專利名稱：新型鉻(III)－α氨基酸絡(luò)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及1∶3鉻(III)-α氨基酸絡(luò)合物及其作為動物營養(yǎng)補(bǔ)充品的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Schwarz和Mertz在1959年(Schwarz，K.和Mertz，W.，Chromium(III)andthe glucose tolerance factor，Archs Biochem.Biophys.85292(1959))第一次確認(rèn)了營養(yǎng)品中鉻的基本作用。這些研究人員發(fā)現(xiàn)，喂飼了產(chǎn)朊假絲酵母的大鼠發(fā)展為葡萄糖耐受不良。然而，喂飼了啤酒酵母的大鼠不會發(fā)展此病況。葡萄糖耐受因子(GTF)是存在于啤酒酵母中但不存在于產(chǎn)朊假絲酵母的一種物質(zhì)。后來證實(shí)了GTF的活性成分是鉻(III)。根據(jù)這些早期研究結(jié)果，人們開始進(jìn)行許多研究途徑以更好地理解鉻的營養(yǎng)作用。雖然現(xiàn)在關(guān)于人和動物中鉻的作用已知之甚多，但仍有許多方面尚未弄清楚，并且鉻在人疾病中的許多作用還存在爭議，也未被很好地記載。最近發(fā)表了幾篇綜述，總結(jié)了現(xiàn)時關(guān)于營養(yǎng)品中鉻的作用的認(rèn)識(Henry C.Lukaski，Chromium as aSupplement，Ann Rev Nutr.19279(1999)；Richard A.Anderson，Chromium，Glucose Intolerance and Diabetes，Journal of the American College of Nutrition，17，548(1998)；John B.Vincent，The Biochemistry of Chromium，J.Nutr.130715(2000)；John B.Vincent，Quest for the Molecular Mechanism of ChromiumAction and its Relationship to Diabetes，Nutrition Reviews，5867(2000))。
最初于1959年提出的葡萄糖耐受因子的確切性質(zhì)到現(xiàn)在仍然不清楚。從酸水解啤酒酵母和豬腎中部分純化了能增強(qiáng)葡萄糖代謝的含鉻物質(zhì)。該酵母提取的物質(zhì)受到普遍重視，通稱為酵母GTF。據(jù)報，酵母GTF中的鉻比源自無機(jī)物的鉻更易被吸收。此外，有人提出，酵母GTF由鉻(III)離子、煙酸、甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸組成(W.Mertz，M.M.Polansky等，Preparation ofchromium-containing material of glucose tolerance factor activity from Brewer’syeast extracts and by synthesis，E.W.Toepfer，J Agric Food Chem，25162(1977))。該酵母GTF組合物一直存在爭議，而且其他實(shí)驗(yàn)室不能重現(xiàn)它的分離。另外，還有人提出，分離的酵母GTF可能是特殊鉻結(jié)合蛋白酸水解而產(chǎn)生的一種產(chǎn)物(K.H.Sumrall和J.B.Vincent，Is glucose tolerance factor anartifact produced by acid hydrolysis of low-molecular weight，chromium bindingsubstance？Polyhedron，164171(1997))。
最近，關(guān)于鉻在調(diào)節(jié)碳水化合物和脂質(zhì)代謝的作用基礎(chǔ)取得了一些進(jìn)展。已經(jīng)分離出一種稱為低分子量鉻結(jié)合物質(zhì)(LMWCr)的肽，并且認(rèn)為它在調(diào)節(jié)胰島素對其受體的作用起關(guān)鍵作用。這種肽似乎廣泛分布于哺乳動物組織，已經(jīng)從許多來源中分離出來。LMWCr由甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸和天冬氨酸組成。谷氨酸和天冬氨酸占氨基酸殘基一半以上。這種肽的分子量為1500道爾頓，結(jié)合四種鉻離子。它在組織中主要以無金屬形式存在。這種蛋白的氨基酸序列以及其鉻絡(luò)合物的晶體結(jié)構(gòu)尚未知道(J.B.Vincent，TheBiochemistry of Chromium，J.Nutr.130715(2000))。