專利名稱：改良型豬肺炎支原體菌苗疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及誘導(dǎo)針對豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)的保護(hù)性免疫的改良方法，具體地說，涉及在單劑量內(nèi)使用有效量的用于免疫受體動物對抗豬肺炎支原體感染的滅活豬肺炎支原體菌苗。
背景技術(shù)：
豬肺炎支原體是豬支原體肺炎的病原體。該疾病導(dǎo)致體重增加減少和喂養(yǎng)效率降低，是養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的重要原因。該疾病導(dǎo)致持續(xù)幾周的持續(xù)性咳嗽、被毛失去光澤、生長遲緩和外觀不壯實。在感染動物尤其是在腹頂端和心葉觀察到特征性病變紫色到灰色實變區(qū)。雖然該疾病的死亡率低，但受感染的豬常常易于受到機(jī)會病原體的繼發(fā)感染，從而導(dǎo)致死亡或應(yīng)激。每年的經(jīng)濟(jì)損失估計在2億～2.5億美元之間。
豬肺炎支原體是生長緩慢、沒有細(xì)胞壁、難培養(yǎng)的細(xì)菌。由于呼吸道內(nèi)還存在一種常見的第二種病原體豬鼻支原體(Myoplasmahyorhinis)，因此常常難以從呼吸道中分離豬肺炎支原體。該疾病通過咳嗽產(chǎn)生的飛沫以及與感染或恢復(fù)期的病原攜帶豬直接接觸而傳播。感染動物和未感染動物混居導(dǎo)致早期和頻繁的再感染。感染通常開始于攜帶病原的母豬產(chǎn)崽時感染小豬。由于豬群集中管理技術(shù)的影響，感染在生命后期用才變得明顯。當(dāng)斷乳后把豬集中起來時，通常還可發(fā)現(xiàn)另外的感染。在六周齡或更大的豬中常常觀察到明顯的疾病。感染豬的生長速度和飼料轉(zhuǎn)化率顯著降低。使用抗生素治療昂貴并且需要長期使用。再感染也是一個問題。目前疫苗是避免感染及其影響的最有效方法。
Fort Dodge Animal Health(FDAH)銷售豬肺炎支原體菌苗，名為SuvaxynRespifendMH，用作保護(hù)健康的豬對抗豬肺炎支原體引起的臨床體征的疫苗。該疫苗含有佐劑Carbopol(卡波普)，推薦作為兩劑疫苗用于至少一周齡大的豬，在第一次免疫后兩到三周給予第二劑。然而，兩劑量疫苗有明顯的缺陷，即為了提供對抗疾病的完全保護(hù)，需要第二次處理動物。
因此，本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供對抗豬肺炎支原體的有效疫苗，該疫苗通過單劑給予，引發(fā)保護(hù)性免疫，預(yù)防由該微生物體引起的疾病。
本發(fā)明的另一個目標(biāo)是提供適用于豬的對抗豬肺炎支原體所引起的感染和疾病的疫苗組合物，所述疫苗組合物可以與其它菌苗和/或類毒素聯(lián)合使用。
本發(fā)明的再一個目標(biāo)是提供預(yù)防或緩解致病微生物是豬肺炎支原體的疾病的方法，該方法利用增強(qiáng)所述菌苗免疫原性的佐劑制劑，以便在給予單劑量所述疫苗后引發(fā)保護(hù)性免疫。
本發(fā)明的其它目的和特點將由下面的詳細(xì)描述而顯而易見地得出。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及用于免疫動物以對抗豬肺炎支原體感染的疫苗組合物，所述疫苗組合物包含免疫量的滅活豬肺炎支原體菌苗；佐劑混合物，所述佐劑混合物包括丙烯酸聚合物以及可代謝油和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的混合物；藥學(xué)上可接受的載體，所述疫苗組合物在單劑給予后，引發(fā)針對豬肺炎支原體的保護(hù)性免疫。
另一方面，本發(fā)明提供用于免疫動物以對抗豬肺炎支原體感染的免疫原性組合物，所述組合物包含滅活豬肺炎支原體菌苗和上述佐劑混合物以及藥學(xué)上可接受的穩(wěn)定劑、載體或稀釋劑。所述佐劑在該疫苗組合物內(nèi)的最終濃度通常約1～25％(v/v)，優(yōu)選約5～12％(v/v)。所述組合物也可以包括其它疫苗成分，包括來自一種或多種病原體(包括所述病原體的一種或多種株系、類型、血清型等)的滅活菌苗或純化類毒素，所述病原體例如副豬嗜血桿菌(Haemonphilus parasuis)、多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multiocida)、豬鏈球菌(Streptococcumsuis)、大葉性肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、支氣管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、豬霍亂沙門氏菌(Salmonella choleraesuis)、豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)和鉤端螺旋體(leptospira)，和病毒抗原，所述病毒抗原例如豬流感病毒(SIV)，豬生殖呼吸綜合癥病毒(PRRSV)，和豬環(huán)狀病毒(PCV)，可以通過肌內(nèi)、皮下、口服、噴霧劑或鼻內(nèi)途徑給予所述組合物。在本發(fā)明的其它實施方案中，其它疫苗成分包括一種或多種選自以下的抗原SIV、副豬嗜血桿菌、PRRSV和PCV、SIV和豬紅斑丹毒絲菌、多殺巴斯德氏菌和支氣管炎博德特氏菌。在本發(fā)明的再一個實施方案中，本發(fā)明的其它疫苗成分(當(dāng)選自SIV時)，將包括選自SIV-H1N1株系、SIV-H1N2和SIV-H3N2的株系。
又一方面，本發(fā)明提供保護(hù)動物以對抗豬肺炎支原體所引起的疾病的方法，該方法為給予單劑包含滅活豬肺炎支原體菌苗和佐劑混合物的上述疫苗。
在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了免疫動物以對抗由豬肺炎支原體引起的感染的免疫性組合物或疫苗，所述免疫性組合物或疫苗包含滅活豬肺炎支原體菌苗和佐劑或佐劑混合物，其單獨或在混合物中，提供對組合物或疫苗的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和局部(分泌型IgA)免疫反應(yīng)；其它疫苗成分包括至少一種其它細(xì)菌性和/或病毒性抗原；和藥學(xué)上可接受的載體，所述疫苗組合物(在單劑給予后)引發(fā)針對豬肺炎支原體的保護(hù)性免疫。在該組合物或疫苗中，其它疫苗成分可包括來自一種或多種病原體(包括所述病原體的一種或多種株系、類型、血清型等)的滅活菌苗或純化類毒素，所述病原體例如是副豬嗜血桿菌、多殺巴斯德氏菌、豬鏈球菌、大葉性肺炎放線桿菌、支氣管炎博德特氏菌、豬霍亂沙門氏菌、豬紅斑丹毒絲菌和鉤端螺旋體，和病毒抗原(包括所述病原的一種或多種株系、類型、血清型等)，所述病毒病原體例如是豬流感病毒(SIV)，豬生殖呼吸綜合癥病毒(PRRSV)和豬環(huán)狀病毒(PCV)，可以通過肌內(nèi)、皮下、口服、噴霧劑或鼻內(nèi)途徑給藥。
在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了免疫動物以對抗由豬肺炎支原體和病毒病原體引起的感染的A疫苗組合物，所述疫苗組合物包含免疫量的豬肺炎支原體菌苗；免疫量的至少一種病毒病原體，所述病毒病原體選自豬流感病毒(SIV)，豬生殖呼吸綜合癥病毒(PRRSV)，和豬環(huán)狀病毒(PCV)；和佐劑系統(tǒng)，所述佐劑系統(tǒng)包含水包油乳劑形式的丙烯酸聚合物，可代謝油和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物；所述疫苗組合物在單劑給予后引發(fā)針對豬肺炎支原體的保護(hù)性免疫。
