專利名稱：重組人內(nèi)抑素的高效表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及利用乳糖做為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)重組人內(nèi)抑素在大腸桿菌工程菌株中高效表達(dá)生產(chǎn)重組人內(nèi)抑素的方法，其中該工程菌株含有如SEQ ID No 3以及圖3所示的核苷酸序列；以及上述基因工程方法所生產(chǎn)的重組人內(nèi)抑素及其在制備用于抗新血管形成，特別是抗腫瘤的藥物中的用途；此外，本發(fā)明還涉及SEQ ID No 3以及圖3所示的核苷酸序列在構(gòu)建高效表達(dá)重組人內(nèi)抑素的大腸桿菌工程菌株中用途；以及乳糖誘導(dǎo)法在誘導(dǎo)重組人內(nèi)抑素的高效表達(dá)中的用途。
背景技術(shù)：
內(nèi)抑素是生物體內(nèi)膠原18自然降解后C末端183個(gè)氨基酸多肽產(chǎn)物，可在生物體液內(nèi)如血液、尿液中檢出。分子量20-24kDa大小。1997年O’Reilly[1]等首先報(bào)導(dǎo)發(fā)現(xiàn)這一分子，并指出這一分子因具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，故具有抗新生血管形成功能，也具有明顯抑制小鼠移植腫瘤生長(zhǎng)的作用。在Boehm[2]等的研究中發(fā)現(xiàn)，反復(fù)應(yīng)用純化后的內(nèi)抑素分子，不但明顯抑制小鼠移植腫瘤的生長(zhǎng)，而且無毒副作用，也不產(chǎn)生小鼠的耐藥性，這無疑是一治療腫瘤最有希望的開發(fā)藥物之一。僅在2年后，美國(guó)FDA以歷史上最快的速度批準(zhǔn)重組人內(nèi)抑素治療實(shí)體腫瘤的臨床實(shí)驗(yàn)前，重組人內(nèi)抑素已在II期臨床實(shí)驗(yàn)。
目前，臨床實(shí)驗(yàn)中所使用的重組人內(nèi)抑素為可溶性，由酵母表達(dá)產(chǎn)生，由于成本和產(chǎn)量不高的原因，人們還在尋找新的高效表達(dá)、低成本、過程簡(jiǎn)單的途徑生產(chǎn)重組人內(nèi)抑素。1997年，自O(shè)’Reilly發(fā)現(xiàn)內(nèi)抑素后，很快將小鼠內(nèi)抑素基因克隆入原核系統(tǒng)表達(dá)載體中，并獲得重組小鼠內(nèi)抑素高效表達(dá)，其誘導(dǎo)方法是利用IPTG，表達(dá)后的蛋白以包涵體形式存在，但蛋白很難以可溶性形式存在，利用復(fù)性再折疊過程處理，可溶性蛋白不足1％。在難以在大腸桿菌中表達(dá)出可溶性重組人內(nèi)抑素后，人們探討多種形式，多種不同類型的重組人內(nèi)抑素的表達(dá)，有的內(nèi)抑素獲得高表達(dá)但不溶或不具備活性，有的具備活性不溶，有的可溶但產(chǎn)量不高。如Boehem[3][4]等1998年在酵母系統(tǒng)中成功表達(dá)可溶性小鼠內(nèi)抑素，但所獲產(chǎn)物具有不均一的N端，分析可能是由于蛋白酶降解的原因，在用B16F10黑色素瘤細(xì)胞表達(dá)重組的小鼠內(nèi)抑素，獲得均一N端產(chǎn)物，有活性，但產(chǎn)量非常低。1998年SaSaki[5]利用人胚腎細(xì)胞表達(dá)重組人內(nèi)抑素可明顯抑制小鼠移植腫瘤的生長(zhǎng)。在此系統(tǒng)中，所表達(dá)的蛋白產(chǎn)量也非常有限。1999年Dhanabal[6]等利用大腸桿菌高效表達(dá)出重組小鼠內(nèi)抑素，但蛋白不溶，所表達(dá)出的蛋白有單體，分子量22-25kDa，也有雙體分子，分子量在44-46kDa。從所使用的表達(dá)系統(tǒng)分析，依然是細(xì)菌的表達(dá)量為最高，但溶解性是一大難題，許多研究組一直在尋找一個(gè)能使細(xì)菌表達(dá)的重組內(nèi)抑素可溶的途徑[7]，從所獲得資料指出，細(xì)菌表達(dá)重組內(nèi)抑素大部分以IPTG做為誘導(dǎo)，國(guó)內(nèi)也有采用溫控和滲透壓改變誘導(dǎo)重組人內(nèi)抑素表達(dá)的報(bào)道[8]。
因此，本領(lǐng)迫切需要一種既能高效表達(dá)，又能使所表達(dá)的重組內(nèi)抑素可溶并且具有人內(nèi)抑素所固有的活性的生產(chǎn)重組人內(nèi)抑素的方法。
發(fā)明概述針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的需要，本發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期的探索和大量的研究，最終成功地發(fā)明了一種既能高效表達(dá)，又能使所表達(dá)的重組內(nèi)抑素可溶并且具有人內(nèi)抑素所固有的活性的生產(chǎn)重組人內(nèi)抑素的方法，從而解決了長(zhǎng)期困擾本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)難題本發(fā)明根據(jù)人膠原18C末端編碼氨基酸序列的核苷酸[9]合成擴(kuò)增重組人內(nèi)抑素的PCR引物，然后利用人胚胎肝細(xì)胞mRNA做為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄再PCR擴(kuò)增(RT-PCR)后，獲得所期望的擴(kuò)增片段，經(jīng)核苷酸序列測(cè)定，所獲基因與所推斷的人內(nèi)抑素基因序列相符合，為使基因在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，在不改變氨基酸序列的前提下，設(shè)計(jì)出N端，細(xì)菌偏愛的4個(gè)氨基酸編碼序列，將突變后的重組人內(nèi)抑素基因克隆入表達(dá)載體pET 24b(Novagen公司.cat No.69418-3)后，經(jīng)IPTG可誘導(dǎo)產(chǎn)生重組人內(nèi)抑素的表達(dá)，由于表達(dá)過程有泄露現(xiàn)象，本發(fā)明利用葡萄糖控制蛋白表達(dá)的泄露，然后利用乳糖誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)，結(jié)果重組人內(nèi)抑素在細(xì)菌中的表達(dá)約占菌體蛋白的40％左右，中試放大發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，乳糖可成功誘導(dǎo)重組人內(nèi)抑素的表達(dá)，表達(dá)量40％左右，而且經(jīng)乳糖誘導(dǎo)表達(dá)的重組人內(nèi)抑素蛋白易于溶解、純化和復(fù)性(溶解性很好)，所獲蛋白具有明顯地抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和動(dòng)物移植瘤生長(zhǎng)的作用。