專利名稱：槐角黃酮有效部位、生產(chǎn)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及槐角黃酮有效部位、生產(chǎn)方法及其應(yīng)用。更具體地說，本發(fā)明涉及槐角異黃酮提取物、黃酮醇提取物、總黃酮提取物及其生產(chǎn)方法和用途，同時還涉及含上述提取物的藥物制劑、功能性食品和護膚品。
背景技術(shù)：
雌激素替代療法是人們所熟知的一種有效的預防或者治療與雌激素缺乏相關(guān)疾病的療法，特別是預防或治療骨質(zhì)疏松癥、女性更年期綜合癥。另外，雌激素替代療法還具有降低冠心病的發(fā)病率、預防或治療老年癡呆癥、抑郁癥和記憶力喪失等作用。但是，人體攝入過多的雌激素，會帶來一些副作用，例如會增加乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率。因此在該領(lǐng)域中，人們一直在尋找具有很好的雌激素樣活性但又沒有雌激素副作用的植物雌激素。
植物中的黃酮類成分就是一類植物雌激素。植物中的黃酮化合物有較多的研究和報道。近年來，由于發(fā)現(xiàn)這些化合物對于人體具有一些很好的生物活性，尤其是發(fā)現(xiàn)了異黃酮類化合物對人體的生物活性，從而引起了人們很大的關(guān)注。黃酮類化合物對人體的生物活性，包括抗氧化作用、抗菌消炎作用、降膽固醇作用、降谷丙轉(zhuǎn)氨酶作用、防治腦血栓和冠心病作用、對心血管系統(tǒng)疾病的預防和治療作用等等，已經(jīng)為人們所熟知。近一些年的大量研究，發(fā)現(xiàn)了這類化合物具有很好的雌激素樣活性，因而被科學界稱為“植物雌激素”，在骨質(zhì)疏松癥、女性更年期綜合癥以及在抗癌和抗腫瘤，尤其是乳腺癌、子宮癌和卵巢癌等方面，有很多有益的效果。
在現(xiàn)有技術(shù)中，除臨床上使用的一些藥物制劑中含有植物黃酮成分外，還出現(xiàn)大量的在食品或飲料中添加植物黃酮類化合物的參考文獻。
Chen等人WO0064276專利中，描述了一種具有保健作用的含鈣、維生素和植物黃酮成分的食品。
Crank等人US5858449專利中，敘述了含大豆黃酮和大豆蛋白的產(chǎn)品和它們制造方法。Crank的產(chǎn)品可放入嬰兒食品、營養(yǎng)飲料、牛奶、酸奶、冷凍食品、涂抹食品和肉食基質(zhì)中。
Gorbach等人的US5498631專利中敘述了一種通過服用有效量的異黃酮治療絕經(jīng)癥、經(jīng)前綜合癥、或與雌激素水平降低有關(guān)的疾病。所述的黃酮可以通過巧克力糖、餅干、谷類食品或飲料的形式食用而攝取。
Gorbach等人的US5733926專利中公開了一種治療早老性癡呆或與年齡有關(guān)的認知功能減退疾病的方法，其中包括特定的異黃酮和黃酮醇。
Barnes等人的US5506211專利中公開了為抑制破骨細胞的分泌作用和減少骨吸收，以包括大豆等食品在內(nèi)的各種形式供給異黃酮苷成分。
Jackson等人的美國專利5654011公開了一種增加絕經(jīng)前后婦女營養(yǎng)的營養(yǎng)強化劑，其中包含8-50毫克的植物雌激素。
Shylankevvich的美國專利5424331公開一種治療和預防骨質(zhì)疏松癥的材料，其中包括一種或多種植物雌激素化合物，可以以食品補充劑或以藥物的形式提供。
Shylankevvich的美國專利5569459敘述了應(yīng)用植物雌激素化合物調(diào)節(jié)雌激素的分泌。
Schouten美國有限責任公司目前生產(chǎn)一種從大豆分離的產(chǎn)品，稱作Soylife，在各種食品和食品飲料中可以包括這種材料。
上述的許多參考文獻中，所述的從大豆中得到的黃酮和異黃酮提取物或濃縮物都存在一定的不足之處，它們存在令人不喜歡的味道。這主要是由于已有技術(shù)中從大豆中得到的異黃酮產(chǎn)品是異黃酮含量為5％-40％的產(chǎn)品，大多為10％-20％，含有大量的非黃酮成分存在，造成最終產(chǎn)品有令人不愉快的味道。如果進一步的純化，其成本將是十分的高，而且異黃酮的產(chǎn)率也會很低。
槐角的化學成分十分復雜，除含有黃酮類化合物之外，還含有大量的糖類和其它成分。槐角中的黃酮類化合物是一類重要的“植物雌激素”，具有很高的開發(fā)價值。在中國專利1417220A中記載通過酶解、堿提酸沉法的槐屬苷提取方法，并記載槐屬苷在冠心病、腦血栓等疾病中的用途。由于槐角中的化學成分十分復雜，在本發(fā)明之前，已有技術(shù)中還沒有記載從槐角中獲得的高純度黃酮提取物，也沒有記載比較成熟的、可工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的從槐角中提取高純度黃酮提取物的方法。因此，這不利于開發(fā)槐角資源。獲得槐角總黃酮有效部位，對于槐角資源利用，開發(fā)新藥、功能性食品和飲料等，是十分必要的，具有重要的價值。
另外，把槐角中所含的異黃酮類成分和黃酮醇類成分分別提純得到各自高純度的提純物，從而能夠根據(jù)不同情況分別滿足應(yīng)用的要求，也是十分有價值的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所述的槐角，指豆科(Leguminosae)槐屬(Sophora Linn.)植物的果實，包括例如槐(Sophora japonica L.)、白刺花槐(Sophora viciifolia Hunce.)、砂生槐(Sophora moorcroftiana)、絨毛槐(Sophora tomentosa)、偏花槐(Sophorasecundiflora)、澳大利亞槐(Sophora fraseri)、大果槐(Sophora macrocarpa)、閩槐(Sophora franchetiana)、四翅槐(Sophora tetraptera)、絲毛槐(Sophoranuttaliana)、黃葉槐(Sophora chrysophylla)、厚果槐(Sophora pachycarpa)、小葉槐(Sophora nicrophylla)、費爾南德斯槐(Sophora fernandeziana)、智利槐(Sophora masafuerana)、稀見槐(Sophora exigua)、硬脊槐(Sophora mollis var.griffithii)、柳葉槐(Sophora dunnii)等槐屬植物的果實；優(yōu)選為豆科(Leguminosae)槐屬(Sophora Linn.)植物槐(Sophorajaponica L.)的果實。本發(fā)明所述的槐角，即果實，包括未成熟的幼果，也包括成熟的果實。本發(fā)明所述的槐角，即果實，可以是生品，也可以是經(jīng)炮制的，如炒炙品、酒炙品或醋炙品等。本發(fā)明的槐角，包括果實的果皮和/或種子。
通過本發(fā)明，發(fā)明人驚喜地發(fā)現(xiàn)，從槐角中可工業(yè)規(guī)模的獲得高純度的槐角異黃酮、槐角黃酮醇和槐角總黃酮，將高純度的槐角異黃酮、槐角黃酮醇或槐角總黃酮制備成藥物制劑，或加入一般的食品、飲料、乳制品中，或加入一般的護膚品中，具有預防或者治療與雌激素缺乏相關(guān)的疾病，具有預防或治療與氧化作用有關(guān)的疾病?？梢灶A防或治療骨質(zhì)疏松癥、女性更年期綜合癥、前列腺增生癥、腫瘤癌癥等，還具有預防或者治療老年癡呆癥、動脈硬化、腦血栓、冠心病、心絞痛、心肌缺血和心血管系統(tǒng)的慢性退化性疾病、抑郁癥、記憶力減退以及皮膚衰老、色斑或雀斑等。
因此，本發(fā)明的目的之一是提供一種高純度的槐角異黃酮提取物、高純度的槐角黃酮醇提取物以及主要含異黃酮和黃酮醇的高純度的槐角總黃酮提取物；本發(fā)明的目的之二是提供一種制備上述提取物的方法；本發(fā)明的目的之三是提供一種含有上述提取物的藥物制劑；本發(fā)明的目的之四是提供一種含有上述提取物的功能性食品；本發(fā)明的目的之五是提供一種含有上述提取物的護膚品；本發(fā)明的目的之六是提供上述提取物的用途。
本發(fā)明的目的通過下述的技術(shù)方案來實現(xiàn)一種槐角異黃酮提取物，主要含具有式(I)結(jié)構(gòu)的異黃酮，以5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-新橙皮糖苷計算，異黃酮占提取物的重量百分比為20％-100％，優(yōu)選為50％-100％，更優(yōu)選為90％-100％； 其中，R1、R2分別選自氫、甲基、葡萄糖和新橙皮糖，R1和R2彼此相同或不同。