在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了免疫動物以對抗由豬肺炎支原體，和至少一種病毒病原體，和任選的其它病毒性和/或細(xì)菌性病原體引起的感染的疫苗組合物和方法，所述疫苗組合物和方法在單劑給予后引發(fā)針對豬肺炎支原體的保護(hù)性免疫。
發(fā)明詳述本文引用的所有專利、專利申請和其它文獻(xiàn)特此全文引入本文作為參考。如有不一致，以本公開內(nèi)容為準(zhǔn)。
本文所用“菌苗”是這樣一種細(xì)菌收獲物所述細(xì)菌收獲物已經(jīng)被滅活，當(dāng)其與某種佐劑組合后給予動物時，能夠引發(fā)保護(hù)性免疫以對抗疾病或感染。
“佐劑”指包含一種或多種物質(zhì)的組合物，所述物質(zhì)增強(qiáng)疫苗組合物內(nèi)豬肺炎支原體菌苗的免疫原性和功效。
本說明書和權(quán)利要求內(nèi)使用的術(shù)語MHDCE指豬肺炎支原體DNA細(xì)胞等同物。
“免疫量”指提供針對豬肺炎支原體的免疫的菌苗量?！懊庖吡俊比Q于物種、品種、年齡、大小、健康狀態(tài)以及動物之前是否接受過對抗同樣病原體的疫苗。
本發(fā)明提供適于單劑免疫法的對抗豬肺炎支原體的疫苗。本發(fā)明的疫苗包括增強(qiáng)所述菌苗的免疫原性的佐劑混合物，因此一次給予就引發(fā)保護(hù)性免疫。
可以通過本領(lǐng)域內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)方法從新鮮收獲的培養(yǎng)物制備所述疫苗(例如，見美國專利5,338,543或美國專利5,565,205，以及下面的實施例2)。也就是說，可以在諸如PPLO(胸膜肺炎樣生物)完全培養(yǎng)基[Difco].Laboratories]的培養(yǎng)基內(nèi)繁殖豬肺炎支原體。通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如測定色度變化單位(CCU)監(jiān)測所述豬肺炎支原體的生長，當(dāng)達(dá)到足夠高的滴定度后收獲。所述貯液在用于配制疫苗前，可以通過常規(guī)方法進(jìn)一步濃縮或凍干?？梢允褂闷渌椒?，例如在Thomas等，Agri-Practice，第7卷No.5，第26～30頁描述的那些方法。
本發(fā)明的疫苗包含滅活豬肺炎支原體菌苗并結(jié)合佐劑混合物以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。適用的載體包括水性媒介，例如鹽水、磷酸鹽緩沖液、基本必需培養(yǎng)基(MEM)或用HEPES緩沖劑配制的MEM。
在本發(fā)明疫苗組合物中使用的佐劑混合物增強(qiáng)免疫反應(yīng)，所述佐劑混合物包括丙烯酸聚合物以及可代謝油和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的混合物，所述可代謝油例如不飽和萜烯烴或其氫化產(chǎn)物，優(yōu)選角鯊?fù)?2，3，10，15，19，23-六甲基二十四烷)或角鯊烯。所述丙烯酸聚合物可以是均聚物或共聚物。所述丙烯酸聚合物優(yōu)選是卡波姆(carbomer)?？ú房梢再彽?，商品名為Carbopol。丙烯酸聚合物在例如美國專利2,909,462和3,790,665有介紹，其公開內(nèi)容引入本文作為參考。所述聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物是表面活性劑，優(yōu)選是液體表面活性劑，其輔助懸浮固體和液體成分。所述表面活性劑可以作為聚合物購得，商品名為Pluronic。優(yōu)選表面活性劑是可購得的泊洛沙姆401，商品名為PluronicL121。
本發(fā)明疫苗組合物中存在的免疫原性刺激佐劑混合物量(v/v)通常約1％～25％，優(yōu)選約2％～15％，更優(yōu)選約5％～12％v/v。所述佐劑混合物的使用量以及所述佐劑內(nèi)兩種成分的比例將根據(jù)其它菌苗或純化類毒素的加入而變化。所述佐劑混合物一般包含可代謝油、丙烯酸聚合物以及聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，其在水性媒介內(nèi)被配制成乳液。
在該佐劑混合物中，可代謝油的量和丙烯酸聚合物的量分別為約10～150ml/L和約0.5～10g/L。在所述佐劑混合物的優(yōu)選實施方案中，所述可代謝油以及聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的混合物是角鯊?fù)楹蚉luronicL121(泊洛沙姆401)的混合物，其含量為約50～100ml/L，羧亞甲基聚合物是Carbopol 934P(卡波姆934P)，其含量為約2ml/L。一般地，所述佐劑混合物中包含的丙烯酸聚合物與可代謝油/聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物混合物的比例是約1∶25～1∶50。
優(yōu)選丙烯酸聚合物是B.F Goodrich銷售的Carbopol 934 P NF和941NF，它們是丙烯酸與聚烯丙基蔗糖的交聯(lián)聚合物，化學(xué)式為(CH2CHOOOH)n。這些聚合物形成適合用水性載體配制的水凝膠。優(yōu)選聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物是BASF銷售的非離子表面活性劑PluronicL121、L61、L81或L101。
本發(fā)明的疫苗組合物中涉及聯(lián)合免疫量的滅活豬肺炎支原體菌苗；其它選自細(xì)菌性和/或病毒病原體的疫苗成分；和藥學(xué)上可接受的載體，所述疫苗組合物在單劑給予后引發(fā)針對豬肺炎支原體的保護(hù)性免疫，所述疫苗組合物還包含佐劑或佐劑混合物，其單獨或在混合物中，提供細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和局部(分泌型IgA)免疫。這些佐劑可進(jìn)一步選自如下佐劑，皂角甙，如QUILA；細(xì)胞因子，如IL-12和IL-18和局部(分泌型IgA)免疫；氫氧化鋁，以水包油乳劑形式的可代謝油，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物和丙烯酸聚合物，乙烯馬來酸共聚物；與其它佐劑的丙烯酸聚合物，二乙氨基乙基(DEAE)葡聚糖；分枝桿菌細(xì)胞壁來源的佐劑等。本發(fā)明的該組合物中的其它疫苗成分可包括細(xì)菌抗原，所述細(xì)菌抗原包含來自一種或多種病原體(包括所述病原體的一種或多種株系、類型、血清型等)的細(xì)菌性抗原(包括滅活菌苗或純化類毒素)，所述病原體例如是副豬嗜血菌、多殺巴斯德氏菌、豬鏈球菌、大葉性肺炎放線桿菌、支氣管炎博德特氏菌、豬霍亂沙門氏菌、豬紅斑丹毒絲菌、鉤端螺旋體，和病毒抗原(包括所述病原的一種或多種株系、類型、血清型等)，所述病毒病原體例如是豬流感病毒(SIV)，豬生殖呼吸綜合癥病毒(PRRSV)，和豬環(huán)狀病毒(PCV)。在本發(fā)明的其它實施方案中，其它疫苗成分包括一種或多種選自以下的抗原SIV、副豬嗜血菌、PRRSV和PCV、SIV和豬紅斑丹毒絲菌、多殺巴斯德氏菌和支氣管炎博德特氏菌。在本發(fā)明的另一實施方案中，本發(fā)明的其它疫苗組分，當(dāng)選自SIV時，將包括選自SIV-H1N1株系，H1N2，和SIV-H3N2株系。