本發(fā)明的目的之一在于利用乳糖做為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)重組人內(nèi)抑素在大腸桿菌中的高效表達(dá)；利用乳糖做為誘導(dǎo)劑，在中試和大規(guī)模生產(chǎn)中誘導(dǎo)重組人內(nèi)抑素的高效表達(dá)。
因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了一種制備重組人內(nèi)抑素的方法，其特征在于使用含有SEQ ID No.3(附圖3)所示的核甘酸的高表達(dá)細(xì)菌工程菌株進(jìn)行。優(yōu)選地，在該方法中，利用乳糖做為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)重組人內(nèi)抑素在大腸桿菌中的高效表達(dá)。更優(yōu)選地，在該方法中，利用葡萄糖控制蛋白表達(dá)的泄露(leakeage指非誘導(dǎo)性表達(dá))。
本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供的一種大腸細(xì)菌工程菌株，該菌株已經(jīng)被含有SEQ ID No.3(或者附圖3)所示的核甘酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。該大腸桿菌菌株能高效表達(dá)重組人內(nèi)抑素，而該重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4(或者附圖3)所示。優(yōu)選地，該大腸細(xì)菌工程菌株是于2003年8月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，武漢)并且保藏號(hào)為CCTCC NOM203063的大腸桿菌BL-21(DE-3)/pENDO工程菌株。
本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了一種重組人內(nèi)抑素，其是由上述方法所生產(chǎn)的，其序列如SEQ ID No.4(或者附圖3)所示，易于純化和復(fù)性(溶解性很好，易溶)且與人內(nèi)抑素具有相同的生物學(xué)功能，即具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的功能，從而對(duì)各種因新血管形成所致的疾病有治療及預(yù)防作用。
本發(fā)明的第四個(gè)方面，提供了SEQ ID No 3以及圖3所示的核苷酸序列。
本發(fā)明的第五個(gè)方面，提供了SEQ ID No 3以及圖3所示的核苷酸序列在構(gòu)建高效表達(dá)重組人內(nèi)抑素的大腸桿菌工程菌株中用途。
本發(fā)明的第六個(gè)方面，提供了乳糖誘導(dǎo)法在誘導(dǎo)重組人內(nèi)抑素的高效表達(dá)中的用途。
本發(fā)明的第七個(gè)方面，提供了上述基因工程方法所生產(chǎn)的重組人內(nèi)抑素在制備用于抗新血管形成，特別是抗腫瘤的藥物中的用途。
但是，在以下的“發(fā)明詳述”，尤其是“實(shí)施例”部分的公開內(nèi)容的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點(diǎn)對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。


圖1人膠原18核苷酸及氨基酸序列(人內(nèi)抑素(Endostatin)的核酸及氨基酸序列)。
圖2PCR擴(kuò)增后所測(cè)人內(nèi)抑素基因序列圖，其中圖2-15’方向，圖2-23’方向。
圖3突變后人內(nèi)抑素核苷酸序列及氨基酸序列。
圖4突變后所測(cè)人內(nèi)抑素基因序列圖。
圖5PCR擴(kuò)增人內(nèi)抑素基因瓊脂糖凝膠電泳圖泳道1標(biāo)準(zhǔn)核苷酸分子量；2、4擴(kuò)增反應(yīng)中不含鎂離子；3、5擴(kuò)增反應(yīng)中含1mM鎂離子；650℃擴(kuò)增含4mM鎂離子；758℃擴(kuò)增含4mM鎂離子。
圖6重組人內(nèi)抑素基因克隆入pET 24b表達(dá)載體圖(重組人血管內(nèi)皮抑制素質(zhì)粒構(gòu)建圖譜)。
圖7重組人內(nèi)抑素在大腸桿菌BL-21(DE3)中IPTG誘導(dǎo)表達(dá)泳道1未誘導(dǎo)(含葡萄糖抑制)；2未誘導(dǎo)(不含葡萄糖抑制)；3IPTG誘導(dǎo)2小時(shí)；4IPTG誘導(dǎo)3小時(shí)；5IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)。
圖8重組人內(nèi)抑素在大腸桿菌BL-21(DE3)中乳糖誘導(dǎo)的表達(dá)泳道1未誘導(dǎo)；2-8分別為誘導(dǎo)2、4、6、8、10、12、14小時(shí)，表達(dá)量的掃描結(jié)果為8，表達(dá)量42.0171/99.7967×100％＝42.1％。
圖9重組人內(nèi)抑素中試放大發(fā)酵中乳糖誘導(dǎo)的表達(dá)泳道1空白；2未誘導(dǎo)；3-9分別為誘導(dǎo)2、4、6、8、10、12、14小時(shí)；10標(biāo)準(zhǔn)分子量。表達(dá)量掃描結(jié)果為9道，表達(dá)量39.5012/99.8929×100％＝39.5％。
圖10純化復(fù)性后重組人內(nèi)抑素SDS-凝膠電泳圖泳道1對(duì)照品；2CM純化樣品；3CM純化樣品。純度掃描結(jié)果為3道，純度為99.0124/99.7281×100％＝99.3％。
