專利名稱：一種銀杏葉提取物及含有它的注射液的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種總黃酮、銀杏內酯等含量高的銀杏葉提取物，及含有它的注射液，又稱為舒血寧注射液。
背景技術：
銀杏葉注射液在臨床治療中已使用多年，對擴張血管、改善微循環(huán)及血流變、清除自由基、減輕有害物的損害等都有很好的效果，市面上有關銀杏葉制劑品種很多，如，銀杏葉注射液、天寶片等。
銀杏葉在9月下旬至10月上旬時總黃酮、銀杏內酯有效成份含量最高，此時提取收率也最高。而干燥后的葉片中總黃酮、銀杏內酯有效成份含量則有不同程度的下降，存貯時間越長含量下降越多。
現(xiàn)有的提取工藝都是采用干銀杏葉進行提取，且提取工藝使用的有機溶劑多，如乙醇、丙酮，成本較高，技術復雜。
有鑒于此，本發(fā)明提出一種利用采收后的鮮銀杏葉，高效提取總黃酮及銀杏內酯有效成份并制成銀杏葉注射液的方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明采用的新鮮的銀杏葉進行提取。一般來說，用當年的干銀杏葉提取，總黃酮含量只能達到6％，用次年的干銀杏葉提取總黃酮含量降至4％。而采用本發(fā)明的方法，用新鮮的銀杏葉進行提取，總黃酮、銀杏內酯、白果內酯都能達到國際標準總黃酮達22～26％，銀杏內酯達2.5～4.5％，白果內酯達2～4％。而且本發(fā)明工藝簡單，有機溶劑用量也較少。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種銀杏葉提取物，該提取物通過以下方法制備鮮銀杏葉清洗打漿，稠厚漿液用乙醇提取，醇提液用堿調pH8-10，過濾，濾液用酸調pH3-8，優(yōu)選5-6，過濾，濾液回收乙醇，獲得黑棕色粘稠物，熱水提取，水提液冷藏過濾，濾液上大孔樹脂柱脫鹽，梯度乙醇洗脫，回收乙醇，任選檢測濃銀杏葉提取液總黃酮及銀杏內酯含量。
其中，用乙醇提取一般包括用3-8倍量50-95％，優(yōu)選約70％乙醇及任選的少量抗氧化劑回流提取2-5小時，共提取2-5次。調pH的堿可以是氫氧化鈣，碳酸氫鈉，碳酸鈉，碳酸鉀等，調pH的酸例如可以是鹽酸，乙酸，硫酸等。
熱水提取中熱水的溫度例如可以是60℃到100℃，也可以更高。
冷藏的溫度一般為-30℃到5℃，優(yōu)選約-5到5℃，更優(yōu)選約0℃。冷藏時間例如可以為2分鐘到72小時，優(yōu)選約1-20小時。
本發(fā)明的另一個目的是提供銀杏葉注射液的制備方法，該方法包括以下工序鮮銀杏葉清洗打漿，稠厚漿液用乙醇提取，醇提液用堿調pH8-10，過濾，濾液用酸調pH3-8，優(yōu)選5-6，過濾，濾液回收乙醇，獲得黑棕色粘稠物，熱水提取，水提液冷藏過濾，濾液上大孔樹脂柱脫鹽，梯度乙醇洗脫，回收乙醇，任選檢測濃銀杏葉提取液總黃酮及銀杏內酯含量，獲得銀杏葉提取物；將上述提取物用注射用水制成針劑，濃度使得相當于生藥0.5-5g/ml注射液。
其中，用乙醇提取一般包括用3-8倍量50-95％，優(yōu)選約70％乙醇及任選的少量抗氧化劑回流提取2-5小時，共提取2-5次。調pH的堿可以是氫氧化鈣，碳酸氫鈉，碳酸鈉，碳酸鉀等，調pH的酸例如可以是鹽酸，乙酸，硫酸等。
熱水提取中熱水的溫度例如可以是60℃到100℃，也可以更高。
冷藏的溫度一般為-30℃到5℃，優(yōu)選約-5到5℃，更優(yōu)選約0℃。冷藏時間例如可以為2分鐘到72小時，優(yōu)選約1-20小時。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了銀杏提取物，其特征在于由以下方法制備取鮮銀杏葉洗凈干燥后用帶打漿機打成漿，加3-8倍量60-95％，優(yōu)選約70％乙醇及抗氧化劑(例如基于鮮銀杏葉總重量的0.001-2wt％)回流提取2-5小時，共提取2-5次，合并醇提取液加入堿水溶液中調PH8-10，靜置2-6小時，過濾，再用酸，優(yōu)選鹽酸回調PH3-8，減壓回收乙醇得黑棕色粘稠物，加入3-8倍量熱蒸餾水攪勻煮沸10-25分鐘，20-40分鐘后過濾，濾渣再加熱水煮兩次合并濾液，冷藏過夜再次濾去不溶物，濾液上大孔樹脂柱用蒸餾水洗去鹽分，再用梯度乙醇從低濃度到高濃度洗脫，收集30％-80％乙醇洗脫部分，回收乙醇至無醇味，得濃銀杏葉提取液，任選檢測含量，獲得銀杏葉提取液。