優(yōu)選上述槐角異黃酮提取物含有5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-新橙皮糖苷、5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-葡萄糖苷和4′，5-二羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷。
一種槐角黃酮醇提取物，主要含具有式(II)結(jié)構(gòu)的黃酮醇，以4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-槐糖苷計算，黃酮醇占提取物的重量百分比為20％-100％，優(yōu)選為50％-100％，更優(yōu)選為90％-100％； 其中，R1、R2和R3分別選自氫、甲基、葡萄糖、鼠李糖以及由葡萄糖和/或鼠李糖組成的雙糖或三糖，R1、R2和R3彼此相同或不同；R4選自氫、羥基和甲基。
優(yōu)選上述槐角黃酮醇提取物含有4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-槐糖苷、4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-蕓香糖苷和3′，4′，5，7-四羥基-黃酮醇-3-O-蕓香糖苷。
一種槐角總黃酮提取物，主要含具有式(I)結(jié)構(gòu)的異黃酮和具有式(II)結(jié)構(gòu)的黃酮醇，以5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-新橙皮糖苷計算的異黃酮和以4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-槐糖苷計算的黃酮醇相加后得到的總黃酮，占提取物的重量百分比為20％-100％，優(yōu)選為50％-100％，更優(yōu)選為90％-100％；； 其中，R1、R2分別選自氫、甲基、葡萄糖和新橙皮糖，R1和R2彼此相同或不同； 其中，R1、R2和R3分別選自氫、甲基、葡萄糖、鼠李糖以及由葡萄糖和/或鼠李糖組成的雙糖或三糖，R1、R2和R3彼此相同或不同；R4選自氫、羥基和甲基。
優(yōu)選上述槐角總黃酮提取物含有5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-新橙皮糖苷、5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-葡萄糖苷、4′，5-二羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷、4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-槐糖苷、4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-蕓香糖苷和3′，4′，5，7-四羥基-黃酮醇-3-O-蕓香糖苷。
上述的槐角異黃酮提取物、槐角黃酮醇提取物以及槐角總黃酮提取物，通過本領(lǐng)域中常規(guī)的水解方法，例如酸水解、堿水解、酶解或加熱等方法，使黃酮苷發(fā)生水解，得到部分水解的產(chǎn)物或者完全水解成苷元的產(chǎn)物。
上述的槐角異黃酮提取物、槐角黃酮醇提取物以及槐角總黃酮提取物，與可藥用的堿通過常規(guī)的化學反應(yīng)，可以使異黃酮、黃酮醇與堿之間形成鹽的形式。所述的可藥用堿，優(yōu)選為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、醋酸鈉、醋酸鉀等。例如，上述的提取物，在常壓下，與0.01-5N的氫氧化鈉溶液反應(yīng)，可以得到相應(yīng)異黃酮、黃酮醇的鈉鹽衍生物。
上述的槐角異黃酮提取物、槐角黃酮醇提取物以及槐角總黃酮提取物，與金屬離子鹽，例如鋅、鎂、鉻、鐵、鋁、銅、鈣、鈷、鋇、鍶、或鋯等金屬離子鹽之間，經(jīng)常規(guī)反應(yīng)，得到槐角異黃酮或黃酮醇的金屬復合物。所述的金屬復合物除具有槐角異黃酮或黃酮醇的藥效和應(yīng)用外，還具有其它新的用途。例如所述的鐵鹽復合物還具有補鐵功能，所述的鋅鹽復合物還具有補鋅功能，所述的鈣鹽復合物還具有補鈣功能，從而分別可以用于與缺鐵、缺鋅或缺鈣有關(guān)的疾病；又例如，所述的鉻鹽復合物，還有預防、治療或者改善糖尿病等用途。向槐角異黃酮提取物、黃酮醇提取物或者總黃酮提取物的水溶液或者酸性溶液中，加入0.01-5N的上述金屬離子鹽溶液，在適當溫度下攪拌反應(yīng)，便得到槐角異黃酮或黃酮醇的金屬復合物鹽。
本發(fā)明的槐角異黃酮提取物、黃酮醇提取物或者總黃酮提取物，可以通過下述的方法制取得到，該方法包括a.以水溶性溶劑作為提取溶劑提取槐角原料，提取液濃縮至干或者濃縮至適量，得到提取濃縮物，所述的水溶性溶劑選自水、乙醇、甲醇、丙酮中的一種溶劑或兩種以上溶劑組成的混合溶劑；b.上述a得到的提取濃縮物懸浮于體積比為0-50∶100-50的乙醇∶水或甲醇∶水或丙酮∶水溶劑中，放置后，析出固體，過濾，得到固體和濾液，固體干燥后即得到提取物A；c.上述b得到的濾液適量濃縮后，用層析柱進行分離，以體積比為0-100∶100-0的乙醇∶水或者甲醇∶水或者丙酮∶水進行梯度洗脫，分段收集流出液，其中所述的層析柱選自大孔樹脂柱、聚酰胺柱或者葡聚糖凝膠柱；d.將上述c流出液中主含式(I)異黃酮的流出液合并，回收溶劑，濃縮至干，干燥后得到提取物B；e.將上述c流出液中主含式(II)黃酮醇的流出液合并，回收溶劑，濃縮至干，干燥后得到提取物C；或者將上述的d和e合二為一，成為f.將上述c流出液中主含式(I)異黃酮和/或式(II)黃酮醇的流出液合并，回收溶劑，濃縮至干，干燥后得到提取物D；其中，上述所述的提取物A、B即為本發(fā)明所述的槐角異黃酮提取物；所述的提取物C即為本發(fā)明所述的槐角黃酮醇提取物；所述的提取物D或由提取物A和/或B與提取物C形成的混合物即為本發(fā)明所述的槐角總黃酮提取物。
如果需要，將上述所得到的提取物A、B、C、D，再經(jīng)精制過程，便能得到純度更高的提取物，精制方法例如是分別以上述所述的柱層析方法再進行分離純化一次或多次，便可以按照需要得到更高純度的提取物；或者是將上述所得到的提取物A、B、C、D，分別以合適極性的溶劑進行提取，提取液回收盡溶劑，濃縮至干，干燥后，便可以按照需要得到更高純度的提取物。所述合適極性的溶劑選自體積比為75-100∶0-25的甲醇∶水、乙醇∶水、丙酮∶水以及乙酸乙酯、氯仿。
本發(fā)明所用的提取溶劑，當是混合溶劑時，各溶劑之間的比例，可以是本領(lǐng)域中常用的配比，例如30％、60％、70％、90％％(體積)的乙醇水或甲醇水或丙酮水本發(fā)明所述的提取，可以是本領(lǐng)域中常規(guī)的提取方法，如回流提取、超聲提取、滲漉提取、超臨界二氧化碳提取等。
當用水作提取溶劑時，采用適當堿性的堿水提取，例如PH8-10的石灰水或碳酸氫鈉溶液，可以提高黃酮成分的提取率。對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，這是顯而易見的。
本發(fā)明所用的大孔樹脂、聚酰胺樹脂、葡聚糖凝膠樹脂等，分別可以是本領(lǐng)域中常用的樹脂材料。例如大孔樹脂為天津農(nóng)藥廠的D101型大孔樹脂，葡聚糖凝膠樹脂為Sephadex LH-20樹脂等。各種樹脂的預處理和再生處理等，均是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。
所述層析柱分離操作，是本領(lǐng)域中熟練人員所熟知的；所述的梯度洗脫，洗脫劑中醇濃度變化的梯度，是本領(lǐng)域中熟練人員根據(jù)樹脂柱的情況很容易確定的。
分段收集時，可以通過肉眼觀看樹脂柱的色帶情況進行分段收集，也可以進行等體積收集后，通過常規(guī)的鑒定例如薄層板鑒定后，含相同組分的進行合并，也可以通過薄層色譜技術(shù)等常規(guī)的手段進行流出液跟蹤鑒別，含相同組分合并收集等。這是所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。薄層色譜技術(shù)，可以參見“徐任生《天然產(chǎn)物化學》科學出版社出版1997年6月第589頁?！睂Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員來說，這是顯而易見的。