圖11重組人內(nèi)抑素復(fù)性后對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用縱軸為抑制率(％)，橫軸為內(nèi)抑素濃度。IC50≤5μg。
圖12重組人內(nèi)抑素對(duì)小鼠移植瘤的生長(zhǎng)的抑制作用縱軸為移植瘤體積(mm3)，橫軸時(shí)間(天)。
發(fā)明詳述在本說明書的上下文中，除非特別指明，否則本說明書所用的任何技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在本領(lǐng)域中通常理解的含義，而未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法是按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，如金冬雁等譯，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第二版，科學(xué)出版社，北京，1992；吳乃虎等，基因工程原理，科學(xué)出版社，北京，2000；朱厚礎(chǔ)等譯，蛋白質(zhì)純化與鑒定實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社，北京，1999；和李育陽(yáng)主編，基因表達(dá)技術(shù)，科學(xué)出版社，北京，2000所述的進(jìn)行的；或按照供應(yīng)商所建議的操作說明書進(jìn)行的。
為獲得人內(nèi)抑素基因，依據(jù)人膠原18C末端183個(gè)氨基酸序列(圖1)，合成N端和C端引物序列，并在N端引物設(shè)計(jì)NdeI酶切位點(diǎn)和起始碼ATG，C端引物設(shè)計(jì)在終止碼后加入-BamHI位點(diǎn)，用人胚胎肝細(xì)胞mRNA做為模板，RT-PCR方法擴(kuò)增人內(nèi)抑素基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增片段約550bp分子量大小，與預(yù)計(jì)的相符合(圖5)，將基因片段克隆入Topo PCR2.1克隆質(zhì)粒(invitrogen公司)后，擴(kuò)增并純化質(zhì)粒，經(jīng)核苷酸序列分析，所獲基因序列與人膠原18C端183個(gè)氨基酸序列完全一致(圖2)，再將基因克隆入原核系統(tǒng)表達(dá)載體質(zhì)粒pET 24b(購(gòu)自Novagen公司)中，轉(zhuǎn)化入BL-21(DE3)宿主菌(購(gòu)自Invitrogen公司)中，培養(yǎng)后，用IPTG誘導(dǎo)重組人內(nèi)抑素的表達(dá)，表達(dá)后收集細(xì)菌，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，在分子量20kDa大小左右有一明顯誘導(dǎo)表達(dá)帶，表達(dá)量約20％左右，為提高重組人內(nèi)抑素在原核細(xì)胞中的表達(dá)，本發(fā)明設(shè)計(jì)突變?nèi)藘?nèi)抑素基因N端1位，3-5位氨基酸的核苷酸編碼，使之成為細(xì)菌核糖體識(shí)別偏愛(圖3，圖4)，將經(jīng)突變后的重組人內(nèi)抑素基因再克隆入pET 24b質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化入BL-21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，重組人內(nèi)抑素蛋白表達(dá)提高到40％左右(圖7)，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)未經(jīng)乳糖誘導(dǎo)表達(dá)的對(duì)照組中，也有10％左右的人內(nèi)抑素表達(dá)，說明這一質(zhì)粒的表達(dá)有泄露現(xiàn)象。本發(fā)明采用未誘導(dǎo)表達(dá)前，將培養(yǎng)基中加入葡萄糖可成功阻止這種泄露，而且利用乳糖又可成功誘導(dǎo)表達(dá)其表達(dá)量在40％左右，在發(fā)酵罐中試放大實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明在前期發(fā)酵中加入葡萄糖，既可作為碳源，又可有效控制表達(dá)泄露，待細(xì)菌生成密度達(dá)到OD60014-18左右時(shí)，加入乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)菌16小時(shí)左右，細(xì)菌密度可達(dá)OD60020以上，重組人內(nèi)抑素表達(dá)量為40％左右(圖9)，經(jīng)乳糖誘導(dǎo)后，重組人內(nèi)抑素經(jīng)包涵體提取，復(fù)性純化等步驟，可獲純度達(dá)95％以上，并且優(yōu)選地99％以上的可溶性蛋白(圖10)，純化后的蛋白具有明顯的抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞和小鼠移植瘤生長(zhǎng)的作用(圖11和12)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在下列實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，或按照廠商所建議的操作說明進(jìn)行。實(shí)施例1重組人內(nèi)抑素基因的獲得和細(xì)菌偏愛型基因的突變根據(jù)人膠原18C末端的183個(gè)氨基酸的核苷酸序列，首先合成RT-PCR的引物，其引物序列如下
5’-GC CAT ATG CAC AGC CAC CGC GAC-3’3’端引物5’-CG GGA TCC CTA CTT GGA GGC AGT-3’人胚胎肝細(xì)胞mRNA來源于人胚肝組織，由Trizol試劑(Invitrogen公司)一步法提取。
RT-PCR反應(yīng)條件如下(RT-PCR試劑盒購(gòu)自Roche公司)①5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液 4μlMgCl22μl(50mM)dNTP 2μl(10mM)隨機(jī)引物 1μl(50pmol)反轉(zhuǎn)錄酶 1μl 2.5IUmRNA 2μl(1μg/μl)RNase抑制劑 1μl42℃水浴100分鐘后，95℃保溫5分鐘，-80℃保存。