LMWCr結(jié)合鉻似乎主要以陰離子橋連多核羧酸鉻組合形式存在(Truitt Ellis等，Synthetic Models forLow Molecular Weight Chromium-Binding SubstanceSynthesis andcharacterization of Oxo-Bridged Tetranuclear Chromium(III)Assemblies，Inorg.Chem.，335522(1994))。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，合成的多核鉻組合與LMWCr相似，能激活胰島素受體活性(C.M.Davis等，Synthetic Multinuclear ChromiumAssembly Activates Insulin Receptor Kinase ActivityFunctional Model forLow-Molecular-Weight Chromium-Binding Substance，Inorg.Chem.，365316(1997))。
認(rèn)識一種未知的鉻(III)和有機(jī)配體絡(luò)合物負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)碳水化合物和脂質(zhì)代謝對開發(fā)在人和動物營養(yǎng)品中的使用新含鉻化合物產(chǎn)生了重大意義。有很多授權(quán)專利描述了結(jié)合各種配體的含鉻化合物。1975年授予本申請其中一名發(fā)明人的專利公開了1∶1和1∶2鉻-α氨基酸絡(luò)合物鹽(US 3,925,433)。這些絡(luò)合物鹽以離子對存在，其中陽離子由鉻(III)離子與一或兩個α氨基酸分子的絡(luò)合物組成。陽離子帶1+或2+，取決于形成絡(luò)合物的氨基酸分子數(shù)。相反離子(陰離子)可以是氯離子、硫酸根離子或酸性硫酸根離子。美國專利US5,278,329公開了L-甲硫氨酸的主要金屬絡(luò)合物，包括1∶1 L-甲硫氨酸鉻絡(luò)合物。而美國專利US 5,698,724描述了通過蛋白水解獲得的氨基酸金屬絡(luò)合物，包括鉻-氨基酸絡(luò)合物。
1982年授權(quán)的美國專利US 4,343,905描述了一種從啤酒酵母制備濃縮葡萄糖耐受因子的方法。有些授權(quán)專利敘述了具有調(diào)節(jié)碳水化合物或脂質(zhì)代謝生物活性的酵母或酵母衍生物的生產(chǎn)方法，例如美國專利US 4,348,483；6,140,107；6,159,466和6,248,323。
美國專利US 4,571,391描述了前述已知化合物乙酰丙酮酸鉻作為食物補(bǔ)充品和藥劑的應(yīng)用。這種水不溶性化合物具有熱穩(wěn)定性，并且在酸和弱堿性溶液中很穩(wěn)定。據(jù)報，口服乙酰丙酮酸鉻后在胃腸道內(nèi)被快速吸收，有效增強(qiáng)胰島素對葡萄糖代謝的作用。
美國專利US 4,315,927第一次公開了用基本金屬吡啶甲酸鹽包括吡啶甲酸鉻作為食物補(bǔ)充，1992年7月7日再頒布為Re33,988。美國專利US 4,315,927描述了吡啶甲酸鉻的制備(實(shí)施例4)。Re33,988的具體權(quán)利要求書包括了鉻、鈷、銅和錳以及美國專利US 4,315,927所述的鋅和鐵的吡啶甲酸鹽絡(luò)合物。美國專利US 5,677,461描述了一種生產(chǎn)吡啶甲酸鉻絡(luò)合物的方法。很多專利也公開了吡啶甲酸鉻在治療和預(yù)防各種疾病中的應(yīng)用，包括5,087,623；5,087624；5,175,156和6,329,361 B1。美國專利5,614,553；5,929,066；6,093,711；6,136,317；6,143,301；6,251,888 B1和6,251,889 B1敘述了含有吡啶甲酸鉻的組合物及這些組合物的應(yīng)用。
美國專利US 4,923,855和5,194,615描述了稱作“GTF鉻材料”的煙酸鉻及其制備方法。煙酸鉻降低血脂水平的應(yīng)用可參見美國專利US 4,954,492。有多項專利包括US 5,905,075；5,948,772；5,980,905；6,100,250；6,100,251和6,323,192敘述了含有煙酸鉻的組合物及其應(yīng)用。
美國專利5,266,560公開了具有GTF樣活性且在藥學(xué)上能促進(jìn)胰島素活性的鉻(III)絡(luò)合物。這些絡(luò)合物由鉻(III)、煙酸或它的其中一種衍生物以及谷胱甘肽(含有L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸的肽)組成。這些絡(luò)合物在體外對分離的脂肪細(xì)胞中葡萄糖運(yùn)送具有促胰島素活性已見報導(dǎo)，并且與以前文獻(xiàn)中所報導(dǎo)的類似絡(luò)合物作了比較。
