核苷反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、抗逆轉(zhuǎn)錄病毒核苷、融合抑制劑、進(jìn)入抑制劑以及其它對(duì)抑制或治療HIV感染有效的抗病毒劑。合適的治療劑的進(jìn)一步的例子包括但不限于齊多夫定、地達(dá)諾新、司他夫定、干擾素、拉米呋啶、阿德福韋、奈韋拉平、地拉韋啶(delaviridine)、洛韋胺、沙奎那韋、茚地那韋、AZT、T20、T22以及T2。其它合適的治療劑包括但不限于抗體或其它抗病毒劑，如阿昔洛韋。在另一個(gè)實(shí)施方案中，防衛(wèi)素多肽與可溶形式的HIV共同受體共同給藥，如CCR5的CXCR4。自然地，所述共同受體是膜蛋白，包含一個(gè)胞外部分、一個(gè)跨膜部分和一個(gè)胞內(nèi)部分。它們可通過去除跨膜和胞內(nèi)部分而制成可溶形式。這些部分可以被重組排除，從而細(xì)胞外部分可表達(dá)為重組蛋白，單獨(dú)或融合蛋白的一部分。
其它本領(lǐng)域已知的結(jié)合療法可被用于與本發(fā)明的方法相結(jié)合。
E.診斷和預(yù)后應(yīng)用本發(fā)明的防衛(wèi)素分子，如核酸和蛋白對(duì)于診斷和預(yù)后也是有用的。比如，在生物樣品(如組織或血清樣品)中防衛(wèi)素水平的提高預(yù)示了延遲或非進(jìn)展到AIDS，或T細(xì)胞數(shù)低于一定水平，如200。在一個(gè)實(shí)施方案中，將CD8+細(xì)胞分離出來(lái)，在體外激活，測(cè)量防衛(wèi)素水平。提高的防衛(wèi)素水平(如在人組織如嗜中性粒細(xì)胞中)與HIV感染的受試者的長(zhǎng)期存活有關(guān)。因此，通過檢測(cè)個(gè)體中的防衛(wèi)素水平，可對(duì)個(gè)體的疾病狀態(tài)作出判斷。如這里所解釋的，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與具有低防衛(wèi)素水平的個(gè)體相比，具有提高的防衛(wèi)素水平的個(gè)體不易于進(jìn)展到AIDS。防衛(wèi)素水平也可被用于選擇和確定抗病毒藥物、劑量以及治療周期。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于檢測(cè)核酸和蛋白的方法可用于診斷和預(yù)后HIV感染以及向AIDS進(jìn)展的情況，如PCR、northern和southern印跡，反轉(zhuǎn)錄和mRNA擴(kuò)增、總RNA或多聚A+RNA的分離、點(diǎn)印跡、核酸陣列、western印跡、原位雜交、免疫試驗(yàn)如免疫沉淀、ELISA、蛋白質(zhì)體學(xué)測(cè)定、多核苷酸試驗(yàn)技術(shù)，以及類似方法。
例如，應(yīng)用核苷酸探針陣列來(lái)檢測(cè)mRNA分布表達(dá)的方法被描述在美國(guó)專利號(hào)6,040,138、歐洲專利號(hào)853,679以及PCT公開號(hào)WO97/27317中。所述方法應(yīng)用可互補(bǔ)到所需mRNA靶系列的探針組。一種mRNA分布或其擴(kuò)增產(chǎn)物與所述陣列相應(yīng)，則所需的靶點(diǎn)被鑒定出，并且可任選地，從特異性結(jié)合到互補(bǔ)探針的程度進(jìn)行量化?？扇芜x地，已知與靶點(diǎn)錯(cuò)配的結(jié)合可用于測(cè)量背景非特異結(jié)合，并從與互補(bǔ)探針特異的結(jié)合中減除。
因此，在本發(fā)明中，編碼防衛(wèi)素蛋白的核酸可與寡核苷酸點(diǎn)陣技術(shù)(高密度或低密度(如GeneClipTM))結(jié)合應(yīng)用，來(lái)鑒定編碼防衛(wèi)素蛋白的cDNA、直向同源物、等位基因、保守性改變變體、以及多態(tài)變體。當(dāng)被鑒定的同源物被連接到病毒感染的調(diào)節(jié)劑上時(shí)，它們可與GeneClipTM陣列結(jié)合應(yīng)用，作為診斷工具測(cè)定生物樣品中的疾病，參見如Gunthand等，AIDS Res.Hum.Retroviruses 14869-876(1998)；Kozal等，Nat.Med.2753-759(1996)；Motson等，Anal.Biochem.，224110-106(1995)；Lockhart等，Nat.Biotechnol.141675-1680(1996)；Gingeras等，Genome Res.，8435-448(1998)；Hacia等，Nucleic Aicds Res.，263865-3866(1998)。
1.防衛(wèi)素多肽的免疫檢測(cè)在本發(fā)明中，除了應(yīng)用核酸雜交技術(shù)來(lái)檢測(cè)防衛(wèi)素基因和基因表達(dá)，免疫測(cè)定也可用于檢測(cè)防衛(wèi)素蛋白。所述測(cè)定對(duì)于篩選防衛(wèi)素的調(diào)節(jié)劑是有用的，同時(shí)也具有治療和診斷應(yīng)用。免疫測(cè)定可被用于定性地或定量地分析防衛(wèi)素蛋白。通?？蛇m用的技術(shù)的概括可參見Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual(1988)。
可與防衛(wèi)素蛋白特異性反應(yīng)的多克隆和單克隆抗體的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(參見如Coligan，Current Protocols in Immunology(1991)；Harlow和Lane，同上；Goding，Monoclonal AntibodiesLPriciples and Practice(第二版，1986)；以及Kohler和Milstein，Nature 256495-497(1975))。所述技術(shù)包括從存在于噬菌體或類似載體中的重組抗體文庫(kù)中選擇抗體，制備出抗體；以及通過免疫兔或小鼠，制備多克隆和單克隆抗體(參見如Huse等，Science，2461275-1281(1989)；Ward等，Nature，341544-546(1989))。
許多包含防衛(wèi)素蛋白的一部分的免疫原可被用于制備與防衛(wèi)素蛋白特異性反應(yīng)的抗體。比如，如這里所描述的，重組或化學(xué)合成的防衛(wèi)素蛋白或其抗原片斷可被分離。如前所述，重組蛋白可在真核或原核細(xì)胞中表達(dá)，并按照常規(guī)的方法純化?？蛇x擇地，從這里所公開的序列獲得合成的肽，并偶連到載體蛋白上，可被用作免疫原。天然存在的蛋白也可以純的或不純的方式被應(yīng)用。然后將所述產(chǎn)物注入一種能生成抗體的動(dòng)物中。既可生成單克隆抗體，也可以生成多克隆抗體，它們可后續(xù)用于免疫測(cè)定，檢測(cè)所述的蛋白。
多克隆抗體的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。一種小鼠近交系(如BALB/C小鼠)或兔用所述蛋白以及標(biāo)準(zhǔn)的佐劑(如弗氏佐劑)進(jìn)行免疫，并使用一種標(biāo)準(zhǔn)的免疫方案。動(dòng)物對(duì)免疫原的免疫應(yīng)答通過提取測(cè)定血液來(lái)監(jiān)測(cè)，確定與β亞基的反應(yīng)效價(jià)。當(dāng)獲得適當(dāng)高的抗體效價(jià)時(shí)，從動(dòng)物中采集血液，制備抗血清。如果需要，可進(jìn)一步分離抗血清，使之富含對(duì)蛋白有反應(yīng)性的抗體。
可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的很多技術(shù)來(lái)獲得單克隆抗體。簡(jiǎn)要地說，從經(jīng)特定抗原免疫的動(dòng)物中獲得脾細(xì)胞，進(jìn)行永生化，與骨髓瘤細(xì)胞融合(參見kohler等，Eur.J.Innunol.，6511-519(1976))?？蛇x擇的永生化方法包括用Esptein Barr病毒、致癌基因或逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化，或采用其它本領(lǐng)域已知的方法。篩選從單個(gè)永生化細(xì)胞生長(zhǎng)起來(lái)的集落，找出對(duì)所述抗原具有所需特異性和親和力的抗體產(chǎn)物，并且可通過很多技術(shù)來(lái)提高從所述細(xì)胞中生產(chǎn)單克隆抗體的水平，包括注射入脊椎動(dòng)物的腹膜腔中。可選擇地，可根據(jù)Huse等，Science，2461275-1281(1989)中所論述的大致方案，通過篩選來(lái)自人B細(xì)胞的DNA文庫(kù)，分離出編碼單克隆抗體或其結(jié)合片段的DNA序列。
收集單克隆抗體和多克隆血清，并在免疫測(cè)定中確定其對(duì)抗抗原蛋白的效價(jià)，例如，可采用固相免疫測(cè)定，免疫原被固定在一種固體支持物上。典型地，選擇具有104或更高效價(jià)的多克隆抗體，應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合免疫測(cè)定，測(cè)定其與非防衛(wèi)素蛋白的交叉反應(yīng)能力。特定的多克隆抗血清和單克隆抗體通常以至少約0.1mM的Kd結(jié)合，更特別地至少約1μM，更優(yōu)選至少約0.1μM或更佳。也可通過減除其它交叉反應(yīng)的來(lái)自某些物種(如非人哺乳動(dòng)物)的直向同源物，制備僅對(duì)特定防衛(wèi)素直向同源物(如人防衛(wèi)素蛋白)特異的抗體。在這種方式下，獲得僅僅結(jié)合到防衛(wèi)素蛋白的抗體。
一旦獲得了可用的抗防衛(wèi)素蛋白特異抗體，所述蛋白可以通過許多免疫測(cè)定方法來(lái)檢測(cè)。并且，所述抗體可作為防衛(wèi)素調(diào)節(jié)劑發(fā)揮治療作用。免疫學(xué)和免疫測(cè)定方法可參見Basic and Clinical Immunology(Stites和Terr編，第7版，1991)。此外，本發(fā)明中的免疫測(cè)定方法可在任何以下配置方案中進(jìn)行，詳盡地概括在酶學(xué)免疫測(cè)定(Maggio編，1980)；以及Harlow和Lane，同上(參見如美國(guó)專利號(hào)4,366,241；4,376,110；4,517,288；以及4,837,168)。如需參考普通免疫測(cè)定方法，也可參見細(xì)胞生物學(xué)方法細(xì)胞生物學(xué)中的抗體，第37卷(Asai編，1993)；Basic andClinical Immunology(Stites和Terr編，第7版，1991)。經(jīng)典的免疫結(jié)合測(cè)定(或免疫測(cè)定)應(yīng)用一種特異性結(jié)合到所選蛋白或抗原(在本發(fā)明中指防衛(wèi)素蛋白或其抗原性亞序列)的抗體。所述抗體(如抗防衛(wèi)素)可通過任何本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的手段來(lái)制備，如前面所描述的。
在測(cè)定試驗(yàn)中采用的特定標(biāo)記或檢測(cè)基團(tuán)不是本發(fā)明的重要方面，只要其不會(huì)明顯干擾測(cè)定所用抗體的特異結(jié)合即可。所述檢測(cè)基團(tuán)可以是任何具有可檢測(cè)性物理或化學(xué)特性的材料。在免疫測(cè)定領(lǐng)域，所述檢測(cè)標(biāo)記已經(jīng)得到了很好的發(fā)展，一般情況下，任何在所述方法中有用的標(biāo)記可被應(yīng)用于本發(fā)明。因此，標(biāo)記是任何可被分光鏡、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)手段檢測(cè)到的組合物。在本發(fā)明中有用的標(biāo)記包括磁珠(如DYNABEADSTM)、熒光染料(如異硫氰酸熒光素、Texas紅、若丹明以及類似物)、放射標(biāo)記(如3H、125I、35S、14C以及32P)、酶(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和其它在ELISA中常用的試劑)、以及比色標(biāo)記如膠體金、有色氣體或塑料珠(如聚苯乙烯、聚丙烯、橡膠等)。
根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法，所述標(biāo)記可直接或間接偶連到所需的免疫測(cè)定組分上。如前面所指明的，可以應(yīng)用許多種標(biāo)記，標(biāo)記的選擇取決于靈敏度要求、與化合物結(jié)合難易程度、穩(wěn)定性要求、可用的儀器設(shè)備、以及處理措施。
非放射性標(biāo)記經(jīng)常通過間接的方式附著連接。通常，配體分子(如生物素)共價(jià)地結(jié)合到所述分子上，然后再結(jié)合到另一種分子(如鏈霉親和素)上，其本身可被檢測(cè)或共價(jià)地結(jié)合到一種信號(hào)系統(tǒng)上，如可檢測(cè)的酶、熒光化合物或化學(xué)發(fā)光化合物。所述配體以及它們的靶點(diǎn)可被用于與任何合適的識(shí)別防衛(wèi)素蛋白的抗體或識(shí)別抗-防衛(wèi)素的第二抗體結(jié)合使用。
所述分子也可直接偶連到信號(hào)生成化合物上，如與酶或熒光團(tuán)?？勺鳛闃?biāo)記的酶主要是水解酶，特別是磷酸酶、酯酶和糖苷酶；或氧化物酶，特別是過氧化物酶。熒光化合物包括熒光素以及它的衍生物、若丹明以及它的衍生物、丹磺酰、7-羥基香豆素等?；瘜W(xué)發(fā)光化合物包括蟲螢光素、2，3-二氫酞嗪二酮，如魯米諾(luminal)。如需參考可用的標(biāo)記或信號(hào)生成系統(tǒng)，可參見美國(guó)專利號(hào)4,391,904。
檢測(cè)標(biāo)記的方式是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。比如，當(dāng)所述標(biāo)記是一種放射活性標(biāo)記，檢測(cè)的方式包括閃光計(jì)數(shù)或進(jìn)行自動(dòng)射線照相獲得攝影膠片。當(dāng)標(biāo)記是一種熒光標(biāo)記，可通過用合適的波長(zhǎng)激活熒光染料進(jìn)行檢測(cè)，并檢測(cè)獲得的熒光。所述熒光可通過視覺觀測(cè)，或應(yīng)用電子探測(cè)器如電荷耦合裝置(CCD)或光電倍增器以及類似儀器來(lái)檢測(cè)。類似地，酶標(biāo)記可通過應(yīng)用合適的酶底物，并檢測(cè)結(jié)果獲得的反應(yīng)產(chǎn)物。比色或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記可簡(jiǎn)單地通過觀察與標(biāo)記相關(guān)的顏色來(lái)檢測(cè)。因此，在很多不同的測(cè)定試驗(yàn)中，偶連的金經(jīng)常呈現(xiàn)粉紅色，而很多偶連的珠呈現(xiàn)珠本身的顏色。