可以通過肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)或口服途徑施用本發(fā)明的疫苗，優(yōu)選通過肌內(nèi)或皮下途徑。
本發(fā)明的疫苗一般包含滅活豬肺炎支原體、水包油乳劑形式的可代謝油、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物以及丙烯酸聚合物。所述疫苗優(yōu)選包含濃度為0.5～10g/L的丙烯酸聚合物。所述疫苗優(yōu)選包含濃度為2～6ml/L的可代謝油。所述疫苗優(yōu)選包含濃度為1～3ml/L的聚氧乙烯-丙烯嵌段共聚物。
對于單劑給予，所述疫苗應(yīng)當(dāng)優(yōu)選包含相當(dāng)于約1×108～3×1011MHDCE/ml量的豬肺炎支原體菌苗，優(yōu)選約1×109～3×109MHDCE/ml。肌內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)給予每只動物約1～5mL，優(yōu)選2mL?？诜虮莾?nèi)給予1～10mL，優(yōu)選2～5mL。
下面的實施例將進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明，而不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1疫苗組合物的豬肺炎支原體菌苗制品病毒貯液描述?？梢詮亩喾N易于獲得的來源獲取豬肺炎支原體。在一個實施方案中，可以使用豬肺炎支原體株系P-5722-3。所述培養(yǎng)物得自C.Armstrong，Purdue University，West Lafayette，Indiana。收到豬肺炎支原體培養(yǎng)物后，在豬肺炎支原體肉湯上傳代七次，建立主導(dǎo)種(Master Seed)。
細(xì)胞培養(yǎng)。在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)豬肺炎支原體18～144小時，培養(yǎng)基含Bacto PPLO粉末、酵母提取物、葡萄糖、L-半胱氨酸鹽酸鹽、氨芐青霉素、乙酸亞鉈、酚紅、止沫劑、正常無菌豬血清和水。為進(jìn)行滅活，將二吖丙啶(BEI)直接加入發(fā)酵容器內(nèi)的生產(chǎn)培養(yǎng)物。將pH調(diào)到7.4，然后按照常規(guī)程序收獲，獲得豬肺炎支原體菌苗。
制備疫苗組合物。
防腐劑組合物和使用的比例。分別加入不超過0.01％的硫柳汞和不超過0.07％的乙二胺四乙酸四鈉(EDTA)，保存所收獲的菌苗。所述生長培養(yǎng)基內(nèi)氨芐青霉素U.S.P.的濃度是0.250克/升。根據(jù)收獲液體的體積，最終產(chǎn)品中的殘余氨芐青霉素濃度將有變化，成品內(nèi)的殘余氨芐青霉素濃度不超過30ug/mL。
產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化。通過DNA熒光測定法定量支原體(Mycoplasma)濃縮物。
按如下方法制備可代謝油(包含一種或多種萜烯烴)和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的混合物(如角鯊?fù)?Pluronic L121混合物)在900mL純化水內(nèi)溶解10g氯化鈉、0.25g氯化鉀、2.72磷酸氫二鈉、0.25磷酸二氫鉀、20mL Pluronic L121(BASF Corporation)、40mL角鯊?fù)?Kodak)、3.2mL吐溫80，然后定容到1000ml?；旌虾?，對所述成分進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。然后混勻所述混合物，直到形成穩(wěn)定的乳濁液?？梢约尤敫栺R林達(dá)到0.2％的終濃度，或加入硫柳汞達(dá)到1∶10,000的終濃度。
組裝各個單位形成系列。無菌操作，將滿意的豬肺炎支原體濃縮物與所述佐劑、防腐劑和稀釋劑混合加入裝備有攪拌器的無菌容器，混合不少于30分鐘。
1,000,000個劑量(每劑量2mL)的量 ％v/v
將該系列的pH調(diào)到7.0±0.2。
MHDCE＝豬肺炎支原體DNA細(xì)胞等同物裝瓶和封口最終容器的方法和技術(shù)。所述產(chǎn)物通過無菌200～500微米濾器元件總體過濾，在專用于裝瓶操作的房間里按照9 CFR 114.6規(guī)定條件下裝瓶進(jìn)無菌的最終容器。用橡膠塞子封閉所述玻璃或塑料容器，并用鋁封條(aluminum seal)卷折密封。每個2.0mL劑量包含不少于2×109豬肺炎支原體DNA細(xì)胞等同物。
測試效能。按如下方法測試成品的大量生產(chǎn)或最終容器的樣品的效能效能測定方法使用Harlan Sprague Dawley或其它可接受供應(yīng)商的同批六到七周齡ICR雌性小鼠。最少20只小鼠需要用每種未知和參考菌苗免疫。保留最少五只小鼠作為未接種對照。測試菌苗和參考菌苗各自完全混合。使用配有25號5/8英寸針頭的無菌一次性注射器，在小鼠腹股溝區(qū)皮下接種1/10宿主動物劑量(0.2mL)。每組小鼠以個體單位飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水14天。然后麻醉每只小鼠。將麻醉的小鼠仰面放置。用一只手壓住小鼠頭部，使一只前腿從身體伸出。使用解剖刀在伸出的前腿和胸之間制造一個長約1/2英寸長的皮膚切口，切斷肱動脈。使用不帶針頭的3.0mL注射器，收集在切口匯集的血。將血排放入標(biāo)記的試管，使其凝結(jié)。凝結(jié)的試管在1,000×g離心，從凝塊分離血清。測試前各個血清保存在-20℃或更冷溫度下。
血清學(xué)測試使用ELISA程序測量小鼠對參考菌苗和/或未知菌苗的抗體反應(yīng)。使用得自Dynatech的Disposable Immulon II平底微量滴定板或其等同物以及ELISA讀板器進(jìn)行所述ELISA程序。
測試試劑磷酸鹽緩沖鹽溶液-吐溫(PBST)(用5N NaOH或5 N HCl將pH調(diào)到7.2～7.4)。
每升含量
甘氨酸緩沖溶液(GBS)(用5N NaOH或5N HCl將pH調(diào)到9.5～9.7)
陽性對照血清陽性對照血清是來自用豬肺炎支原體菌苗接種的小鼠的血清的匯總。
結(jié)合物和底物
從Kirkegaard and Perry Laboratories，Inc.獲得親和純化的抗小鼠IgG過氧化物酶標(biāo)記的結(jié)合物(目錄號074-1802)。確定結(jié)合物最佳稀釋度的程序如下。從Kirkegaard and Perry，Inc.獲得過氧化物酶底物溶液(ABTS)。
滴定結(jié)合物用每孔100ul包被液包被Immulon II平底板，所述包被液每mL含20ug溶解于10mM GBS的豬肺炎支原體全細(xì)胞抗原。該板在37℃±2℃溫育不少于一小時，然后轉(zhuǎn)移到2～7℃放置不少于18小時和不超過一周。使用前，該板用PBST洗滌三次，每次洗滌之間浸泡一分鐘，然后輕扣甩干。制備陽性對照血清在PBST中1∶40的稀釋物，將所述稀釋的陽性血清加入板上的一半孔中(100uL/孔)。在另一半孔內(nèi)加入PBST。該板在室溫下溫育一小時，然后洗滌三次。所述結(jié)合的血清順序用PBST兩倍稀釋，從1∶100稀釋開始，直到1∶10,240稀釋度。在陽性血清的四個孔和PBST的四個孔內(nèi)加入各個結(jié)合物稀釋液100ul，在室溫下反應(yīng)一個半小時。洗板四次，每孔加入100ul過氧化物酶底物溶液(abts)。在Tλ＝450的雙波長設(shè)置下讀板。從陽性對照血清值減去PBST對照的值，并選出陽性對照血清讀數(shù)在0.850～1.050之間的結(jié)合物稀釋液。