本發(fā)明所述的干燥，可以是本領(lǐng)域中常規(guī)的干燥方法，如常壓干燥、減壓干燥、噴霧干燥或冷凍干燥等。
黃酮類成分的含量測定，現(xiàn)有技術(shù)中有大量文獻報道，因而是所屬領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)很容易進行本發(fā)明提取物中黃酮的含量測定。本發(fā)明提取物中異黃酮、黃酮醇含量測定，可以用本領(lǐng)域中常規(guī)的含量測定方法，例如比色法、紫外分光光度法、薄層掃描法、酸堿滴定法、高效液相色譜法等進行測定，優(yōu)選采用高效液相色譜法進行含量測定。高效液相色譜法測定提取物中異黃酮、黃酮醇含量，其測定方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)很容易進行測定。
這里描述一種高效液相色譜法(HPLC)測定本發(fā)明提取物中黃酮含量的方法，但對本發(fā)明所述的含量沒有任何的限定作用。
島津高效液相色譜儀，SPD-10AV型紫外可見光檢測器，LC-10AD型溶劑輸送泵單元；25微升進樣器；十萬分之一分析天平。
色譜分離條件ODS-C18柱，5um，250mm×4.6mm，柱溫22±2℃，流動相甲醇/水 梯度洗脫進樣量10ul流速1ml/min檢測波長260nm，365nm對照品均為自制，經(jīng)過波譜和高效液相色譜鑒定、純度檢測，符合要求。
將提取物以酸水解后，通過HPLC法測定4′，5，7-三羥基異黃酮量，再換算成5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-新橙皮糖苷量，以計算異黃酮的含量；測定4′，3，5，7-四羥基黃酮醇和3′，4′，3，5，7-五羥基黃酮醇量，再換算成4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-槐糖苷量，以計算黃酮醇的含量；異黃酮的量和黃酮醇的量相加后，得到總黃酮的量；所述黃酮苷元與黃酮苷之間的含量的換算，通過它們的分子量比值進行換算。
本發(fā)明的槐角黃酮提取物，具有雌激素樣活性。特別適用于治療、預防或者改善與雌激素缺乏有關(guān)的疾病。
本發(fā)明的槐角黃酮提取物，還具有很強的抗氧化作用，可以預防、改善或治療與氧化反應(yīng)有關(guān)的疾病。
本發(fā)明的槐角黃酮提取物，在治療、預防或者改善骨質(zhì)疏松癥尤其是絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松癥、女性更年期綜合癥或絕經(jīng)綜合癥(具有潮熱、焦慮、抑郁、盜汗、頭痛或情緒不穩(wěn)定等癥狀)、絕經(jīng)后皮膚感覺異常、月經(jīng)不調(diào)尤其是月經(jīng)前期綜合癥(具有痛經(jīng)、周期性乳腺痛、流質(zhì)潴留等癥狀)、老年癡呆癥、衰老、雷納德(Reynaud)綜合癥、伯格氏病等方面具有特別的作用和效力。
本發(fā)明的槐角黃酮提取物，在治療、預防或者改善腫瘤或癌癥，尤其是乳腺癌、子宮癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、大腸癌、前列腺癌等癌癥方面，具有很好的醫(yī)療效果。
本發(fā)明的槐角黃酮提取物，在治療、預防或者改善心腦血管系統(tǒng)疾病方面，尤其是對高血脂、動脈硬化、高血壓、腦血栓、腦梗塞、冠心病、心肌缺血以及心血管系統(tǒng)的慢性退化性疾病方面，具有良好的預防、改善或治療效果。
本發(fā)明的槐角黃酮提取物，對于皮膚衰老、色斑、雀斑、女性絕經(jīng)后皮膚感覺異常等有很好的預防、改善或治療效果。
本發(fā)明的槐角黃酮提取物，在男性前列腺增生癥、痤瘡或青春痘、脫發(fā)尤其是男性斑禿、遺傳性脫發(fā)、風濕病尤其是類風濕性關(guān)節(jié)炎等方面，具有很理想的治療、預防或者改善效果。
在本發(fā)明中，所述的槐角異黃酮提取物、槐角黃酮醇提取物以及槐角總黃酮提取物，使用的劑量與許多因素有關(guān)，包括應(yīng)用的方式、給藥的方式、病人的疾病情況、病人的個體狀況等有關(guān)系。例如，按功能性食品或飲料方式服用本發(fā)明的槐角黃酮提取物，以達到預防或改善所述疾病的效果，那么日劑量可以小一些，可以長期服用；如果為達到特定醫(yī)療目的而按藥物制劑方式服用，那么日劑量可以大一些，服用的療程可以短一些。本發(fā)明提取物的劑量，可以按所含的黃酮量進行計算，通常，單個病人的日劑量可以是0.5mg-5g；優(yōu)選劑量是0.05g-2g；更優(yōu)選為0.25g-1g。本發(fā)明提取物可以以常規(guī)方式和劑量使用，例如參見Goodman and Gilman，the pharmacological basis of therapeutica，p1299(第7版，1985年)。所用的具體劑量與進行治療的疾病的狀態(tài)、受治療者的狀況、給藥途徑以及其它已知因素有關(guān)。
本發(fā)明的槐角黃酮提取物，毒性十分小。以寇氏改良法靜脈注射本發(fā)明所得的提取物，在50mg-2000mg/Kg范圍的劑量給藥與小鼠時，也未顯示明顯的毒性；小鼠口服給藥LD50＞5g/kg/日，相當于人體用量的5000倍，無毒。用Ames試驗分點試驗法和平皿試驗法研究誘變活性，結(jié)果表明本發(fā)明的槐角黃酮提取物均沒有顯示出誘變活性。
尤其是，本發(fā)明的槐角黃酮提取物對子宮無作用，其作用的靶器官不在子宮，沒有一般的雌激素對子宮所致的毒副作用。
制備用于預防、治療或改善所述的疾病或適應(yīng)癥的藥物制劑，是將本發(fā)明的槐角異黃酮提取物、槐角黃酮醇提取物或槐角總黃酮提取物(為方便起見，下文稱為“有效部位”)，與一種或多種本領(lǐng)域所熟知的可藥用的載體和/或賦形劑混合。
當然，載體必須是藥物可接受的，也就是與制劑中的有效成分之間不發(fā)生化學反應(yīng)，并且對受治療者安全無害。載體或賦形劑可以是固體或液體或者二者都是，并且優(yōu)選制成有效部位為一個劑量單位的制劑，例如，一種片劑，其中可以含有0.5％-60％重量比的有效部位，或高達100％重量比的有效部位。本發(fā)明的藥物制劑，可以使用本領(lǐng)域中所公知的藥物制劑技術(shù)來制備。
本發(fā)明的制劑，包括適于口服、直腸、口腔(例如舌下)、腸胃外(例如皮下、肌內(nèi)、靜脈注射等)和透皮給藥制劑等。在具體用藥中，最合適的給藥途徑與所治療的疾病特性和受治療者狀況等有關(guān)系。
適于口服給藥的藥物制劑，可以制成單個的單位劑量，例如膠囊、片劑、軟膠囊、滴丸劑、口服液、浸膏劑等等，其中每一單位劑量中含有預定劑量的本發(fā)明的槐角有效部位。這些制劑可以用本領(lǐng)域所熟知的合適的制劑技術(shù)進行制備，其中包括將本發(fā)明的有效部位與合適的藥用載體和/或賦形劑混合這一步驟。例如，片劑可以通過將含有本發(fā)明的有效部位的粉末或顆粒壓片或鑄模制備得到，其中所述的粉末或顆粒中含有一種或多種合適的載體或賦形劑，如惰性稀釋劑、粘合劑、潤滑劑和/或表明活性劑(分散劑)等。
適于口腔(舌下)給藥的制劑包括將本發(fā)明的有效部位與合適的惰性基質(zhì)或調(diào)味基質(zhì)混合一起，調(diào)味基質(zhì)通常是蔗糖或阿拉伯膠等，惰性基質(zhì)通常是明膠、甘油或阿拉伯膠等。
本發(fā)明中適于腸胃外給藥的制劑通常包括含有本發(fā)明的有效部位的無菌水針劑、粉針劑、靜脈輸液劑等?？梢酝ㄟ^將本發(fā)明的有效部位與水或甘氨酸緩沖液混合，然后將得到的溶液調(diào)到與血液等滲并且進行滅菌便得到這些制劑。根據(jù)本發(fā)明的注射制劑，通常含有0.1％-80％w/w的有效部位。
適于直腸給藥的制劑優(yōu)選制成單位劑量的栓劑。這些栓劑可以將活性化合物與一種或多種常規(guī)載體，例如椰子油混合，然后定型便得到。
適于透皮給藥制劑優(yōu)選為乳膏、噴霧劑、氣溶膠、軟膏等?？墒褂玫妮d體包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇等，有效部位的含量通常是0.1％-20％w/w，這些制劑還包括皮膚用化妝品乳膏。