②模板(cDNA反應(yīng)液)5μl5’引物 2μl 50pmole3’引物 2μl 50pmoledNTP 2μl 10mM5×PCR緩沖液 20μlMgCl22μl 100mMTaq DNA聚合酶 1μl 5UH2O 76μl最終反應(yīng)體積100μl聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)(PCR)的條件如下98℃變性5分鐘，然后94℃40秒、56℃40秒、72℃50秒共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延長(zhǎng)10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR樣品置于冰上或-80℃凍存。
將RT-PCR反應(yīng)后的樣品在1％瓊脂糖電泳，可見在550bp分子量大小處有明顯擴(kuò)增基因片段(圖5)。取1μl擴(kuò)增反應(yīng)液，混合3μlH2O和1μl Topo PCR 2.1載體(Invitrogen公司)混合液，室溫下作用5分鐘后，取1μl放入感受態(tài)細(xì)菌shot one(Invitrogen公司)50μl，冰浴30分鐘后，42℃水浴30秒，再加入＞50μl SOS(Invitrogen公司)培養(yǎng)基(購(gòu)于Invitrogen公司)，37℃水浴30分鐘，鋪含有卡那霉素(30μg/ml)的LB瓊脂板過夜，37℃，第二天挑選單克隆，LB(含卡那霉素30μg/ml)培養(yǎng)基振搖培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，酶切鑒定。同時(shí)做核苷酸序列分析，結(jié)果證實(shí)，所獲基因序列與所推測(cè)的序列完全一致(圖2)，利用N端NdeI和C端BamHI酶切位點(diǎn)，切下重組人內(nèi)抑素基因并克隆入表達(dá)載體pET24b中(圖6)，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞BL-21(DE3)后，在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB中培養(yǎng)并誘導(dǎo)重組人內(nèi)抑素的表達(dá)，當(dāng)細(xì)菌濃度OD600達(dá)到0.6-0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5mM誘導(dǎo)4小時(shí)后，離心收集細(xì)菌，經(jīng)細(xì)菌破碎后在15％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳下，檢測(cè)重組人內(nèi)抑素的表達(dá)，結(jié)果顯示在分子量20kDa左右，有一明顯蛋白誘導(dǎo)表達(dá)帶，掃描法計(jì)算表達(dá)量為20％左右，為再進(jìn)一步提高重組人內(nèi)抑素在大腸桿菌中的表達(dá)，利用PCR的方法，將人內(nèi)抑素基因的前4人氨基酸的編碼突變成細(xì)菌偏愛型。5’端突變引物如下5’-GC CAT ATGCAT AGC CAT CGT GAT TTC CAG CCG GTG CTCC-3’與原3’端引物組合，利用野生型人內(nèi)抑素基因質(zhì)粒(上述550bp PCR片段裝入Topo PCR2.1載體)為模板，以同樣的PCR方法(除引物不同外)后，也獲得550bp擴(kuò)增片段，克隆入Topo PCR 2.1(Invitrogen)后，提取質(zhì)粒并做核苷酸序列分析，其結(jié)果與預(yù)計(jì)突變結(jié)果相符合(圖4)，將突變后的重組人內(nèi)抑素基因再克隆入pET 246中，轉(zhuǎn)化BL-21(DE3)后，經(jīng)培養(yǎng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，收集菌體15％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，在20kDa分子量大小的表達(dá)帶約為細(xì)菌蛋白的40％(圖7)，結(jié)果證實(shí)，突變質(zhì)粒為野生型基因克隆質(zhì)粒在細(xì)菌中的表達(dá)的2倍。優(yōu)選地，該大腸細(xì)菌工程菌株是于2003年8月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，武漢)并且保藏號(hào)為CCTCC NOM203063的大腸桿菌BL-21(DE-3)/pENDO工程菌株。
實(shí)施例2乳糖誘導(dǎo)重組人內(nèi)抑素在大腸桿菌中的高效表達(dá)突變型質(zhì)粒在BL-21(DE3)宿主菌可誘導(dǎo)高效表達(dá)重組人內(nèi)抑素。而且在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，即使未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的對(duì)照組也有明顯的蛋白表達(dá)。說明由于啟動(dòng)子過強(qiáng)，對(duì)人內(nèi)抑素的表達(dá)有啟動(dòng)泄露現(xiàn)象，本發(fā)明曾利用不同的溫度、不同時(shí)間、不同培養(yǎng)基嘗試防止泄露，最后發(fā)現(xiàn)利用葡萄糖可有效防止泄露，而且不僅在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)重組人內(nèi)抑素，而且利用乳糖同樣可以有效表達(dá)重組人內(nèi)抑素，表達(dá)量達(dá)40％左右(圖8)。
具體培養(yǎng)基組成份如下 挑選單克隆，在1.5ml含有50μg氨芐青霉素1ml新鮮LB中，37℃培養(yǎng)過夜，第二天，將過夜菌用1∶50新鮮的LB(含氨芐)稀釋，再37℃振搖培養(yǎng)至細(xì)菌OD6001.2左右，加入乳糖至終濃度為2％，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)菌6-8個(gè)小時(shí)后，離心收集細(xì)菌檢測(cè)重組人內(nèi)抑素的表達(dá)。