一些測(cè)定被設(shè)計(jì)成無(wú)需應(yīng)用經(jīng)標(biāo)記的化合物的形式。比如，凝集試驗(yàn)可被用于檢測(cè)靶抗體的存在。在這種狀況下，當(dāng)試樣中包含靶抗體時(shí)，抗原包被的顆粒就會(huì)發(fā)生凝集。應(yīng)用這種方式，沒有組分需要進(jìn)行標(biāo)記，靶抗體的存在僅通過簡(jiǎn)單的目測(cè)就可確定。
2.防衛(wèi)素多肽的SELDI檢測(cè)除了應(yīng)用核酸雜交技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)檢測(cè)防衛(wèi)素基因表達(dá)，表面-增強(qiáng)的激光解吸/電離(SELDI)也可用于檢測(cè)本發(fā)明的防衛(wèi)素，或用于檢測(cè)調(diào)節(jié)或結(jié)合到防衛(wèi)素的化合物。SELDI是指一種解吸/電離氣體相離子光譜法(如質(zhì)譜法)，其中，被分析物被捕獲到SELDI探針的表面上，使探針與氣相離子光譜儀接觸。在“SELDI MS”中，氣相離子光譜儀是質(zhì)譜儀。在一些實(shí)施方案中，SELDI包括將被分析物捕獲到固相支持物上，如質(zhì)譜探針表面，用一種可從混合物中捕獲靶分析物的吸附劑衍生化。經(jīng)典地，一種基質(zhì)材料被應(yīng)用于所述的被分析物，并且用激光解吸質(zhì)譜儀來(lái)檢測(cè)被分析物。應(yīng)用的吸附劑可以是色譜的或生物特異的。SELDI技術(shù)描述在美國(guó)專利號(hào)5,719,060(Hutchens和Yip)以及美國(guó)專利號(hào)6,225,047(Hutchens和Yip)中?；赟ELDI的生物芯片和儀器可獲自Ciphergen生物系統(tǒng)公司，CA。
“表面-增強(qiáng)的親和捕獲”或“SEAC”是SELDI的改變形式，涉及應(yīng)用包含一種吸附表面的探針(一種“SEAC探針”)。“吸附表面”是指一種結(jié)合了吸附劑(也稱為“捕獲試劑”或“親和試劑”)的表面。吸附劑可以是任何能夠結(jié)合分析物(如靶多肽或核酸)的材料?！吧V吸附劑”是指一種通常用于色譜分析的材料。色譜吸附劑包括比如離子交換材料、金屬鰲合劑(如乙酸腈或乙酰乙酸亞氨)、固定的金屬鰲合物、疏水反應(yīng)吸附劑、親水反應(yīng)吸附劑、染料、單生物分子(如核苷酸、氨基酸、單糖和脂肪酸)以及混合形式吸附劑(如疏水吸引/靜電排斥吸附劑)?！吧锾禺愇絼笔侵敢环N包含生物分子的吸附劑，如包含核酸分子(如適配體)、多肽、多糖、脂質(zhì)、類固醇或它們的偶連體(如糖蛋白、脂蛋白、醣脂、核酸(如DNA)-蛋白偶連體)。在某些例子中，生物特異吸附劑可以具有大分子結(jié)構(gòu)，如多蛋白復(fù)合體、生物膜或病毒。生物特異吸附劑通常具有比色譜吸附劑更高的靶分析物特異性。應(yīng)用于SELDI的吸附劑的其它例子可參見美國(guó)專利6,225,047(Hutchens和Yip，“應(yīng)用滯留色譜法來(lái)生成不同的圖譜”，2001年5月1日)。
在一些實(shí)施方案中，SEAC探針被給予一種預(yù)-活化的表面，其可被改變以獲得所需的吸附劑。比如，某些探針被給予一種反應(yīng)性結(jié)構(gòu)域，能夠通過共價(jià)鍵結(jié)合生物分子。環(huán)氧化物和carbodiimidizole是有用的反應(yīng)性結(jié)構(gòu)域，可共價(jià)連接生物特異性吸附劑，如抗體或細(xì)胞受體。
“表面-增強(qiáng)潔凈解吸”或“SEND”是SELDI的一種改變形式。涉及應(yīng)用包含化學(xué)結(jié)合到探針表面的能量吸附分子的探針(SEND探針)?！澳芰课椒肿印?EAM)是指能夠從一種激光解吸/電離來(lái)源吸附能量，然后將能量用于與其接觸的分析物分子的解吸/電離分子。所述短語(yǔ)包括應(yīng)用于MALDI的分子，經(jīng)常被稱為“基質(zhì)”，并且明顯地包括苯乙烯酸衍生物、芥子酸(SPA)、氰基羥基苯乙烯(CHCA)和二羥苯甲酸、阿魏酸、氫苯乙酮衍生物，以及其它。其也包括應(yīng)用于SELDI的EAM。在某些實(shí)施方案中，能量吸附分子被加入一種線性或交叉聚合體，如聚甲基丙烯酸酯。例如，所述組合物可以是α-氰基-4-異丁烯酰氧基肉桂酸(α-cyano-4-methacryloyloxycinnamic acid)和丙烯酸鹽共-聚體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物是α-氰基-4-異丁烯酰氧基肉桂酸、丙烯酸鹽和3-(三甲氧基)甲硅烷基甲基丙烯酸丙脂共聚體。在另一個(gè)方面，所述組合物是α-氰基-4-異丁烯酰氧基肉桂酸和十八烷基甲基丙烯酸的共聚體(C18 SEND)。SEND還描述在美國(guó)專利號(hào)5,719,060以及提交于2002年9月4日的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0/408,225(Kitagawa，“具有能量吸附結(jié)構(gòu)域的單體和多聚體在分析物的解吸/電離中的應(yīng)用”)中。
“表面-增強(qiáng)的光不穩(wěn)定附著和釋放”或“SEPAR”是SELDI的一種改變形式，涉及具有可附著到表面的結(jié)構(gòu)域的探針的應(yīng)用，其可共價(jià)地結(jié)合分析物，然后通過與光接觸(如激光)，斷裂結(jié)構(gòu)域中的光不穩(wěn)定鍵，釋放出所述分析物。SPEAR還描述在美國(guó)專利號(hào)5,719,060中。
“吸附”是指分析物與吸附劑或捕獲劑的非共價(jià)結(jié)合?！跋疵撘骸被颉跋礈烊芤骸笔侵敢环N通常是溶液的試劑，其可用于影響或改變分析物與吸附表面的吸附和/或從表面上移走未吸附的材料。洗脫液的洗脫性質(zhì)可取決于如pH、離子強(qiáng)度、疏水性、離液程度、洗滌劑強(qiáng)度和溫度。“固相支持物”是指一種固體材料，其能與化學(xué)結(jié)構(gòu)域如捕獲劑、反應(yīng)結(jié)構(gòu)域或能量吸附類物質(zhì)衍生化，或附著到其上?？捎玫墓滔嘀С治锇ㄐ酒?如探針)、微量滴定板和層析樹脂?！靶酒笔侵敢环N固相支持物，具有一個(gè)平坦的表面，化學(xué)結(jié)構(gòu)可附著其上。適用于形成探針接觸的芯片也稱為“探針”。“生物芯片”是指一種附著了化學(xué)結(jié)構(gòu)的探針。經(jīng)常地，探針的表面包含一種較多的定址位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)上附著了化學(xué)結(jié)構(gòu)?！暗鞍仔酒笔侵敢环N適用于捕獲蛋白的生物芯片。本領(lǐng)域已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了許多種蛋白芯片，包括比如由Ciphergen生物系統(tǒng)公司(弗里蒙特，CA)、Packsrd生物科學(xué)公司(Meriden CT)、Zyomyx(海達(dá)德，CA)以及Phylos(萊克星頓，MA)所生產(chǎn)的蛋白芯片。這些蛋白芯片的例子描述在以下的專利或?qū)＠暾?qǐng)中美國(guó)專利號(hào)6,225,047(Huntchens和Yip，“應(yīng)用滯留色譜法生成不同圖譜”，2001年5月1日)；國(guó)際PCT公開號(hào)W099/51773(Kuimelis和Wagner等，“可定址的蛋白測(cè)定”，1999年10月14日)；美國(guó)專利號(hào)6,329,209(Wagner等，“蛋白捕獲劑及其應(yīng)用方法的試驗(yàn)”，2001年12月11日)；以及國(guó)際PCT公開號(hào)WO 00/56934(Englert等，“多孔基質(zhì)試驗(yàn)”，2000年9月28日)。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，防衛(wèi)素可以在色譜的或生物特異的SELDI生物芯片上進(jìn)行檢測(cè)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，防衛(wèi)素在具有陽(yáng)離子交換表面的SELDI生物芯片(WCX2 ProteinChip點(diǎn)陣，Ciphergen生物系統(tǒng)公司)上可很好地被分辨。所述樣品被應(yīng)用于芯片并可進(jìn)行孵育以促進(jìn)吸收。然后將生物芯片在100mM乙酸鈉、pH4.5、以及含0.2％Triton-X100的PBS緩沖液中洗滌。蛋白通過質(zhì)譜儀來(lái)檢測(cè)。α-防衛(wèi)素呈現(xiàn)三組峰，約在3371D、3443D以及3484D。
可選擇地，防衛(wèi)素可在具有防衛(wèi)素特異性抗體的SELDI生物芯片上檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，SELDI生物芯片包含一些功能基團(tuán)，如通過將抗體在生物芯片表面上與反應(yīng)緩沖液孵育，將carboxodiimizole或環(huán)氧化物(如PS10或PS20 ProteinClip點(diǎn)陣，Clihergen Biosystems公司)與抗體衍生化。然后將所述樣品施加于芯片表面，孵育以促進(jìn)結(jié)合，并且洗滌。蛋白通過質(zhì)譜儀來(lái)檢測(cè)。
在被生物芯片捕獲后，防衛(wèi)素(或防衛(wèi)素調(diào)節(jié)劑以及結(jié)合防衛(wèi)素的化合物)可應(yīng)用質(zhì)譜儀來(lái)檢測(cè)，特別是應(yīng)用如前所述的SELDI進(jìn)行檢測(cè)。在質(zhì)譜儀中生成的數(shù)據(jù)起始于由離子檢測(cè)器檢測(cè)到離子。典型的激光解吸質(zhì)譜儀可應(yīng)用一種在337.1nm的氮激光。一種有用的脈沖寬度約在4毫微秒。通常地，使用的能量輸出約為1-25μJ。撞擊到檢測(cè)器的離子生成一種電潛能，然后被一種數(shù)字捕獲類似物信號(hào)的高速時(shí)間-點(diǎn)陣記錄儀器數(shù)字化。Ciphergen的ProteinClip系統(tǒng)提供了一種類似物-到-數(shù)字的變換器(ADC)來(lái)實(shí)現(xiàn)上述功能。所述ADC在規(guī)律性分布的間隔時(shí)間里將檢測(cè)器的輸出整合為時(shí)間-依賴的數(shù)據(jù)。所述時(shí)間間隔通常為一至四毫微秒。此外，最終分析的飛行時(shí)間光譜并非代表來(lái)自電離能量的單脈沖的信號(hào)，而是綜合了來(lái)自一定數(shù)量脈沖的信號(hào)，這降低了噪音并且提高了動(dòng)態(tài)范圍。然后將所述的飛行時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。在Ciphergen的ProteinClip軟件中，數(shù)據(jù)處理通常包括TOF-to-M/Z轉(zhuǎn)化、基線減除、高頻率噪音過濾。
TOF-to-M/Z轉(zhuǎn)化包括應(yīng)用一種算法，將飛行時(shí)間轉(zhuǎn)化為質(zhì)荷比(M/Z)。在該步驟中，信號(hào)被從時(shí)域轉(zhuǎn)換成質(zhì)域。也就是說，每個(gè)飛行時(shí)間被轉(zhuǎn)換為質(zhì)荷比或M/Z。校準(zhǔn)可在內(nèi)部或外部進(jìn)行。在內(nèi)部校準(zhǔn)中，被分析的樣品中包含一種或多種已知M/Z的分析物。飛行時(shí)間的信號(hào)峰代表那些測(cè)量過的分析物給定的已知的M/Z，基于這些給定的M/Z比率，可計(jì)算出參數(shù)，獲得將飛行時(shí)間轉(zhuǎn)換為M/Z的數(shù)學(xué)函數(shù)。在外部校準(zhǔn)中，一種將飛行時(shí)間轉(zhuǎn)換為M/Z的函數(shù)(如通過先前的內(nèi)部校準(zhǔn)中所創(chuàng)造的)被應(yīng)用于飛行時(shí)間光譜，而不使用內(nèi)部校準(zhǔn)。
基線減除通過消除人為的、擾亂光譜的可再生的儀器偏差，提高了數(shù)據(jù)的質(zhì)量。其包括應(yīng)用一種算法計(jì)算光譜基線，所述算法考慮了如峰寬等參數(shù)。然后從質(zhì)譜中減除基線。
高頻率噪音信號(hào)通過應(yīng)用濾波函數(shù)來(lái)消除。典型的濾波函數(shù)將移動(dòng)平均函數(shù)運(yùn)用到每個(gè)時(shí)間-依賴的數(shù)據(jù)中。在一種改進(jìn)的方式中，移動(dòng)平均過濾器是一種可變寬度數(shù)字過濾器，其中過濾器的頻帶寬度作為一個(gè)函數(shù)而改變，如峰的頻帶寬度，當(dāng)飛行時(shí)間提高時(shí)其也變寬。參見如WO 00/70648，2001年11月23日(Gavin等，“用于飛行時(shí)間質(zhì)譜的寬度可變的數(shù)字過濾器”)。
一種計(jì)算機(jī)可以將結(jié)果產(chǎn)生的光譜轉(zhuǎn)化為不同的格式來(lái)顯示。一種格式被稱為“質(zhì)譜觀察或滯留圖譜”，可顯示一種標(biāo)準(zhǔn)的光譜圖，其中所述圖譜描述了在任何特定分子量上到達(dá)檢測(cè)器的分析物的量。另一種格式被成為“峰圖譜”，僅能從光譜觀察中獲得峰高和質(zhì)量信息，生成一種清潔圖譜，使幾乎相同分子量的分析物可更容易識(shí)別。還有另一種格式被稱為“電泳樣圖譜”，基于每一個(gè)峰的高度，每一種來(lái)自峰的物質(zhì)可被轉(zhuǎn)化為亮度色標(biāo)圖象，形成一種類似于電泳凝膠的外觀。還有另一種格式被稱為“3-D覆蓋圖”，一些光譜可被覆蓋，以研究相對(duì)峰高度的細(xì)微變化。還有另一種格式被稱為“差別圖譜”，可比較兩種或多種光譜，方便地區(qū)分出獨(dú)特的分析物以及在樣品間上調(diào)或下調(diào)的分析物。
分析通常涉及在圖譜中進(jìn)行峰的鑒別，找出一種分析物的代表信號(hào)。當(dāng)然，峰的選擇可通過視覺。然而，也可用軟件，如用Ciphergen的ProteinClip軟件的一部分自動(dòng)檢測(cè)峰。通常，所述軟件通過鑒定具有高于所選閥值的信號(hào)-至-噪音比率的信號(hào)、并在峰信號(hào)的矩心標(biāo)記出峰而發(fā)揮作用。在一個(gè)有用的應(yīng)用中，比較許多光譜，鑒定出存在于一些所選百分?jǐn)?shù)質(zhì)譜中相同的峰。所述軟件的一種版本集成了所有存在于不同質(zhì)譜中具有一定質(zhì)量范圍的峰，并且向所有接近質(zhì)量(M/Z)集群中點(diǎn)的峰指定一種質(zhì)量(M/Z)。