適于透皮給藥的制劑也可以通過離子電滲療法釋放活性化合物，可以參見“pharmaceutical research，1986，3(6)318”，并且典型的使用形式是活性化合物任選的緩沖水溶液。合適的制劑中包括檸檬酸鹽緩沖液(PH6)或乙醇/水，并且含有0.05M-1M的有效部位。
本發(fā)明所述的功能性食品，指含有本發(fā)明槐角黃酮提取物(即有效部位)的食品、飲料或乳制品等類似食品，有效部位可以以加入、混合、包衣、結(jié)合或其它途徑加到食品中去，或以溶解、懸浮或混懸于飲料、乳制品中。含有本發(fā)明的槐角黃酮有效部位的食品、飲料或乳制品，能依據(jù)標準方法容易地制備得到。
本發(fā)明的槐角有效部位，具有抗氧化活性，因此也能廣泛地應(yīng)用于護膚品中，例如防止皮膚衰老、色斑、雀斑的護膚乳膏、防曬劑、洗面奶等類似物品當中。這些護膚品能夠依據(jù)標準的方法很容易地制備得到。
另外，本發(fā)明的產(chǎn)物可以與其它物質(zhì)聯(lián)合使用以產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。例如，在治療腫瘤時，本發(fā)明產(chǎn)物可與常規(guī)化療結(jié)合，在取得抑制或殺死腫瘤細胞的同時，又能減輕腫瘤化療劑(如一些蒽環(huán)化合物或金屬鉑化合物等)帶來的氧化損傷，從而具有雙重優(yōu)勢。
又例如，在動脈硬化等其它情形中，本發(fā)明產(chǎn)物與其它抗氧化劑合用，如類胡蘿卜素、特別是番茄紅素和玉米黃素等，以發(fā)揮協(xié)同的抗氧化作用。同樣，在骨質(zhì)疏松、女性更年期綜合癥等方面，本發(fā)明產(chǎn)物可以與其它具有治療或預防骨質(zhì)疏松、女性更年期綜合癥的中藥或西藥聯(lián)合使用，以取得協(xié)同增效的作用。
具體實施例方式
下述實施例將有助于進一步理解本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。
實施例1槐角異黃酮提取物、黃酮醇提取物的制備干燥的槐角細粉2Kg，用6000ml水，加熱保持微沸，提取2小時，紗布過濾，藥渣再以2×4000ml水微沸提取2次，每次1.5小時；合并提取液，濾紙過濾；濾液濃縮至干得到濃縮物，將濃縮物加到3000ml的20％％的乙醇水(V/V)中，攪拌溶解，放置后，析出白色固體，過濾，濾取固體，低溫常壓干燥后，得到提取物A-1；濾液蒸去乙醇后，濃縮至適量，加入到已處理好的D101大孔樹脂柱，用不同濃度的乙醇水梯度洗脫，流速為約10-15ml/min。先用去離子水約5升洗脫，再以濃度為10％的乙醇約4升洗脫，再以濃度為30％的乙醇洗脫，直至條帶狀色帶I被完全洗脫出來，用去30％的乙醇約2升；再以濃度為50％％的乙醇約5升洗脫；再以濃度為70％的乙醇洗脫，直至條帶狀色帶II被完全洗脫出來，用去70％的乙醇約2升。再以濃度為95％的乙醇洗脫再生樹脂柱。
合并色帶I的流分，減壓回收乙醇，濃縮至干，得到提取物B-1；合并色帶II的流分，減壓回收乙醇，濃縮至干，得到提取物C-1；成分分析硅膠GF254薄層板薄層層析；展開劑為氯仿/甲醇(4∶1)，含少量醋酸；顯色劑為2％三氯化鋁乙醇溶液；365nm紫外光下觀察熒光。含量測定采用上述的HPLC法。
結(jié)果提取物A-1含有5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-新橙皮糖苷，5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-葡萄糖苷，4′，5-二羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷，5-羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷-4′-O-新橙皮糖苷，5-羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷-4′-O-葡萄糖苷；異黃酮占提取物的重量百分比為82.35％。
提取物B-1含有5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-新橙皮糖苷，5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-葡萄糖苷，4′，5-二羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷，5-羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷-4′-O-新橙皮糖苷，5-羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷-4′-O-葡萄糖苷，4′-甲氧基-5-羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷，4′，5，7-三羥基異黃酮；異黃酮占提取物的重量百分比為58.23％。
提取物C-1含有4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-槐糖苷，4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-蕓香糖苷，3′，4′，5，7-四羥基-黃酮醇-3-O-蕓香糖苷，4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-[α-L-鼠李糖基(1→6)-O-β-D-葡萄糖基(1→2)-O-β-D-葡萄糖苷]，4′，3，5-三羥基-黃酮醇-7-O-鼠李糖苷，4′，3，5，7-四羥基黃酮醇，3′，4′，3，5，7-五羥基黃酮醇；黃酮醇占提取物的重量百分比為53.05％。
實施例2槐角異黃酮提取物的制備取10g實施例1所得到的提取物A-1，加100ml的95％乙醇，加熱回流40min，趁熱過濾，濾液回收乙醇后濃縮至干，殘余物低溫干燥后，得到提取物A-1a。
提取物A-1a經(jīng)薄層層析成分分析，含有5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-新橙皮糖苷，5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-葡萄糖苷，4′，5-二羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷，5-羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷-4′-O-新橙皮糖苷，5-羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷-4′-O-葡萄糖苷；HPLC法含量測定結(jié)果，異黃酮占提取物的重量百分比為93.77％。
實施例3槐角異黃酮提取物的制備取20g實施例1所得到的提取物B-1，加適量的水溶解后，加入到已處理好的D101大孔樹脂柱，用不同濃度的乙醇水梯度洗脫，流速為約5-8ml/min。先以濃度為10％的乙醇約0.7升洗脫，再以濃度為60％的乙醇洗脫，直至條帶狀色帶被完全洗脫出來，用去60％的乙醇約0.5升；再以濃度為95％的乙醇洗脫再生樹脂柱。
合并主含異黃酮的色帶流出液，減壓回收乙醇，濃縮至干，得到提取物B-1a。
提取物B-1a經(jīng)薄層層析成分分析，含有5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-新橙皮糖苷，5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-葡萄糖苷，4′，5-二羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷，5-羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷-4′-O-新橙皮糖苷，5-羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷-4′-O-葡萄糖苷，4′-甲氧基-5-羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷，4′，5，7-三羥基異黃酮；HPLC法含量測定結(jié)果顯示，提取物B-1a所含異黃酮占提取物重量百分比為77.46％。