美國專利5,707,679和6,303,158 B1描述了包括丙酸鉻在內(nèi)的金屬丙酸鹽的應(yīng)用。含有短鏈脂肪酸鉻鹽的組合物及其在動物營養(yǎng)中的應(yīng)用可參見美國專利5,846,581。生產(chǎn)用作動物食物補(bǔ)充品的金屬羧酸鹽的方法在美國專利5,591,878和5,795,615中有所描述。
肌氨酸和基本金屬(包括鉻在內(nèi))的有生物利用性的螯合物在美國專利US6,114,379中有所描述。該專利要求保護(hù)肌氨酸-鉻絡(luò)合物，所述絡(luò)合物的每個鉻離子含有1-3當(dāng)量的配體。
美國專利6,149,948和6,197,816 B1敘述了已公知的三核鉻(III)絡(luò)合物作為營養(yǎng)補(bǔ)充品或在治療醫(yī)學(xué)病況中的應(yīng)用。該絡(luò)合物的分子式是[Cr3O(O2CCH2CH3)6(H2O)3]+。這些專利描述了該絡(luò)合物對參與碳水化合物和脂質(zhì)代謝中的許多酶的生物作用。美國專利US 5,872,102描述了分離牛低分子量鉻結(jié)合物質(zhì)的方法及其應(yīng)用。這種物質(zhì)增強(qiáng)了大鼠脂肪細(xì)胞中胰島素激活的葡萄糖攝取，并激活了大鼠脂肪細(xì)胞膜酪氨酸激酶和磷酸酪氨磷酸酶的活性。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，一些缺點(diǎn)限制文獻(xiàn)中所述各種鉻絡(luò)合物的有效性。通過商業(yè)途徑獲得的鉻絡(luò)合物中最常見的是吡啶甲酸鉻。然而，這種化合物的水溶性較低，有些最新研究還質(zhì)疑它的安全性。雖然已經(jīng)證實(shí)了氯化鉻和吡啶甲酸鉻在大鼠體內(nèi)無毒性(Anderson等，Lack of Toxicity of Chromium Chloride andChromium Picolinate in Rats，J.Amer.Coll.Nutr.16273(1997))，但最新研究報導(dǎo)吡啶甲酸鉻切割DNA，對中國倉鼠卵巢細(xì)胞的染色體造成破壞(J.K.Speetjens等，The Nutritional Supplement Chromium(III)Tris(picolinate)CleavesDNA，Chem.Res.Toxicol.12483(1999)以及D.M.Stearns，Chromium(III)picolinate produces chromosome damage in Chinese hamster ovarycells，F(xiàn)ASEB J.，91643(1995))。一項關(guān)于吡啶甲酸鉻(III)在大鼠體內(nèi)分布的研究得出結(jié)論該化合物在體內(nèi)停留時間短會減弱該食物補(bǔ)充品潛在的有毒作用(D.D.D.Hepburn和J.B.Vincent，In Vivo Distribiution of Chromium fromChromium Picolinate in Rates and Impliations for the Safety of the DitarySupplement，Chem.Res.Toxicol.，1593(2002))。因此，需要具有可溶性、生物利用性、有效性和安全性的食用鉻的替代來源是顯然的。
本發(fā)明的主要目的是滿足上述需要。
本發(fā)明的另一個目的是提供新的1∶3鉻(III)和α氨基酸絡(luò)合物，用作人和家畜動物的營養(yǎng)補(bǔ)充品。
本發(fā)明的另一個目的是提供這些新絡(luò)合物的制備方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供并描述這些絡(luò)合物對動物生產(chǎn)性能的理想作用。
本發(fā)明又一個目的是證明這些新絡(luò)合物在實(shí)驗(yàn)動物中無毒性。
本發(fā)明的結(jié)構(gòu)是1∶3鉻(III)和α氨基酸絡(luò)合物。有人早已研究了大部分現(xiàn)有營養(yǎng)相關(guān)的鉻絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。例如，已經(jīng)合成了吡啶甲酸鉻(III)單核和雙核絡(luò)合物，而且它們的結(jié)構(gòu)也已通過X射線結(jié)晶學(xué)測定。氯化鉻(III)與吡啶甲酸在水(pH＜4.0)中反應(yīng)，生成單核絡(luò)合物，其中金屬與氨基酸之比為1∶3(三吡啶甲酸鉻)。但如果溶液的pH值＞4.0，就會形成雙核絡(luò)合物。雙核絡(luò)合物中鉻與氨基酸之比是1∶2(D.M.Steams和W.H.Armstrong，Mononuclearand Binuclear Chromium(III)Picolinate Complexes，Inorg.Chem.，3151(1992))。
