專利名稱：長期儲存血液和血液組分的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用CO(一氧化碳)處理血液和/或血液組分，來長期儲存和保存血液和血液組分的方法。
背景技術(shù)：
輸血是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中重要的治療輔助手段。它是急診醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的主要治療方法。所以，自二十世紀(jì)初起，人們就采集血液并將其儲存在血庫中。起初以全血形式采集和儲存血液，目前是先將從供血者采集的血液分離成特定的成分然后再儲存，并最終用于治療患者。將這些血液組分儲存在密封的塑料袋中，根據(jù)組分的不同，儲存的溫度范圍為-80℃至+24℃。表1列出了目前血液組分的儲存條件。
表1血液組分的儲存條件

盡管人的血液可進(jìn)行國際間流通，但是保持足夠的供應(yīng)卻取決于許多因素，其中包括供血者是否易得、合適的采血和儲存設(shè)備的供應(yīng)和這種生物材料的有限保存期。因此，醫(yī)學(xué)界對于開發(fā)延長這些血液組分的保存期的新方法非常感興趣。
理論上講，所保存的血液組分的保存期取決于兩個主要因素血液組分的功能在儲存時能夠得到保持的時限和減少病原體的污染。已通過以下方法使這些組分的功能在儲存時得到長期保持加入如磷酸鹽和/或抑制諸如凝血等不期望的生物活性的化合物等物質(zhì)；改變儲存介質(zhì)的pH平衡；和保持特定組分的適當(dāng)溫度(如上表1所示)。對于某些類型的血液組分，降低溫度有利于儲存，而且也有利于降低污染性微生物的生長速率。然而，對于另一些組分，例如血小板，降低溫度有可能導(dǎo)致生物功能喪失，所以，不能利用降低溫度來減少病原體的污染。
一直認(rèn)為血液被病原體污染是引起輸血并發(fā)癥的重要因素。即使選擇健康的供血者，并且對所得到的捐獻(xiàn)的血液中是否存在各種類型的病原體(包括諸如肝炎病毒和HIV(人體免疫缺陷病毒)在內(nèi)的各種病毒)進(jìn)行篩選，長期保存的血液組分還是易于受到病原體的污染。
為了有助于減少這樣的污染，在無菌條件下采集供血者的血液。利用無菌密閉系統(tǒng)來采集和處理血液組分，以進(jìn)一步減少病原體的污染。然而，血液組分中存在的細(xì)菌目前仍是與輸血相關(guān)的致病和致死的最常見微生物因素。由靜脈不慎輸入被病原體污染的血小板所引起的與輸血相關(guān)的污染似乎比由紅細(xì)胞或血漿污染引起的并發(fā)癥常見得多。這可能是因?yàn)椋?dāng)被污染的血液制品含有足夠大量的細(xì)菌(≥106)，并產(chǎn)生相當(dāng)高水平的細(xì)菌內(nèi)毒素時，就發(fā)生顯著的致病率和致死率。為了不使血小板冒喪失生物功能的危險，不能將血小板儲存在20℃以下，這樣血小板被污染的危險性成比例地大大高于血紅細(xì)胞被污染的危險性。實(shí)際上，據(jù)報道由被感染的血小板導(dǎo)致的并發(fā)癥的比率比由血紅細(xì)胞導(dǎo)致的高，其比例為2∶1。
血小板是來源于骨髓巨核細(xì)胞的除核細(xì)胞。它們在體內(nèi)平衡、血液凝固和血栓形成中發(fā)揮重要的作用。據(jù)估計血小板在體內(nèi)血液循環(huán)中的壽命為約10天至12天。但是，凋亡過程的形態(tài)學(xué)信號顯示，在離體儲存5～6天后，血小板就老化了，所述凋亡過程的形態(tài)學(xué)信號有例如血小板的形態(tài)從盤狀變?yōu)榍驙睿⑶页霈F(xiàn)膜泡化現(xiàn)象。另一個可測量的血小板生存力參數(shù)是周圍環(huán)境緩沖液的pH；當(dāng)pH降至低于pH6.0時，血小板的生存力就喪失了。測量血小板生存力的另一個參數(shù)是酶的泄漏。特別是，LDH(乳酸脫氫酶)的泄漏被用作血小板生存力喪失的參數(shù)。