實施例4槐角異黃酮提取物的制備取10g實施例1所得到的提取物B-1，加100ml的95％乙醇，加熱回流60min，趁熱過濾，濾液回收乙醇后濃縮至干，殘余物低溫干燥后，得到提取物B-1b。
提取物B-1b經(jīng)薄層層析成分分析，含有5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-新橙皮糖苷，5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-葡萄糖苷，4′，5-二羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷，5-羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷-4′-O-新橙皮糖苷，5-羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷-4′-O-葡萄糖苷，4′-甲氧基-5-羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷，4′，5，7-三羥基異黃酮；HPLC法含量測定結(jié)果，異黃酮占提取物的重量百分比為69.77％。
實施例5槐角黃酮醇提取物的制備取20g實施例1所得到的提取物C-1，加適量的水溶解后，加入到已處理好的D101大孔樹脂柱，用不同濃度的乙醇水梯度洗脫，流速為約5-8ml/min。先以濃度約10％的乙醇約1升洗脫，再以濃度約75％的乙醇洗脫，直至條帶狀色帶被完全洗脫出來，用去75％的乙醇約0.5升；再以濃度為95％的乙醇洗脫再生樹脂柱。
合并主含異黃酮的色帶流出液，減壓回收乙醇，濃縮至干，得到提取物C-1a。
提取物C-1a經(jīng)薄層層析成分分析，含有4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-槐糖苷，4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-蕓香糖苷，3′，4′，5，7-四羥基-黃酮醇-3-O-蕓香糖苷，4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-[α-L-鼠李糖基(1→6)-O-β-D-葡萄糖基(1→2)-O-β-D-葡萄糖苷]，4′，3，5-三羥基-黃酮醇-7-O-鼠李糖苷，4′，3，5，7-四羥基黃酮醇，3′，4′，3，5，7-五羥基黃酮醇；HPLC法含量測定結(jié)果顯示，提取物C-1a所含黃酮醇占提取物重量百分比為80.46％。
實施例6槐角黃酮醇提取物的制備取10g實施例1所得到的提取物C-1，加100ml的95％乙醇，加熱回流30min，趁熱過濾，濾液回收乙醇后濃縮至干，殘余物低溫干燥后，得到提取物C-1b。
提取物C-1b經(jīng)薄層層析成分分析，含有4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-槐糖苷，4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-蕓香糖苷，3′，4′，5，7-四羥基-黃酮醇-3-O-蕓香糖苷，4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-[α-L-鼠李糖基(1→6)-O-β-D-葡萄糖基(1→2)-O-β-D-葡萄糖苷]，4′，3，5-三羥基-黃酮醇-7-O-鼠李糖苷，4′，3，5，7-四羥基黃酮醇，3′，4′，3，5，7-五羥基黃酮醇；HPLC法含量測定結(jié)果，黃酮醇占提取物的重量百分比為66.13％。
實施例7槐角異黃酮提取物、黃酮醇提取物的制備干燥的槐角細粉1Kg，用3000ml濃度為60％的乙醇，加熱回流提取1.5小時，紗布過濾，藥渣再以2×150％0ml濃度為60％乙醇加熱回流提取2次，每次1小時；合并提取液，濾紙過濾；濾液減壓回收乙醇后濃縮至干，得到濃縮物；將濃縮物加到1000ml的30％的丙酮水(V/V)中，攪拌溶解，放置后，析出白色固體，過濾，濾取固體，低溫常壓干燥后，得到提取物A-2；濾液回收丙酮后，濃縮至干，得到濃縮物。取濃縮物20％g，加適量甲醇溶解后，拌入聚酰胺粉后，減壓抽干，磨細，加入到已處理好的聚酰胺柱上，用不同濃度的乙醇水梯度洗脫，流速為約8-10ml/min。先用去離子水約1000ml洗脫，再以濃度約10％的乙醇約800ml洗脫，再以濃度約40％的乙醇洗脫，直至條帶狀色帶I被完全洗脫出來，用去40％的乙醇約1000ml；再以濃度約70％的乙醇洗脫，直至條帶狀色帶II被完全洗脫出來，用去60％的乙醇約150％0ml。再以濃度為95％乙醇、5％氫氧化鈉、去離子水洗脫聚酰胺柱，以再生聚酰胺柱。
合并色帶I的流分，減壓回收乙醇，濃縮至干，得到提取物B-2；
合并色帶II的流分，減壓回收乙醇，濃縮至干，得到提取物C-2；成分分析硅膠GF254薄層板薄層層析；展開劑為氯仿/甲醇(4∶1)，含少量醋酸；顯色劑為2％三氯化鋁乙醇溶液；365nm紫外光下觀察熒光。含量測定采用上述的HPLC法。
結(jié)果提取物A-2含有5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-新橙皮糖苷，5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-葡萄糖苷，4′，5-二羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷，5-羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷-4′-O-葡萄糖苷；異黃酮占提取物的重量百分比為91.07％。
提取物B-2含有5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-新橙皮糖苷，5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-葡萄糖苷，4′，5-二羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷，5-羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷-4′-O-新橙皮糖苷，5-羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷-4′-O-葡萄糖苷，5-羥基-異黃酮-7-O-鼠李糖苷-4′-O-槐糖苷，4′-甲氧基-5-羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷；異黃酮占提取物的重量百分比為67.43％。
提取物C-2含有4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-槐糖苷，4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-蕓香糖苷，3′，4′，5，7-四羥基-黃酮醇-3-O-蕓香糖苷，4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-[α-L-鼠李糖基(1→6)-O-β-D-葡萄糖基(1→2)-O-β-D-葡萄糖苷]，4′，5-二羥基-黃酮醇-3-O-葡萄糖苷-7-O-葡萄糖苷，4′，3，5-三羥基-黃酮醇-7-O-鼠李糖苷，4′，3，5，7-四羥基黃酮醇，3′，4′，3，5，7-五羥基黃酮醇；黃酮醇占提取物的重量百分比為62.72％。
實施例8槐角異黃酮提取物的制備取0.5g實施例7所得到的提取物B-2，加150ml的乙酸乙酯，加熱回流90min，放冷后過濾，濾液回收盡乙酸乙酯后濃縮至干，殘余物低溫干燥后，得到提取物B-2a。
提取物B-2a經(jīng)薄層層析成分分析，含有5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-新橙皮糖苷，5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-葡萄糖苷，4′，5-二羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷，5-羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷-4′-O-新橙皮糖苷，5-羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷-4′-O-葡萄糖苷，5-羥基-異黃酮-7-O-鼠李糖苷-4′-O-槐糖苷，4′-甲氧基-5-羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷；HPLC法含量測定結(jié)果，提取物B-2a中異黃酮占提取物的重量百分比為90.21％。