還研究了吡啶甲酸和煙酸的鉻絡(luò)合物的組合物與生物活性。用這些吡啶羧酸形成的鉻絡(luò)合物是不同的，這是因?yàn)閮煞N化合物的結(jié)構(gòu)不同。煙酸不是α氨基酸，因此起單齒狀配體的作用。它通過羧酸根陰離子與鉻結(jié)合，形成雙核和三核絡(luò)合物。兩種絡(luò)合物(1∶1和1∶2)都是在鉻和煙酸之間形成。在本研究所用的測試組中沒有一種絡(luò)合物有生物活性，除了二煙酸鉻在大鼠分離脂肪組織中促進(jìn)了胰島素活性。另一方面，吡啶甲酸是一種α氨基酸，起雙齒狀配體的作用。它通過吡啶上的氮原子和羧基上的氧原子與鉻離子結(jié)合，形成穩(wěn)定的五元環(huán)。當(dāng)氯化鉻溶液用吡啶甲酸處理時，根據(jù)反應(yīng)混合物中吡啶甲酸與鉻之比形成了三種不同絡(luò)合物。在氯化鉻溶液中加入1或2摩爾當(dāng)量吡啶甲酸，改變了溶液的顏色。用氫氧化鈉調(diào)溶液至pH 7.4，產(chǎn)生絡(luò)合物沉淀。經(jīng)高效液相層析法(HPLC)發(fā)現(xiàn)這些絡(luò)合物是均勻的。當(dāng)使用1摩爾當(dāng)量吡啶甲酸時，產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)是CrPic(H2O)2(OH)2。當(dāng)使用2摩爾當(dāng)量吡啶甲酸時，沉淀物的結(jié)構(gòu)是Cr(Pic)2(H2O)(OH).(H2O)。因?yàn)檫@些絡(luò)合物都是在pH＞4的條件下形成，所以它們最有可能是雙核絡(luò)合物。這兩種絡(luò)合物中沒有一種有生物活性。在氯化鉻水溶液中加入3摩爾當(dāng)量吡啶甲酸，形成一種在溶液中沉淀的紅色固體。用HPLC發(fā)現(xiàn)該沉淀物是均勻的。對該沉淀物的分析表明，它是三吡啶甲酸鉻一水合物(Cr(Pic)3(H2O))。這種物質(zhì)最可能是單核絡(luò)合物。該絡(luò)合物增進(jìn)了體外大鼠骨胳肌培養(yǎng)液對葡萄糖的攝取。在大鼠飲食中加入該絡(luò)合物，顯著降低了血糖，并防止了血紅蛋白的糖化。人食用補(bǔ)充了三吡啶甲酸鉻的食物之后，男性和女性的瘦體重都有明顯上升(G W Evans和D JPouchnick，Composition and Biological Activity of Chromium-PyridineCarboxylate complexes，J.Inorg.Biochem.，49177(1993))。
由此可見，現(xiàn)有的全部結(jié)構(gòu)均與本發(fā)明的鉻化合物不同，本發(fā)明的鉻化合物有不同的經(jīng)驗(yàn)式和不同的空間化學(xué)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及新的1∶3鉻(III)絡(luò)合物的制備。這些絡(luò)合物含有氧化態(tài)鉻和3個氨基酸。絡(luò)合物中的鉻與三個α氨基酸分子結(jié)合。與在極性溶劑中實(shí)際不溶的已知中性鉻絡(luò)合物不同，本專利申請所述的新絡(luò)合物極易溶于極性溶劑中，如水和甲醇。這些絡(luò)合物在酸和堿性溶液中是穩(wěn)定的。該水溶性絡(luò)合物當(dāng)加在食物中時，是容易獲得具有生物利用性的鉻的有用來源。這些絡(luò)合物用作動物營養(yǎng)品的飼料添加劑提高了動物的生產(chǎn)性能。這些絡(luò)合物以高劑量喂飼實(shí)驗(yàn)室大鼠時不會引起中毒。
具體實(shí)施例方式
鉻以幾種氧化態(tài)存在，但最穩(wěn)定和重要的形態(tài)是鉻(III)。在此最穩(wěn)定形態(tài)中，三價鉻的配位數(shù)是6。有6個配位數(shù)的三價鉻與多種配體形成八面體絡(luò)合物。這些絡(luò)合物的特點(diǎn)在于其在水溶液中的相對分子運(yùn)動惰性。這些絡(luò)合物中有許多的配體置換反應(yīng)的半衰期是數(shù)小時。由于有這種分子運(yùn)動惰性，所以很多絡(luò)合物以固體被分離出來，甚至在熱力學(xué)不穩(wěn)定時也能在水溶液中穩(wěn)定存在相當(dāng)長的時間。
本發(fā)明涉及新的安全有效鉻-氨基酸絡(luò)合物的設(shè)計、合成和評估。賦予金屬-氨基酸絡(luò)合物生物活性的特征包括溶解度、絡(luò)合物在腸胃內(nèi)pH值時的穩(wěn)定性、絡(luò)合物的吸收率和絡(luò)合物參與生化反應(yīng)的能力。使用天然氨基酸以及提高其生物利用性以減少為滿足動物營養(yǎng)需要而向飼養(yǎng)添加的金屬用量，都可以增加金屬-氨基酸絡(luò)合物的安全性。