來(lái)自一種或多種光譜的峰數(shù)據(jù)可被用于進(jìn)一步的分析，如創(chuàng)建一種電子數(shù)據(jù)表，每行代表一種特定質(zhì)量的光譜，每列代表光譜中由質(zhì)量限定的一種峰，并且每格中包括在特定光譜中的峰的強(qiáng)度。不同的統(tǒng)計(jì)或圖樣識(shí)別方法可被應(yīng)用于所述數(shù)據(jù)。
F.檢測(cè)HIV感染的試驗(yàn)在細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞或整個(gè)有機(jī)體中病毒的水平可通過本領(lǐng)域已知的手段進(jìn)行檢測(cè)。典型地，病毒水平用western印跡或其他免疫測(cè)定方法(如ELISA)來(lái)測(cè)定，或通過進(jìn)行定量PCR測(cè)定。在免疫測(cè)定方式中，病毒水平通過檢測(cè)病毒蛋白(或病毒衣殼)的量來(lái)測(cè)定，通過確定蛋白結(jié)合到免疫反應(yīng)性試劑(如一種抗體)上的量來(lái)定量。在定量PCR中，通過檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)得病毒核酸的水平，并將所獲的擴(kuò)增核酸的量與已知參考核酸經(jīng)擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物相比較。
生產(chǎn)多克隆和單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且許多抗病毒抗體是商業(yè)可利用的。參見如Coligan(1991)，Current Protocols in Immunology，Wiley/Greene，NY；以及Harlow和Lane(1989)，AntibodiesA Labora tory Manual，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社NY；Stites等(編)，Basic and Clinical Immunology(第4版)，Lange Medical Publications，Los Altos，CA，以及其中引用的參考文獻(xiàn)；Goding(1986)，Monoclonal AntibodiesLPriciples and Practice(第二版)，學(xué)術(shù)出版社，紐約，NY；以及Kohler和Milstein(1975)，Nature 256495-497。所述技術(shù)包括通過從噬菌體或類似載體重組抗體文庫(kù)中選擇抗體，制備抗體。參見Huse等(1989)，Science 2461275-1281；以及Ward等(1989)，Nature 341544-546。特異的單克隆抗體和多克隆抗體以及抗血清通常以KD小于約0.1mM結(jié)合，更特別地低于約1μM，更優(yōu)選地低于約0.01μM或更佳。
經(jīng)常地，多肽以及它們的相應(yīng)抗體通過共價(jià)地或非共價(jià)地連接一種可提供檢測(cè)信號(hào)的底物來(lái)標(biāo)記。許多標(biāo)記和偶連技術(shù)是已知，并被報(bào)導(dǎo)在許多科學(xué)和專利文獻(xiàn)中。合適的標(biāo)記包括放射核苷酸、酶、底物、輔助因子、抑制劑、熒光結(jié)構(gòu)、化學(xué)發(fā)光結(jié)構(gòu)、磁性顆粒，以及它們的類似物。指導(dǎo)應(yīng)用這些標(biāo)記的專利包括美國(guó)專利號(hào)3,817,837、3,850,753、3,939,350、3,996345、4,277437、4,275149和4,366,241。
在一個(gè)優(yōu)選類型的實(shí)施方案中，當(dāng)定量本發(fā)明中的病毒抑制時(shí)測(cè)定病毒蛋白，用于檢測(cè)患者中的病毒(如HIV)。比如，HIV多肽被常規(guī)地用于western印跡，以檢測(cè)在患者血液中的抗HIV抗體，并且相反的實(shí)驗(yàn)(用于檢測(cè)患者血液中的HIV)適合于檢測(cè)患者血液中含有的HIV病毒。所述試驗(yàn)是已知的，并且存在一種標(biāo)準(zhǔn)的方法，通過該方法測(cè)定患者中的HIV-1和HIV-2感染。許多免疫測(cè)定方式是已知的并且是可實(shí)施的。
一種特定的蛋白可通過許多免疫測(cè)定方法來(lái)定量，如需參考一般的免疫學(xué)和免疫測(cè)定方法，可參見Stites和Terr(編)1991，Basic and Clinical Immunology(第7版)。此外，本發(fā)明中的免疫測(cè)定方法可在任何以下方案中進(jìn)行，所述方案論述在Maggio編，(1980)，酶學(xué)免疫測(cè)定，CRC Press，Bica Raton，F(xiàn)lorida；Tijan(1985)，“酶免疫測(cè)定的實(shí)踐與原理”，Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology，Elsevier Science Publishers B.V.，Amsterdam；Haelow和Lane，同上；Chan(編)(1987)，ImmunoassayAPractical Guide Academic Press，Orlando，F(xiàn)L；Price和Newman(編)(1991)，Principles and Practice ofImmunoassays，Stockton Press，NY；以及Ngo(編)(1988)，Non isotopicImmunoassays，Plenum Press，NY.。
一種HIV轉(zhuǎn)錄子、抗體或多肽優(yōu)選在生物樣品中定量，如患者的細(xì)胞或組織樣品。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，HIV多肽抗血清在血清中定量。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，HIV核酸在感染的患者中定量，應(yīng)用衍生自本發(fā)明的核酸的基因探針。比如，在一個(gè)實(shí)施方案中，在生物樣品中的HIV核酸通過體外擴(kuò)增技術(shù)(如PCR或LCR)擴(kuò)增，應(yīng)用經(jīng)標(biāo)記的互補(bǔ)核酸進(jìn)行檢測(cè)。
如需要，樣品可進(jìn)行預(yù)處理，稀釋在適當(dāng)?shù)木彌_溶液中或進(jìn)行濃縮。存在許多標(biāo)準(zhǔn)的水性緩沖液，應(yīng)用許多緩沖液的一種，如磷酸、Tris或類似物，在生理pH值是合適的。細(xì)胞分類技術(shù)如FACS可選擇性地應(yīng)用于分離特定的細(xì)胞，如CD4+細(xì)胞，從而定量其中的病毒。
本發(fā)明的HIV抗體、多肽和核酸通過任何本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的手段進(jìn)行檢測(cè)。這些手段包括分析生物化學(xué)方法如熒光分光光度法、放射照相術(shù)、電泳、毛細(xì)電泳、高效液相色譜(HPLC)、薄層層析(TLC)、超擴(kuò)散色譜，以及類似方法。并且，還有許多免疫學(xué)方法如液體或凝膠沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散(單或雙)、免疫電泳、放射免疫測(cè)定(RIA)、酶連接的免疫吸收劑試驗(yàn)(ELISA)、免疫熒光試驗(yàn)，以及類似方法。通過已知方法的核酸檢測(cè)如Southern印跡、northern分析、凝膠電泳、PCR、放射標(biāo)記、閃光計(jì)數(shù)，以及親和層析。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，在免疫測(cè)定和核酸試驗(yàn)中以及在純化分析物期間，應(yīng)該降低非特異性結(jié)合。當(dāng)所述測(cè)定涉及一種病毒抗體或其他捕獲劑被固定在固體底物上時(shí)，需要把非特異性結(jié)合到底物上的量降到最低。降低這種非特異性結(jié)合的手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。典型地，所述手段包括用蛋白組合物包被底物。特別地，蛋白組合物如牛血清白蛋白(BSA)、脫脂粉狀牛奶、以及明膠被廣泛地應(yīng)用.Wesrern印跡分析也可應(yīng)用于檢測(cè)和定量樣品中多肽或蛋白(包括肽、轉(zhuǎn)錄子或酶消化產(chǎn)物)的存在。所述技術(shù)通常包含通過凝膠電泳，基于分子量的不同分離樣品產(chǎn)物，轉(zhuǎn)移分離的產(chǎn)物至合適的固相支持物上(如硝化纖維素、尼龍或衍生的尼龍)，將樣品與標(biāo)記的可特異性結(jié)合到分析物蛋白(抗體或HIV-2多肽)的抗體共同孵育。標(biāo)記抗體特異地結(jié)合到位于固相支持物上的分析物上。這些抗體可直接進(jìn)行標(biāo)記，或可選擇地，后續(xù)應(yīng)用標(biāo)記試劑如特異性結(jié)合到標(biāo)記抗體的抗體(如標(biāo)記的羊抗鼠抗體，該抗體結(jié)合的分析物是一種鼠抗體)進(jìn)行檢測(cè)。
其他測(cè)定方法包括脂質(zhì)體免疫測(cè)定(LIAs)，應(yīng)用設(shè)計(jì)成可結(jié)合特異分子(如抗體)的脂質(zhì)體，釋放出封裝在內(nèi)的試劑或標(biāo)記，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)檢測(cè)釋放的化學(xué)物(參見Monroe等，(1986)，Amer.Clin.Prod.Rev.534-41)。
G.本發(fā)明的多肽的調(diào)節(jié)劑的鑒定本發(fā)明的多肽的調(diào)節(jié)劑，即多肽活性、多肽或多核苷酸表達(dá)的激動(dòng)劑或拮抗劑，其對(duì)于治療與HIV感染相關(guān)的疾病是有用的，如這里所描述。例如，給藥調(diào)節(jié)劑可用于治療AIDS患者或防止HIV感染的個(gè)體向AIDS進(jìn)展，以及治療HIV或AIDS相關(guān)的癥狀。
本發(fā)明中優(yōu)選的調(diào)節(jié)劑是那些可在蛋白水平上提高防衛(wèi)素活性的，如通過提高防衛(wèi)素的半衰期，或通過使前-前防衛(wèi)素分子獲得增強(qiáng)的加工能力，更高效或促進(jìn)翻譯，通過螯合細(xì)胞內(nèi)防衛(wèi)素的抑制劑，通過防止防衛(wèi)素降解，提高防衛(wèi)素的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)，以及提供防衛(wèi)素通路中重要的分子。優(yōu)選的調(diào)節(jié)劑包括那些在核酸水平上提高防衛(wèi)素表達(dá)的，如防衛(wèi)素啟動(dòng)子活化物、提高防衛(wèi)素基因的染色體可接近性的化合物、提高防衛(wèi)素RNA穩(wěn)定性和加工性的化合物、以及提高在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中防衛(wèi)素RNA水平的化合物。
1.調(diào)節(jié)本發(fā)明的多肽的試劑可作為防衛(wèi)素蛋白的調(diào)節(jié)劑的測(cè)試化合物可以是任何小型有機(jī)分子、或生物實(shí)體，比如一種蛋白(如抗體或肽)、一種糖、一種核酸(如反義寡核苷酸或核酶)或脂質(zhì)?？蛇x擇地，調(diào)節(jié)劑可以是遺傳學(xué)改變方式的防衛(wèi)素蛋白。典型地，測(cè)試化合物將是小型有機(jī)分子、肽、RNA、反義分子、核酶以及脂質(zhì)。
盡管最多的是應(yīng)用那些可溶解在水溶液或有機(jī)(特別是基于DMSO的)溶液中的化合物，但在本發(fā)明的試驗(yàn)中，本質(zhì)上任何化學(xué)化合物可被作為潛在的調(diào)節(jié)劑或配體。所述試驗(yàn)被設(shè)計(jì)成通過自動(dòng)進(jìn)行的試驗(yàn)步驟篩選巨大的化學(xué)文庫(kù)，并提供來(lái)自任何便利來(lái)源的化合物進(jìn)行試驗(yàn)，其通常是平行運(yùn)行的(如在自動(dòng)試驗(yàn)中，在微量滴定板上采取微量滴定的形式)?？梢岳斫猓嬖谠S多化學(xué)化合物的供給來(lái)源，包括Sigma(圣路易斯，MO)、Aldrich(圣路易斯，MO)，Sigma-Aldrich(圣路易斯，MO)，F(xiàn)lukaChemika-Biochemica Analytika(Buchs，Switzerland)，以及類似來(lái)源。
2.篩選本發(fā)明的多肽的調(diào)節(jié)劑的方法許多不同的體外和體內(nèi)篩選方案可被用于在細(xì)胞中，特別是在人細(xì)胞中，鑒定可調(diào)節(jié)本發(fā)明的多肽的多核苷酸的表達(dá)水平或活性的試劑。在普通的方式中，所述篩選方法包括篩選許多試劑，來(lái)鑒定出一種可調(diào)節(jié)本發(fā)明的多肽的活性的試劑，如通過結(jié)合到多肽、阻止一種抑制劑或活化劑結(jié)合到多肽、促進(jìn)抑制劑或活化劑與多肽的結(jié)合、或者活化或抑制多肽的表達(dá)。
任何表達(dá)本發(fā)明的全長(zhǎng)多肽或其片段的細(xì)胞可被用于鑒定調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是真核細(xì)胞系(如CHO)，被轉(zhuǎn)化以表達(dá)一種異源的本發(fā)明的多肽。在一些實(shí)施方案中，應(yīng)用一種表達(dá)內(nèi)源性多肽的細(xì)胞(CD4)篩選。在另外的實(shí)施方案中，根據(jù)抑制HIV復(fù)制的能力篩選調(diào)節(jié)劑。
a)多肽結(jié)合試驗(yàn)初步篩選通過篩選能夠結(jié)合到本發(fā)明的多肽的試劑來(lái)進(jìn)行，因?yàn)橹辽僖恍┤绱髓b定的試劑很可能是本發(fā)明的多肽的調(diào)節(jié)劑。結(jié)合試驗(yàn)對(duì)于鑒定內(nèi)源性可與本發(fā)明的多肽反應(yīng)的蛋白也是有用的。例如，抗體、受體或其他結(jié)合本發(fā)明的多肽的分子可在結(jié)合試驗(yàn)中被鑒定出。
