專利名稱：復合膠乳粒子包被胱抑素c檢測試劑盒的制作方法
復合膠乳粒子包被胱抑素C檢測試劑盒本發(fā)明涉及醫(yī)學免疫體外診斷領域，特別是一種檢測血清中的胱抑素C測定試劑盒。腎臟疾病是臨床上一種常見的疾病，各種原因導致的腎功能損害是進展為終末性腎病及心血管疾病的危險因素。唯一能阻止腎臟疾病惡化的方法就是早診斷、早治療以逆轉損傷的腎功能。胱抑素C的濃度幾乎不受腎前因素的影響，能自由通過腎小球濾過，沒有腎小管的重吸收和排泄，也沒有腎外的排泄途徑。較多研究發(fā)現(xiàn)胱抑素C是反映腎功能損害的敏感指標。膠乳顆粒增強比池法(particle-enhancedturbidimetric immunoassay, PETIA)是近年來出現(xiàn)的一種較為穩(wěn)定、準確的體液蛋白均相免疫比濁檢測方法。PETIA法大體分為兩種。一種是散射比濁檢測法；另一種是透射比濁檢測法。這兩種方法的基本原理非常相似，都是在高分子膠乳微球的表面交聯(lián)單克隆抗體，當交聯(lián)有抗體的微球與抗原結合后，在短時間內會迅速聚集在一起，改變了反應液的散光性能或透光性能。而且，反應液散光性能或透光性能(即吸光度)的改變與被測抗原的濃度有較強的相關性，在一定范圍內可以反映被測抗原的濃度。PETIA檢測方法是在均相反應體系中進行抗原、抗體反應及結果的測定?？乖?、抗體反應后，直接測定反應液的吸光度值，省卻了 ELISA法反復孵育和洗板等煩瑣操作步驟，幾分鐘就能獲得結果，省時省力。此外，納米免疫比濁法操作步驟的簡化也相應地避免了許多人為操作因素和試劑、環(huán)境等外界因素的干擾，穩(wěn)定性和重復性都較好，能較真實地反映被測物質的含量。免疫比濁法的靈敏度雖然比ELISA法差一些，但足于檢測到健康人血漿中許多標志蛋白的下限值，可完全滿足臨床檢測要求。由于血清胱抑素C的含量很低，其測定方法需要較高的靈敏度和特異性。由最初免疫電泳的定性檢測，到放射免疫、熒光免疫和酶免疫的定量檢測，以及到免疫比濁的自動化檢測，發(fā)展十分迅速。單向免疫擴散(SRID)、放射免疫測定法(RIA)、熒光免疫測定發(fā)(FIA)、時間分辨熒光免疫測定法(TRFIA)、酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)、膠乳顆粒法、顆粒增強透射免疫比濁法(PETIA)、顆粒增強散射免疫比濁法(PENIA)。目前，膠乳顆粒增強比濁法是最為普遍通用的方法，但是膠乳顆粒增強比濁法最高最高檢測限只能達到O. lmg/1，線 性只能達到8mg/l，在臨床應用上存在著局限性。本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術的不足，發(fā)明提供了一種復合粒徑乳膠粒子包被抗體的測試試劑盒來檢測血清中的胱抑素C含量，以達到操作簡便、靈敏度高、特異性好，快速、測定結果準確可靠的目的。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明設計了一種復合膠乳粒子包被胱抑素C檢測試劑盒，包括試劑Rl，試劑R2及校準品，其中
試劑Rl為磷酸鹽緩沖體系，其組分為，PH值為7. 2-7. 6的磷酸鹽緩沖液30-60mmol/l,聚乙二醇 6000-8000 60_95mmol/l 和乙二胺四乙酸二納 6_13mmol/l。試劑R2包括羊抗人胱抑素C多克隆抗體包被的兩種大小不同的聚苯乙烯乳膠粒子致敏顆粒；還包括乳膠稀釋液，以及封閉液。校準品為0-10mg/l牛血清基質，還包括O. 2-2. 2%的防腐劑以及1-10%的穩(wěn)定劑。所述試劑R2中，所述封閉液包括O. 01%-O. I %脫脂奶粉，以及O. 1-0. 6mm的甘氨
酸。 所述試劑R2中，乳膠稀釋液包括PH值為7. 2-7. 6的磷酸鹽緩沖液35-60mmol/l，乙二胺四乙酸二鈉10. 2mmol/l,0. 01% -O. I %的脫脂奶粉，O. 9%的NaN3。所述試劑R2中，兩種聚苯乙烯乳膠粒子的直徑分別為40-70nm和150_190nm。所述試劑R2中，大粒徑膠乳與小粒徑膠乳以1/3-1/5的比例混合。所述試劑R2中，羊抗人胱抑素C多克隆抗體和包被的聚苯乙烯乳膠粒子的質量比為 1/10-3/10。所述的校準品中，防腐劑為疊氮鈉。所述的校準品中，穩(wěn)定劑為甘油、蔗糖、BSA、甘露醇或山梨醇中的一種或多種混合物。本發(fā)明同現(xiàn)有技術相比，具有靈敏度高、特異性好，快速、測定結果準確可靠的特點。圖I為本發(fā)明五種不同濃度的胱抑素C參考標準的標準曲線。圖2為本發(fā)明臨床相關性曲線分析圖。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例I :本發(fā)明稀釋液由如下物質配置而成。試劑Rl制備如下PH7. 4 磷酸鹽緩沖液 45mmol/l ；聚乙二醇600085mmol/l ；乙二胺四乙酸二鈉 8.5mmol/l;NaN3占總試劑 Rl 的 O. 9%。