美國專利US 3,925,433描述了1∶1和1∶2鉻-α氨基酸絡(luò)合物鹽。雖然這些絡(luò)合物與鉻無機(jī)源相比營養(yǎng)有重要的提高，但它們也存在一些不足。氯化鉻溶液與1、2或3摩爾當(dāng)量α氨基酸混合，形成澄清綠色溶液。這些溶液的pH值分別是0.932、1.324和1.627。小心加入氫氧化鈉或碳酸鈉溶液調(diào)這些溶液至pH 7，使鉻化合物沉淀，這表明這些化合物在胃腸道pH值范圍內(nèi)可能非常不穩(wěn)定的。當(dāng)鉻-α氨基酸絡(luò)合物(1∶3)以3當(dāng)量氫氧化鈉處理時，形成紫色沉淀物。該沉淀物實(shí)際上不溶于水、稀釋酸和堿、甲醇、乙醇、異丙醇和乙酸乙酯。元素分析和它的傅立葉紅外光譜(FTIR)檢查顯示，它是鉻-氨基酸絡(luò)合物(1∶3)與一些多核鉻-氨基酸絡(luò)合物的混合物。該絡(luò)合物的不溶性及其不確定組成使我們可以假定，它不可能具有營養(yǎng)價值。
結(jié)構(gòu)1本發(fā)明所述的新絡(luò)合物以結(jié)構(gòu)式1表示，是1∶3鉻-氨基酸絡(luò)合物鹽。這些絡(luò)合物以離子對存在，其中一價陽離子由三價鉻與三個α氨基酸分子復(fù)合組成。其中一個氨基酸分子保留了它的兩性離子特征，使絡(luò)合物帶凈正電荷。該氨基酸的羧基與鉻(III)離子形成兩個鍵，從而形成一個滿足鉻6個配位中的2個配位的應(yīng)變四元環(huán)。其余兩個α氨基酸分子通過α氨基和羧基結(jié)合鉻，形成五元環(huán)。這將使鉻(III)的全部6個配位飽和。本文把離子對中的陰離子稱為“X”，它可以是一價陰離子，如氯離子，或二價陰離子，如硫酸根離子?！癛”是α氨基酸的有機(jī)基團(tuán)。它可由精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、甘氨酸等衍生而來。雖然甘氨酸不是基本氨基酸，但它也是優(yōu)選的α氨基酸，因?yàn)樗菀撰@得，并能輕易合成本發(fā)明的絡(luò)合物鹽。最優(yōu)選的兩種天然α氨基酸是甘氨酸和甲硫氨酸。對于甘氨酸，R表示氫原子，對于甲硫氨酸，R表示基團(tuán)CH3-SC-H2-CH2-。
這些絡(luò)合物可用簡單實(shí)用方法制成。把氯化鉻水溶液加熱至90-95℃。溶液的顏色通常呈深綠色。小心加入氨基酸(3摩爾當(dāng)量)，繼續(xù)加熱。溶液的顏色慢慢變成深藍(lán)綠色。再將溶液冷卻至約40℃，緩慢小心地加入氫氧化鈉溶液調(diào)溶液至pH 3.9-4.0。調(diào)節(jié)pH值需要2摩爾當(dāng)量氫氧化鈉。溶液的顏色轉(zhuǎn)為深紫色。蒸發(fā)液體得到固體，該固體由所希望的產(chǎn)物和氯化鈉組成。用甲醇或乙醇萃取，可從氯化鈉中分離出產(chǎn)物。另外，也可通過合適的尺寸排斥樹脂層析法從氯化鈉中分離出產(chǎn)物。
用上述方法得到的產(chǎn)物有一些獨(dú)特性質(zhì)。它是一種穩(wěn)定固體。它的顏色呈深紫色。該產(chǎn)物易溶于水和甲醇中，溶于乙醇中，微溶于異丙醇中，不溶于乙酸乙酯。0.1M該產(chǎn)物水溶液的pH值為4.078。該溶液的紫外/可見光光譜的最大吸收峰在400nm(摩爾吸光度，44.08)和541nm(摩爾吸光度，50.60)處。與之不同的是，氯化鉻的紫外/可見光光譜的最大吸收峰在429nm(摩爾吸光度，18.10)和608nm(摩爾吸光度，14.43)處。加入20摩爾當(dāng)量的0.1M碳酸氫鈉溶液將溶液的pH值調(diào)至8.097，但無形成沉淀。在一實(shí)施例中，加入80摩爾當(dāng)量的0.1M碳酸氫鈉溶液?；旌衔锏膒H值是8.354，但無形成鉻化合物沉淀。與之相反，在0.1M氯化鉻溶液中加入稍高于2當(dāng)量的0.1M碳酸氫鈉溶液，形成大量沉淀物，但混合物的pH值只有4.356。加入20摩爾當(dāng)量鹽酸調(diào)0.1M絡(luò)合物溶液至約pH 1.0，溶液的紫外/可見光光譜無改變，這表明絡(luò)合物不會分解。
用HPLC測定，用上述方法得到的固體絡(luò)合物是均勻的。用尺寸排斥柱分析甲醇溶液，顯示存在單個組分。檢測兩種不同波長的峰(一種波長檢測鉻，另一種波長檢測氨基酸)表明，兩種波長都洗脫出單峰。對氯化鉻甲醇溶液分析表明，它洗脫出多峰，沒有一個峰與絡(luò)合物的峰相似。而且，氯化鉻的主峰停留時間比絡(luò)合物短，表示絡(luò)合物的分子量較大。
用不同α氨基酸得到具有相似物化性質(zhì)的絡(luò)合物。這些絡(luò)合物的元素分析得出的結(jié)果與所提出的結(jié)構(gòu)一致。絡(luò)合物的FTTR光譜與用來形成絡(luò)合物的氨基酸不同，而與其它金屬氨基酸絡(luò)合物相類似。