結(jié)合試驗(yàn)通常涉及將一種或多種測(cè)定試劑與本發(fā)明的多肽接觸，給予足夠的時(shí)間使蛋白和測(cè)定試劑形成結(jié)合復(fù)合物。任何形成的復(fù)合物可通過應(yīng)用任何已建立的分析技術(shù)被檢測(cè)到。蛋白結(jié)合試驗(yàn)包括但不限于在非變性SDS聚丙烯酰胺凝膠上檢測(cè)共沉淀或共遷移的方法，以及在Western印跡上檢測(cè)的共遷移(參見如Bennet J.P.以及Yamamura，H.I.(1985)，在Neurotransmitter Receptor Binding(Yamamura，H.I.等編)中，第61-89頁(yè)，“神經(jīng)傳遞素、激素或藥物受體結(jié)合方法”)。其他結(jié)合試驗(yàn)包括應(yīng)用質(zhì)譜儀或NMR技術(shù)來(lái)鑒定結(jié)合到本發(fā)明的多肽的分子，或置換標(biāo)記的底物的方法。利用在這些試驗(yàn)中的本發(fā)明的多肽是可被天然表達(dá)、克隆或合成的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，運(yùn)用一種高通量結(jié)合試驗(yàn)來(lái)鑒定結(jié)合到防衛(wèi)素的分子，其中所述防衛(wèi)素蛋白或其片段與一種潛在的調(diào)節(jié)劑接觸，孵育適當(dāng)量的時(shí)間，檢測(cè)和/或定量防衛(wèi)素和所述分子的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述潛在的調(diào)節(jié)劑被結(jié)合到固相支持物上，然后加上防衛(wèi)素蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，防衛(wèi)素蛋白結(jié)合到固相支持物上?？蓱?yīng)用大量的調(diào)節(jié)劑，如前所述，包括小型有機(jī)分子、肽、抗體和防衛(wèi)素配體類似物。可應(yīng)用大量的測(cè)定試驗(yàn)來(lái)鑒定防衛(wèi)素調(diào)節(jié)劑的結(jié)合，包括標(biāo)記的蛋白-蛋白結(jié)合試驗(yàn)、電泳淌度移動(dòng)、免疫測(cè)定、酶測(cè)定如激酶測(cè)定，以及類似方法。在一些情況下，侯選調(diào)節(jié)劑的結(jié)合通過應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)來(lái)測(cè)定，在潛在的調(diào)節(jié)劑存在下測(cè)定已知配體或底物的結(jié)合干擾。調(diào)節(jié)劑或已知配體或底物都可先進(jìn)行結(jié)合，然后加入競(jìng)爭(zhēng)物。洗滌防衛(wèi)素蛋白后，測(cè)定調(diào)節(jié)劑或已知配體或底物的結(jié)合干擾。經(jīng)常地，潛在調(diào)節(jié)劑或已知配體或底物是經(jīng)過標(biāo)記的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述測(cè)定是基于SELDI的測(cè)定，采用如前面“2.防衛(wèi)素多肽的SELDI檢測(cè)”中所描述的方法，在所述測(cè)定中，防衛(wèi)素/測(cè)試化合物對(duì)中的一員被結(jié)合到一個(gè)基于SELDI的芯片(如一種預(yù)活化的ProteiClip點(diǎn)陣，獲自Ciphergen生物系統(tǒng)公司)的表面，其他成員與生物芯片的表面接觸。所述防衛(wèi)素/測(cè)試化合物對(duì)之間的結(jié)合通過SELDI檢測(cè)。例如，一種防衛(wèi)素蛋白可以結(jié)合到生物芯片的表面，然后可將測(cè)試化合物文庫(kù)與之接觸。洗掉沒有結(jié)合的分子。然后發(fā)生結(jié)合的分子通過SELDI檢測(cè)。
高通量篩選包括提供一種組合的小型有機(jī)分子或肽文庫(kù)，其中包含大量的潛在治療性化合物(潛在的調(diào)節(jié)劑或配體化合物)。然后如這里所描述的，用一種或多種測(cè)定方法篩選所述“組合的化學(xué)文庫(kù)”或“配體文庫(kù)”，鑒定那些顯示所需特征活性的文庫(kù)成員(特別是化學(xué)類型或小類)。這樣鑒定出來(lái)的化合物可作為傳統(tǒng)的“先導(dǎo)化合物”或自身可用作潛在的或?qū)嶋H的治療物質(zhì)。
一種組合的化學(xué)文庫(kù)是不同的化學(xué)合成或生物合成的化學(xué)物質(zhì)的集合，通過集合許多化學(xué)的“積木”來(lái)實(shí)現(xiàn)，如試劑。例如，一種線性組合化學(xué)文庫(kù)如多肽文庫(kù)是通過在任何可能的途徑中根據(jù)給定的化合物長(zhǎng)度(即在多肽化合物中的氨基酸數(shù)目)集合一組化學(xué)“積木”(氨基酸)來(lái)形成的。通過這種化學(xué)“積木”的組合，可以合成成百上千萬(wàn)個(gè)化學(xué)組合物。
制備和篩選組合的化學(xué)文庫(kù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)。所述的組合的化學(xué)文庫(kù)包括但不限于肽文庫(kù)(參見如美國(guó)專利號(hào)5,010,175，F(xiàn)urka，Int.J.Pept.Res.，37487-493(1991)；以及Houghton等，Nature，35484-88(1991))。也可應(yīng)用其他可生成化學(xué)多樣性文庫(kù)的化學(xué)物質(zhì)。所述的化學(xué)物質(zhì)包括但不限于類肽(如PCT公開號(hào)WO 91/19735)、編碼的肽(如PCT公開號(hào)WO93/20242)、隨機(jī)生物低聚體(如PCT公開號(hào)WO92/00091)、苯并二氮(如美國(guó)專利號(hào)5,288,514)、異化體(diversomer)如乙內(nèi)酰脲、苯并二氮和二肽(Hobbs等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，906909-6913(1993))、插烯多肽(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.，1146568(1992))、具有葡萄糖框架的非肽的肽模擬物(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.，1149217-9218(1991))、小化合物文庫(kù)的類似有機(jī)綜合體(Chen等，J.Amer.Chem.Soc.，1162662(1994)、寡氨基甲酸酯(Cho等，Science，2611303(1993))，和/或肽酰磷酸酯(Campbell等，J.Org.Chem.59658(1994))、核酸文庫(kù)(參見Ausubel，Berger和Sambrook，all同上)、肽核酸文庫(kù)(參見如美國(guó)專利號(hào)5,393,083)、抗體文庫(kù)(參見如Vaughn等，Nature Biotechnolog，14(3)309-314(1996)和PCT/US96/10287)、碳水化合物文庫(kù)(參見如Liang等，Science，2741520-1522(1996)和美國(guó)專利號(hào)5,593,853)、小型有機(jī)分子文庫(kù)(參見如苯并二氮，Baum C&EN，1月18日，第33頁(yè)(1993)；類異戊二烯，美國(guó)專利號(hào)5,569,588；噻唑丁酮和metathiazanone，美國(guó)專利號(hào)5,549,974；吡咯烷，美國(guó)專利號(hào)5,525,735和5,519,134；嗎啉化合物，美國(guó)專利號(hào)5,506,337；苯并二氮，美國(guó)專利號(hào)5,288,514等)。
制備組合的文庫(kù)的設(shè)備是商業(yè)可購(gòu)買的(參見如357 MPS，390 MPS，Advanced ChemTech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433A Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。并且，許多組合的文庫(kù)是自身商業(yè)可購(gòu)買的(參見如ComCenex，普林斯頓，N.J.，Asinex，PA，MartekBiosciences，哥倫比亞，MD等)。
此外，哺乳動(dòng)物或酵母雙雜交方法(參見如Bartel，P.L.等，Methods Enzymol，254241(1995))可被用于鑒定當(dāng)在同一宿主細(xì)胞中時(shí)發(fā)生反應(yīng)或結(jié)合的多肽或其他分子。
b)多肽活性本發(fā)明的多肽的活性可應(yīng)用許多體外和體內(nèi)測(cè)定來(lái)評(píng)估，以確定功能、化學(xué)和物理影響，如酶活性、細(xì)胞增殖(如CD4+淋巴細(xì)胞增殖)、HIV復(fù)制、HIV蛋白表達(dá)、或者配體或底物結(jié)合。此外，所述測(cè)定可被用于測(cè)定本發(fā)明的多肽的抑制劑或活化劑。調(diào)節(jié)劑也可以是本發(fā)明的多肽的遺傳學(xué)改變形式。
所述測(cè)定的多肽選自一種具有由這里所描述的登錄號(hào)或SEQ ID NO1-24所編碼的序列的多肽，或其保守性改變變體?？蛇x擇地，所述防衛(wèi)素多肽獲自一種真核細(xì)胞，并包括氨基酸亞序列，其具有與這里所描述的登錄號(hào)的氨基酸序列基本相同的序列。通常，氨基酸序列相同性為至少60％，優(yōu)選至少65％、70％、75％、80％、85％或90％，最優(yōu)選至少95％?？蛇x擇地，所述測(cè)定的多肽包含本發(fā)明的多肽的一個(gè)片段，如細(xì)胞外區(qū)域、跨膜區(qū)域、細(xì)胞質(zhì)區(qū)域、配體結(jié)合區(qū)域、亞基相關(guān)區(qū)域、活性位點(diǎn)，以及類似結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的多肽或其一個(gè)區(qū)域都可共價(jià)地連接到一種異源蛋白上，創(chuàng)建一種嵌合蛋白，應(yīng)用在這里所描述的測(cè)定中。
應(yīng)用本發(fā)明的重組或天然存在的多肽可測(cè)定多肽的調(diào)節(jié)劑的活性。所述蛋白可被分離，在細(xì)胞中表達(dá)，在來(lái)自某個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)，在組織或一種動(dòng)物中表達(dá)，重組的或天然存在的。比如，可應(yīng)用組織切片、游離細(xì)胞如來(lái)自表達(dá)本發(fā)明的多肽的組織的細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞或細(xì)胞膜。應(yīng)用一種這里所述的體外或體內(nèi)測(cè)定來(lái)測(cè)定調(diào)節(jié)劑。
結(jié)合到本發(fā)明的多肽的調(diào)節(jié)劑、一個(gè)區(qū)域或嵌合蛋白可在溶液中、在雙分子層膜中、附著到固相支持物上、在脂質(zhì)單體中或在囊泡中進(jìn)行測(cè)定?？蓱?yīng)用如分光特性(如熒光、吸光率、折射率)、流體動(dòng)力學(xué)(如外形)、色譜或溶解特性的改變來(lái)測(cè)定調(diào)節(jié)劑的結(jié)合。
將用潛在的調(diào)節(jié)劑(如一種“測(cè)試化合物”)處理的樣品或試驗(yàn)與沒有測(cè)試化合物的對(duì)照樣品進(jìn)行比較，檢測(cè)調(diào)節(jié)劑的效力。指定對(duì)照樣品(未用活化劑或抑制劑處理的)的相對(duì)活性值為100。當(dāng)活性值相對(duì)于對(duì)照樣品約90％，特別為50％、更特別為25-0％時(shí)，本發(fā)明的多肽的抑制作用成立。當(dāng)活性值相對(duì)于對(duì)照為110％，可選擇地為150％、200％、300％、400％、500％，或1000-2000％時(shí)，防衛(wèi)素的活化作用成立。
c)表達(dá)測(cè)定也提供了篩選調(diào)節(jié)本發(fā)明的多核苷酸和多肽表達(dá)的化合物的篩選。篩選方法通常包括進(jìn)行基于細(xì)胞的測(cè)定，測(cè)試化合物與一種或多種表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸或多肽的細(xì)胞結(jié)合，然后檢測(cè)表達(dá)(轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或翻譯產(chǎn)物)的提高或降低。測(cè)定可以在任何本發(fā)明的多核苷酸和多肽的細(xì)胞中進(jìn)行。可以通過許多不同的途徑來(lái)檢測(cè)表達(dá)。如下文所描述的，本發(fā)明的多核苷酸在細(xì)胞中的表達(dá)水平可通過探測(cè)細(xì)胞中mRNA的表達(dá)來(lái)確定，應(yīng)用一種可特異性與本發(fā)明的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交的探針(或其互補(bǔ)核酸)?？赏ㄟ^溶解細(xì)胞來(lái)進(jìn)行探測(cè)，進(jìn)行Northern印跡；也可不溶解細(xì)胞，應(yīng)用原位雜交技術(shù)進(jìn)行?？蛇x擇地，本發(fā)明的多肽可應(yīng)用免疫性方法來(lái)檢測(cè)，用能夠特異性結(jié)合到多肽上的抗體來(lái)探測(cè)細(xì)胞溶解產(chǎn)物。
本發(fā)明的多核苷酸或多肽的表達(dá)或活性的水平可與基線值相比較?；€值可以是對(duì)照樣品值或是統(tǒng)計(jì)值，代表了針對(duì)特定群體(如AIDS進(jìn)展者)或細(xì)胞(如沒有與調(diào)節(jié)劑接觸的組織培養(yǎng)細(xì)胞)，本發(fā)明的多核苷酸或多肽的表達(dá)水平。合適的用于所述基于細(xì)胞的測(cè)定的細(xì)胞包括初級(jí)細(xì)胞如PBMCs、淋巴細(xì)胞(如CD4+)、嗜中性粒細(xì)胞、多形核白細(xì)胞，以及其它噬菌細(xì)胞核細(xì)胞系，如Jurkat細(xì)胞、BJAB細(xì)胞等。所述防衛(wèi)素蛋白可以是天然存在的、化學(xué)合成的或重組的。