測試抗原豬肺炎支原體抗原是全細(xì)胞制備物，由Fort Dodge Anima1 Health提供。
如下進(jìn)行ELISA使用Dynatech Immulon II平底微量滴定板。用甘氨酸緩沖鹽溶液(GBS)重構(gòu)一小瓶凍干的豬肺炎支原體全細(xì)胞抗原至10ml。重構(gòu)的支原體蛋白濃度是20μg/mL。然后在板上的所有孔內(nèi)加入100μl(2μg)稀釋抗原。所述板在37℃±2℃溫育不少于一小時，然后轉(zhuǎn)移到2～7℃放置最短18小時、最長一周。所述板用PBST洗滌三次，每次洗滌之間浸泡一分鐘，然后輕扣甩干。血清用PBST以1∶40稀釋。每塊板包括一式四份的陽性對照血清。每孔的樣品體積是100μl。在同一塊板上一式兩份地測定順序測試血清樣品和參考血清樣品。所述板在室溫溫育一小時，然后用PBST洗滌三次。所有孔內(nèi)加入100μl用PBST稀釋的抗鼠IgG過氧化物酶標(biāo)記的結(jié)合物(Kirkegaard and Perry)，所述孔在室溫下溫育30分鐘。用PBST洗滌板四次。在所有孔內(nèi)加入100μl過氧化物酶底物溶液(ABTS)，使機(jī)器以PBST對照孔為空白，溫育板直到陽性血清對照達(dá)到0.850～1.050之間的OD405(450)。以PBST孔為空白，讀板。為使測試有效，接種參考菌苗的小鼠的血清的最小平均值必須為0.500，未接種對照小鼠的血清的平均值必須最大不超過0.100。或者接種參考菌苗的小鼠的血清的平均值與未接種對照小鼠的血清的平均值之間的差異必須大于或等于0.400。
如下計算和評價系列接種物、參考接種物和對照的平均值判定結(jié)果滿意的前提條件是測試菌苗必須顯示等于或大于參考的平均的平均光密度值?；蛘撸鶕?jù)單側(cè)斯氏T檢驗，測試菌苗必須不能顯著低于參考菌苗(置信水平p≤0.05)。計算得到的任何等于或大于1.686的T值將指示參考和測試菌苗之間的顯著差異，從而導(dǎo)致測試菌苗被淘汰。計算得到的任何小于1.686的T值將指示為滿意的系列。由于任何與產(chǎn)品效力無關(guān)的原因被所述測試認(rèn)為不滿意的任何測試菌苗都接受再測試，最初的測試被認(rèn)為無效。
實施例2測試疫苗根據(jù)實施例1中詳細(xì)描述的程序制備用于測試的疫苗，每個劑量包含2×109豬肺炎支原體DNA細(xì)胞等同物(MHDCE)，使用5％的可代謝油(包括一種或多種萜烯烴)與聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的混合物(角鯊?fù)?Pluronic L121混合物)以及0.2％丙烯酸聚合物(Carbopol)作為佐劑。
實施例3本研究設(shè)計用于證明用實施例2所述疫苗在三周齡單劑接種豬誘導(dǎo)四個月的免疫保護(hù)期(duration of immunity，DOI)。
本研究進(jìn)行了兩個獨立的動物試驗。兩個試驗內(nèi)所有的豬在接種時都是血清學(xué)陰性(抗體滴度＜10)，表明所有豬對豬肺炎支原體敏感。對照組內(nèi)的所有豬在試驗前都保持血清學(xué)陰性。這表明在接種豬體內(nèi)的免疫反應(yīng)是由所述疫苗引起，而不是由于任何環(huán)境暴露引起。
在第一個試驗中，通過高水平強(qiáng)毒豬肺炎支原體(.4×106支原體)攻擊評估實施例2所述疫苗以及一種商業(yè)化產(chǎn)品Ingelvac M.hyo(由Boehringer Ingelheim(BI)生產(chǎn))。用實施例2所述疫苗肌內(nèi)(IM)接種18～21日齡的二十二(22)只豬，用Ingelvac M.hyo[serial 271 032]接種八(8)只豬。使用二十二(22)只豬作為攻擊對照，10只豬作為未攻擊對照。接種后四個月用強(qiáng)毒豬肺炎支原體攻擊接種組和攻擊對照組的豬。用實施例2所述疫苗接種的豬的平均肺損傷是15.9％，攻擊對照組的平均肺損傷是19.6％。盡管用比IowaState University(ISU)推薦劑量更高的劑量攻擊豬，但用實施例2所述疫苗接種組的平均肺損傷少于對照組，然而，該差異并不顯著(p＝0.19)。同樣的，當(dāng)用相同攻擊劑量在同一組豬中評價商業(yè)化產(chǎn)品Ingelvac M.hyo時，也觀察到相似水平的肺損傷(14.6％)。在Ingelvac M.byo接種組和對照組之間(p＝0.27)，以及在IngelvacM.hyo接種組和用實施例2所述疫苗接種的組之間，也沒有顯著差異。
在第二個試驗中，接種后四個月用ISU建議水平(1.0×106支原體)的強(qiáng)毒豬肺炎支原體攻擊評價實施例2所述疫苗。在21日齡用一劑量所述疫苗接種二十三(23)只豬，25只豬作為攻擊對照，7只豬作為未攻擊對照。接種后四個月用強(qiáng)毒豬肺炎支原體攻擊在接種組和攻擊對照組內(nèi)的豬。對照組的平均肺損傷是10.4％，接種組的平均肺損傷是5.5％。在接種組和對照組之間有顯著差異(p＝0.031)。這表明實施例2所述疫苗有效刺激保護(hù)性免疫，這種保護(hù)性免疫在單劑量接種三周齡的豬后能夠持續(xù)至少四個月。
當(dāng)合并并分析這兩個試驗中與實施例2所述疫苗有關(guān)的數(shù)據(jù)后，接種組的平均肺損傷顯著低于對照組的平均肺損傷。
總之，用實施例2所述疫苗單劑量接種三周齡豬四個月后誘導(dǎo)了針對強(qiáng)毒豬肺炎支原體攻擊的保護(hù)性免疫。
實驗數(shù)據(jù)在本研究中進(jìn)行兩個單獨的試驗。在試驗一，使用Microsoft Excel隨機(jī)化程序?qū)⒘?67)只豬分配為四個組。二十四(24)只豬在18～21日齡接受按照實施例2制備的一劑量疫苗的肌內(nèi)(IM)接種。二十四(24)只豬用作攻擊對照，10只豬用作未攻擊對照。用商業(yè)化產(chǎn)品Ingelvac M.hyo[serial 271 032，Boehringer Ingelheim(BI)]按照說明書的指導(dǎo)肌內(nèi)接種九只豬。五只豬(兩只豬用實施例2所述疫苗接種，一只豬用BI疫苗接種，兩只豬是對照)在接種保持期內(nèi)由于與接種無關(guān)的原因死亡。接種組和攻擊對照組的剩余豬在接種后四個月接受14mL強(qiáng)毒豬肺炎支原體(1.4×106生物)的攻擊。攻擊后30天無痛苦處死所有四個組的豬，對該試驗中每只豬的肺損傷評分。
在第二個試驗中，二十五(25)只豬在21日齡接受一劑量按照實施例2制備的疫苗的肌內(nèi)接種。二十五(25)只豬用作攻擊對照，10只豬用作未攻擊對照。兩只豬由于與接種無關(guān)的原因死亡，一只豬在接種保持期內(nèi)被錯誤地賣掉。接種組和攻擊對照組內(nèi)剩余的豬在接種后四個月接受10mL強(qiáng)毒豬肺炎支原體(1.0×106生物)的攻擊。兩只豬在攻擊后的觀察期內(nèi)由于與接種/攻擊無關(guān)的原因死亡。攻擊后30天無痛苦處死所有三個組內(nèi)剩余的豬，對該試驗中每只豬的肺損傷評分。
接種接種組的每只豬在頸側(cè)肌內(nèi)接受一劑量2mL所述測試疫苗。
攻擊和尸體剖檢強(qiáng)毒豬肺炎支原體攻擊貯液是冰凍(-70℃)的肺勻漿物，由IowaState University(ISU)的Dr.Eileen Thacker制備。所述攻擊貯液經(jīng)證實是純的，每mL含約107M.豬肺炎支原體生物。推薦的攻擊劑量是10mL以1∶100稀釋的貯液(即1.0×106生物)。