測試了由鉻(III)和L-甲硫氨酸形成的絡(luò)合物作為乳牛鉻營養(yǎng)源，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳牛的生產(chǎn)性能有所改善。飲食中補(bǔ)充三L-甲硫氨酸鉻鹽酸鹽不會影響乳牛攝取干物質(zhì)，但增加了牛奶產(chǎn)量。檢查該絡(luò)合物在大鼠中的毒性，發(fā)現(xiàn)所用劑量不會引起中毒。
實(shí)施例1 三L-甲硫氨酸鉻(III)鹽酸鹽的制備把水(550毫升)倒入2000毫升燒杯中。加入氯化鉻六水合物(79.959克，0.3摩爾)。混合物攪拌加熱至沸騰。加入L-甲硫氨酸(134.306克，0.9摩爾)?；旌衔飻嚢杓訜嶂敝凉腆w完全溶解。持續(xù)攪拌加熱多30分鐘。溶液由深綠色轉(zhuǎn)為深藍(lán)綠色。將溶液冷卻至30℃。氫氧化鈉(23.317克，0.5829摩爾)溶于100毫升水中，將溶液冷卻至30℃。邊攪拌邊向甲硫氨酸鉻溶液逐滴加入氫氧化鈉溶液。溶液由深藍(lán)綠色轉(zhuǎn)為紫色。減壓蒸干溶液。殘留物用甲醇萃取，得到白色結(jié)晶固體。蒸干甲醇萃取液，得到深紫色結(jié)晶固體(161.352克，得率為100.91％)。
將產(chǎn)物置于溴化鉀片上進(jìn)行FTIR，吸光結(jié)果為3421.5(s)、2916.2(s)、1635.5(s)、1508.2(m)、1438.8(m)、1338.8(m)、1338.5(s)、1272.9(w)、1242.1(w)和1145.6(m)cm-1。(s表示強(qiáng)、m表示中等，w表示弱)0.01M水溶液的可見光光譜有兩個最大吸收峰400nm(摩爾吸光度，44.08)和541nm(摩爾吸光度，50.60)。
0.1M水溶液的pH值是4.078。取10毫升該溶液用200毫升0.1M碳酸氫鈉溶液稀釋。無形成沉淀。溶液的pH值是8.097。加入另外600毫升0.1M碳酸氫鈉溶液。無形成沉淀，溶液的pH值是8.354。
對絡(luò)合物在甲醇中的溶液(含有0.9555毫克/毫升鉻)用HPLC和紫外/可見光檢測儀進(jìn)行分析，HPLC層析柱為60A Macrosphere GPC柱(AlltechAssociates，Inc.)，流動相為甲醇，流速0.5毫升/分鐘。獲得一個單峰，停留時間為6.48分鐘。當(dāng)在相同條件下對含有0.4666毫克/毫升鉻的氯化鉻六水合物溶液進(jìn)行分析時，洗脫出一個峰，停留時間為6.67分鐘。停留時間延長表明鉻絡(luò)合物的分子量比氯化鉻大。
除了把檢測儀設(shè)在210nm外，重復(fù)一次HPLC分析以檢測氨基酸。檢測靈敏度比405nm高100倍，因而需要將樣品稀釋至含有0.009555毫克/毫升鉻。407nm時該稀釋樣品出現(xiàn)單峰，停留時間為6.19分鐘。210nm時有多個次峰與一個主峰，而主峰的停留時間為6.19分鐘。在相同條件下把檢測儀設(shè)在210nm，分析L-甲硫氨酸鹽酸鹽樣品，結(jié)果顯示有多個次峰與一個主峰，而主峰的停留時間為7.6分鐘。這些結(jié)果表明，絡(luò)合物完全轉(zhuǎn)移到柱上，它的分子量比氯化鉻和L-甲硫氨酸鹽酸鹽大。
實(shí)施例2 三亮氨酸鉻(III)鹽酸鹽的制備把水(150毫升)倒入600毫升燒杯中。加入氯化鉻六水合物(13.325克，0.05摩爾)?；旌衔飻嚢杓訜嶂练序v。加入L-亮氨酸(19.685克，0.15摩爾)?；旌衔飻嚢杓訜嶂敝凉腆w完全溶解。持續(xù)攪拌加熱多30分鐘。溶液由深綠色轉(zhuǎn)為深藍(lán)綠色。將溶液冷卻至30℃。氫氧化鈉(4.014克，0.10摩爾)溶于20毫升水中，將溶液冷卻至30℃。邊攪拌邊向亮氨酸鉻溶液逐滴加入氫氧化鈉溶液。溶液由深藍(lán)綠色轉(zhuǎn)為深紫色。減壓蒸干溶液。殘留物用甲醇萃取，得到白色結(jié)晶固體。蒸干甲醇萃取液，得到深紫色結(jié)晶固體(28.363克，理論值是23.948克，得率118.44％，這表示產(chǎn)物含有殘余的氯化鈉)。
將產(chǎn)物置于溴化鉀片上進(jìn)行FTIR，吸光結(jié)果為3425.3(m)、2916.2(s)、1635.5(s)、1508.2(m)、1438.8(m)、1384.8(m)、1338.5(s)、1272.9(w)、1242.1(w)和和1141.8(m)cm-1。(s表示強(qiáng)、m表示中等，w表示弱)0.01M水溶液的可見光光譜有兩個最大吸收峰406nm(摩爾吸光度，38.79)和545nm(摩爾吸光度，42.81)。
0.1M水溶液的pH值是3.996。取10毫升該溶液用200毫升0.1M碳酸氫鈉溶液稀釋。無形成沉淀。溶液的pH值是7.987。溶液的可見光光譜有兩個最大吸收峰409nm(摩爾吸光度，47.46)和558nm(摩爾吸光度，47.67)。