d)動(dòng)物模型本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，HIV感染的動(dòng)物模型也可用于篩選防衛(wèi)素的調(diào)節(jié)劑。同樣地，也可應(yīng)用包括基因敲除技術(shù)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)，比如，與一種合適的基因靶向載體同源重組，或基因超表達(dá)，將引起防衛(wèi)素蛋白的不表達(dá)或提高表達(dá)。類似的技術(shù)也可應(yīng)用于制造敲除細(xì)胞。
可通過同源重組技術(shù)，在小鼠基因組的內(nèi)源防衛(wèi)素基因位點(diǎn)插入標(biāo)記基因或其他異源基因，制備敲除細(xì)胞和基因小鼠。所述小鼠也可通過用突變型防衛(wèi)素基因取代內(nèi)源防衛(wèi)素來(lái)制備；或通過對(duì)內(nèi)源防衛(wèi)素進(jìn)行突變，如將其與致癌物質(zhì)接觸。
將一種DNA結(jié)構(gòu)導(dǎo)入到胚胎干細(xì)胞的核中。將包含所述新遺傳型的細(xì)胞注入宿主小鼠胚胎中，再移植進(jìn)入受體雌鼠中，一些胚胎發(fā)展成嵌合的小鼠，擁有部分來(lái)自突變細(xì)胞系的生殖細(xì)胞。因此，通過繁殖這種嵌合小鼠，可能獲得一種包含有導(dǎo)入基因型的新的小鼠(參見如Capecchi等，Science，2441288(1989))。嵌合型打靶小鼠可根據(jù)以下文獻(xiàn)中的方法制備Hogan等，小鼠胚胎的操作實(shí)驗(yàn)指南，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1988)；以及畸胎癌核胚胎干細(xì)胞實(shí)踐方法，Robertson編，IRL Press，華盛頓(1987)。
e)固相和溶液高通量測(cè)定在本發(fā)明的高通量測(cè)定中，在一天中可能篩選高達(dá)數(shù)千的不同調(diào)節(jié)劑或配體。特別地，可應(yīng)用微量滴定板的每個(gè)孔來(lái)進(jìn)行分離的針對(duì)一個(gè)潛在調(diào)節(jié)劑的測(cè)定；或者，如果需要觀察濃度或孵育時(shí)間，可用5-10個(gè)孔測(cè)定一種調(diào)節(jié)劑。因此，單塊標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板可以測(cè)定約100(如96)個(gè)調(diào)節(jié)劑。如果應(yīng)用了含1536個(gè)孔的板，則單塊板可以方便地測(cè)定從約100至約1500個(gè)不同的化合物。每天測(cè)定幾塊不同的板也是可能的；應(yīng)用本發(fā)明的完整的系統(tǒng)，可能篩選高達(dá)約6,000-20,000或更多的不同化合物。此外，可應(yīng)用微流方法進(jìn)行試劑處理。
特定的分子(如本發(fā)明的多肽或多核苷酸，或其調(diào)節(jié)劑)可直接或間接地結(jié)合到固態(tài)組合物上，通過共價(jià)或非共價(jià)的連接方式，如通過一種標(biāo)簽(tag)。所述的標(biāo)簽可以是許多組合物中的任意一種。通常，一種結(jié)合到標(biāo)簽的分子(一種標(biāo)簽結(jié)合物)被固定在一種固相支持物上，通過標(biāo)簽和標(biāo)簽結(jié)合物的相互作用，所述標(biāo)簽分子被附著到固相支持物上。
基于已知的分子相互作用，許多的標(biāo)簽和標(biāo)簽結(jié)合物可被應(yīng)用，這在許多文獻(xiàn)中有描述。例如，當(dāng)標(biāo)簽具有天然的結(jié)合物時(shí)，如生物素、蛋白A、或蛋白G可被用于連接到適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽結(jié)合物上(抗生物素蛋白、鏈霉親和素、中性鏈親和素、免疫球蛋白的Fc區(qū)、多聚組氨酸等)上。具有天然結(jié)合物的分子(如生物素)以及適當(dāng)?shù)臉?biāo)記結(jié)合物的抗體也被廣泛地應(yīng)用，(參見SIGMA免疫化學(xué)1998目錄，SIGMA，圣路易斯MO)。
同樣地，任何半抗原或抗原性化合物可被用于結(jié)合適當(dāng)?shù)目贵w，形成標(biāo)簽/標(biāo)簽結(jié)合物對(duì)。數(shù)千種特定抗體是商業(yè)可用的，并且有許多另外的抗體被描述在文獻(xiàn)中。例如，在一種普通配置方案中，所述標(biāo)簽是一種第一抗體，標(biāo)簽結(jié)合物是一種結(jié)合第一抗體的第二抗體。除了抗體-抗原反應(yīng)，受體-配體反應(yīng)也適合于作為標(biāo)簽和標(biāo)簽結(jié)合物對(duì)，如作為細(xì)胞膜受體的激動(dòng)劑和拮抗劑(如細(xì)胞受體-配體反應(yīng)，如c-kit、病毒受體配體、細(xì)胞因子受體、趨化因子受體、白細(xì)胞介素受體、免疫球蛋白受體和抗體、鈣粘素家族、整合素家族、選擇素家族，以及類似物。參見如Pigott和Power，The Adhesion Molecule Facts Book I(1993))。同樣地，毒素和毒物、病毒決定簇、激素(如鴉片劑、類固醇)、細(xì)胞內(nèi)受體(如其能介導(dǎo)不同小配體的作用，包括類固醇、甲狀腺激素、類維生素A和維生素D；以及肽)、藥物、凝集素、糖、核酸(線性和環(huán)狀聚合結(jié)構(gòu))、低聚糖、蛋白、磷脂以及可與不同細(xì)胞受體反應(yīng)的抗體。
合成的聚合體，如聚氨酯橡膠、聚酯、聚碳酸酯、聚亞安酯、聚酰胺、聚乙烯亞胺、聚芳基硫、聚硅氧烷、聚酰亞胺和聚醋酸酯也可用于形成一種適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽或標(biāo)簽結(jié)合物。在參考了這里所公開的內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然清楚，許多其他標(biāo)簽/標(biāo)簽結(jié)合物對(duì)也是對(duì)本發(fā)明的測(cè)定系統(tǒng)有用的。
普通的連接物如肽、聚醚以及類似物也能用作標(biāo)簽，包括多肽序列，如約5-200個(gè)氨基酸的聚-苷氨酸(gly)序列。所述靈活的連接物對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。比如，Shearwater Polymers公司(Huntsville，阿拉巴馬州)提供的聚(乙烯乙二醇)連接物?？扇芜x地，這些連接物具有酰胺連接、巰基連接或異功能連接。
應(yīng)用任何可用的現(xiàn)有方法將標(biāo)簽結(jié)合物固定到固相底物上。通常通過把底物的所有或部分與一種化學(xué)試劑接觸，將可與標(biāo)簽結(jié)合物反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)固定到表面，獲得衍生化的或功能化的固相底物。比如，適合于附著到長(zhǎng)鏈部分的基團(tuán)包括胺、羥基、硫醇以及羧基基團(tuán)。氨烷基硅烷和羥烷基硅烷可被用于功能化許多的表面，如玻璃表面。所述固相生物聚合體陣列在文獻(xiàn)中多有描述(參見如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149-2154(1963)(描述肽的固相合成)；Geysen等，J.Immun.Meth.102259-274(1987)(描述固相組分的合成)；Frank和Doring，Tetrahedron4460316040(1988)(描述在纖維素板上不同肽序列的合成)；Fodor等，Science，251767-777(1991)；Sheldon等，Clinical Chemistry 39(4)718-719(1993)；以及Kozal等，Mature Medicine 2(7)753-759(1996)(都描述生物聚合體固定到固相底物的陣列)。用于將標(biāo)簽結(jié)合物固定到底物的非化學(xué)途徑包括其他常規(guī)方法，如加熱、用UV輻射進(jìn)行交聯(lián)，以及類似方法。
本發(fā)明提供了體外測(cè)定方法，用于在高通量方式下鑒定可調(diào)節(jié)本發(fā)明的多肽的表達(dá)或活性的化合物，如免疫測(cè)定方法，如ELISA。因?yàn)闇y(cè)定是高度一致的，在一個(gè)孔進(jìn)行選擇性對(duì)照反應(yīng)，進(jìn)行不包括潛在調(diào)節(jié)劑的反應(yīng)，對(duì)比測(cè)定本發(fā)明的多肽活性。所述選擇性對(duì)照反應(yīng)是合適的，并能提高測(cè)定的可靠性。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括所述的對(duì)照反應(yīng)。對(duì)于每一種已描述的測(cè)定方式，不包括調(diào)節(jié)劑的“無(wú)調(diào)節(jié)劑”對(duì)照反應(yīng)提供了結(jié)合活性的背景水平。
在一些測(cè)定中，需要陽(yáng)性對(duì)照。至少兩種類型的陽(yáng)性對(duì)照是合適的。首先，將一種已知的本發(fā)明的多肽或多核苷酸的活化物與所述測(cè)定的樣品孵育，結(jié)果信號(hào)提高，說明本發(fā)明的多肽或多核苷酸的表達(dá)水平或活性提高了。第二，可加入一種已知的本發(fā)明的多肽或多核苷酸的抑制物，結(jié)果信號(hào)降低，說明本發(fā)明的多肽或多核苷酸的表達(dá)水平或活性降低了?？梢岳斫猓{(diào)節(jié)劑也可與活化物或抑制物結(jié)合，尋找抑制所述提高或降低(由已知的本發(fā)明的多肽或多核苷酸的調(diào)節(jié)劑引起的)的調(diào)節(jié)劑。
H.與防衛(wèi)素多肽反應(yīng)的分子的測(cè)定除了提供可用于鑒定防衛(wèi)素調(diào)節(jié)劑的測(cè)定以外，本發(fā)明還提供了用于與防衛(wèi)素多肽反應(yīng)的分子的測(cè)定。與α-防衛(wèi)素反應(yīng)的來(lái)自CD4+細(xì)胞的分子在α-防衛(wèi)素的抗病毒活性方面可能是重要的，從而其可能是藥物調(diào)節(jié)的靶點(diǎn)。因此，本發(fā)明提供了檢測(cè)這些分子的試驗(yàn)。所述方法包括將CD4+細(xì)胞與α-防衛(wèi)素接觸足夠的時(shí)間，誘導(dǎo)抗病毒反應(yīng)，然后從CD4+細(xì)胞中或從培養(yǎng)所述細(xì)胞的培養(yǎng)介質(zhì)中捕獲可結(jié)合α-防衛(wèi)素的分子。結(jié)合到α-防衛(wèi)素的分子的捕獲可以通過間接或直接的方式進(jìn)行。
在一種直接的方法中，在與α-防衛(wèi)素接觸后，將來(lái)自細(xì)胞的材料與一種固定的α-防衛(wèi)素接觸，如衍生化的珠或親和生物芯片(如PtoteinClip陣列)。任何結(jié)合α-防衛(wèi)素的分子將被捕獲在固相上。然后，可洗滌固相，移走未結(jié)合的材料，將結(jié)合到α-防衛(wèi)素的分子洗脫，通過任何已知的方式進(jìn)行檢測(cè)。
在一種間接的方法中，在與α-防衛(wèi)素接觸后，將來(lái)自細(xì)胞的材料與一種可結(jié)合α-防衛(wèi)素的捕獲試劑接觸。所述試劑可以是固定的抗α-防衛(wèi)素抗體或溶液狀的抗α-防衛(wèi)素抗體(其自身可被捕獲在固相上)。在這種方式中，任何結(jié)合α-防衛(wèi)素的分子將與α-防衛(wèi)素一起被捕獲。然后，可洗滌固相，移走未結(jié)合的材料，將結(jié)合到α-防衛(wèi)素的分子洗脫和檢測(cè)。
I.試劑盒本發(fā)明也提供了檢測(cè)防衛(wèi)素的試劑盒。所述試劑盒是有用的，比如可用于診斷或預(yù)后測(cè)定。試劑盒通常包括一種用于捕獲防衛(wèi)素的固相，適合于固相上捕獲的分子的檢測(cè)。因此，所述固相可以用抗防衛(wèi)素的抗體衍生化；或者所述試劑盒中包括一種抗體，可通過它來(lái)將底物衍生化。所述固相包括微量滴定板、珠，或適于質(zhì)譜檢測(cè)的生物芯片，如Ciphergen生物系統(tǒng)公司提供的ProteinClip陣列(如PS1ProteinClip陣列或PS2 ProteinClip陣列。特別有用的試劑盒是包含捕獲試劑或檢測(cè)定劑的試劑盒，用于至少兩種不同的防衛(wèi)素或至少三種不同的防衛(wèi)素。當(dāng)用于α-防衛(wèi)素時(shí)，由于序列相同性，可用單種抗體捕獲α-防衛(wèi)素1、2和3?？刹捎觅|(zhì)譜來(lái)區(qū)別這些α-防衛(wèi)素，它們可因質(zhì)量不同而被區(qū)分開；或可采用三明治免疫測(cè)定，應(yīng)用特異性結(jié)合到α-防衛(wèi)素的氨基末端的抗體。所述試劑盒也可包括用于在樣品中檢測(cè)和定量防衛(wèi)素的使用指導(dǎo)，以及將檢測(cè)到的量與預(yù)后或HIV感染狀態(tài)相關(guān)聯(lián)的指導(dǎo)。
實(shí)施例提供以下的實(shí)施例用于舉例證明，而并非限制本發(fā)明所要求的權(quán)項(xiàng)。