各種成分可以室溫下依次添加，或者同時添加，或者是分別單獨包裝并與檢測之前在即時配制。試劑R2制備如下取直徑為186nm的聚苯乙烯膠乳粒子以及直徑為45nm的聚苯乙烯膠乳粒子按照I 4的比例混合。羊抗人胱抑素C多克隆抗體和混合后的聚苯乙烯膠乳粒子以30 100的質量比混合，將兩者混勻后37°C吸附8小時，之后透析除去未連接上的抗體，加入O. 1%脫脂奶粉與O. 2mm的甘氨酸組成的封閉液，封閉2小時。用PH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液45mmol/l，乙二胺四乙酸二鈉10. 2mmol/l,0. 05%脫脂奶粉，O. 9%的NaN3組成的乳膠稀釋液，離心去上清。牛血清基質校準品制備將經(jīng)過處理的牛血清，加入BSA 0.1%, NaN3 O. 9%得到校準品稀釋液。用重組胱抑素C蛋白溶于制備的類似人血清基質的溶液，制備不同濃度的標準品其濃度分別為O ;O. 5mg/l ;1· 5mg/l ;3· Omg/1 ;6· Omg/1 ；10. Omg/1。本實施例描述的胱抑素C檢測試劑盒，適用于各種類型的全自動生化儀，以日立7170全自動生化儀為例，其操作如表I。分析方法兩點終點法，即試劑Rl ；R2的用量分別為230ul和50ul，樣本量3ul ；230ul試劑Rl加入3ul樣本于37C5min后加入50ulR2,即開始讀點，反應5min后讀取另一點；檢測波長分別主波長546nm副波長800nm。采用本試劑及上述測定方法，采用日立7170生化分析儀測得的5種不同含量的胱抑素C標準品(自制)的曲線，如圖I所示，每個點代表一個含量的參考標準品，其中X軸表不胱抑素C含量(mg/L) ;Y軸表不吸光度。表I :
權利要求
1.一種復合膠乳粒子包被胱抑素C檢測試劑盒，包括試劑R1，試劑R2及校準品，其中 試劑Rl為磷酸鹽緩沖體系，其組分為，PH值為7. 2-7. 6的磷酸鹽緩沖液30-60mmol/l，聚乙二醇 6000-8000 60_95mmol/l 和乙二胺四乙酸二納 6_13mmol/l ； 試劑R2包括羊抗人胱抑素C多克隆抗體包被的兩種大小不同的聚苯乙烯乳膠粒子致敏顆粒；還包括乳膠稀釋液，以及封閉液； 校準品為0-10mg/l牛血清基質，還包括O. 2-2. 2%的防腐劑以及1_10%的穩(wěn)定劑。
2.根據(jù)權利要求I所述的復合膠乳粒子包被胱抑素C檢測試劑盒，其特征在于所述試劑R2中，所述封閉液包括O. 01% -O. 1%脫脂奶粉，以及O. 1-0. 6mm的甘氨酸。
3.根據(jù)權利要求I所述的復合膠乳粒子包被胱抑素C檢測試劑盒，其特征在于所述試劑R2中，乳膠稀釋液包括PH值為7. 2-7. 6的磷酸鹽緩沖液35-60mmol/l，乙二胺四乙酸二鈉 10. 2mmol/l,0. 01% -O. I % 的脫脂奶粉，O. 9% 的 NaN3。
4.根據(jù)權利要求I所述的復合膠乳粒子包被胱抑素C檢測試劑盒，其特征在于所述試劑R2中，兩種聚苯乙烯乳膠粒子的直徑分別為40-70nm和150_190nm。
5.根據(jù)權利要求I所述的復合膠乳粒子包被胱抑素C檢測試劑盒，其特征在于所述試劑R2中，大粒徑膠乳與小粒徑膠乳以1/3-1/5的比例混合。
6.根據(jù)權利要求I所述的復合膠乳粒子包被胱抑素C檢測試劑盒，其特征在于所述試劑R2中，羊抗人胱抑素C多克隆抗體和包被的聚苯乙烯乳膠粒子的質量比為1/10-3/10。
7.根據(jù)權利要求I所述的復合膠乳粒子包被胱抑素C檢測試劑盒，其特征在于所述的校準品中，防腐劑為疊氮鈉。
8.根據(jù)權利要求I所述的復合膠乳粒子包被胱抑素C檢測試劑盒，其特征在于所述的校準品中，穩(wěn)定劑為甘油、蔗糖、BSA、甘露醇或山梨醇中的一種或多種混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學免疫體外診斷領域，特別是一種檢測血清中的胱抑素C測定試劑盒，包括試劑R1，試劑R2及校準品；所述試劑R1為磷酸鹽緩沖體系，其組分為，PH值為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液30-60mmol/l，聚乙二醇6000-800060-95mmol/l和乙二胺四乙酸二鈉6-13mmol/l。所述試劑R2包括羊抗人胱抑素C多克隆抗體包被的兩種大小不同的聚苯乙烯乳膠粒子致敏顆粒；還包括乳膠稀釋液，以及封閉液。所述校準品為0-10mg/l牛血清基質，還包括0.2-2.2％的防腐劑以及1-10％的穩(wěn)定劑。本發(fā)明同現(xiàn)有技術相比，具有靈敏度高、特異性好，快速、測定結果準確可靠的特點。
文檔編號G01N33/68GK102636653SQ20121011756
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月19日 優(yōu)先權日2012年4月19日
發(fā)明者房君江, 李子樵 申請人:上海藍怡科技有限公司