第一個試驗中接種組和攻擊對照組內(nèi)的豬接受14ml以1∶100稀釋的貯液(即1.4×106生物)的攻擊。第二個試驗中的豬根據(jù)推薦接受10ml以1∶100稀釋的貯液(即1.0×106生物)的攻擊。
在攻擊的當(dāng)天，在溫水中快速融化所述勻漿物，按照ISU的推薦用無菌豬肺炎支原體生長培養(yǎng)基稀釋。給予豬鎮(zhèn)靜劑，所述鎮(zhèn)靜劑是含50mg/mL噻拉嗪、50mg/mL氨氨酮和100mg/mL Telazol的Xylazine-Ketamine-TelazolTM混合物。按照0.01～0.02mL/磅體重給予所述麻醉混合物。每只豬氣管內(nèi)接受一劑量14mL(第一個試驗)或10mL(第二個試驗)所述攻擊材料。為保證針頭位置正確，在給予攻擊劑量前用注射器抽氣。未接種的未攻擊對照豬飼養(yǎng)在單獨的房間內(nèi)，不進(jìn)行攻擊。
攻擊后(DPC)30天，無痛苦處死所有豬。取出肺，由不了解試驗分組的人員對總肺損傷評分。
樣品收集和測試在接種當(dāng)天(0DPV)、接種后一個月(1MPV)、4MPV/0DPC和30DPC，從所有豬收集血液樣品，使用競爭性ELISA試劑盒(由DAKOCo.制造)檢測抗豬肺炎支原體的血清抗體。所述血清樣品在測試前保存在-20℃。
數(shù)據(jù)分析通過方差分析(ANOVA)比較接種組和未接種組間的肺損傷評分。將肺評分用反正弦函數(shù)轉(zhuǎn)化，以改善殘數(shù)分布(distribution ofresidual)。
結(jié)果和討論血清學(xué)使用商業(yè)化競爭性ELISA試劑盒測試兩個試驗中所有豬體內(nèi)抗豬肺炎支原體的血清抗體，其中所有測定使用1∶10的血清稀釋物。所有豬在接種時都是血清學(xué)陰性(抗體滴度＜10)，這表明所有豬都對豬肺炎支原體敏感。對照組的所有豬在攻擊前保持血清學(xué)陰性。這表明接種豬體內(nèi)的免疫反應(yīng)是由所述疫苗引起的，而不是任何環(huán)境暴露引起的。接種組內(nèi)所有的豬和攻擊對照組內(nèi)大部分豬(試驗一22只豬中的18只，試驗二25只豬中的15只)在攻擊后都轉(zhuǎn)化為對豬肺炎支原體呈血清學(xué)陽性，而所有未受攻擊的豬保持血清學(xué)陰性。這提示所述攻擊是豬肺炎支原體特異性的。表1總結(jié)了測試豬的血清學(xué)狀態(tài)。
第一個試驗中的免疫原性測試進(jìn)行第一個試驗以確定實施例2所述疫苗是否能夠刺激強(qiáng)的免疫性，所述免疫性能夠在接種后四個月保護(hù)豬，抵抗比ISU推薦水平更高水平的攻擊。本試驗還比較實施例2所述疫苗以及商業(yè)化Ingelvac M.hyo在接種后四個月刺激保護(hù)性免疫的能力。
二十二只豬用FDAH Suvaxyn MH-One接種，八只豬用注冊產(chǎn)品Ingelvac M.hyoserial 271，032接種，然后用每只豬1.4×106生物(ISU推薦每只豬1.0×106生物，見5.5小節(jié))的所述攻擊材料攻擊這些豬。二十二只豬用作攻擊對照，10只豬用作未攻擊對照。肺損傷百分率綜述于表2。用實施例2所述疫苗接種的豬的平均肺損傷是15.9％，攻擊對照組的平均肺損傷是19.6％。甚至當(dāng)用更高劑量豬肺炎支原體攻擊豬時，用實施例2所述疫苗接種的組的平均肺損傷仍少于對照組。然而，該差異并不顯著(p＝0.19)。同樣的，當(dāng)用相同攻擊劑量在同一組豬中評價商業(yè)化產(chǎn)品Ingelvac M.hyo時，也獲得相似水平的肺損傷(14.6％)。在Ingelvac M.hyo接種組和對照組之間(p＝0.27)以及在Ingelvac M.hyo接種組和實施例2所述疫苗接種組之間(p＝0.88)沒有顯著差異。
雖然在接受實施例2的組中記錄到并不顯著的病變數(shù)量減少，但本試驗獲得的數(shù)據(jù)提示在本試驗中使用的更高攻擊劑量(1.4×106生物)可能太高，甚至對于商業(yè)化Ingelvac產(chǎn)品刺激的豬免疫也是如此。該攻擊水平可能并不適合于使用20～25只豬的組規(guī)模進(jìn)行的接種/攻擊研究評價，雖然使用更大的組大小可能證明該顯著性。
第二個試驗中的免疫原性測試試驗二中接種組和攻擊對照組內(nèi)的豬在接種后四個月用ISU推薦的攻擊劑量(1.0×106生物)進(jìn)行評價，以證明四個月的DOI。肺損傷百分率綜述于表3。對照組的平均肺損傷是10.4％。接種組的平均肺損傷是5.5％。在接種組和對照組之間有顯著差異(p＝0.031)。這指出實施例2所述疫苗有效刺激保護(hù)性免疫，所述保護(hù)性免疫在用單劑量接種三周齡的豬后持續(xù)至少四個月。
評價兩個試驗的綜合結(jié)果雖然兩個試驗顯著不同，但組的試驗效應(yīng)不是顯著的。兩個試驗間組效應(yīng)的幅度相似。因此，可以在不考慮試驗的情況下評價組效應(yīng)。由于對全模型的分析顯示組和試驗之間的相互作用不顯著，因此這支持兩個試驗中組效應(yīng)相同的觀點，并支持將兩個試驗的數(shù)據(jù)結(jié)合進(jìn)行單一分析。如此，當(dāng)結(jié)合兩個試驗中與實施例2所述疫苗有關(guān)的數(shù)據(jù)，將組和試驗作為獨立變量，分析肺損傷的反正弦轉(zhuǎn)化變量時(簡化模式，reduced model)，組在統(tǒng)計學(xué)上是有意義的(p＝0.013)。
表1對照組和接種組的豬對豬肺炎支原體的血清學(xué)狀態(tài)小結(jié)試驗一陽性/陰性(1∶10)
試驗二陽性/陰性(1∶10)
表2試驗一肺損傷百分率小結(jié)(超劑量)*
*按每只豬1.4×106生物的劑量攻擊豬(ISU推薦的劑量是每只豬1.0×106生物)**FDAH疫苗組和對照之間的比較***BI疫苗組和對照組之間的比較****BI疫苗組和FDAH疫苗組之間的比較表3試驗二肺損傷百分率小結(jié)(推薦劑量)
*按ISU推薦劑量攻擊豬(每只豬1.0×106生物)**FDAH疫苗組和對照之間的比較實施例4評價本發(fā)明疫苗組合物在單劑給予后六個月誘導(dǎo)的對毒力攻擊的長期免疫性使用實施例1和2內(nèi)所述的基本相同的程序以及使用下面顯示的量，制備測試疫苗A。
測試疫苗A1,000,000劑的量(每劑量2mL) ％v/v
將該系列的pH調(diào)到7.0±0.2。
MHDCE＝豬肺炎支原體DNA細(xì)胞等同物小結(jié)本評價包括三十三只21日齡的豬。二十只豬在三周齡接受一劑量疫苗A的肌內(nèi)接種。十只豬作為未接種對照，三只豬作為未攻擊環(huán)境對照。
所有豬在接種時都是血清學(xué)陰性(抗體滴度＜10)，這表明這些豬對豬肺炎支原體敏感。對照組內(nèi)所有的豬在攻擊前保持血清學(xué)陰性。這表明接種豬體內(nèi)的免疫反應(yīng)是由疫苗引起的，而不是由于任何環(huán)境暴露引起的。
接種后六個月，用強(qiáng)毒豬肺炎支原體(每只豬1.0×106生物)攻擊20只接種的豬和10只未接種的對照豬。三只豬作為未攻擊對照。接種豬的平均肺損傷評分是3.6％，攻擊對照豬的平均肺損傷評分是14.6％。接種組的肺損傷顯著少于對照組(p＝0.0215)。
本評價中獲得的數(shù)據(jù)證明測試疫苗A在單劑接種后誘導(dǎo)六個月的針對強(qiáng)毒豬肺炎支原體攻擊的長期保護(hù)性免疫。