實(shí)施例3 三甲硫氨酸鉻(III)鹽酸鹽預(yù)混合物(0.1％鉻)的制備量取100毫升蒸餾水，倒入400毫升燒杯中。加入氯化鉻六水合物(6.672克，0.0251摩爾)，混合物攪拌加熱直至固體完全溶解。加入L-甲硫氨酸(11.201克，0.0751摩爾)，所得的混合物攪拌加熱。溶液的顏色由深綠色轉(zhuǎn)為藍(lán)綠色。再在90-95℃加熱多60分鐘。將溶液冷卻至30℃。邊攪拌邊逐滴加入氫氧化鈉(1.967克，0.0492摩爾)在50毫升水中的冷卻溶液。溶液的顏色轉(zhuǎn)為深紫色。減壓蒸發(fā)溶液。殘留物溶于100毫升甲醇中，把該溶液加在1000克載體中。將混合物放入60℃烘箱內(nèi)24小時。如實(shí)施例1所述用紫外/可見光檢測儀、比色法和HPLC分析干燥的預(yù)混合物樣品。該預(yù)混合物用于豬的喂飼試驗(yàn)。
實(shí)施例4 三甲硫氨酸鉻(III)(1.75％鉻)的制備量取1500毫升水，倒入4升燒杯中。加入氯化鉻六水合物(390.993克，1.4675摩爾)，混合物攪拌加熱直至固體完全溶解。連續(xù)攪拌加熱多1小時，直至鉻鹽完全形成水合物。加入L-甲硫氨酸(1094.845克，7.338摩爾)，所得的混合物攪拌加熱直至全部固體溶解。連續(xù)攪拌加熱1小時。溶液的顏色轉(zhuǎn)為深紫色。用蒸餾水把溶液配至4升。
溶液的pH值是2.336。它含有25.61％甲硫氨酸和1.86％鉻。
0.01M水溶液的可見光光譜有兩個最大吸收峰416nm(摩爾吸光度，102.5)和579.5nm(摩爾吸光度，101.9)。
0.1M水溶液的pH值是2.285。取10毫升該溶液用200毫升0.1M碳酸氫鈉溶液稀釋。無形成沉淀。溶液的pH值是7.546。溶液的可見光譜有兩個最大峰409.5nm(摩爾吸光度，43.89)和558nm(摩爾吸光度，46.83)。
實(shí)施例5 三L-甲硫氨酸鉻鹽酸鹽對乳牛生產(chǎn)性能的影響研究了以三L-甲硫氨酸鉻鹽酸鹽形式存在的鉻補(bǔ)充品對臨近分娩的乳牛的生產(chǎn)性能的影響。用了72只乳牛來確定臨近分娩期在食物中加入三L-甲硫氨酸鉻鹽酸鹽是否會影響牛奶產(chǎn)量和干物質(zhì)的攝取。從預(yù)產(chǎn)期前21天直至分娩的期間給乳牛喂飼高非草料纖維食物或高非纖維碳水化合物食物，然后再喂飼一般哺乳食物。每日以膠囊錠(gelcap)形式補(bǔ)充1次三L-甲硫氨酸鉻鹽酸鹽，劑量為0、0.03或0.06毫克/千克代謝體重。鉻的補(bǔ)充在預(yù)產(chǎn)期前第21天開始，持續(xù)至產(chǎn)后第28天。按照確立的程序在乳牛產(chǎn)下小牛后擠奶。在整個實(shí)驗(yàn)期間記下每只乳牛每日的食物攝取量。每周抽取食物樣品，測定干物質(zhì)含量。在實(shí)驗(yàn)的泌乳期記錄每次擠奶時各乳牛的牛奶重量。每周都在一個24小時的時段內(nèi)，從全部擠出的牛奶采牛奶樣品，根據(jù)每次的奶量把這些樣品混合，分析其脂肪、蛋白質(zhì)、乳糖和總固體。
食物中補(bǔ)充了三L-甲硫氨酸鉻鹽酸鹽不會影響乳牛的干物質(zhì)攝取。然而，補(bǔ)充了鉻有增加牛奶產(chǎn)率的趨勢(p＜0.13，表1)。
表1

本實(shí)施例和本發(fā)明的鉻(III)絡(luò)合物可與常用惰性營養(yǎng)載體，例如蒸餾發(fā)酵溶質(zhì)、飼料谷物、家禽和魚雙產(chǎn)物、飼料粉、乳清、天然鹽、磨碎玉米棒子、羽毛粉等一起使用。
實(shí)施例6 三L-甲硫氨酸鉻鹽酸鹽在大鼠中的毒性在大鼠單劑量口服三L-甲硫氨酸鉻鹽酸鹽之后，研究它在大鼠中的毒性。研究用了50只6周齡的大鼠(25只雄性和25只雌性)。雄性大鼠重130克至220克，雌性大鼠重120克至190克。這些動物關(guān)在聚碳酸酯籠內(nèi)，籠內(nèi)以無塵木屑為墊料，每組5只。將籠置于溫度22℃和相對濕度55％的空調(diào)室內(nèi)。給大鼠隨意喂飼丸狀完全食物。在給藥前使動物禁食一晚，給藥后3-4小時再進(jìn)食。動物隨意飲水。隨機(jī)指派動物接受5種處理之一。兩組動物(每組5只)、一組雄性動物、一組雌性動物分別接受一種處理。這些處理就是對照處理、給予250毫克/千克、500毫克/千克、1000毫克/千克、和2000毫克/千克化合物?；衔锏乃芤航?jīng)胃灌流以單劑量口服給予。動物接受給藥后觀察14天。在第14天處死存活動物。就在處理前、研究期間每周2次以及死亡時記錄動物的重量。
研究期間無動物死亡，給予任何劑量水平化合物的動物也沒有發(fā)現(xiàn)有與處理相關(guān)的臨床癥狀。此外，口服劑量后第14天對動物進(jìn)行尸檢，肉眼觀察也沒有發(fā)覺有任何異常。但給予2000毫克/千克劑量的雄性大鼠增體下降5％。此劑量是豬推薦劑量的4000倍。另外還發(fā)現(xiàn)，給予1000和2000毫克/千克劑量的兩組動物與對照組動物相比，食物攝取量下降與劑量有關(guān)。
這些結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)條件下，以豬推薦劑量的1000倍水平給大鼠單劑量口服三L-甲硫氨酸鉻鹽酸鹽不會引起中毒。給予豬推薦劑量的2000倍會導(dǎo)致食物攝取量下降，但與體重增加的減少無關(guān)。2000毫克/千克劑量是豬推薦劑量的4000倍，食物攝取量減少與增重輕微下降有關(guān)。