實施例9槐角總黃酮提取物的制備取實施例7的濃縮物40g，加適量甲醇溶解后，拌入大孔樹脂，減壓抽干溶劑，加入到已處理好的D101大孔樹脂柱上，用不同濃度的乙醇水梯度洗脫，流速約5-8ml/min。先以濃度約10％的乙醇洗脫至流出液色很淡為止，用去10％乙醇約為1升，再以濃度約50％-75％的乙醇洗脫，直至流出液色很淡為止，再以濃度為95％的乙醇洗脫再生樹脂柱。合并含黃酮的流出液，共計為1.5升，減壓回收乙醇后濃縮至干，殘余物低溫干燥后，得到提取物D-1。
提取物D-1分別以氯仿、乙酸乙酯和正丁醇分段后，各段分別進行薄層層析成分分析，結(jié)果表明提取物D-1含有5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-新橙皮糖苷，5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-葡萄糖苷，4′，5-二羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷，5-羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷-4′-O-新橙皮糖苷，5-羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷-4′-O-葡萄糖苷，5-羥基-異黃酮-7-O-鼠李糖苷-4′-O-槐糖苷，5-羥基-異黃酮-7-O-鼠李糖苷-4′-O-新橙皮糖苷，4′-甲氧基-5-羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷，4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-槐糖苷，4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-蕓香糖苷，3′，4′，5，7-四羥基-黃酮醇-3-O-蕓香糖苷，4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-[α-L-鼠李糖基(1→6)-O-β-D-葡萄糖基(1→2)-O-β-D-葡萄糖苷]，4′，5-二羥基-黃酮醇-3-O-葡萄糖苷-7-O-葡萄糖苷，4′，3，5-三羥基-黃酮醇-7-O-鼠李糖苷，4′，5，7-三羥基異黃酮，4′，3，5，7-四羥基黃酮醇，3′，4′，3，5，7-五羥基黃酮醇；HPLC法含量測定結(jié)果，提取物D-1中含有的總黃酮占提取物的重量百分比為59.51％。
取0.5g的提取物D-1，按實施例8方法，以丙酮作溶劑回流提取，最后得到提取物D-1a。經(jīng)HPLC法含量測定，提取物D-1a中總黃酮含量為74.34％。
實施例10制備藥物制劑1.含有槐角異黃酮提取物的明膠膠囊將含異黃酮3g的槐角異黃酮提取物(提取物B-2)與8g微晶纖維素、0.3g硅膠、0.8g羧甲基纖維素鈉和0.1g硬脂酸鎂混合。形成的混合物裝入100粒硬膠囊中。
2.含有槐角總黃酮提取物的包衣片劑將含總黃酮4g的槐角總黃酮提取物(提取物A-2和提取物C-2按1∶1比例混合均勻)與5g微晶纖維素、3.3g二價磷酸鈣、0.3g硅膠、1.2g羧甲基纖維素鈉和0.2g硬脂酸鎂進行混合，將此混合粉末壓100片；形成的藥片用含0.45g羥丙基甲基纖維素、0.09g聚乙二醇、0.2g二氧化肽和0.1g滑石粉進行包衣，得到包衣片。
實施例11制備含槐角黃酮提取物的功能性食品1.制備含槐角總黃酮提取物的食品將足量的槐角總黃酮提取物(提取物D-1)加入到小麥粉中，制得每100g含總黃酮約5g的小麥粉混合物。采用該小麥粉混合物制備面包、蛋糕、曲奇餅干、薄脆餅干、面條、方便面等，從而獲得含槐角活性成分的功能性食品。
2.制備含槐角異黃酮提取物的奶制品將足量的槐角異黃酮提取物(提取物B-1b)加入到牛奶中，制得每100g牛奶中含異黃酮約2-5g的混合奶，然后由其制備各種奶制品，如酸奶、冰琪琳、奶酪等。
3.制備含槐角總黃酮提取物的飲料將足量的槐角總黃酮提取物(提取物D-1)加入到蔬菜汁、果汁或碳酸飲料中，獲得每100ml飲料中包含0.1-10g的總黃酮，從而得到含槐角活性成分的功能性食品。
實施例12制備含槐角黃酮提取物的護膚品化妝用的乳劑將足量的含總黃酮5g的槐角總黃酮提取物(提取物D-1a)，與1g硬脂酸、2g鯨蠟醇、1g的PEG-20失水山梨糖醇單硬脂酸酯、1g失水山梨糖醇單硬脂酸酯、10g礦物油、5g三辛酸酯、0.5g三乙醇胺、5g甘油、3g丙二醇、適量防腐劑、適量香料和余量純水，混合，制成100g的防止皮膚老化、面部色斑或雀斑的乳劑。
實施例13抗腫瘤活性試驗試驗原理活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結(jié)晶物并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫儀在490nm波長處測定其吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。該方法可以參見鄂征主編的《組織培養(yǎng)和分子細胞學技術(shù)》，北京出版社；韓銳主編的《抗癌藥物研究與試驗技術(shù)》，北京醫(yī)科大學和中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社。
儀器超凈工作臺；酶聯(lián)免疫檢測儀；倒置生物顯微鏡；平板搖床；恒溫CO2培養(yǎng)箱。
試劑RPMI1640(GIBCO)；胰蛋白酶(SIGMA)；小牛血清(HYCLONE)；MTT(SIGMA)；DMSO(SIGMA)。
細胞株人低分化的胃腺癌細胞(BGC)，培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中，含10％小牛血清，37攝氏度，5％CO2。
受試藥物槐角異黃酮提取物(提取物A-1a)；槐角黃酮醇提取物(提取物C-1a)；槐角總黃酮提取物(提取物D-1a)；槐角異黃酮提取物的酸水解產(chǎn)物(水解產(chǎn)物)；5-氟尿嘧啶(5-FU，陽性對照藥)。
方法1.取處于指數(shù)生長期狀態(tài)良好的細胞一瓶，加入0.25％胰蛋白酶消化液，消化液使脫壁細胞脫落，制成細胞懸液；2.細胞計數(shù)，并將細胞密度稀釋至5×104個/ml。
3.取細胞懸液接種于96孔板上，180ul/孔，置恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。
4.將受試藥物配制好。
5.換液，加入受試藥物，20ul/孔，培養(yǎng)48小時。
6.將MTT加入96孔板中，20ul/孔，培養(yǎng)箱中反應(yīng)4小時。
7.吸去上清液，加入DMSO，150ul/孔，平板搖床上振搖5min。
8.用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長為490nm處測定每孔的吸光度，并計算細胞抑制率。
結(jié)果見表1。
表1 細胞抑制率(BGC)受試藥物濃度細胞抑制率％結(jié)果(ug/ml)均值 SD1 29.91 0.03提取物A-1a 10 41.98 0.03+100 69.88 0.021 30.53 0.03提取物C-1a 10 36.32 0.04+100 61.43 0.031 24.15 0.03提取物D-1a 10 39.33 0.02+100 64.72 0.021 37.14 0.05水解產(chǎn)物10 40.25 0.03+100 67.33 0.021 34.26 0.110 69.38 0.05++5-氟尿嘧啶 100 84.76 0.06試驗結(jié)果表明了本發(fā)明的槐角黃酮提取物，具有抗腫瘤的作用。
實施例14防治骨質(zhì)疏松癥的作用6月齡雌性Wistar大鼠，分為4組模型組(手術(shù)切除雙測卵巢)，假手術(shù)組(行假手術(shù))，模型加槐角黃酮提取物(提取物A-1)的槐角黃酮組，模型加尼爾雌醇片的尼爾雌醇組(陽性對照組)。