試驗設(shè)計使用Microsoft Excel隨機(jī)化程序，將三十三只21日齡的豬隨機(jī)分配到三個組(接種組、攻擊對照組和未攻擊環(huán)境對照組)。二十只豬在三周齡接受一劑量測試疫苗A的肌內(nèi)接種。十只豬作為攻擊對照，三只豬作為未攻擊環(huán)境對照。接種后六個月按每只豬10mL強(qiáng)毒豬肺炎支原體(1.0×106生物)培養(yǎng)物攻擊接種組和攻擊對照組的豬。三只未接種的豬用作未攻擊對照。攻擊后26天無痛苦處死接受攻擊的豬和未接受攻擊的對照，對每只豬的肺損傷評分。
接種組的每只豬在頸側(cè)肌內(nèi)接受一劑量2mL所述測試疫苗。
攻擊和尸體剖檢強(qiáng)毒豬肺炎支原體攻擊貯液是冰凍(≤-70℃)的肺勻漿物，由IowaState University(ISU)的Dr.Eileen Thacker制備。所述攻擊貯液經(jīng)證實是純的，每mL含約107豬肺炎支原體生物。
用10mL以1∶100稀釋的貯液(即1.0×106生物)攻擊豬。
在攻擊的當(dāng)天，在溫水中快速融化所述勻漿物，按照ISU的推薦用無菌豬肺炎支原體生長培養(yǎng)基稀釋。給予豬鎮(zhèn)靜劑，所述鎮(zhèn)靜劑是含50mg/mL噻拉嗪、50mg/mL氯氨酮和100mg/mL Telazol的Xylazine-Ketamine-TelazolTM混合物。按照0.01～0.02mL/磅體重給予所述麻醉混合物。每只豬氣管內(nèi)接受一劑量10mL所述攻擊材料。為保證針頭位置正確，在給予攻擊劑量前用注射器抽氣。未接種的未攻擊對照豬飼養(yǎng)在單獨的房間內(nèi)，不進(jìn)行攻擊。
攻擊后(DPC)26天，無痛苦處死所有豬。取出肺，如實施例3所述對總肺損傷評分。
樣品收集和測試在接種當(dāng)天(0DPV)、35DPV、-1DPC和26DPC，從所有豬收集血液樣品，使用競爭性ELISA試劑盒(由DAKO Co.制造)檢測抗豬肺炎支原體的血清抗體。所述血清樣品在測試前保存在＜-20℃。
數(shù)據(jù)分析通過單因素方差分析(ANOVA)比較接種組和對照組間的肺損傷評分。將肺評分用反正弦函數(shù)轉(zhuǎn)化，以改善殘數(shù)分布。由于所述肺損傷評分的正態(tài)假設(shè)是有問題的，因此使用Wilcoxon秩和檢驗分析肺損傷評分以及肺損傷評分的反正弦轉(zhuǎn)化值。顯著性水平設(shè)為p＜0.05。報告來自非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗結(jié)果。
結(jié)果和討論血清學(xué)使用商業(yè)化競爭性ELISA試劑盒測試兩個試驗中所有豬體內(nèi)抗豬肺炎支原體的血清抗體，其中所有測定使用1∶10的血清稀釋液。按照試劑盒說明書測試結(jié)果存在懷疑的樣品在數(shù)據(jù)分析中作為陽性處理。所有豬在接種時都是血清學(xué)陰性(抗體滴度＜10)，這表明所有豬都對豬肺炎支原體敏感。對照組的所有豬在攻擊前保持血清學(xué)陰性。接種后，二十只接種豬中的十五只(15/20)變?yōu)閷ωi肺炎支原體血清學(xué)陽性至少一次(在35DPV和-1DPC收集的樣品)。這表明接種豬體內(nèi)的免疫反應(yīng)是由所述疫苗引起的，而不是任何環(huán)境暴露引起的。所有接種豬和攻擊對照組內(nèi)的十只豬有四只豬在攻擊后都轉(zhuǎn)化為對豬肺炎支原體呈血清學(xué)陽性，而所有未受攻擊的豬保持血清學(xué)陰性。表4中總結(jié)了測試豬的血清學(xué)狀態(tài)。
肺損傷評分接種后六個月用強(qiáng)毒豬肺炎支原體(每只豬1.0×106生物)攻擊用測試疫苗A接種的二十只豬和十只未接種對照豬。三只豬用作未攻擊對照。二十只接種豬中有八只(40％)在攻擊后沒有出現(xiàn)肺損傷，而對照組的10只豬中僅一只豬(10％)沒有肺損傷。肺損傷的百分率綜述于表5。接種豬的平均肺損傷評分是3.6％，攻擊對照豬的平均肺損傷評分是14.6％。接種組內(nèi)的肺損傷顯著少于對照(p＝0.0215)。
表4本研究中豬對豬肺炎支原體的血清學(xué)狀態(tài)*陽性數(shù)量(1∶10)/總數(shù)組處理豬的數(shù)量0DPV**35DPV-1DPC***26DPC1 疫苗/攻擊20 0/20 9/20 12/20 20/202 對照/攻擊10 0/10 0/10 0/104/103 對照/未攻擊3 0/30/3 0/3 0/3*使用商業(yè)化試劑盒，通過ELISA測定所述血清學(xué)樣品中的抗豬肺炎支原體血清抗體。
所有樣品在血清稀釋度1∶10測試。按照試劑盒說明書解釋結(jié)果。
在1∶10存在懷疑的樣品認(rèn)為是陽性。
**DPV＝接種后天數(shù)***DPC＝攻擊后天數(shù)表5在用豬肺炎支原體攻擊的豬和未攻擊對照中肺損傷評分(％)小結(jié)平均肺損傷 平均值的95％ 平均值的95％組 處理 豬的數(shù)量 評分(％)標(biāo)準(zhǔn)差 CL*下限 CL上限P值**1 疫苗/攻擊20 3.6 7.6 0.07 7.19 0.02152 對照/攻擊10 14.620.00.33 28.943 對照/未攻擊 31.8 1.8 -2.67 6.27*CL＝置信度**P值來自于組1和組2的比較。
如表4和表5的數(shù)據(jù)所示，在用測試疫苗A單劑給予三周齡的豬后，測試疫苗A誘導(dǎo)六個月的針對強(qiáng)毒豬肺炎支原體攻擊的保護(hù)性免疫。
實施例5
豬流感病毒疫苗可按本領(lǐng)域眾所周知的方法制備。而且，SIV株系(如H1N1和H3N2)也是本領(lǐng)域眾所周知的且易于獲得，例如可獲自NVSL，Ames，Iowa，USDA和其它地方。這些株系通?？稍?，例如馬-達(dá)二氏犬腎(Maidin Darby Canine Kidney(MDCK))細(xì)胞系上使用例如適當(dāng)加入一種或多種胎牛血清，牛血清白蛋白，乳清蛋白，hydrosylate，和碳酸氫鈉的Opti-Mem生長培養(yǎng)基進(jìn)行增殖。在一個實例中，為促進(jìn)最適宜的病毒生長，將進(jìn)一步在用于H1N1株系增殖的生長培養(yǎng)基中加入適量的胰蛋白磷酸鹽肉湯，丁酸鈉和胰蛋白酶；而在用于H3N2株系增殖的生長培養(yǎng)基中加入適量的胰蛋白酶。在收集時，可用福爾馬林滅活收集的病毒液。包含這些疫苗株系的SIV疫苗組合物可按以下進(jìn)行配制SIV H1N1(≥400HA單位/1ml)20,000mlSIV H3N2(≥200HA單位/1ml)20,000mlCarbopol(2％溶液)5,000ml硫柳汞(5％溶液) 50mlMEM或平衡鹽溶液 4,950ml總計 50,000ml根據(jù)本發(fā)明的含有SIV的組合物疫苗通?？砂匆韵逻M(jìn)行制備支原體濃縮物(1×1010MHDCE/ml) 100,000mLSIV H1N1(5120HA單位/1ml)≥1067HA單位/1ml 75,000mlSIV H3N2(≥2560HA單位/1ml)≥1533HA單位/1ml 56,000ml角鯊?fù)?Pluronic L121混合物 200,000mlCarbopol(2％溶液)100,000ml硫柳汞(5％溶液) 7690mlMEM或平衡鹽溶液 611,310ml總計 1,000,000ml用三種不同的實驗來證明組合物中不同部分的效能。在每個實驗中將適齡的豬隨機(jī)分配至三組接種組，用于測試的部分的攻擊對照組，和環(huán)境對照組。
這些試驗的結(jié)果如下
試驗總結(jié)-豬肺炎支原體部分該實驗被設(shè)計用于證明豬流感疫苗，H1N1和H3N2，滅活病毒-根據(jù)本發(fā)明的豬肺炎支原體菌苗的豬肺炎支原體部分的效能以及不存在由SIV部分引起的抗原封閉。