各種研究都已證實(shí)，在所有的各種血液組分和制品中，血小板的病原體污染引起的致死率是最高的。對于同種異體輸血來說，單采血小板輸血的致死率比血小板濃縮輸血后帶來的不利事件的危險性高7倍；比紅細(xì)胞輸血后帶來的危險性高3倍多。在血小板匯集輸血(來自多個供血者)后，所述危險性升高了12倍，在單采血小板濃縮輸血后，所述危險性升高了5.5倍(所有的統(tǒng)計數(shù)據(jù)來自Perez等人，“與輸血相關(guān)的細(xì)菌污染的決定因素；法國BACTHEM病例對照研究的結(jié)果(Determinantsof transfusion associated bacterial contamination；Results of the FrenchBACTHEM Case Control Study)”；輸血(Transfusion)，2001，卷41，頁477～482；還參見K.Sazama，“輸注用血中的細(xì)菌綜述(Bacteria in Bloodfor TransfusionA Review)”，Arch PatholLab Med，卷118，1994，頁350～365)。這些關(guān)于血小板污染的危險性的研究導(dǎo)致在1986年FDA(美國食品和藥品管理局)將血小板的保存期從7天縮短為5天。然而，這么短的保存期顯著減少了血小板的可獲得來源。
因此，目前醫(yī)學(xué)界考慮兩種選擇為血庫提供更快速的細(xì)菌篩選方法；和開發(fā)控制細(xì)菌和/或其他病原體生長的方法。前一種方法具有許多缺點(diǎn)，其中包括細(xì)菌檢測方法的速度越快，靈敏度越低且費(fèi)用增高。已開發(fā)的后面這種方法中通常包括破壞復(fù)制遺傳物質(zhì)的能力，據(jù)信這種方法對于諸如紅細(xì)胞和血小板等除核細(xì)胞是安全的。例如，已考慮使用需要或不需要光激活的交聯(lián)化學(xué)試劑。這樣的化學(xué)試劑的例子包括補(bǔ)骨脂素8-MOP、AMT和最近使用的S-59“滅活素(inactine)”。由于認(rèn)為這些化學(xué)試劑對人體有害，所以在將血小板輸入患者前，必須進(jìn)行后處理以除去這些試劑。目前除去這些試劑的方法包括過濾或洗滌過程以除去未以某種方式與細(xì)胞表面或蛋白質(zhì)結(jié)合的試劑。
由于該清除過程較費(fèi)時，而且可能破壞血細(xì)胞，因此，開始考慮其他危害較小的試劑。這樣的試劑的一個例子是核黃素，當(dāng)光激活后，其形成光色素。然而，已顯示這種試劑對于使細(xì)菌失活的效果是不穩(wěn)定的，而且在靈長類動物中進(jìn)行的自體輸血中，甚至可能降低血小板的存活率，而這對于其在促進(jìn)延長血小板儲存時間的應(yīng)用方面卻是不利的(“與更安全的血液制品的關(guān)系清除病原體技術(shù)的概述(Connect with Safer BloodProductsAbstracts on Pathogen Eradication Technology)”，Gambro BCTInc.，美國，2001)。
到目前為止，上述保存方法均未得到認(rèn)可。每種方法都有很多缺點(diǎn)，其中包括的事實(shí)如下它們通常只適合一種血液組分，而且使用的清除方法可能損壞血液組分。另外，保存方法本身可能損壞血液組分。因此，目前沒有保存全血和/或血液組分的合適方法，所謂合適的方法應(yīng)當(dāng)不包括將潛在有害的化學(xué)物質(zhì)引入人體內(nèi)，也不包括損壞全血和/或血液組分本身。
一氧化碳(CO)是血紅素蛋白在人體內(nèi)降解后的天然產(chǎn)物，其在化學(xué)上為惰性。已知，由于一氧化碳具有以高親和性取代血紅蛋白的結(jié)合位點(diǎn)上的氧的能力，所以其為劇毒性氣體。然而，近10年來，越來越多的科學(xué)證據(jù)已顯示，就是同樣的這種分子還起到諸如神經(jīng)系統(tǒng)的傳遞等基礎(chǔ)生理作用。因此，一氧化碳的位置和含量似乎決定其是對身體有利還是對身體有害。

發(fā)明內(nèi)容
以上背景技術(shù)既沒有教導(dǎo)也沒有暗示以下的一種保存血小板和其他血液組分的方法，這種方法容易可逆，并且對于血小板的任何部分都不引起永久性損壞或改變。
背景技術(shù)：
既沒有教導(dǎo)也沒有暗示這樣一種方法，即，利用相對無害的試劑處理血液組分和/或全血。