實(shí)施例I材料和方法制備CD8+T細(xì)胞以及受激的培養(yǎng)上清。從2個(gè)長(zhǎng)期生存者中采集靜脈血樣，所述長(zhǎng)期生存者盡管感染HIV-1超過13年(攜帶CD4和病毒)，但仍然保持健康。也從4個(gè)HIV-1感染進(jìn)展者(抗病毒治療前)中采集血樣(攜帶CD4和病毒)，以及從15個(gè)未感染的正常個(gè)體中采集血樣。然后通過標(biāo)準(zhǔn)Ficoll/Hypaque梯度離心分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。應(yīng)用包被了抗CD8單克隆抗體(Dynal，Lake Success，NY)的磁珠，通過陽(yáng)性選擇將CD8+T細(xì)胞從PBMC細(xì)胞中分離。然后通過Detach-a-Bead(Dynal)將磁珠從細(xì)胞中移走。通過所述步驟獲得的細(xì)胞的純度＞99.5％，由FACS來(lái)判定純度。將CD8+T細(xì)胞置于潮濕的CO2培養(yǎng)箱中，37℃下刺激3天，與0.1μg/ml的抗CD3抗體(12F6)(由MIT的Johnson饋贈(zèng))和5μl/ml的抗CD28抗體(Becton Dickinson)共同孵育，同時(shí)還有等量的異源照射的PBMC置于無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)基中(Cellgro)，添加重組IL-2(20U/ml)、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100μg/ml)。收集培養(yǎng)上清，在3000rpm下離心5分鐘除去雜質(zhì)，并存放在-80℃?zhèn)溆谩?br> 細(xì)胞培養(yǎng)上清的ProtenClip陣列分析。每種ProteinClip陣列具有獨(dú)特的化學(xué)(離子的、疏水的、親水的等)或生物(抗體、受體、DNA等)特性，用于從復(fù)合混合物中選擇性捕獲蛋白/肽。最初被用于我們的實(shí)驗(yàn)的很多類型的ProteinClip陣列，包括弱陽(yáng)離子交換(WCX2)、強(qiáng)陰離子交換(SAX2)、固定化金屬親和捕獲(IMAC-3)和反相H4(Ciphergen)。WCX2陣列最后被選擇用于整個(gè)研究，因?yàn)樗趶呐囵B(yǎng)上清中檢測(cè)蛋白/肽類型時(shí)具有高的再現(xiàn)性。特別地，將100μl的培養(yǎng)上清與等體積的結(jié)合緩沖液(100mM NaAc，PH4.5；0.2％Triton X-100溶于PBS中)混合。然后將混合物通過一種生物處理器(Ciphergen)施用于WCX2，并在4℃孵育過夜，并進(jìn)行恒定的水平搖動(dòng)。通過用結(jié)合緩沖液(50mM NaAc，PH4.5；0.1％Triton X-100溶于PBS中)洗滌3次，將沒有結(jié)合的蛋白/肽移走，這些都在相同的溫度和搖動(dòng)條件下進(jìn)行。然后將WCX2陣列從生物處理器上解下，在1mM HEPES(pH4.5)中沖洗30秒，風(fēng)干。在干燥后，在芯片表面加上3，5-二甲氧-4-羥基苯乙烯酸(SPA)溶于50％乙腈和0.5％三氟乙酸的飽和溶液。SPA作為一種能量吸收分子，用于由表面-增強(qiáng)的激光解吸/電離(SELDI)飛行時(shí)間質(zhì)譜(Ciphergen)的檢測(cè)的蛋白/肽的捕獲。然后所述陣列被置于Ciphergen Protein Biological System II(PBSII)，從氮激光(337nm)生成和激發(fā)毫微秒激光脈沖，沖擊在SPA和蛋白/肽混合物中。應(yīng)用在激光強(qiáng)度220-240上平均80個(gè)激光射擊點(diǎn)(laser shots)生成蛋白/肽的質(zhì)譜。根據(jù)由精氨酸8-血管加壓素(ARG-8-Vasopressin)(1,084,3Da)、生長(zhǎng)激素抑制素(Somatostatin)(1,637.9)、牛胰島素β鏈(3,495.9Da)、人胰島素(5,807.7)、以及水蛭素(7,033.6Da)(Ciphergen)校準(zhǔn)的客觀蛋白/肽標(biāo)準(zhǔn)，確定每種被捕獲在陣列表面的蛋白/肽的質(zhì)荷率(M/Z)。
應(yīng)用抗體-包被的珠的蛋白鑒定伴隨著SELDI ProteinClip分析。根據(jù)制造方的說明，將Dynal珠用人嗜中性粒細(xì)胞(α)防衛(wèi)素特異的抗體或人噬菌體炎癥蛋白(MIP)1α特異的抗體包被。簡(jiǎn)要地說，將人嗜中性粒細(xì)胞防衛(wèi)素1-3(D21，HyCult生物技術(shù))特異的生物素化的抗體與溶解在PBS(包含0.1％Tween 20)中的Biotin-Binder Dynabeads(Dynal)混合，在室溫下旋轉(zhuǎn)30分鐘。用包含0.1％Tween 20的PBS洗滌3次，去除沒有結(jié)合的抗體。并且，通過在4℃旋轉(zhuǎn)過夜，人MIP-1α特異的抗體(R&D系統(tǒng))被直接偶連到存在于0.1M Borate緩沖液(pH7.0-7.5)中的Dynabeads M-450 Epoxy(Dynal)上。在孵育15-30分鐘后，加入0.5％BSA，確?？贵w的最佳定位。然后將抗體-包被的珠用包含0.1％BSA(pH7.4)的PBS洗滌3次。每107個(gè)珠，需要約2-5μg的每種抗體。然后將抗體-包被的珠(約4×107)單獨(dú)地與200μl來(lái)自受激CD8+T細(xì)胞的培養(yǎng)上清混合，其中還存在0.01％溴化十六碳烷基三甲銨(CETAB，Sigma，圣路易斯，MO)，并且在4℃旋轉(zhuǎn)過夜。然后通過磁鐵，將抗原-抗體復(fù)合物包被的珠從上清中移走，將剩余的上清施用于WCX2陣列，通過如前所述的SELDI進(jìn)行分析。
制備用于抗病毒測(cè)定的來(lái)自受激CD8+T細(xì)胞的富含的和缺失的細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過Qq-TQF進(jìn)行蛋白鑒定。將BioSepra Q-HyperD柱(Ciphergen)平衡處理，用包含10％乙腈(CAN)和0.1％三氟乙酸(TFA)的50mM Tris HCl(pH8.0)洗滌。為了富集推定的α-防衛(wèi)素肽，將培養(yǎng)上清與含50％乙腈的50mM Tris HCl(pH8.0)混合，施加到柱上。收集流出液，在相同的緩沖液中稀釋5倍，直接施加到BioSepra Reverse PhaseC18柱上。用含0.1％TFA和逐步升高量的ACN(從30％、40％、50％、60％以及最后到80％)的50mM Tris HCl(pH8.0)洗脫結(jié)合的蛋白/肽。
應(yīng)用Micromass Q-TQF II進(jìn)行蛋白鑒定。從BioSepra Reverse Phase C18柱上洗脫的部分中含有50％CAN和0.1％TFA。通過加入10％v/v的100mM重碳酸銨緩沖液(pH8.0)中和TFA，然后通過真空離心抽氣機(jī)濃縮中性的洗出液，在室溫下進(jìn)行30分鐘，直至溶液達(dá)到約25毫微微摩爾蛋白/肽每微升。然后經(jīng)濃縮的材料用含5mM DDT的50mM Tris HCl(pH8.6-9)在90℃還原5分鐘，但不進(jìn)行烷化。經(jīng)還原的混合物冷卻到室溫，用0.6μg/μl的胰蛋白酶在40℃消化2小時(shí)，然后在冰上終止。所有的上述反應(yīng)在惰性氬的存在下進(jìn)行。然后將胰蛋白酶消化的產(chǎn)物直接施加到CiphergenNP-20陣列上，通過Ciphergen PCI-1000 ProteinClipInterface，用MicromassQ-TQF II進(jìn)行蛋白鑒定。
病毒抑制試驗(yàn)。同時(shí)應(yīng)用假型單環(huán)病毒和可復(fù)制型HIV-1病毒菌株進(jìn)行病毒抑制試驗(yàn)，所述菌株分離自感染HIV-1的患者的CEM174細(xì)胞系和/或PBMC。CEM174細(xì)胞系已經(jīng)被構(gòu)建成可同時(shí)表達(dá)HIV-1共同受體CXCR4和CCR5的形式。通過共轉(zhuǎn)染熒光素酶-受體病毒骨架PNL4-3 LucR-E-和JR-FL或HXB2外殼表達(dá)載體進(jìn)入人胚胎腎細(xì)胞系293T，生成假型病毒。2天后收集包含病毒的上清，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的方案(ref)定量上清中的p24抗原水平。然后將上清取出，并儲(chǔ)存在-80℃?zhèn)溆?。?duì)于應(yīng)用假型單環(huán)病毒的病毒抑制試驗(yàn)，感染前，在96孔板的每個(gè)孔中放置2×105CEM174細(xì)胞。在人嗜中性粒細(xì)胞防衛(wèi)素1或2(American Peptide公司，桑尼維爾，CA)之一或同時(shí)存在下，在每孔中加入5毫微克的p24單環(huán)JR-FL或HXB2報(bào)告病毒。為了研究可能的抑制機(jī)制，加入人嗜中性粒細(xì)胞防衛(wèi)素或來(lái)自受激LTNP CD8+T細(xì)胞的培養(yǎng)上清，可與病毒同時(shí)加入或在感染一段時(shí)間后加入。本實(shí)驗(yàn)中還包括加入病毒進(jìn)入抑制劑T-20和非核苷反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑UC-781，用于評(píng)估在病毒生命周期中每個(gè)階段的時(shí)間。在感染起始后3天，用PBS洗滌細(xì)胞，在50μl熒光素酶細(xì)胞溶解緩沖液(Promega)中溶解，進(jìn)行一次冰凍-解凍過程來(lái)提高檢測(cè)靈敏度。在3,000rpm簡(jiǎn)單離心10分鐘，應(yīng)用Promega Luciferase Assay System和光度計(jì)(Dynex Technologic公司)測(cè)定25μl細(xì)胞溶解產(chǎn)物的熒光素酶活性。
對(duì)于應(yīng)用可復(fù)制型病毒的病毒抑制試驗(yàn)，先將PBMC用濃度為20μg/ml的PHA刺激3天。96孔板上，在存在人嗜中性粒細(xì)胞防衛(wèi)素1或2之一或全部下，每孔加入約2×105個(gè)細(xì)胞，每種病毒具有100組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)。在一些實(shí)驗(yàn)中，也包括來(lái)自受激LTNP CD8+T細(xì)胞的培養(yǎng)上清。在37℃感染2小時(shí)后，通過PBS洗滌，移走上清中剩余的病毒。加入包含相同濃度的人嗜中性粒細(xì)胞防衛(wèi)素或來(lái)自受激LTNP CD8+T細(xì)胞的培養(yǎng)上清的新鮮介質(zhì)。在感染后第0、3和7天，用標(biāo)準(zhǔn)的方案測(cè)定上清中的p24抗原水平。在病毒生產(chǎn)高峰時(shí)間，一般在起始感染后第7天，通過對(duì)比有或沒有抑制劑的上清中的p24水平計(jì)算抑制百分?jǐn)?shù)。
結(jié)果一系列由LTNP和正常人的CD8+細(xì)胞分泌的小型蛋白的鑒定。從來(lái)自3個(gè)LTNP、4個(gè)AIDS進(jìn)展者以及15個(gè)正常對(duì)照的受激和非受激的CD8T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物中收集上清溶液。每種樣品在PriteinClipSystem(Ciphergen生物系統(tǒng)公司，費(fèi)瑞蒙，CA)上進(jìn)行分析，其是基于化學(xué)改變的陣列表面的集成，采用表面-增強(qiáng)的激光解吸/電離(SELDI)飛行時(shí)間(TOF)質(zhì)譜(MS)檢測(cè)。選擇所述技術(shù)是因?yàn)槠渚哂懈叻直婺芰?、高再現(xiàn)性、易于使用，以及毫微微摩爾水平的敏感性。如圖1a所示，2個(gè)LTNP和1個(gè)正常對(duì)照的代表蛋白的質(zhì)譜顯示，受激和非受激的CD8上清相比，峰的方式明顯不同。在受激的培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)一簇兩個(gè)或三個(gè)峰的情況，在3,371.9Da、3,442.5Da和3,486.5Da上。該簇分子在來(lái)自3個(gè)LNTP和(15個(gè)中的)11個(gè)正常個(gè)體的受激的CD8 T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物中被檢測(cè)到，但在來(lái)自4個(gè)進(jìn)展者的受激的培養(yǎng)物中都沒有找到(圖1a)。一個(gè)獨(dú)特的峰在7,815.0Da上，后來(lái)鑒定為MIP-1α，也在來(lái)自2個(gè)LTNP的受激的樣品中被檢測(cè)到。盡管觀察到許多8,000-200,000Da的峰，但沒有在三類受試者的受激或非受激CD8培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)明顯的差異(數(shù)據(jù)未顯示)。特別地，沒有高于8,000Da的峰保持與CAF活性的存在相關(guān)聯(lián)。
為了進(jìn)一步定性在3,300和3,500Da之間的峰，從來(lái)自LTNP受試者-3(LTNP-3)和正常對(duì)照受試者-2(正常個(gè)體-2)的受激CD8 T細(xì)胞的培養(yǎng)上清中富集所述的蛋白。然后所述富集的材料用二硫蘇糖醇(DTT)、丙烯醯胺或碘代乙酰胺處理，探測(cè)在該簇峰的每種蛋白中二硫鍵的存在。然后將處理后的材料直接施加到Ciphergen NP-20陣列上，用SELDI-TOF-MS測(cè)定。下表1中顯示了在正常個(gè)體-2的經(jīng)DTT還原的材料中發(fā)現(xiàn)的三個(gè)峰的分子質(zhì)量的改變。在還原后每個(gè)峰增加了～6Da(圖6)，證明在該簇中的每種蛋白包含三個(gè)內(nèi)部二硫鍵橋，由于每個(gè)二硫鍵斷裂后，DTT還原可加上兩個(gè)氫原子，形成兩個(gè)自由的巰基基團(tuán)。此外，對(duì)于在來(lái)自LTNP-3的培養(yǎng)上清中檢測(cè)到的峰，用丙烯醯胺或碘代乙酰胺還原和烷化可分別增加～434Da或349Da。根據(jù)丙烯醯胺(m.w.71)和碘代乙酰胺(m.w.57)的分子質(zhì)量，觀察到的質(zhì)量增加是由6個(gè)丙烯醯胺或碘代乙酰胺分子通過6個(gè)自由巰基基團(tuán)添加到每個(gè)蛋白上而構(gòu)成的。該結(jié)果進(jìn)一步證明了每個(gè)蛋白中有三個(gè)分子內(nèi)二硫鍵橋。
表1.在還原±烷化之前[-]和之后[+]分子質(zhì)量(m/z)的變化