所有豬在接種時均為血清學(xué)陰性(抗體滴度＜10)，這表明所有豬都對豬肺炎支原體敏感。對照組的所有豬在攻擊前保持血清學(xué)陰性。這表明接種豬體內(nèi)的免疫反應(yīng)是由所述疫苗引起的，而不是任何環(huán)境暴露引起的。
二十二(22)只豬在一周齡接受SIV疫苗(疫苗A)的接種然后在第一次免疫接種后三周接受MH/SIV疫苗(疫苗B)的再接種。二十二(22)只豬用作豬肺炎支原體攻擊對照而三只豬用作環(huán)境對照。在第二次接種后四周，用毒性豬肺炎支原體攻擊接種組和攻擊對照組中的豬。在攻擊后28天無痛苦處死豬并對每只豬的肺損傷評分。
對照組中20只豬中的十八只(90％)的肺損傷評分高于5％而在接種組中21只豬中僅8只(38％)的肺損傷評分高于5％。接種組的平均肺損傷評分為10.2％而受到攻擊的對照組的平均肺損傷為16.9％。在接種組和對照組之間有顯著差異(p＝0.02)。這表明在一周齡用SIV疫苗接種而在三周后用MH/SIV接種的豬發(fā)展了對抗毒性豬肺炎支原體攻擊的保護(hù)性免疫。這還表明在MH/SIV組合物疫苗中不存在SIV部分對豬肺炎支原體部分的抗原封閉。
試驗總結(jié)-SIV H1N1部分該實驗被設(shè)計用于證明豬流感疫苗，H1N1和H3N2，滅活病毒-根據(jù)本發(fā)明的豬肺炎支原體菌苗的豬流感病毒(SIV)H1N1部分的效能。
所有豬在接種時都是對SIV H1N1血清學(xué)陰性的(抗體滴度＜10)。對照組內(nèi)所有的豬在攻擊前保持血清學(xué)陰性，而所有接種豬均產(chǎn)生對SIV H1N1的血清學(xué)轉(zhuǎn)變。這表明接受接種豬中的保護(hù)性免疫反應(yīng)(如攻擊所證實的)是由疫苗引起的，而不是由于任何環(huán)境暴露引起的。
二十五(25)只豬在一周齡接受SIV疫苗(疫苗A)的接種然后在第一次免疫接種后兩周接受SIV-MHP疫苗(疫苗B)的再接種。二十四(24)只豬用作攻擊對照，五只豬用作環(huán)境對照。在第二次接種后三周攻擊豬。從攻擊前兩天開始直至攻擊后(DPC)五天觀測豬的臨床體征并每天記錄直腸溫度。在5DPC無痛苦處死豬并對每只豬的肺損傷評分。將在0DPC，3DPC和5DPC收集的鼻拭子和在尸體剖檢時收集的肺組織進(jìn)行病毒分離。
在攻擊前(0DPC)從取自豬的鼻拭子中未分離出病毒。在攻擊后(3DPC和5DPC)從取自對照組24只豬中的10只的鼻拭子中分離出病毒而與之相比從接種組25只中的1只的鼻拭子中分離出病毒。攻擊后的鼻病毒脫落在接種組和對照組之間有顯著差異(p＝0.0011)。在24只對照豬中的12只以及25只接種豬的1只于尸體剖檢中所獲肺組織中也分離出病毒。在接種組和對照組之間有顯著差異(p＜0.0001)?？傆?，在攻擊后從24只對照豬的19只(79％)和25只接種豬的僅2只中分離出病毒。此外，SIV H1N1攻擊還誘導(dǎo)出發(fā)熱反應(yīng)。而全部發(fā)熱反應(yīng)在接種組和對照組之間無顯著意義(p＝0.07)，與接種組相比對照組在2DPC具有顯著性較高的溫度增加(p＝0.0355)。由攻擊誘導(dǎo)的臨床體征非常輕微且個體體征的發(fā)生率非常低，以至不適宜將這些數(shù)據(jù)用于攻擊評估。接種組的平均肺損傷評分為6.9％而受到攻擊的對照組的平均肺損傷為9.2％。
總之，接種組的鼻腔中病毒脫落的發(fā)生率和頻率和分離自肺組織的病毒的情況顯著性低于對照組。與對照豬相比，接種豬在攻擊后發(fā)生的發(fā)熱反應(yīng)較低且還具有較低的肺損傷。這表明接種豬獲得了對抗SIV H1N1攻擊的保護(hù)。
試驗總結(jié)-SIV H3N2部分該動物實驗被設(shè)計用于證明豬流感疫苗，H1N1和H3N2，滅活病毒-根據(jù)本發(fā)明的豬肺炎支原體菌苗的豬流感病毒(SIV)H3N2部分的效能。
所有豬在第一次接種時(0DPV1)均為或者對SIV H3N2血清學(xué)陰性的(抗體滴度＜10)或者具有低的對SIV H3N2的母體抗體。在攻擊時，那些豬中的的母體抗體降為血清血陰性。對照組內(nèi)所有的豬在攻擊前保持血清學(xué)陰性。這表明接受接種豬中的保護(hù)性免疫反應(yīng)(如攻擊所證實的)是由疫苗引起的，而不是由于任何環(huán)境暴露引起的。
二十二(22)只豬在一周齡接受SIV疫苗(疫苗A)的接種然后在第一次免疫接種后三周接受SIV-MHP疫苗(疫苗B)的再接種。十八(24)只豬用作攻擊對照，五只豬用作環(huán)境對照。從攻擊前三天開始直至攻擊后(DPC)五天觀測豬的臨床體征并每天記錄直腸溫度。在5DPC無痛苦處死豬并對每只豬的肺損傷評分。在0DPC，3DPC和5DPC收集的鼻拭子和在尸體剖檢時收集的肺組織進(jìn)行病毒分離。
SIV H3N2毒性攻擊在對照豬中誘導(dǎo)了發(fā)熱反應(yīng)。對照豬的78％發(fā)生發(fā)熱，接種豬中僅18％發(fā)生發(fā)熱反應(yīng)。發(fā)熱反應(yīng)在接種組和對照組間具有顯著性差異(p＝0.0002)。由攻擊誘導(dǎo)的臨床體征非常輕微且個體體征的發(fā)生率非常低。受攻擊的對照組中六只豬(33％)咳嗽一至兩天，而在接種組中僅兩只豬發(fā)生咳嗽(9.1％)。同樣地，其它臨床體征在接種組和對照組之間沒有顯著差異。對照組中18只豬中的十五(15)只(83％)的肺損傷評分高于5％而在接種組中22只豬中僅五只(23％)的肺損傷評分高于5％。接種組的平均肺損傷評分為4.9％而受到攻擊的對照組的平均肺損傷為23.2％。肺損傷評分在接種組和對照組之間有顯著差異(p＝0.0003)。在攻擊前(0DPC)從取自豬的鼻拭子中未分離出病毒。在3DPC獲取的鼻拭子中，從對照組18只豬中的12只(67％)分離出病毒而與之相比從接種組22只中的5只(23％)中分離出病毒。在5DPC取自對照組18只豬的3只豬的鼻拭子中分離出病毒，而在任何接種豬中均未分離出。還在尸體剖檢(5DPC)中取自對照組18只豬的5只豬的肺組織樣品中分離出病毒，而在任何接種豬中均未分離出。攻擊后病毒從鼻拭子中的分離在接種組和對照組之間有顯著差異(對個別天p＝0.0035，對在3DPC和5DPC的聯(lián)合病毒脫落p＝0.0008)而病毒從肺組織中的分離在接種組和對照組之間也有顯著差異(p＝0.013)。
總之，與對照豬相比，接種豬在攻擊后發(fā)生的發(fā)熱反應(yīng)較低且還具有更低的肺損傷。鼻腔中病毒脫落和從肺組織樣品中回收病毒在在接種組和對照組之間有顯著差異。這表明在一周齡用SIV疫苗接種而在三周后追加SIV-MHP疫苗的豬發(fā)展了對抗SIV H3N2攻擊的保護(hù)性免疫。
權(quán)利要求
1.一種疫苗組合物，所述疫苗組合物用于免疫動物以對抗由豬肺炎支原體和病毒病原體引起的感染，所述疫苗組合物包含免疫量的豬肺炎支原體菌苗；免疫量的至少一種病毒病原體，所述病毒病原體選自豬流感病毒(SIV)，豬生殖呼吸綜合癥病毒(PRRSV)，和豬環(huán)狀病毒(PCV)；佐劑混合物，所述佐劑混合物包含丙烯酸聚合物以及可代謝油和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的混合物；和藥學(xué)上可接受的載體，所述疫苗組合物在單劑給予后引發(fā)針對豬肺炎支原體的保護(hù)性免疫。
2.權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中所述佐劑混合物由丙烯酸聚合物以及可代謝油和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的混合物組成，所述可代謝油包括一種或多種萜烯烴，其中丙烯酸聚合物與可代謝油/聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物混合物的比例為約1∶25～1∶50。