本發(fā)明通過提供一種處理血小板和選擇性地處理其他血液組分和/或全血的方法，克服了背景技術(shù)中所述的缺陷，所述方法相對無毒，并且是可逆的。本發(fā)明的方法包括用一氧化碳處理血液組分和/或全血，其中在暴露于空氣中后，一氧化碳的殘余量較少以至于其毒性低至足以被身體耐受(一氧化碳對于人體的安全閾或TLV(閾極限值)是每天吸入8小時的含有20ppm這種氣體的空氣，這相當(dāng)于每分鐘吸入含有104ppm這種氣體的空氣)。一氧化碳在被吸入時比存在于體內(nèi)其他器官中時毒性更大。本發(fā)明的方法能夠?qū)⑾鄬ι倭康囊谎趸家肴梭w內(nèi)，而且選擇性地，該方法更優(yōu)選包括在將所述處理后的全血和/或血液組分輸入受血者身體之前，減少一氧化碳的含量或甚至清除一氧化碳的步驟。
本發(fā)明還提供通過利用一氧化碳進(jìn)行處理，在全血和/或血液組分中抑制細(xì)菌生長的方法，因此這種方法可以用于延長全血和/或血液組分的儲存期。如下詳述，本發(fā)明優(yōu)選用于保存血小板，血小板特別容易受細(xì)菌和其他微生物的感染，所以本發(fā)明的方法特別適用于保存血小板。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方式，首先將供血者提供的全血分離成各種組分，然后，更優(yōu)選用一氧化碳僅對血小板成分進(jìn)行處理?；蛘撸紫扔靡谎趸继幚硭璜I(xiàn)的全血，然后更優(yōu)選再次用一氧化碳處理血小板成分。作為選擇或另外地，對于上述兩個實(shí)施方式，還可選擇性地用一氧化碳處理血漿成分。用一氧化碳處理后的全血還可選擇性地用于給受血者身體輸血。
本發(fā)明的處理方法更優(yōu)選包括從裝有血小板成分的容器中除去空氣，然后引入含有一氧化碳作為主要組分的經(jīng)改性的空氣。選擇性地，經(jīng)改性的空氣中的氧最高達(dá)10％。然后更優(yōu)選將所述容器儲存在適合特定血液組分的溫度下，所述血液組分優(yōu)選可以是如上所述的血小板成分，但是或者可選擇性地是全血本身。這樣的溫度包括，但不限于，全血細(xì)胞和血小板為室溫(20～24℃)；包裝后的血紅細(xì)胞為冷藏溫度(4℃)；血漿為20℃；骨髓(干細(xì)胞)為-180℃。
本發(fā)明具有許多優(yōu)點(diǎn)，其中包括，但不限于，抑制諸如寄生物、霉菌和細(xì)菌等病原體的生長；和延長各種成分以及全血的保存期。
已顯示由于CO能夠通過與鳥苷酸環(huán)化酶結(jié)合而抑制血小板的凝集，所以CO還在血小板激活中發(fā)揮了重要作用(Brune Band Ullrich，V.；Molec Pharm，卷32，497～504頁，1987)。因此，在本發(fā)明中使用CO的另一個好處是CO通過防止血小板由于離體凝集而喪失生存力，從而給保存帶來可能的積極作用。
盡管只提到了對血液組分的處理，但是這只是用于解釋，而決不是旨在限制本發(fā)明，因?yàn)楸景l(fā)明還適于處理全血。
在下文中，術(shù)語“血液制品”指全血和血液組分如血小板中的至少一種。


參考附圖，從下列對本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式的具體描述，將更好地理解本發(fā)明的前述和其他目的、方面和優(yōu)點(diǎn)，其中圖1顯示在全血中接種的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(YersiniaEnterocolitica)的生長，所述全血保存在一氧化碳?xì)夥?CO)和正?？諝?空氣)中；圖2～6顯示接種的特定細(xì)菌在PRP(多血小板血漿)形式的懸浮于血漿的血小板中的生長，其生長氣氛為正?？諝?空氣)、氮?dú)猸h(huán)境(N2)或一氧化碳(CO)；各圖中顯示了以下細(xì)菌的生長圖2蠟狀芽孢桿菌(Bacilus Cereus)；圖3大腸埃希氏菌(E.Coli)；圖4假單胞菌(Pseudomonas Aeraginosa)；圖5伯克霍爾德氏菌(Bulkholderia Cepasea)；圖6葡萄球菌(Staphilococcus Aereus)圖7比較了在用空氣或CO處理后，PRP形式的懸浮于血漿的血小板中和PC(濃縮的血小板)形式的血小板中的沙門氏菌(SalmonellaThyphimurium)的生長；圖8顯示在相似條件下，無細(xì)胞的血漿中的沙門氏菌的生長；圖9比較了在PC形式的血小板的儲存期間pH的變化，儲存條件為存在或不存在額外添加的碳酸氫鹽緩沖液的情況下，在空氣和一氧化碳?xì)夥罩?；圖10比較了LDH從以PC形式儲存的血小板中的泄漏，儲存條件為存在或不存在額外添加的碳酸氫鹽緩沖液的情況下，在空氣和一氧化碳?xì)夥罩小?br> 具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供一種處理血小板和選擇性地處理其他血液組分的方法，該方法相對無毒，并且是可逆的。如上所述，本發(fā)明的方法包括用一氧化碳進(jìn)行處理，該一氧化碳的用量較少以至于其毒性低至足以被身體耐受。