實(shí)施例3乳糖誘導(dǎo)重組人內(nèi)抑素在中試發(fā)酵中的高效表達(dá)重組人內(nèi)抑素細(xì)菌發(fā)酵種子液的組成如下每升培養(yǎng)基中含10g酪蛋白，5g酵母提取粉，10g氯化鈉，2％葡萄糖。實(shí)際操作過程如下挑取新鮮單一菌落，接種到200ml新鮮種子液中，過夜培養(yǎng)，第二天10倍體積新鮮種子液繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)至細(xì)菌OD6002.0左右時(shí)，加入發(fā)酵罐中，比例為1∶10放大，發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基依然是種子液成份。發(fā)酵過程中，當(dāng)溶氧降至0時(shí)，加入1/10體積的補(bǔ)料1，成份為葡萄糖，硫酸胺和硫酸鎂，分別為20％、10％和1％，當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)菌OD600達(dá)到10時(shí)，加入1/20體積的10％酵母提取物，當(dāng)OD600上升到14左右時(shí)，加入最終濃度為2％的乳糖液進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，再繼續(xù)培養(yǎng)約14個(gè)小時(shí)后，OD600約20左右時(shí)，放罐，此時(shí)每升發(fā)酵液約可得濕菌40g，細(xì)菌表達(dá)量40％左右，圖9為發(fā)酵不同時(shí)間下重組人內(nèi)抑素的表達(dá)。
實(shí)例4.采用與實(shí)例3完全相同的方法，只改變?nèi)樘菨舛?，分別為0.01％、0.5％、1％、10％，測(cè)定細(xì)菌表達(dá)量，分別為10％、20％、40％、36％。
實(shí)施例5乳糖誘導(dǎo)的重組人內(nèi)抑素經(jīng)包涵體純化、復(fù)性、再純化收集菌體后，每罐發(fā)酵液可獲濕菌1,400g，用冰浴的緩沖液A(50mM Tris-HCl，pH8.3，1mM EDTA，1mM β-巰基乙醇)，約7500ml混懸菌體后再加入終濃度為0.05％的溶菌酶，4℃下超聲破菌，超聲功率為1,000W，時(shí)間10min，超聲10秒暫停3秒，超聲裂解后，涂片顯微鏡下檢查，細(xì)菌破碎率應(yīng)＞95％。4℃下細(xì)菌裂解液離心7,000rpm/min，離心20分鐘，棄上清，沉淀即為粗包涵體。用緩沖液B(50mM Tris-HCl，pH8.3，4M尿素，1％Trition X-100，1mM EDTA，5mM β-巰基乙醇)，混懸包涵體后，置室溫下10分鐘，離心7,000rpm/分，30分鐘，洗滌1次，再用緩沖液A洗滌一次，包涵體的純度可從50％提高到75％。用緩沖液C(50mM Tris-HCl，pH8.3，8M尿素，1mM EDTA，15mM β-巰基乙醇)，4℃下攪拌溶解包涵體，每克濕重包涵體用20ml緩沖液C溶解。攪拌溶解過夜后，10,000rpm/min離心30分鐘，收集上清，棄沉淀(上清即為包涵體溶解液)。
將經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow純化后的內(nèi)抑素裝入透析袋中(分子截留為12,000-14,000kDa)，在PBS緩沖液下加入4M尿素，透析24小時(shí)，再減尿素為2M，調(diào)節(jié)pH至7.0，同時(shí)加入0.1mM氧化型谷胱甘肽和1mM還原型谷胱甘肽，透析24小時(shí)，用平衡液(20mMNaAc/Ac，pH5.8)平衡柱床，然后上樣，同時(shí)用核酸蛋白檢測(cè)儀(檢測(cè)波長(zhǎng)280nm)在線檢測(cè)，上樣后用洗脫液A(0.1M NaCl，20mM NaAc/AcpH5.8)洗脫，收集洗脫峰A，再用平衡液清洗，最后用洗脫液B(0.3MNaCl，20mM NaAc/Ac，pH5.8)洗脫，收集洗脫峰B，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定洗脫峰B含有內(nèi)抑素蛋白，經(jīng)純化復(fù)性后得到的純品純度為99.3％。如圖10所示。
實(shí)施例6重組人內(nèi)抑素復(fù)性后對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用選擇生長(zhǎng)狀態(tài)旺盛的ECV細(xì)胞(ATCC)，加入少量胰酶，于室溫消化，待消化完全后，小心去除胰酶，加入含3μg.L-1bFGF和2％FBS的RPMI medium 1640及青霉素105U.L-1，鏈霉素100mg.L-1的培養(yǎng)基終止反應(yīng)，用滴管將瓶壁上細(xì)胞從壁上吹下，并吹打均勻。再調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升2×104個(gè)，向96孔板中加入0.1ml的細(xì)胞懸液。重組人內(nèi)抑素再用上述培養(yǎng)基進(jìn)行不同濃度梯度倍比稀釋，每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔加液0.1ml，使終濃度(mg.L-1)分別為100、50、25、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。在37℃，飽和濕度及5％CO2條件下靜止培養(yǎng)4h。4h后，小心吸去培養(yǎng)上清，加入0.15ml DMSO，溶解細(xì)胞，用培養(yǎng)板震動(dòng)器搖勻。再用酶標(biāo)儀按參比波長(zhǎng)為630nm，測(cè)試波長(zhǎng)為492nm測(cè)定各孔OD吸收值，求出空白及樣品每個(gè)稀釋度3孔測(cè)得的平均值，將樣品每個(gè)稀釋度平均光吸收減去空白平均光吸收，以陰性對(duì)照的光吸收度為50％時(shí)的樣品濃度。
重組人內(nèi)抑素的抑制率按下述公式計(jì)算 根據(jù)各點(diǎn)的抑制率，繪制量效曲線以重組人內(nèi)抑素劑量為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)，Microsoft Excel作圖，觀察重組人內(nèi)抑素的抑制作用并求抑制率為50％時(shí)的制劑濃度。
結(jié)果表明產(chǎn)生50％內(nèi)皮細(xì)胞抑制的重組人內(nèi)抑素的濃度約為3.50mg.L-1。見圖11。