3.權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中所述佐劑混合物為所述疫苗組合物的約1～25％v/v。
4.權(quán)利要求3的疫苗組合物，其中所述丙烯酸聚合物的終濃度為約1％v/v，所述萜烯烴/聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物混合物的終濃度為約5％～10％v/v。
5.權(quán)利要求3的疫苗組合物，其中所述佐劑混合物為所述疫苗組合物的約2％～15％v/v。
6.權(quán)利要求5的疫苗組合物，其中所述佐劑混合物為所述疫苗組合物的約5％～12％v/v。
7.權(quán)利要求1的疫苗組合物，其中所述可代謝油是角鯊?fù)榛蚪酋徬?br> 8.權(quán)利要求6或7的疫苗組合物，其中所述丙烯酸聚合物是卡波姆。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的疫苗組合物，所述疫苗組合物還包含至少一種選自以下的菌苗或純化類毒素副豬嗜血桿菌、多殺巴斯德氏菌、豬鏈球菌、大葉性肺炎放線桿菌、支氣管炎博德特氏菌、豬霍亂沙門氏菌、豬紅斑丹毒絲菌和鉤端螺旋體細(xì)菌。
10.權(quán)利要求1-8中任一項的疫苗組合物，所述疫苗組合物還包含選自以下的一種或多種細(xì)菌性或病毒性抗原SIV、副豬嗜血菌、PRRSV和PCV、SIV和豬紅斑丹毒絲菌、多殺巴斯德氏菌和支氣管炎博德特氏菌。
11.一種保護(hù)動物免患豬肺炎支原體和至少一種病毒抗原所引起的疾病的方法，所述方法包括給予所述動物疫苗組合物的步驟，所述疫苗組合物包含免疫量的豬肺炎支原體菌苗；免疫量的至少一種病毒抗原，所述病毒抗原選自豬流感病毒(SIV)，豬生殖呼吸綜合癥病毒(PRRSV)，和豬環(huán)狀病毒(PCV)，佐劑混合物，所述佐劑混合物包含丙烯酸聚合物以及可代謝油和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的混合物；藥學(xué)上可接受的載體，所述疫苗組合物在單劑給予后引發(fā)針對豬肺炎支原體感染的保護(hù)性免疫。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述細(xì)菌的免疫量是約1×108～3×1011MHDCE/ml。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述細(xì)菌的免疫量是約1×109～3×109MHDCE/ml。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述給予步驟的給藥方式是肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、氣溶膠、口服或鼻內(nèi)給藥。
15.權(quán)利要求11的方法，其中所述佐劑混合物由丙烯酸聚合物以及可代謝油和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的混合物組成，所述可代謝油包括一種或多種萜烯烴，所述佐劑混合物的終濃度是約1～25％v/v。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述佐劑混合物中的丙烯酸聚合物是卡波姆。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述佐劑混合物內(nèi)的可代謝油是選自角鯊烯和角鯊?fù)榈妮葡N。
18.權(quán)利要求11-17中任一項的方法，所述方法還包括同時給予至少一種選自以下的其它菌苗副豬嗜血桿菌、多殺巴斯德氏菌、豬鏈球菌、大葉性肺炎放線桿菌、支氣管炎博德特氏菌、豬霍亂沙門氏菌、豬紅斑丹毒絲菌和鉤端螺旋體細(xì)菌。
19.權(quán)利要求11-17中任一項的保護(hù)動物免患豬肺炎支原體和至少一種病毒病原體和至少一種其它病原體所引起的疾病的方法，所述方法還包括同時給予至少一種選自一種或多種細(xì)菌性或病毒性抗原的其它細(xì)菌性或病毒性抗原，所述細(xì)菌性或病毒性抗原選自以下的一種或多種SIV、副豬嗜血菌、PRRSV和PCV、SIV和豬紅斑丹毒絲菌、多殺巴斯德氏菌和支氣管炎博德特氏菌。
20.一種疫苗組合物，所述疫苗組合物用于免疫動物以對抗由豬肺炎支原體和病毒病原體引起的感染，所述疫苗組合物包含免疫量的豬肺炎支原體菌苗；免疫量的至少一種選自以下的細(xì)菌性或病毒抗原，所述細(xì)菌性或病毒抗原選自副豬嗜血桿菌、多殺巴斯德氏菌、豬鏈球菌、大葉性肺炎放線桿菌、支氣管炎博德特氏菌、豬霍亂沙門氏菌、豬紅斑丹毒絲菌、鉤端螺旋體細(xì)菌、豬流感病毒(SIV)，豬生殖呼吸綜合癥病毒(PRRSV)，和豬環(huán)狀病毒(PCV)，至少一種佐劑；和藥學(xué)上可接受的載體，所述疫苗組合物在單劑給予后引發(fā)針對豬肺炎支原體的保護(hù)性免疫。
21.權(quán)利要求20的疫苗組合物，所述疫苗組合物還包含選自以下一種或多種的細(xì)菌性或病毒性抗原SIV、副豬嗜血桿菌、PRRSV和PCV、SIV和豬紅斑丹毒絲菌、多殺巴斯德氏菌和支氣管炎博德特氏菌。
22.一種疫苗組合物，所述疫苗組合物用于免疫動物以對抗由豬肺炎支原體和病毒病原體引起的感染，所述疫苗組合物包含免疫量的豬肺炎支原體菌苗；免疫量的至少一種選自以下的病毒抗原，所述病毒抗原選自豬流感病毒(SIV)，豬生殖呼吸綜合癥病毒(PRRSV)，和豬環(huán)狀病毒(PCV)；和佐劑系統(tǒng)，所述佐劑系統(tǒng)包含以水包油乳劑形式的丙烯酸聚合物，可代謝油和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物；所述疫苗組合物在單劑給予后引發(fā)針對豬肺炎支原體的保護(hù)性免疫。
全文摘要
本發(fā)明提供改良豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)菌苗疫苗組合物，所述疫苗組合物在單劑給予后有利地提供對感染的免疫。所述組合物包含滅活豬肺炎支原體菌苗和佐劑混合物，該組合物在單劑給予后提供對抗豬肺炎支原體感染的免疫，引發(fā)特異性針對豬肺炎支原體菌苗的免疫反應(yīng)，其中包括細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和局部(分泌型IgA)免疫。在優(yōu)選實施方案中，所述佐劑混合物包含丙烯酸聚合物(最優(yōu)選Carbopol)以及可代謝油(如一種或多種不飽和萜烯烴，優(yōu)選角鯊烯或角鯊?fù)?和聚氧乙烯－聚氧丙烯嵌段共聚物(如Pluronic)的混合物。所述疫苗組合物可以任選地包括防腐劑，優(yōu)選硫柳汞和/或EDTA。在另一實施方案中，本發(fā)明提供改良豬肺炎支原體菌苗疫苗組合物，所述疫苗組合物在單劑給予后有利地提供針對感染的免疫，所述組合物包含滅活豬肺炎支原體菌苗和佐劑或佐劑混合物，該組合物聯(lián)合其它疫苗成分在單劑給予后提供對抗豬肺炎支原體感染的免疫，引發(fā)特異性針對豬肺炎支原體菌苗的免疫反應(yīng)，其中包括細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和局部(分泌型IgA)免疫。
文檔編號A61K39/116GK1652817SQ03811098
公開日2005年8月10日 申請日期2003年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月17日
發(fā)明者H·-J·楚, W·李, Z·徐 申請人:惠氏公司