本發(fā)明還提供通過利用一氧化碳進(jìn)行處理，抑制細(xì)菌在血液組分中生長的方法，因此這種方法可以用于延長這些血液組分的儲存期。如下詳述，本發(fā)明優(yōu)選用于保存血小板，血小板特別容易受細(xì)菌和其他微生物的感染，所以本發(fā)明的方法特別適用于血小板。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方式，首先將供血者提供的全血分離成各種組分，然后，更優(yōu)選用一氧化碳僅對血小板成分進(jìn)行處理。
根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方式，首先將所捐獻(xiàn)的全血用一氧化碳處理，然后選擇性分離血液組分。或者，在除去一氧化碳后，可以將處理后的全血施用給受血者。還可以選擇性地在儲存前，再次用一氧化碳處理血液組分。
不管用一氧化碳進(jìn)行處理的方法如何，選擇性地和更優(yōu)選地，可將處理后的全血和/或血液組分暴露于光下，例如波長為400nm或更大波長的光，最優(yōu)選在氧存在下。這樣的照射有利于一氧化碳與氧的交換(參見例如Brune Band Ullrich，V.；Molec Pharm，卷32，497～504頁，1987)。
本發(fā)明的處理方法更優(yōu)選包括從裝有血小板成分的容器中除去空氣，然后將含有一氧化碳作為主要組分的經(jīng)改性的氣氛引入，因而優(yōu)選在所述經(jīng)改性的氣氛中存在的氧低于約1％。選擇性地，經(jīng)改性的氣氛中的氧最高達(dá)約10％。然后更優(yōu)選將所述容器儲存在適合特定血液成分的溫度下，如上所述，所述血液成分優(yōu)選可以是血小板成分，但是或者可選擇性地是全血本身。這樣的溫度的例子包括，但不限于，全血細(xì)胞和血小板為室溫(20～24℃)；包裝后的紅細(xì)胞為冷藏溫度(4℃)；血漿為20℃；骨髓(干細(xì)胞)為-180℃。
為了用處理后的血液處理受血者，在施用給受血者前，最好選擇性地進(jìn)行用氧交換一氧化碳的氣體交換，例如通過打開裝有血液或血液組分的袋子或其他容器，以與周圍的空氣進(jìn)行所述的氣體交換?；蛘?，可選擇性地始終保持所述容器密封，但是引入含有氧但不含一氧化碳的空氣。
另一種選擇性但又優(yōu)選的方法包括對血液和/或血液組分進(jìn)行照射，更優(yōu)選用波長為400nm或更大波長的光在含有純氧或高濃度氧的氣氛中或在空氣中照射。更優(yōu)選在振蕩血液和/或血液組分的情況下，進(jìn)行所述處理，最優(yōu)選在氧存在下，振蕩約20分鐘；在空氣存在下，振蕩約35分鐘。在將輸血所需要的任何紅細(xì)胞施用給受血者前，特別優(yōu)選對所述紅細(xì)胞進(jìn)行這樣的處理，因?yàn)槿绻蝗坏脑?，它們的攜帶氧的能力可能會下降。
材料和方法A.處理后的血液組分的制備在無菌條件下，從人供血者獲得新采集的全血，并將其儲存在體積至少為所述血液體積1.5倍的不透氣袋中。然后，在利用水泵施加的20mmHg低真空下，用含有無菌CO的氣氛置換所述袋子中的氣體環(huán)境(或氣氛)。CO通過0.25微米的無菌過濾器迅速涌入。將袋子密封并振蕩15分鐘以達(dá)到平衡。重復(fù)進(jìn)行所述過程3次，借此用CO置換袋子和血液中的氣氛。根據(jù)血紅蛋白在可見光區(qū)域的光吸收譜的典型變化，即從577nm(氧-血紅蛋白的典型光譜)偏移到569nm(一氧化碳-血紅蛋白的典型光譜)，可以確定一氧化碳在處理后的血液樣品中的血紅蛋白內(nèi)達(dá)到飽和。
在室溫中，將處理后的血液放置在振蕩器上，直至檢測(如下詳述)，或者選擇性地在振蕩后利用血庫中使用的常規(guī)方法將處理后的血液分離成血液組分(紅細(xì)胞、血漿、血小板)。為了進(jìn)一步進(jìn)行保存，將所述成分分別處理。