實(shí)施例7重組人內(nèi)抑素對(duì)小鼠移植瘤的生長(zhǎng)的抑制作用試驗(yàn)方法1.動(dòng)物 昆明種小鼠(中國(guó)藥科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心)，雌雄兼用，體重18-22g，鼠齡5-6周。
2.腫瘤模型S180肉瘤。
3.腫瘤移植選擇腫瘤生長(zhǎng)旺盛且無潰破的荷瘤小鼠，頸椎脫臼處死，在無菌條件下(超凈臺(tái))，用碘酒、酒精消毒動(dòng)物皮膚，切開皮膚，剝離腫瘤并稱重。在培養(yǎng)皿內(nèi)將瘤組織剪成小塊(室溫＞15℃時(shí)應(yīng)放冰塊上操作)，放入無菌勻漿器內(nèi)，按1∶3～1∶4(W/V)加入滅菌生理鹽水，勻漿。取受瘤小鼠，于前肢腋窩處碘酒、酒精消毒，皮下注射腫瘤勻漿液0.2ml/只(腫瘤細(xì)胞數(shù)約5×106個(gè))。
4.動(dòng)物分組 于接種后第三天，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和治療組。治療組動(dòng)物數(shù)一般10只，陰性對(duì)照級(jí)動(dòng)物數(shù)為治療組動(dòng)物×√藥物配制和試驗(yàn)組數(shù)。
5.藥物配制和給藥途徑 溶于水的固體藥物，用生理鹽水或注射用水配制。皮下注射給藥(須注意注射部位的消毒)，每日給藥一次，陰性對(duì)照組注射等體積生理鹽水或注射用水。
6.給藥時(shí)間 接種腫瘤后每日觸摸局部，當(dāng)腫瘤直徑達(dá)1～2mm時(shí)開始給藥，連續(xù)用藥7天。
7.觀察指標(biāo) 給藥后每日測(cè)量腫瘤的最長(zhǎng)徑(r1)、最短徑(r2)，計(jì)算腫瘤的體積(V＝1/2×r1×(r2)2)，并記錄動(dòng)物有無不良反應(yīng)或死亡，若有死亡應(yīng)記錄死亡時(shí)間，分析死亡原因。
8.腫瘤生長(zhǎng)抑制率 根據(jù)上述的測(cè)量結(jié)果，計(jì)算出腫瘤相對(duì)體積(relative tumor volume，RTV)，計(jì)算公式為RTV＝Vt/V0。其中V0為給藥時(shí)測(cè)量所得的腫瘤體積，Vt為每一次測(cè)量時(shí)的腫瘤體積?？鼓[瘤活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)為相對(duì)腫瘤增殖率T/C(％)，計(jì)算公式如下T/C(%)=TRTVCRTV×100%]]>其中TRTV治療組RTV；CRTV陰性對(duì)照組RTV。
結(jié)果顯示按5mg/kg，10mg/kg和20mg/kg劑量皮下注射重組人內(nèi)抑素可明顯抑制人胃癌BGC803裸鼠移植腫瘤的生長(zhǎng)，如圖12所示。
總上所述，本發(fā)明的乳糖誘導(dǎo)的重組人內(nèi)抑素經(jīng)包涵體純化、復(fù)性、再純化后，蛋白純度(HPLC)達(dá)95％以上(圖10)，并具有明顯的生物活性(圖11，12)。
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序列表<110>廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司<120>重組人內(nèi)抑素的高效表達(dá)方法<130>I020301<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>552<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(1)..(552)<223><400>1cac agc cac cgc gac ttc cag ccg gtg ctc cac ctg gtt gcg ctc aac 48His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn1 5 10 15agc ccc ctg tca ggc ggc atg cgg ggc atc cgc ggg gcc gac ttc cag 96Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln20 25 30tgc ttc cag cag gcg cgg gcc gtg ggg ctg gcg ggc acc ttc cgc gcc 144Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala35 40 45ttc ctg tcc tcg cgc ctg cag gac ctg tac agc atc gtg cgc cgt gcc 192Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala50 55 60gac cgc gca gcc gtg ccc atc gtc aac ctc aag gac gag ctg ctg ttt 240Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe65 70 75 80ccc agc tgg gag gct ctg ttc tca ggc tct gag ggt ccg ctc aag ccc 288Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro85 90 95ggg gca cgc atc ttc tcc ttt gac ggc aag gac gtc ctg agg cac ccc 336Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro100 105 110acc tgg ccc cag aag agc gtg tgg cat ggc tcg gac ccc aac ggg cgc 384Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn Gly Arg115 120 125agg ctg acc gag agc tac tgt gag acg tgg cgg acg gag gct ccc tcg 432Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser130 135 140gcc acg ggc cag gcc tcc tcg ctg ctg ggg ggc agg ctc ctg ggg cag 480Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gln145 150 155 160agt gcc gcg agc tgc cat cac gcc tac atc ctg ctc tgc att gag aac 528Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Leu Leu Cys Ile Glu Asn