1.股骨骨密度的影響結(jié)果表明，模型組的骨密度明顯降低，與假手術(shù)組相比有極顯著差異(p＜0.001)；槐角黃酮組和尼爾雌醇組均比模型組骨密度明顯增加，差異明顯(p＜0.05)；槐角黃酮組和尼爾雌醇組之間差異不明顯，但槐角黃酮組骨密度增加值普遍略高于尼爾雌醇組骨密度增加值。
2. 血清骨鈣素含量的變化結(jié)果表明，模型組血清骨鈣素含量高于假手術(shù)組，與假手術(shù)組相比有極顯著差異(p＜0.001)；槐角黃酮組和尼爾雌醇組均比模型組血清骨鈣素顯著降低，差異顯著(p＜0.01)；槐角黃酮組的血清骨鈣素含量較尼爾雌醇組明顯低，之間差異明顯(p＜0.05)。
3.生物力學試驗試驗結(jié)果股骨三點折彎試驗，槐角黃酮組的彈性形變數(shù)值、最大載負荷數(shù)值和最大形變數(shù)值比尼爾雌醇組和假手術(shù)組的數(shù)值略高，這些數(shù)值均明顯高于模型組，并且差異明顯(p＜0.05)；斷裂形變，槐角黃酮組、尼爾雌醇組和假手術(shù)組的斷裂形變數(shù)值，均顯著高于模型組，并且差異顯著(p＜0.01)；槐角黃酮組的斷裂形變數(shù)值明顯高于尼爾雌醇組和假手術(shù)組，并且差異明顯(p＜0.05)；韌性，槐角黃酮組、尼爾雌醇組和假手術(shù)組的韌性均顯著高于模型組，并且差異顯著(p＜0.01)；槐角黃酮組的韌性明顯高于尼爾雌醇組和假手術(shù)組，并且差異明顯(p＜0.05)；最大應(yīng)力，槐角黃酮組、尼爾雌醇組和假手術(shù)組之間相當，它們與模型組相比有顯著差異(p＜0.05)；彈性應(yīng)力，槐角黃酮組和假手術(shù)組之間相當，同模型組相比有顯著差異(p＜0.01)，同尼爾雌醇組相比有明顯差異(p＜0.05)腰椎抗壓試驗槐角黃酮組、尼爾雌醇組和假手術(shù)組之間相當，同模型組相比有顯著差異(p＜0.01)。
上述防治骨質(zhì)疏松癥試驗表明本發(fā)明的槐角黃酮提取物對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松有明顯預防和治療作用，能夠顯著改善去卵巢大鼠密質(zhì)骨和松質(zhì)骨的生物力學性能。
實施例15子宮影響試驗未發(fā)育的雌性Wistar大鼠(3周齡)，用本發(fā)明槐角黃酮提取物(提取物D-1a)經(jīng)口腔灌胃給藥一周，每日1次。結(jié)果，用藥前后大鼠子宮的濕重和干重均沒有明顯變化，病理觀察也未見子宮形態(tài)向發(fā)育成熟改變。
試驗說明，本發(fā)明的槐角黃酮提取物對子宮無作用，其作用的靶器官不在子宮。這為槐角黃酮類化合物沒有一般的雌激素對子宮等副作用提供試驗依據(jù)。
實施例16對前列腺增生治療試驗大鼠前列腺增生模型制備摘除雙測睪丸的SD雄性大白鼠，用精制麻油稀釋丙酸睪丸素肌肉注射，連續(xù)給藥一個月，使大鼠前列腺增生。
試驗方法雄性SD大白鼠，分為4組模型組(手術(shù)摘除雙側(cè)睪丸)，假手術(shù)組(行假手術(shù))，模型加槐角黃酮提取物(提取物D-1a)的槐角黃酮組，模型加雌二醇的雌二醇組(陽性對照組)。模型組、槐角黃酮組和雌二醇組，每日注射丙酸睪丸素，同時槐角黃酮組和雌二醇組分別灌胃給本發(fā)明提取物和雌二醇。
試驗結(jié)果1.模型組與假手術(shù)組相比，前列腺的體積和重量均明顯增加，差異極顯著(p＜0.001)；雌二醇組與模型組相比，前列腺的體積和重量均明顯小，差異極顯著(p＜0.001)。這說明大鼠前列腺增生模型制造合理，陽性對照藥選自也正確。
2.槐角黃酮組大鼠前列腺的體積和重量明顯較模型組減輕，且隨劑量的增加減輕越多，顯示出一定的劑量關(guān)系；槐角黃酮組與雌二醇組相比，效果接近，差異不明顯。
上述試驗結(jié)果表明，本發(fā)明的產(chǎn)物對前列腺增生具有一定的預防和治療作用。
實施例17槐角黃酮提取物降血脂試驗高血脂大鼠模型制造方法大鼠給飼高脂膳食(2％膽固醇)，連續(xù)灌服20％天，使血脂水平升高。
將正常血脂水平的SD大鼠，分為4組模型組(灌服高脂膳食)，模型加槐角黃酮提取物(提取物D-1a)的槐角黃酮組，模型加脂必妥的脂必妥組(陽性對照組)，空白對照組(正常飲食飼料)。大鼠眼眶取血測大鼠血清膽固醇、血清甘油三酯、血清高密度脂蛋白和血清低密度脂蛋白的數(shù)值。
試驗結(jié)果1.模型組的血清膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平明顯高于空白對照組(p＜0.01)，血清高密度脂蛋白值明顯低于空白對照組(p＜0.01)。上述結(jié)果表明大鼠高脂血癥模型制造成功。
2.與模型組相比，槐角黃酮組和陽性對照組的血清膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平顯著降低(p＜0.01)，血清高密度脂蛋白水平顯著升高(p＜0.01)；槐角黃酮組與陽性對照組相比，降脂效果接近，但槐角黃酮組稍次于陽性對照組，二者差別無統(tǒng)計學意義。
上述試驗表明，本發(fā)明產(chǎn)物對高脂血癥具有肯定的降血脂作用，從而可以預防或治療高血脂癥。
實施例18槐角黃酮提取物抗氧化作用研究試驗試劑NO、SOD、LPO和NOS測試盒以及蛋白定量(雙縮脲法)測試盒；D-半乳糖等。
3-4月齡的健康昆明種雌性小鼠，分為4組模型組(皮下注射D-半乳糖)，模型加槐角黃酮提取物(提取物D-1a)的槐角黃酮組，模型加維生素E的維E組(陽性對照組)，對照組。對照組給生理鹽水。連續(xù)用藥30天后，取腦稱重量，用生理鹽水制成腦勻漿，取上清夜測定各項指標。
結(jié)果見表2。
表2抗氧化試驗組別 SOD(NU/ml)LPO(umol/L)NO(umol/L)NOS(U/ml)對照組 2.15±0.2323.15±4.010.64±0.030.95±0.03模型組 0.98±0.2431.14±4.230.45±0.050.65±0.04槐角黃酮組3.15±0.4020％.28±3.98 0.75±0.091.02±0.05陽性對照組2.64±0.5121.05±4.270.69±0.070.93±0.03上述試驗表明1.模型組的SOD活性、NO量和NOS活性顯著低于對照組(p＜0.01)，而LPO量顯著高于對照組(p＜0.01)。這說明D-半乳糖制造小鼠衰老模型成功。
2.槐角黃酮組、陽性對照組的SOD活性、NO量和NOS活性顯著高于模型組(p＜0.01)，而LPO量顯著低于模型組(p＜0.01)，試驗表明本發(fā)明的槐角黃酮提取物具有抗氧化作用。
3.槐角黃酮組的SOD活性、NO量和NOS活性明顯高于維E陽性對照組(p＜0.05)，而LPO量明顯低于維E陽性對照組(p＜0.05)，試驗表明了本發(fā)明的槐角黃酮提取物抗氧化作用明顯強與維生素E。
上述抗氧化試驗結(jié)果表明，本發(fā)明的槐角黃酮提取物具有很好的抗氧化作用，可以治療與氧化有關(guān)的疾病，例如本發(fā)明的產(chǎn)物可以延緩衰老、預防和治療老年癡呆癥、防治皮膚衰老、面包色斑或雀斑等，并且作用明顯強于目前市場上常用的抗氧化劑維生素E。
臨床實施例1槐角黃酮提取物治療女性絕經(jīng)后更年期綜合癥效果選擇年齡45-65歲、絕經(jīng)1年以上、有不同程度的潮熱出汗、頭暈失眠、煩躁易怒、心悸頭痛、抑郁、乏力、陰道干澀或性交困難、腰背或關(guān)節(jié)酸痛、皮膚感覺異常等癥狀者30例。每日服用含本發(fā)明產(chǎn)物(提取物D-1a)的膠囊，并停止服用其它雌激素類或與治療上述癥狀有關(guān)的藥物或保健品；10天為1療程。服用3-4療程后，有22例上述癥狀得到明顯改善，其中18例臨床癥狀基本消失；有3例臨床癥狀有所緩解；其余5例效果不明顯。所有的30例服用者，服用本發(fā)明產(chǎn)物，未觀察到任何的臨床毒、副作用。
試驗表明了，本發(fā)明的槐角黃酮提取物，有非常理想的預防、改善或治療婦女絕經(jīng)后更年期綜合癥的作用，不僅效果好，更重要的優(yōu)點，是本發(fā)明的槐角黃酮提取物沒有一般雌激素的毒副作用，長期服用，也不會有增加乳腺、子宮內(nèi)膜等方面疾病發(fā)病率的危險。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯然能夠認識到，在上述實施方案中，允許作出常規(guī)的改變，因此，本發(fā)明不僅包括申請文件中提到的技術(shù)特征，還包括所有不超出本發(fā)明宗旨和保護范圍的變化或改變。
權(quán)利要求