B.保存用的PRP形式或PC形式的血小板的制備在無菌環(huán)境中，通過使用血庫條件連續(xù)離心由經(jīng)CO預(yù)處理或未處理的血液中同樣制備PC成分。然后一邊振蕩一邊加入來自750mM的原液的碳酸氫鹽(PC體積的4％)，使碳酸氫鹽的終濃度達(dá)到30mM。接著，按照與處理全血類似的方法，用CO處理PC。或者，不施用真空，在振蕩容器的同時，使無菌CO沖洗容器10分鐘，然后將容器密封。將容器保持在20～24℃的室溫下。用類似的方法處理PRP形式的血小板。
在空氣存在下將作為對照的血液樣品包裝在同樣的容器中，但是不進(jìn)行使空氣轉(zhuǎn)移的任何額外處理。在一些實(shí)驗(yàn)中，使用諸如氮?dú)獾亩栊詺怏w作為對照，采用與CO同樣的方式置換空氣。
C.細(xì)菌的生長通過用革蘭氏陰性細(xì)菌病原體和革蘭氏陽性細(xì)菌病原體的各種菌株來接種含有血小板的成分，已證實(shí)本發(fā)明的方法有效地抑制了細(xì)菌的生長。以下將參考附圖更詳細(xì)地描述細(xì)菌的種類和接種量。
用病原性細(xì)菌接種全血或其成分。然后在不同氣氛(氣體環(huán)境)下使細(xì)菌在室溫下生長。血液成分為多血小板血漿(PRP)；濃縮血小板(PC)，該濃縮血小板與目前儲存在血庫中的濃縮血小板相同，但除去了約3/4的血漿；和無細(xì)胞的血漿。
圖1顯示全血中的病原體耶爾森氏菌的生長，該耶爾森氏菌的生長需要鐵，因此，在含有血紅蛋白的培養(yǎng)基中迅速生長。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌株獲自ATCC(美國典型微生物保藏中心)，在特定的豐富培養(yǎng)基中生長。將約20個細(xì)菌/毫升接種到儲存在室溫下的新鮮血液樣品中。所述血液儲存于CO氣氛中，并且將儲存于空氣中的同樣血液樣品作為對照。在圖1中，顯示了一個典型例子。在空氣中生長迅速，但是當(dāng)把同樣的血液放在氮?dú)庵袝r，生長完全被抑制。為了釋放包裝的血液中的CO，將密封的包裝打開并放置在空氣中幾分鐘。為了進(jìn)一步釋放與血紅素結(jié)合的CO，通過用波長為400nm或更大波長的光照射，進(jìn)行光解作用。
如圖2～6所示，在正規(guī)血庫所用的血庫振蕩平板上，在室溫(20～24℃)下振蕩以PRP形式儲存的血小板，其振蕩氣氛為可換氣的空氣(空氣)；或氮?dú)饷芊鈿夥?N2)或一氧化碳密封氣氛(CO)。所有的氣體都經(jīng)過0.25微米的無菌過濾器過濾。所有的細(xì)菌都是已鑒定的ATCC菌株。接種前將細(xì)菌的接種量調(diào)節(jié)為10～100CFU(菌落形成單位)/ml，其中通過將原種細(xì)菌鋪在合適的瓊脂平板上以使細(xì)菌生長并計數(shù)，來測定細(xì)菌的最終的精確的數(shù)目(在每種情況下，給出最終的起始計數(shù))。
圖2顯示蠟狀芽孢桿菌在PRP中的生長，接種量為18CFU/ml。圖3顯示大腸埃希氏菌(株系O157)在PRP中的生長，接種量為25CFU/ml。圖4顯示假單胞菌在PRP中的生長，接種量為16CFU/ml。圖5顯示伯克霍爾德氏菌在PRP中的生長，接種量為12CFU/ml。圖6顯示葡萄球菌在PRP中的生長，接種量為18CFU/ml。
圖7比較了沙門氏菌在PRP或PC成分中的生長，最初的接種量約為20CFU/ml(在時間為0時，實(shí)際計數(shù)分別為16CFU/ml或32CFU/ml)。在這兩種不同的血小板制備物中的生長是相似的。然而，應(yīng)注意，在有利于細(xì)菌快速生長的條件(空氣)下，形成了血小板的凝塊，這樣就不能采集到勻質(zhì)的樣品來對細(xì)菌的水平進(jìn)行計數(shù)。
圖8比較了在空氣、N2和CO條件下，沙門氏菌在無細(xì)胞的血漿中的生長。
D.血小板生存力檢測檢測了儲存中的PC形式的血小板的生存力，這是因?yàn)?，為了能夠分別儲存和利用PRP中的多余的血漿，目前以PC形式儲存血小板。然而，因?yàn)镻C環(huán)境既缺少紅細(xì)胞也缺少血漿，所以這種環(huán)境中的血小板比PRP形式的血小板更容易喪失生存力。不想被單一假說所束縛，PC形式的血小板可能經(jīng)歷pH的改變，因此，可能無法保持該環(huán)境中必需的pH中性。根據(jù)以下兩種參數(shù)，研究了以PC形式儲存的血小板的生存力該環(huán)境的pH的下降和細(xì)胞本身的膜完整性的喪失，所述膜完整性的喪失導(dǎo)致細(xì)胞的蛋白質(zhì)泄漏。