n/d未檢測(cè)鑒定作為人α-防衛(wèi)素1、2和3的蛋白簇。通過檢索蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI和Swiss-Pro)，尋找與刺激后上調(diào)的峰具有相似分子質(zhì)量的蛋白，發(fā)現(xiàn)分別與人嗜中性粒細(xì)胞(α)防衛(wèi)素相對(duì)應(yīng)的具有平均分子質(zhì)量3,371.9Da、3,442.5Da和3,486.5Da的成對(duì)的或三個(gè)一對(duì)的峰主要是由人嗜中性粒細(xì)胞制造的肽抗生素(Ganz等，J.Clin.Invest.，761427(1985)，Selsted等，J.Clin.Invest.，761436(1985)；Daher等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，857327(1988))。此外，已知所述每一種多肽包含三個(gè)內(nèi)在二硫鍵(Lehrer等，Curr.Opin.Immun.，1496(2002))。7,815.ODa的峰相應(yīng)于人MIP-1α。并且，以前已經(jīng)證明，約10％的種群會(huì)缺少防衛(wèi)素3(Mars等，J.Bio.Chem.，27030371(1995))，這就恰恰證明了為什么一些研究受試者顯示兩個(gè)峰，而其它一些顯示三個(gè)峰，這種現(xiàn)象同時(shí)存在于LTNP和正常個(gè)體(圖1)。為了測(cè)定這種假設(shè)，用人α-防衛(wèi)素1、2和3特異的抗體包被Dynal珠，與來(lái)自受激CD8+細(xì)胞的上清共同孵育，然后移走磁珠。簡(jiǎn)要地，將生物素化的人α-防衛(wèi)素1、2和3特異的單克隆抗體(克隆D21，HyCult Biotechnology，Norwood，MA)與Biotin-Binder Dynabeads(Dynal)在包含0.1％Tween 20的PBS中混合，在室溫下旋轉(zhuǎn)30分鐘。用包含0.1％Tween 20的PBS洗滌3次，移走未結(jié)合的抗體。分離地，在0.1M硼酸緩沖液(pH7.0-7.5)中，將人-MIP-1α特異的單克隆抗體(R&D系統(tǒng)，明尼阿波利斯，MN)直接連接到Dynabeads M-450 Epoxy(Dynal)上，在4℃旋轉(zhuǎn)過夜。在孵育后15-30分鐘，加入0.5％BSA，以確?？贵w達(dá)到最佳的定位。然后將抗體包被的磁珠用包含0.1％BSA的PBS(pH7.4)洗滌3次。每107個(gè)珠使用2-5μg每種抗體。接著在0.01％十六烷基三甲基溴化銨(Sigma，圣路易斯，MO)存在下，將抗體包被的珠(約4×107)與200μl的來(lái)自受激CD8+T細(xì)胞的培養(yǎng)上清混合，在4℃旋轉(zhuǎn)過夜。然后用Detach-a-Bead磁鐵(Dynal)，將所述抗原-抗體復(fù)合物包被的珠從上清中移出，將剩余的上清施加到WCX2陣列上，如前所述用SELDI-TOF-MS分析。通過與那些來(lái)自上清的抗體包被的磁珠孵育并最后移走，同時(shí)從上清中去除兩個(gè)或三個(gè)峰，可以解釋成對(duì)的或三個(gè)一對(duì)的峰是否真正屬于人α-防衛(wèi)素家族。用一種抗防衛(wèi)素1、2、3抗體預(yù)處理消除了在3,300至3,500Da(圖2a)范圍內(nèi)的蛋白簇，而不會(huì)明顯影響其它有用的峰。與抗MIP-1α預(yù)孵育沒有影響有用的峰，但卻導(dǎo)致在7815.0Da的峰的移動(dòng)。這些實(shí)驗(yàn)清楚地證明，在來(lái)自LTNP和正常個(gè)體的CD8+T細(xì)胞受激后發(fā)生上調(diào)的二或三峰蛋白簇是人α-防衛(wèi)素家族的成員。β-趨化因子MIP-1α在刺激后也發(fā)生上調(diào)，這與以前的報(bào)導(dǎo)相一致。
應(yīng)用Micromass Qq-TOF MS-MS進(jìn)行蛋白峰的低MW簇的蛋白測(cè)序。為了進(jìn)一步證明所述結(jié)論，前面用于還原和烷化實(shí)驗(yàn)的富集的材料用胰蛋白酶消化，并通過串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析。與沒有所述蛋白簇的對(duì)照比較，來(lái)自LTNP-3和正常個(gè)體-2的胰蛋白酶消化的材料獲得一條獨(dú)特的1060.50Da(圖2b，上右插入圖)片段。通過在MS-MS撞擊細(xì)胞中撞擊-誘導(dǎo)的離解，所述獨(dú)特的片段被進(jìn)一步選擇和片段化成更小的離子。然后，七個(gè)通過所述方式(圖2b)形成的離子被用在蛋白搜索引擎(參見圖2b的插圖說明)中，尋找所述1060.50Da母離子的假設(shè)片段。所述檢索獲得了一個(gè)與人α-防衛(wèi)素1、2和3的胰蛋白酶消化片段理想的且明確的匹配。實(shí)際上，所述的肽在這三種分子中是保守的，精確地與來(lái)自氨基酸位點(diǎn)16-24位的序列YGTCIYQGR相符(圖2b)。蛋白測(cè)序證明在來(lái)自LTNP和正常個(gè)體的CD8 T細(xì)胞受激后發(fā)生上調(diào)的蛋白簇是人α-防衛(wèi)素家族的成員。
人α-防衛(wèi)素1、2和3引起了CAF的HIV-1抑制活性，而并非因?yàn)棣纶吇蜃?。為了評(píng)估α-防衛(wèi)素1、2和3對(duì)于總體CAF活性的相對(duì)作用，用前面所述的特異性抗體包被的珠或親和柱(來(lái)自克隆21的生物素化的單克隆抗體(HyCultBiotechnology)被用于從培養(yǎng)上清中去除α-防衛(wèi)素1、2和3，根據(jù)生產(chǎn)方的指導(dǎo)，應(yīng)用HiTrap親和柱進(jìn)行(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ))，選擇性去除來(lái)自LTNP-3和LTNP-5的受激CD8+T細(xì)胞的培養(yǎng)上清中的所述分子。圖3a對(duì)比了在α-防衛(wèi)素1、2和3去除前和去除后，對(duì)抗X4和R5 HIV的抗病毒活性(兩次實(shí)驗(yàn)的平均)，包括來(lái)自不同基因型的菌株。如前面所描述的方法進(jìn)行病毒抑制測(cè)定。在去除前，培養(yǎng)上清能夠抑制所有被測(cè)定X4病毒的約50-60％的復(fù)制，不考慮基因型。然而在去除后，抗X4病毒的抑制作用完全消失了，表明α-防衛(wèi)素1、2和3引起了幾乎所有(如果不是全部的話)的CAF抗X4病毒抑制活性。對(duì)于R5病毒，在移走了α-防衛(wèi)素以后，抗HIV-1活性平均降低了約40％(圖3a)。
同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在濃度為10μM時(shí)，α-防衛(wèi)素1和2能夠抑制約15-30％的每種病毒的復(fù)制。然而，當(dāng)以類似的濃度同時(shí)加入α-防衛(wèi)素1和2時(shí)，抑制百分?jǐn)?shù)升高到70％，證明這兩種防衛(wèi)素之間存在著增效效應(yīng)。此外，通過α-防衛(wèi)素的每種病毒的抑制都是劑量依賴的。
然后，通過向上清液中加入一種抗α-防衛(wèi)素1、2和3的抗體，檢測(cè)CAF活性是否能夠以劑量依賴的方式被中和，并且，共同加入或不加入β趨化因子抗體。隨著抗α-防衛(wèi)素抗體濃度的提高，來(lái)自LTNP-3和LTNP-5的CD8上清的抗HIV-1活性降低(圖3b)。當(dāng)抗體濃度達(dá)到25μg/ml時(shí)，對(duì)于所有被測(cè)定的X4病毒，CAF的抑制活性實(shí)際上消失了，而類似量的對(duì)照抗體沒有影響(數(shù)據(jù)未顯示)。通過加入增加量的α-防衛(wèi)素抗體，抗R5病毒的抑制活性也降低了，盡管影響沒有如在X4病毒中所觀察到的那樣強(qiáng)烈(圖3b)。為了研究剩余的對(duì)抗R5病毒的活性是否由β趨化因子所引起，將來(lái)自LTNP-3和LTNP-5的培養(yǎng)上清用增加量的抗MIP-1α、MIP-1β和RANTES抗體混合物(1∶1∶1)處理，同時(shí)用固定濃度(25μg/ml)的α-防衛(wèi)素抗體處理。在使用最高抗體濃度時(shí)，抗三種R5分離物的剩余抗病毒活性幾乎完全被中和(圖3b，右邊圖)，而一種對(duì)照抗體的加入具有最小的影響(數(shù)據(jù)未顯示)。總體來(lái)說，這些結(jié)果證明α-防衛(wèi)素1、2和3引起了受激CD8+T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中將近所有的抗HIV-1活性，而并非是因?yàn)棣纶吇蜃印?br> 合成和純化的人α-防衛(wèi)素可以在體外抑制HIV-1的復(fù)制。接著我們將把注意點(diǎn)集中到檢測(cè)合成或純化形式的α-防衛(wèi)素的體外抗HIV-1活性。兩種產(chǎn)物是商業(yè)可購(gòu)買的α-防衛(wèi)素1和2(American Peptide公司，桑尼維爾，CA)。隨著兩種合成α-防衛(wèi)素混合物(1∶1)濃度的增加，觀察到對(duì)抗HIV-1的6個(gè)分離物的提高程度的抑制(圖4)，不管病毒的顯型和基因型?；旌衔锏?0％抑制濃度在約11-24μM。當(dāng)混合物的抗病毒能力不高時(shí)，應(yīng)該注意這些商業(yè)產(chǎn)品是不純的，如SELDI-TOF-MS(圖7)所示的。與由受激的CD8+T細(xì)胞生成的α-防衛(wèi)素相比，除了正確的分子質(zhì)量的峰以外，商業(yè)產(chǎn)品還包含一些蛋白峰。而且，即使是具有接近正確的分子質(zhì)量的峰，仍然不能保證形成正確的二硫鍵橋。因而，為了確認(rèn)商業(yè)α-防衛(wèi)素制品的抗HIV-1活性的特異性，重復(fù)用這些肽進(jìn)行病毒抑制試驗(yàn)，并在一種抗α-防衛(wèi)素抗體存在下進(jìn)行。圖4(左邊圖)顯示所述抗體真正充分地中和了商業(yè)肽的抗-HIV-1活性。所述結(jié)果證明抗病毒作用并非由商業(yè)制品中非特異的雜質(zhì)介導(dǎo)的；取而代之的，在成分中的活性部分是由抗α-防衛(wèi)素抗體識(shí)別的。也檢測(cè)了從正常人(36，39)嗜中性粒細(xì)胞純化獲得的α-防衛(wèi)素1、2和3的抗HIV-1活性。所述制品包含α-防衛(wèi)素峰，其本質(zhì)上不能被質(zhì)譜儀與那些從來(lái)自LTNP-5的CD8 T細(xì)胞上清中發(fā)現(xiàn)的α-防衛(wèi)素區(qū)分開來(lái)(圖8)。在體外也能抑制HIV-1的復(fù)制，但是具有的IC50為約0.5-2.2μM(圖4，右邊圖)，證明純化的α-防衛(wèi)素的抗HIV-1能力高于商業(yè)產(chǎn)品的10-20倍。純化的人嗜中性粒細(xì)胞α-防衛(wèi)素的抗病毒活性也會(huì)因加入α-防衛(wèi)素特異的抗體而降低或消除。
小部分CD8 T細(xì)胞表達(dá)α-防衛(wèi)素1、2和3。從一些正常的血供體純化得到的嗜中性粒細(xì)胞和CD8 T細(xì)胞通過免疫熒光進(jìn)行研究，研究α-防衛(wèi)素1、2和3在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。一部分未受刺激的CD8 T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)小顆粒中攜帶這些分子，但是在量上明顯少于在嗜中性粒細(xì)胞中的含量(圖5)。一旦刺激，一些CD8 T細(xì)胞似乎失去了所述α-防衛(wèi)素陽(yáng)性顆粒，可能是因?yàn)榉置诘脚囵B(yǎng)上清中去了。非常小的一部分CD8 T細(xì)胞被活化，表達(dá)更高量的α-防衛(wèi)素(圖5；位于最右邊的細(xì)胞)。
通過流式細(xì)胞術(shù)分析，約2.3％的未刺激αβCD8 T淋巴細(xì)胞表達(dá)可評(píng)估水平的α-防衛(wèi)素(圖9)。在刺激1天后，一些所述包含α-防衛(wèi)素的細(xì)胞中不能再檢測(cè)到α-防衛(wèi)素。然而，與免疫熒光結(jié)果相一致，在刺激后兩天，相當(dāng)多的表達(dá)更高量α-防衛(wèi)素的CD8 T細(xì)胞(21.1％)出現(xiàn)了。所述α-防衛(wèi)素陽(yáng)性的CD8細(xì)胞主要為沒有γδ或NK標(biāo)記的αβCD8 T細(xì)胞。這些發(fā)現(xiàn)還證明，CD8 T細(xì)胞真正攜帶和分泌α-防衛(wèi)素1、2和3，在先天和后天的免疫系統(tǒng)之間建立了另一個(gè)聯(lián)系。
實(shí)施例II該實(shí)施例證明，在感染HIV的患者血清中α-防衛(wèi)素水平可作為預(yù)后的標(biāo)記。
采取一種研究，來(lái)確定在感染HIV患者的血漿中α-防衛(wèi)素的表達(dá)水平是否是不同的。收集患者的血漿，通過SELDI和標(biāo)準(zhǔn)ELISA(HNP1-3 ELISA，Cell Science)來(lái)測(cè)定防衛(wèi)素，來(lái)自正常個(gè)體的血漿(匯集的，定購(gòu)自Sigma)被用作陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)21位患者中的每一位，在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上測(cè)定防衛(wèi)素在起始HAART治療之前以及在起始HAART治療后正好一年。所有患者的病毒負(fù)載在剛開始時(shí)是可測(cè)量的，在HAART治療一年后無(wú)法測(cè)出。在HAART治療之前和之后，他們的T細(xì)胞數(shù)(CD4和CD8)是已知的。表2總結(jié)了所述結(jié)果。
所述研究發(fā)現(xiàn)，防衛(wèi)素在未感染的對(duì)照人血漿中以6.2-7ng/ml的濃度存在，在21位感染HIV的個(gè)體中只有33％(7/21)可檢測(cè)到。在7位可檢測(cè)到防衛(wèi)素的患者中，3位具有低的起始病毒負(fù)載，暗示了隨著病毒負(fù)載的提高，防衛(wèi)素的生產(chǎn)受到影響。盡管事實(shí)上他們的病毒負(fù)載在一年后無(wú)法檢測(cè)到并且他們的CD4和CD8數(shù)是正常的，7位患者中的4位在研究起始時(shí)具有可檢測(cè)到的防衛(wèi)素水平，在起始HAART治療一年后部分或全部地失去了表達(dá)。
1位患者在研究起始時(shí)無(wú)法檢測(cè)到防衛(wèi)素水平，但在HAART治療期間，當(dāng)他的CD4數(shù)增加3倍后，可檢測(cè)到正常人的約1/3水平的防衛(wèi)素。另有2位患者在HAART治療之前和之后都具有低的防衛(wèi)素水平(也是未感染個(gè)體的約1/3水平)。
這些結(jié)果證明，在感染HIV的個(gè)體中，α-防衛(wèi)素水平在血漿中的水平比未感染的個(gè)體低。這確證了體外發(fā)現(xiàn)的防衛(wèi)素可終止病毒復(fù)制、并由正常對(duì)照和長(zhǎng)期非進(jìn)展者(LTNP)的CD8 T細(xì)胞分泌，而不是由來(lái)自AIDS患者的CD8細(xì)胞分泌的。
表2
應(yīng)理解，這里描述的實(shí)施例和實(shí)施方案都只用于舉例證明的目的，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說，根據(jù)這些內(nèi)容可以作出不同的修改和變化，它們都包括在本申請(qǐng)的意愿和范圍內(nèi)，以及包括在附加的權(quán)利要求范圍內(nèi)。這里引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)以它們的全部作為參考加入本文，用于所有目的。
權(quán)利要求
1.一種組合物，所述組合物包含防衛(wèi)素多肽和藥學(xué)上可接受的載體。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述防衛(wèi)素多肽是α-防衛(wèi)素多肽。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中，所述的α-防衛(wèi)素多肽選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2和α-防衛(wèi)素3。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，包含至少兩種α-防衛(wèi)素多肽。