權(quán)利要求
1.一種鉻絡(luò)合物，其特征在于所述絡(luò)合物以下式表示 結(jié)構(gòu)1式中，“R”是天然氨基酸正常所帶的有機(jī)基團(tuán)，“X”是水溶性陰離子。
2.如權(quán)利要求1所述的絡(luò)合物，其特征在于所述“X”是一價離子。
3.如權(quán)利要求1所述的絡(luò)合物，其特征在于所述“X”選自氯離子、溴離子、碘離子、硫酸根離子、磷酸根離子、乙酸根離子和丙酸根離子。
4.如權(quán)利要求1所述的絡(luò)合物，其特征在于選取“R”以致天然氨基酸為一種選自精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸和甘氨酸的氨基酸。
5.一種增強(qiáng)家畜生物利用性的營養(yǎng)組合物，其特征在于所述組合物包括以下式表示的鉻絡(luò)合物和動物營養(yǎng)載體。
6.如權(quán)利要求5所述的絡(luò)合物，其特征在于所述“X”是一價離子。
7.如權(quán)利要求5所述的絡(luò)合物，其特征在于所述“X”選自氯離子、溴離子、碘離子、硫酸根離子、磷酸根離子、乙酸根離子和丙酸根離子。
8.如權(quán)利要求5所述的絡(luò)合物，其特征在于選取“R”以致天然氨基酸為一種選自由精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸和甘氨酸的氨基酸。
9.如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于所述載體選自天然鹽、磨碎玉米棒子、玉米粉和羽毛粉的惰性動物營養(yǎng)載體。
10.一種用鉻(III)1∶3絡(luò)合物增加動物營養(yǎng)的方法，其特征在于所述方法包括把小量但可增加營養(yǎng)的有效量的鉻絡(luò)合物給予有需要的動物，所述的鉻絡(luò)合物以下式表示， 結(jié)構(gòu)1式中，“R”是天然氨基酸正常所帶的有機(jī)基團(tuán)，“X”是水溶性陰離子。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述動物是豬，劑量最高是300ppm鉻。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述動物是牛，劑量是0.03毫克/千克體重至0.06毫克/千克體重。
13.一種形成1∶3鉻(III)可溶于極性溶劑的鉻-α氨基酸絡(luò)合物的方法，其特征在于所述方法包括將鉻(III)鹽水溶液加熱至近沸點(diǎn)；在加熱混合物中加入約3當(dāng)量的α氨基酸；繼續(xù)加熱直至顏色由深紅色轉(zhuǎn)為紫色；以及冷卻并調(diào)pH值使絡(luò)合物穩(wěn)定。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于加熱至90至95℃之間。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于調(diào)pH值在約3.9至約4.0之間。
16.一種增強(qiáng)家畜生物利用性的營養(yǎng)組合物，其特征在于所述組合物包括以下式表示的鉻絡(luò)合物， 式中，“R”是天然氨基酸正常所帶的有機(jī)基團(tuán)，“X”是水溶性陰離子，全部在液態(tài)載體中。
17.如權(quán)利要求16所述的絡(luò)合物，其特征在于所述“X”是一價離子。
18.如權(quán)利要求16所述的絡(luò)合物，其特征在于所述“X”選自氯離子、溴離子、碘離子、硫酸根離子、磷酸根離子、乙酸根離子和丙酸根離子。
19.如權(quán)利要求16所述的絡(luò)合物，其特征在于選取“R”以致天然氨基酸為一種選自精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸和甘氨酸的氨基酸。
20.如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征在于所述溶劑選自由水、乙醇、糖漿或任何其它合適的溶劑或這些合適溶劑的混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及1∶3鉻(III)－α氨基酸絡(luò)合物及其作為動物營養(yǎng)補(bǔ)充品的應(yīng)用。
文檔編號A61K31/28GK1610541SQ03801844
公開日2005年4月27日 申請日期2003年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月31日
發(fā)明者M·M·阿布戴爾－莫能, M·D·安德森 申請人:津浦羅公司