對于pH值來說，已證實(shí)在偏離中性的pH條件下，特別是在低pH值(pH值低于約6.0)的條件下，血小板發(fā)生變質(zhì)。血小板中的厭氧代謝易產(chǎn)生高水平的乳酸，因此有可能影響血小板的生存力。因此，預(yù)計在低氧或無氧條件下儲存血小板時有可能降低血小板的生存力。由此，比較了用常規(guī)方法(使氣體自由交換)保存的PC和PRP成分的pH值和本發(fā)明利用一氧化碳處理后獲得的pH值。
圖9比較了在空氣、CO和COb條件下，濃縮血小板(PC)在儲存期的pH變化，其中，儲存在CO條件下的部分包裝中加入了等分的無菌碳酸氫鹽溶液以使終濃度為30mM(COb)。
對于LDH的泄漏，還可根據(jù)膜完整性來評價細(xì)胞生存力。LDH(乳酸脫氫酶)是穩(wěn)定的酶，其在細(xì)胞內(nèi)通常具有活性；當(dāng)所述細(xì)胞喪失膜完整性，LDH泄漏到細(xì)胞外，這樣較高水平的LDH活度與血小板生存力的降低相互關(guān)聯(lián)。從含有血小板的成分中采集不含血小板的溶液樣品，并測定該不含血小板的溶液樣品中出現(xiàn)的LDH的活度以評價所述含有血小板的成分的生存力。
然后根據(jù)含有血小板的溶液的pH值，并根據(jù)LDH活度，檢測血小板的生存力，之所以檢測LDH是因?yàn)槿缜八觯琇DH的泄漏是血小板生存力降低的一個指標(biāo)。
圖10顯示LDH酶從無菌血小板的泄漏，所述無菌血小板在空氣(與室內(nèi)氣體相互交換)、CO和COb條件下，以PC形式儲存。儲存在CO條件下的部分包裝中加入了等分的無菌碳酸氫鹽溶液以使終濃度為30mM(COb)(與圖9的縮寫一樣)。
結(jié)果和討論如圖1所示，一氧化碳完全抑制了病原體在全血中的生長。在多血小板血漿中，一氧化碳顯著抑制(圖2～4、6、7)或甚至消除了(圖1和5)了細(xì)菌的生長。與此相反，與正?？諝鈼l件(可自由換氣)相比，氮?dú)鈱τ诩?xì)菌生長幾乎沒有影響。
圖7顯示與正?？諝鈼l件(空氣)相比，以PRP或PC形式儲存的血小板中的細(xì)菌的生長得到了抑制。不僅與空氣相比，CO氣氛抑制兼性細(xì)菌的生長，而且與氮?dú)庀啾龋珻O環(huán)境同樣抑制兼性細(xì)菌的生長(圖2～7)。這顯示CO特異性地抑制細(xì)菌的生長，而不是因?yàn)檫M(jìn)行厭氧代謝的兼性細(xì)菌具有較慢的能量產(chǎn)生速率。
當(dāng)僅使用血漿作為病原體的營養(yǎng)來源時，仍抑制病原體的生長。因此，如果在非冷藏條件下保存血漿，還可以選擇性地通過處理保持無菌。為了檢測儲存的血小板的生存力，跟蹤所保存的細(xì)胞的pH以及LDH(乳酸脫氫酶)的泄漏，之所以檢測LDH是因?yàn)長DH從血小板的泄漏是已知的喪失生存力的參數(shù)。以PRP形式儲存的血小板中的pH保持得很好，但是在氮?dú)?未顯示)或CO條件下儲存的血小板的pH降低至遠(yuǎn)離中性(圖9)。認(rèn)為pH的降低是厭氧代謝的結(jié)果。血液中的30mM的天然緩沖液，即用堿性緩沖物質(zhì)例如碳酸氫鹽處理，就足以增強(qiáng)血小板保持pH的能力。(圖9)。
對于上清液中的LDH活度，再次以PRP形式儲存血小板時，LDH的泄漏與空氣條件下(數(shù)據(jù)未顯示)相比，相等或甚至略低。在CO條件下儲存的PC中的血小板的生存力比儲存在空氣條件的PC中的血小板的生存力喪失得要快得多(圖10)。因?yàn)樵诘獨(dú)鈼l件下(未顯示)，血小板的生存力在儲存期間同樣發(fā)生了降低，盡管不想受單一假說的限制，但是PC未能保持中性pH很可能是其原因。如LDH的泄漏所示，血小板保持了生存力。圖10顯示上清液中的LDH活度，即測定的泄漏，是最低的，因此，認(rèn)為在一氧化碳環(huán)境下儲存在含有碳酸氫鹽的溶液中的血小板的生存力最高。在正?？諝鈼l件和僅使用一氧化碳的條件下儲存的血小板顯示相似的高水平LDH活性，因此，顯示這種儲存條件導(dǎo)致血小板的生存力喪失。