5.如權(quán)利要求4所述的組合物，包含α-防衛(wèi)素1和α-防衛(wèi)素2。
6.如權(quán)利要求4所述的組合物，包含α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2和α-防衛(wèi)素3。
7.一種在人體內(nèi)治療HIV感染的方法，所述方法包括給予人體一種防衛(wèi)素多肽。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，還包括給予人體一種防衛(wèi)素多肽和一種第二治療劑。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述防衛(wèi)素多肽是一種選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2和α-防衛(wèi)素3的α-防衛(wèi)素多肽。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，還包括施用一種選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2和α-防衛(wèi)素3的第二α-防衛(wèi)素多肽。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述α-防衛(wèi)素多肽是α-防衛(wèi)素1和α-防衛(wèi)素2。
12.一種向HIV感染高危人體施用預(yù)防量的防衛(wèi)素多肽的方法。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述防衛(wèi)素多肽是一種選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2和α-防衛(wèi)素3的α-防衛(wèi)素。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，還包括施用一種選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2和α-防衛(wèi)素3的第二α-防衛(wèi)素多肽。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述α-防衛(wèi)素多肽是α-防衛(wèi)素1和α-防衛(wèi)素2。
16.一種抑制HIV感染培養(yǎng)中的CD4+細(xì)胞的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞與一種防衛(wèi)素多肽接觸的步驟。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述防衛(wèi)素多肽是一種選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2和α-防衛(wèi)素3的α-防衛(wèi)素多肽。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，還包括施用一種選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2和α-防衛(wèi)素3的第二α-防衛(wèi)素多肽。
19.一種組合物，所述組合物含有包含于藥學(xué)上可接受的載體中的編碼第一防衛(wèi)素多肽的第一核酸。
20.如權(quán)利要求18所述的組合物，還包含編碼第二防衛(wèi)素多肽的第二核酸。
21.如權(quán)利要求19所述的組合物，其中，所述防衛(wèi)素多肽是一種選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2和α-防衛(wèi)素3的α-防衛(wèi)素多肽。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述α-防衛(wèi)素多肽是α-防衛(wèi)素1和α-防衛(wèi)素2。
23.一種在人體內(nèi)抑制HIV感染的方法，所述方法包括在體內(nèi)用一種包含編碼防衛(wèi)素多肽核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞；或者，在體外用一種包含編碼防衛(wèi)素多肽核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并將細(xì)胞給予所述的人。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述防衛(wèi)素多肽是選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2和α-防衛(wèi)素3的α-防衛(wèi)素多肽。
25.如權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述細(xì)胞是肌細(xì)胞。
26.如權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述細(xì)胞是AC133+或CD34+祖細(xì)胞。
27.如權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述轉(zhuǎn)染在先體外后體內(nèi)進(jìn)行。
28.如權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述核酸包含一種操作性連接到編碼防衛(wèi)素多肽核苷酸序列的可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。
29.一種確定個(gè)體的HIV感染狀態(tài)的方法，所述方法包括a)在來(lái)自個(gè)體的樣品中檢測(cè)α-防衛(wèi)素的量；以及b)將獲得的量與HIV感染狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。
30.如權(quán)利要求28所述的方法，還包括將防衛(wèi)素的量和至少一種其他指標(biāo)與HIV感染狀態(tài)相關(guān)聯(lián)，所述計(jì)數(shù)器選自CD8+細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)、HIV病毒負(fù)載和總T細(xì)胞計(jì)數(shù)。
31.如權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述α-防衛(wèi)素通過ELISA或SELDI檢測(cè)。
32.如權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述α-防衛(wèi)素多肽選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2和α-防衛(wèi)素3。
33.一種確定個(gè)體HIV感染狀態(tài)的方法，所述方法包括a)在來(lái)自個(gè)體的樣品中檢測(cè)α-防衛(wèi)素mRNA的量；以及b)將獲得的量與HIV感染狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。
34.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述α-防衛(wèi)素多肽選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2和α-防衛(wèi)素3。
35.一種用于確定一種化合物是否能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞中α-防衛(wèi)素活性的方法，所述方法包括a)將α-防衛(wèi)素-生成細(xì)胞與所述化合物接觸；以及b)確定所述化合物對(duì)于α-防衛(wèi)素活性的功能性影響。
36.如權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述細(xì)胞選自嗜中性粒細(xì)胞、CD8+細(xì)胞和上皮細(xì)胞。
37.如權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述功能性影響通過檢測(cè)防衛(wèi)素的表達(dá)水平、細(xì)胞增殖或HIV復(fù)制來(lái)確定。
38.如權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述化合物是一種小型有機(jī)分子。
39.如權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述α-防衛(wèi)素多肽選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2和α-防衛(wèi)素3。
40.一種在人體內(nèi)抑制HIV感染的方法，所述方法包括給予所述人體一種用權(quán)利要求35所述方法鑒定的化合物以增加α-防衛(wèi)素的活性。
41.一種方法，所述方法包含a)將一種細(xì)胞與α-防衛(wèi)素接觸；b)將一種抗-α-防衛(wèi)素抗體與所述細(xì)胞的溶解產(chǎn)物接觸；c)在b)步驟之前或之后，將抗-α-防衛(wèi)素抗體固定到固相上，以使來(lái)自細(xì)胞的α-防衛(wèi)素結(jié)合到固相上；以及d)檢測(cè)結(jié)合到固定的α-防衛(wèi)素上的蛋白。
42.一種方法，所述包含a)將一種細(xì)胞與α-防衛(wèi)素接觸；b)將一種α-防衛(wèi)素與所述細(xì)胞的溶解產(chǎn)物接觸；c)在b)步驟之前或之后，將所述α-防衛(wèi)素固定到固相上，以使結(jié)合到α-防衛(wèi)素的蛋白被捕獲；以及d)檢測(cè)結(jié)合到固定的α-防衛(wèi)素上的蛋白。
43.如權(quán)利要求40或41所述的方法，其中，所述細(xì)胞是CD4+細(xì)胞、Hela細(xì)胞或HOS細(xì)胞。
44.如權(quán)利要求40或41所述的方法，其中，所述α-防衛(wèi)素多肽選自α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2和α-防衛(wèi)素3。
45.一種試劑盒，其包含(a)一種可結(jié)合抗體的底物；(b)一種抗α-防衛(wèi)素多肽的抗體；以及(c)將在患者樣品中檢測(cè)到的α-防衛(wèi)素的量與預(yù)后AIDS發(fā)展相關(guān)聯(lián)的指導(dǎo)。
46.如權(quán)利要求44所述的試劑盒，其中，所述底物是一種質(zhì)譜探針。
47.如權(quán)利要求44所述的試劑盒，其中，所述底物是一種微量滴定板。
48.如權(quán)利要求44所述的試劑盒，還包含一種特異性抗α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2或α-防衛(wèi)素3的第二抗體。
49.如權(quán)利要求44所述的試劑盒，其中，所述第二抗體是標(biāo)記的。
50.一種試劑盒，其包含(a)一種可結(jié)合α-防衛(wèi)素多肽的底物；以及(b)將在患者樣品中檢測(cè)到的α-防衛(wèi)素的量與預(yù)后AIDS發(fā)展相關(guān)聯(lián)的指導(dǎo)。
51.一種試劑盒，其包含一種可特異性結(jié)合一種α-防衛(wèi)素的第一抗體，以及一種可特異性結(jié)合α-防衛(wèi)素1、α-防衛(wèi)素2或α-防衛(wèi)素3的第二抗體。
52.一種α-防衛(wèi)素融合蛋白，其包含一個(gè)第一α-防衛(wèi)素多肽部分和一個(gè)結(jié)合CD4的第二部分。
53.一種α-防衛(wèi)素融合蛋白，其包含一個(gè)第一α-防衛(wèi)素多肽部分和一個(gè)第二信號(hào)肽部分。
54.如權(quán)利要求53所述的α-防衛(wèi)素融合蛋白，其中，所述第二信號(hào)肽部分是TPA信號(hào)肽。
55.一種核酸，其包含編碼權(quán)利要求52所述多肽的核苷酸序列。
56.一種α-防衛(wèi)素融合蛋白，其包含一個(gè)第一α-防衛(wèi)素多肽部分和一個(gè)可在體內(nèi)提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性或生物利用度的第二部分。
57.一種藥物組合物，其包含PEG化的α-防衛(wèi)素和藥學(xué)上可接受的載體。
58.一種α-防衛(wèi)素類似物，其包含可刪除蛋白水解切割位點(diǎn)的氨基酸取代。
59.一種提高內(nèi)源性α-防衛(wèi)素生產(chǎn)的方法，所述方法包括施用一種可激活CD8+細(xì)胞的組合物。
60.如權(quán)利要求59所述的方法，其中，所述組合物包含抗-CD3。
61.一種方法，所述方法包括a)先體外后體內(nèi)擴(kuò)展CD8+細(xì)胞；b)檢測(cè)CD8+細(xì)胞的α-防衛(wèi)素生產(chǎn)；以及c)向HLA匹配人群施用所述擴(kuò)展的CD8+細(xì)胞。
62.一種方法，所述方法包括給予人體一種疫苗以及一種α-防衛(wèi)素多肽或編碼α-防衛(wèi)素的核酸。
63.一種組合物，其包含一種疫苗和一種α-防衛(wèi)素多肽或編碼α-防衛(wèi)素的核酸。
64.一種組合物，其包含一種α-防衛(wèi)素多肽以及一種第二治療劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用防衛(wèi)素抑制病毒，如HIV。本發(fā)明還涉及鑒定和使用試劑的方法，包括小分子化學(xué)組合物、抗體、肽、核酸、反義核酸和核酶，其能提高天然存在的防衛(wèi)素的表達(dá)或活性，從而抑制細(xì)胞中的HIV；同時(shí)，還涉及將表達(dá)曲線和組合物應(yīng)用于診斷和預(yù)防，并且治療與HIV相關(guān)的感染以及相關(guān)的疾病狀態(tài)如AIDS。
文檔編號(hào)A61K35/14GK1688324SQ03818321
公開日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2003年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月31日
發(fā)明者L·張, D·D·何, R·E·卡弗里, E·A·戴爾馬索, J·梅 申請(qǐng)人:賽弗根生物系統(tǒng)股份有限公司, 亞倫戴蒙艾滋病研究中心