165 170 175agc ttc atg act gcc tcc aag tag 552Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys180<210>2<211>183<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn1 5 10 15Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln20 25 30Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala35 40 45Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala50 55 60Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe65 70 75 80Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro85 90 95Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro
100 105 110Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn Gly Arg115 120 125Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser130 135 140Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gln145 150 155 160Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Leu Leu Cys Ile Glu Asn165 170 175Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys180<210>3<211>552<212>DNA<213>Artificial<220><221>CDS<222>(1)..(552)<223><400>3cat agc cat cgt gat ttc cag ccg gtg ctc cac ctg gtt gcg ctc aac 48His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn1 5 10 15agc ccc ctg tca ggc ggc atg cgg ggc atc cgc ggg gcc gac ttc cag 96Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln20 25 30tgc ttc cag cag gcg cgg gcc gtg ggg ctg gcg ggc acc ttc cgc gcc 144Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala35 40 45ttc ctg tcc tcg cgc ctg cag gac ctg tac agc atc gtg cgc cgt gcc 192Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala50 55 60gac cgc gca gcc gtg ccc atc gtc aac ctc aag gac gag ctg ctg ttt 240Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe65 70 75 80ccc agc tgg gag gct ctg ttc tca ggc tct gag ggt ccg ctc aag ccc 288Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro85 90 95ggg gca cgc atc ttc tcc ttt gac ggc aag gac gtc ctg agg cac ccc 336Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro100 105 110acc tgg ccc cag aag agc gtg tgg cat ggc tcg gac ccc aac ggg cgc 384Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn Gly Arg115 120 125agg ctg acc gag agc tac tgt gag acg tgg cgg acg gag gct ccc tcg 432Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser130 135 140gcc acg ggc cag gcc tcc tcg ctg ctg ggg ggc agg ctc ctg ggg cag 480Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gln145 150 155 160agt gcc gcg agc tgc cat cac gcc tac atc ctg ctc tgc att gag aac 528Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Leu Leu Cys Ile Glu Asn165 170 175agc ttc atg act gcc tcc aag tag 552Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys180<210>4<211>183<212>PRT<213>Artificial<400>4His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn1 5 10 15Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln20 25 30Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala35 40 45Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala50 55 60Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe65 70 75 80Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro85 90 95Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro100 105 110Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn Gly Arg115 120 125Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser130 135 140Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gln145 150 155 160Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Leu Leu Cys Ile Glu Asn165 170 175Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys180
權(quán)利要求
1.一種制備重組人內(nèi)抑素的方法，其特征在于使用含有N端1位，3-5位氨基酸的編碼無意義突變的人內(nèi)抑素基因的高表達(dá)的大腸桿菌工程菌株進(jìn)行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的N端1位，3-5位氨基酸的編碼無意義突變的人內(nèi)抑素基因是SEQ ID No.3(附圖3)所示的核甘酸
3.根據(jù)權(quán)利要求1或者2的方法，其中利用乳糖做為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)重組人內(nèi)抑素在大腸桿菌中的高效表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中的乳糖誘導(dǎo)是通過在細(xì)菌工程菌株生長(zhǎng)至OD60014-18時(shí)，加入乳糖而進(jìn)行的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中加入的乳糖的最終濃度為2％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或者2的方法，其中利用葡萄糖控制蛋白表達(dá)的泄露。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中的蛋白表達(dá)的泄露是通過在未誘導(dǎo)表達(dá)前，在培養(yǎng)基中加入葡萄糖而進(jìn)行的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或者2的方法，其中的大腸桿菌工程菌株是保藏號(hào)為CCTCC NOM203063的大腸桿菌BL-21(DE-3)/pENDO。
9.一種大腸細(xì)菌工程菌株，該菌株已經(jīng)被含有SEQ ID No.3(或者附圖3)所示的核甘酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的大腸細(xì)菌工程菌株，其是于2003年8月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，武漢)并且保藏號(hào)為CCTCC NOM203063的大腸桿菌BL-21(DE-3)/pENDO。
11.一種重組人內(nèi)抑素，其是由權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法所生產(chǎn)的。
12.一種核苷酸序列，其如SEQ ID No 3以及圖3所示。
13.權(quán)利要求12的核苷酸序列在構(gòu)建高效表達(dá)重組人內(nèi)抑素的大腸桿菌工程菌株中用途。
14.乳糖誘導(dǎo)法在誘導(dǎo)重組人內(nèi)抑素的高效表達(dá)中的用途。
15.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法所生產(chǎn)的重組人內(nèi)抑素在制備用于抗新血管形成的藥物中的用途。
16.權(quán)利要求15的用途，其中的藥物用于抗腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明提供了利用乳糖做為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)重組人內(nèi)抑素在大腸桿菌工程菌株中高效表達(dá)生產(chǎn)重組人內(nèi)抑素的方法，其中該工程菌株含有如SEQ ID No 3以及圖3所示的核苷酸序列；此外，本發(fā)明還涉及SEQ ID No 3以及圖3所示的核苷酸序列在構(gòu)建高效表達(dá)重組人內(nèi)抑素的大腸桿菌工程菌株中用途；以及乳糖誘導(dǎo)法在誘導(dǎo)重組人內(nèi)抑素的高效表達(dá)中的用途。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1490410SQ0315572
公開日2004年4月21日 申請(qǐng)日期2003年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月29日
發(fā)明者朱敏生, 智剛, 朱年春, 智強(qiáng), 陳曉明 申請(qǐng)人:廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司