結(jié)論基于上述結(jié)果，本發(fā)明的用一氧化碳處理血小板的方法能夠明顯降低或消除含有血小板的成分中的細(xì)菌的生長。不論在PRP還是PC類型的血小板成分中都得到了相似的結(jié)果。然而，這種結(jié)果不是由于厭氧條件，原因在于氮?dú)獠荒墚a(chǎn)生顯著抑制細(xì)菌生長的作用。
除了用一氧化碳處理外，在還含有碳酸氫鈉(一種堿性緩沖物質(zhì))的溶液中，更顯著保持血小板的生存力，只要額外增加的碳酸氫鈉使緩沖能力增強(qiáng)而使pH保持不變。本發(fā)明將一氧化碳首次用于抑制細(xì)菌在含有血小板的成分中的生長，而且，本發(fā)明首次證明這樣的處理還能夠保持血小板的生存力。
因此，本發(fā)明的方法的優(yōu)選方面包括在用一氧化碳處理之前，用堿性緩沖物質(zhì)例如碳酸氫鈉或類似物質(zhì)進(jìn)行處理。
本發(fā)明的方法還與以前試圖使用一氧化碳來延長其他生物物質(zhì)的儲存期顯著不同，原因在于將一氧化碳首次用于抑制細(xì)菌在含有血小板的成分中的生長，而且，本發(fā)明首次證明這樣的處理還能夠保持血小板的生存力。
例如，美國專利號6,042,859描述了一種通過將生肉暴露于純一氧化碳環(huán)境中，利用一氧化碳保存肉的方法。然而，該專利沒有教導(dǎo)也沒有暗示將一氧化碳用于處理任何種類的血液制品。
美國專利號5,476,764和6,270,829描述了一種使用一氧化碳延長冷藏的血紅細(xì)胞的保存期的方法。然而，這些公開文獻(xiàn)只是教導(dǎo)使用一氧化碳來結(jié)合血紅蛋白，以防止紅細(xì)胞老化。沒有提供關(guān)于抑制細(xì)菌生長的教導(dǎo)。此外，也沒有提供關(guān)于一氧化碳在任何其他類型的血液制品中的用途的教導(dǎo)，這是不足為奇的，因?yàn)橹挥醒t細(xì)胞含有血紅蛋白。所述公開的方法需要進(jìn)行該處理的反向處理之后才能將血紅細(xì)胞輸入患者，而這種反向處理并不是本發(fā)明的方法的必需部分。此外，所述公開文獻(xiàn)沒有教導(dǎo)或暗示通過使用一氧化碳抑制細(xì)菌的生長，來延長血小板的儲存期，也沒有教導(dǎo)或暗示加入pH緩沖物質(zhì)來進(jìn)一步延長儲存在一氧化碳?xì)夥罩械难“宓纳媪Α?br> 權(quán)利要求
1.一種離體處理全血的方法，該方法包括用一氧化碳處理該全血的步驟。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的全血為從供血者新采集的全血。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述的處理步驟包括將全血放置在含有至少90％一氧化碳的氣氛中的步驟。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的氣氛含有至少約99％的一氧化碳。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其中所述的氣氛中還含有氧。
6.如權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述的處理后的全血在室溫下保存。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中將所述的處理后的全血儲存長達(dá)約10天。
8.如權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述的處理后的全血分離成多個血液成分。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中用一氧化碳進(jìn)一步處理至少一種所述的血液成分。
10.如權(quán)利要求1～9任一項(xiàng)所述的方法，該方法還包括以下步驟促進(jìn)所述處理后的全血中的一氧化碳與氧進(jìn)行交換。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的促進(jìn)步驟還包括以下步驟在氧存在下，用波長至少為400nm的光照射所述的處理后的全血。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述氧的存在量至少為全部氣體的10％。
13.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的促進(jìn)步驟通過將所述的處理后的全血暴露于空氣中來完成。