1.一種槐角異黃酮提取物，主要含具有式(I)結(jié)構(gòu)的異黃酮，以5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-新橙皮糖苷計算，異黃酮占提取物重量百分含量為50％-100％， 其中，R1、R2分別選自氫、甲基、葡萄糖和新橙皮糖，R1和R2彼此相同或者不同。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的槐角異黃酮提取物，其特征在于異黃酮占提取物的重量百分含量為90％-100％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的槐角異黃酮提取物，其特征在于含有5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-新橙皮糖苷、5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-葡萄糖苷、4′，5-二羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷。
4.一種槐角黃酮醇提取物，主要含具有式(II)結(jié)構(gòu)的黃酮醇，以4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-槐糖苷計算，黃酮醇占提取物的重量百分含量為50％-100％， 其中，R1、R2和R3分別選自氫、甲基、葡萄糖、鼠李糖、由葡萄糖和/或鼠李糖組成的雙糖或三糖，R1、R2和R3彼此相同或不同；R4選自氫、羥基和甲基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的槐角黃酮醇提取物，其特征在于黃酮醇占提取物的重量百分含量為90％-100％。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的槐角黃酮醇提取物，其特征在于含有4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-槐糖苷、4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-蕓香糖苷、3′，4′，5，7-四羥基-黃酮醇-3-O-蕓香糖苷。
7.一種槐角總黃酮提取物，主要含具有式(I)結(jié)構(gòu)的異黃酮和具有式(II)結(jié)構(gòu)的黃酮醇，以5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-新橙皮糖苷計算的異黃酮和以4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-槐糖苷計算的黃酮醇相加后得到總黃酮，所述的總黃酮占提取物的重量百分比為20％-100％， 其中，R1、R2分別選自氫、甲基、葡萄糖和新橙皮糖，R1和R2彼此相同或者不同。 其中，R1、R2和R3分別選自氫、甲基、葡萄糖、鼠李糖、由葡萄糖和/或鼠李糖組成的雙糖或三糖，R1、R2和R3彼此相同或不同；R4選自氫、羥基和甲基。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的槐角總黃酮提取物，其特征在于總黃酮占提取物的重量百分含量為50％-100％。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的槐角總黃酮提取物，其特征在于總黃酮占提取物的重量百分含量為90％-100％。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任意一項所述的槐角總黃酮提取物，其特征在于含有5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-新橙皮糖苷、5，7-二羥基-異黃酮-4′-O-葡萄糖苷、4′，5-二羥基-異黃酮-7-O-葡萄糖苷、4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-槐糖苷、4′，5，7-三羥基-黃酮醇-3-O-蕓香糖苷、3′，4′，5，7-四羥基-黃酮醇-3-O-蕓香糖苷。
11.權(quán)利要求1-10任意一項所述的提取物，其中的黃酮苷經(jīng)水解反應(yīng)過程形成水解后的產(chǎn)物，所述的水解反應(yīng)選自酸催化水解反應(yīng)、堿催化水解反應(yīng)、和酶催化水解反應(yīng)。
12.權(quán)利要求1-11任意一項所述的提取物，其中的黃酮類化合物與金屬離子形成了黃酮金屬鹽復合物，所述的金屬離子選自鈉、鉀、鋅、鎂、鉻、鐵、鋁、銅、鈣、鈷、鋇、鍶、硒和鋯中的一種或數(shù)種金屬離子。
13.權(quán)利要求1-10任意一項所述的提取物的制備方法，該方法包括a.以水溶性溶劑作為提取溶劑提取槐角原料，提取液濃縮至干或者濃縮至適量，得到提取濃縮物，所述的水溶性溶劑選自水、乙醇、甲醇、丙酮中的一種溶劑或兩種以上溶劑組成的混合溶劑；b.上述a得到的提取濃縮物懸浮于體積比為0-50∶100-50的乙醇∶水或甲醇∶水或丙酮∶水溶劑中，放置后，析出固體，過濾，得到固體和濾液，固體干燥后即得到提取物A；c.上述b得到的濾液適量濃縮后，用層析柱進行分離，以體積比為0-100∶100-0的乙醇∶水或者甲醇∶水或者丙酮∶水進行梯度洗脫，分段收集流出液，其中所述的層析柱選自大孔樹脂柱、聚酰胺柱或者葡聚糖凝膠柱；d.將上述c流出液中主含式(I)異黃酮的流出液合并，回收溶劑，濃縮至干，干燥后得到提取物B；e.將上述c流出液中主含式(II)黃酮醇的流出液合并，回收溶劑，濃縮至干，干燥后得到提取物C；或者將上述的d和e合二為一，成為f.將上述c流出液中主含式(I)異黃酮和/或式(II)黃酮醇的流出液合并，回收溶劑，濃縮至干，干燥后得到提取物D；其中，上述所述的提取物A、B即為權(quán)利要求1-3任意一項所述的槐角異黃酮提取物；所述的提取物C即為權(quán)利要求4-6任意一項所述的槐角黃酮醇提取物；所述的提取物D或由提取物A和/或B與提取物C形成的混合物即為權(quán)利要求7-10任意一項所述的槐角總黃酮提取物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中得到的提取物A、B、C或D再經(jīng)精制過程，便能得到純度更高的提取物，所述的精制過程為按同樣的柱層析方法再純化一次或多次，或者為將提取物A、B、C或D以合適極性的溶劑進行提取，提取液回收盡溶劑，濃縮、干燥后即得到純度更高的提取物，所述合適極性的溶劑選自體積比為75-100∶25-0的甲醇∶水、乙醇∶水、丙酮∶水以及乙酸乙酯、氯仿。
15.一種藥物制劑、功能性食品或護膚品，其特征在于含有權(quán)利要求1-12任意一項所述的提取物。
16.權(quán)利要求1-12任意一項所述的提取物在制備用于預防、改善或者治療與雌激素缺乏相關(guān)病癥的或者具有抗氧化作用的藥物制劑、功能性食品或者護膚品中的應(yīng)用。
17.權(quán)利要求1-12任意一項所述的提取物在制備用于預防、改善或者治療骨質(zhì)疏松癥、女性更年期綜合癥、女性月經(jīng)不調(diào)、老年癡呆癥、衰老、腫瘤癌癥、男性前列腺增生癥、高血脂癥、高血壓癥、動脈硬化、腦血栓或冠心病的藥物制劑或功能性食品中的應(yīng)用。
18.權(quán)利要求1-12任意一項所述的提取物在制備用于預防、改善或者治療皮膚老化、面部色斑雀斑或女性絕經(jīng)后皮膚綜合癥的藥物制劑、功能性食品或者護膚品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及高純度的槐角黃酮有效部位，即槐角的異黃酮提取物、黃酮醇提取物和總黃酮提取物，還涉及有效部位的工業(yè)化生產(chǎn)方法及其在藥品、功能性食品或護膚品中的應(yīng)用，本發(fā)明的槐角黃酮有效部位用于預防或治療骨質(zhì)疏松癥、女性更年期綜合癥、老年癡呆癥、腫瘤癌癥、高血脂癥、高血壓癥、冠心病、腦血栓等病癥，還用于抗衰老和防止皮膚老化、面部色斑或雀斑等。
文檔編號A61P13/08GK1490321SQ0315628
公開日2004年4月21日 申請日期2003年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月3日
發(fā)明者魏先華, 劉習艮, 牛性來, 左從翠 申請人:魏先華