14.一種處理含有血小板的血液成分的方法，該方法包括以下步驟用一氧化碳處理所述的含有血小板的血液成分。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的處理步驟包括用純一氧化碳置換所有的氣體。
16.如權(quán)利要求14或15所述的方法，其中所述的處理步驟還包括以下步驟用一氧化碳處理全血；分離所述全血以得到至少一種含有血小板的成分；和用一氧化碳處理所述至少一種含有血小板的成分。
17.如權(quán)利要求14～16任一項(xiàng)所述的方法，其中所述含有血小板的成分包括多血小板血漿成分即PRP和濃縮血小板成分即PC中的至少一種。
18.如權(quán)利要求14～17任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的處理步驟還包括以下步驟將pH緩沖物質(zhì)加入所述含有血小板的成分中。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的pH緩沖物質(zhì)為堿性pH緩沖物質(zhì)。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的堿性緩沖物質(zhì)包括碳酸氫鈉。
21.如權(quán)利要求14～20任一項(xiàng)所述的方法，該方法還包括以下步驟促進(jìn)所述處理后的含有血小板的成分中的一氧化碳與氧進(jìn)行交換。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的促進(jìn)步驟還包括以下步驟在氧存在下，用波長至少為400nm的光照射所述的處理后的含有血小板的成分。
23.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述氧的存在量至少為全部氣體的10％。
24.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的促進(jìn)步驟通過將所述的處理后的含有血小板的成分暴露于空氣中來完成。
25.一種處理血液的血漿成分的方法，該方法包括用一氧化碳處理血液的血漿成分的步驟。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的血漿成分基本上不含有細(xì)胞。
27.一種抑制細(xì)菌在含有血小板的血液成分中生長的方法，該方法包括用一氧化碳處理所述含有血小板的血液成分的步驟。
28.一種增強(qiáng)含有血小板的血液成分的儲存穩(wěn)定性的方法，該方法包括以下步驟用一氧化碳處理所述含有血小板的血液成分；并且將pH緩沖物質(zhì)加入所述含有血小板的血液成分中。
29.一種處理全血和含有血小板的血液成分中的至少一種血液制品的方法，該方法包括以下步驟用一氧化碳處理全血和含有血小板的血液成分中的至少一種血液制品以形成處理后的血液制品；和促進(jìn)所述處理后的血液制品中的一氧化碳與氧進(jìn)行交換。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的促進(jìn)步驟還包括以下步驟在氧存在下，用波長至少為400nm的光照射所述的處理后的血液制品。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述氧的存在量至少為全部氣體的10％。
32.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的促進(jìn)步驟通過將所述的處理后的血液制品暴露于空氣中來完成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種處理血小板，和選擇性地處理其他血液組分的方法，該方法相對無毒，并且是可逆的。本發(fā)明的方法包括用一氧化碳進(jìn)行處理，少量的一氧化碳是無毒的，足以能夠被身體耐受。
文檔編號A61J3/00GK1652804SQ03810783
公開日2005年8月10日 申請日期2003年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月13日
發(fā)明者紐瑞斯·沙克拉 申請人:薩伏汀有限公司