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了銀杏葉注射液，其特征在于由以下方法制備銀杏葉提取液的制備取鮮銀杏葉洗凈干燥后用帶打漿機打成漿，加3-8倍量60-95％，優(yōu)選約70％乙醇及少量抗氧化劑(例如基于鮮銀杏葉總重量的0.001-2wt％)回流提取2-5小時，共提取2-5次，合并醇提取液加入堿水溶液中調PH8-10，靜置2-6小時，過濾，再用酸，優(yōu)選鹽酸回調PH3-8，減壓回收乙醇得黑棕色粘稠物，加入3-8倍量熱蒸餾水攪勻煮沸10-25分鐘，20-40分鐘后過濾，濾渣再加熱水煮兩次合并濾液，冷藏過夜再次濾去不溶物，濾液上大孔樹脂柱用蒸餾水洗去鹽分，再用梯度乙醇從低濃度到高濃度洗脫，收集30％-80％乙醇洗脫部分，回收乙醇至無醇味，得濃銀杏葉提取液，任選檢測含量，獲得銀杏葉提取液；取上步之濃銀杏葉提取液適量，補足量注射用水(相當于0.5g-5g生藥/ml)并加0.05-0.25％針用活性炭，0.02％-0.06％抗氧化劑，例如NaHSO3、0.02％-0.06％EDTA-Na2煮沸5-25分鐘過濾，濾液再過超微濾膜(例如分子截留量為一萬的超微濾膜)，灌裝，根據(jù)需要分別制成不同規(guī)格針劑，熔封后滅菌(例如100℃滅菌15-30分鐘)即得可供肌注或靜滴的銀杏葉注射液成品。
本發(fā)明的提取原理及技術要點為提取全程不可遇鐵，否則黃酮變黑。
抗氧劑例如NaHSO3，抗壞血酸等避免黃酮受熱破壞降低收率。
鮮葉中含大量葉綠素及鞣質等雜質，在堿性乙醇中可產(chǎn)生沉淀去除掉。但堿性過高乃使總黃酮母核破壞故控制在PH10為佳。
用HCL回調至PH5.5時黃酮較穩(wěn)定耐熱利于精制。
大孔樹脂選D-101型，可很好地吸附總黃酮，而CaCl2等鹽分不被吸附隨水分洗出。
30％乙醇可洗出雙黃酮等無效成分。
EDTA-Na2(乙二胺四乙酸一二鈉)可防止微量金屬離子促總黃酮氧化，從而使針劑穩(wěn)定。
實施例1取鮮銀杏葉1000g，用打漿機粉碎成糊，加5000ml70％的乙醇及1gNaHSO3回流提取3小時，過濾再將濾渣同樣提取2次過濾，合并3次濾液加飽和石灰水調PH10，產(chǎn)生污綠色沉淀，靜置4小時以上，過濾，加鹽酸調PH5.5，減壓回收乙醇得到黑棕色粘稠物約300g，加1500ml熱蒸餾水煮沸15分鐘，過濾，濾渣再同樣提取兩次合并黃色水提液在0℃冷藏過夜過濾后上大孔樹脂柱(用800g樹脂可完全吸附)控制滴速至水流盡后先以30％乙醇洗雜質，至流出液無色后，再以50％乙醇洗脫至流出液無色為止，對50％乙醇洗脫液回收乙醇至無醇味得濃銀杏葉提取液約450ml，檢測含量，即可。
實施例2
取鮮銀杏葉1000g，用打漿機粉碎成糊，加5000ml70％的乙醇及1gNaHSO3回流提取3小時，過濾再將濾渣同樣提取2次過濾，合并3次濾液加飽和石灰水調PH10，產(chǎn)生污綠色沉淀，靜置4小時以上，過濾，加鹽酸調PH5.5，減壓回收乙醇得到黑棕色粘稠物約300g，加1500ml熱蒸餾水煮沸15分鐘，過濾，濾渣再同樣提取兩次合并黃色水提液在0℃冷藏過夜過濾后上大孔樹脂柱(用800g樹脂可完全吸附)控制滴速至水流盡后先以30％乙醇洗雜質，至流出液無色后，再以50％乙醇洗脫至流出液無色為止，對50％7醇洗脫液回收乙醇至無醇味得濃銀杏葉提取液約450ml，檢測含量，備用。
將上步所得濃銀杏葉提取液加注射用水600ml并加1g針用活性炭及0.4gNaHSO3、0.4gEDTA-Na2煮沸15分鐘，趁熱過濾，再用超微濾膜精濾，于充氮氣條件下灌裝熔封(2ml/支)于100℃滅菌15分鐘，制得銀杏葉注射液成品，避光保存。
試驗一、本發(fā)明銀杏葉注射液治療腦梗死臨床試驗本發(fā)明舒血寧注射液為銀杏葉提取物制劑。其中主要分為總黃酮醇甙、銀杏內脂。其有效成分能調節(jié)血管張力，改善臟器血液循環(huán)及末梢微循環(huán)。銀杏內酯B具有很強的PAF受體阻斷作用，抑制PAF活性，降低全血粘度，血漿粘度及血漿纖維蛋白原，改善血液流動特性，減少微血栓形成，并且它是一個較強的自由基清除劑，有較強的抗氧化和清除自由基作用。我院對入院96例急性腦梗死病人進行了療效對比分析。
病例選擇本觀察病例為住院患者，入選病人均符合1995年全國第四次腦血管會議修訂標準，并經(jīng)腦CT或腦MRI證實。病人治療前后神經(jīng)功能缺損評分采用歐洲評分標準。治療組50例，重型20例、中型18例、輕型12例對照組46例，重型21例、中型16例、輕型9例。治療組梗死部位基底節(jié)24例、放射冠10例、腦干2例、腦葉4例、丘腦5例、多發(fā)腔梗5例；對照組梗死部位基底節(jié)22例、放射冠8例、腦干1例、腦葉6例、丘腦3例、多發(fā)腔梗6例。
治療方法治療組舒血寧注射液(每2毫升含總黃酮醇甙1.68毫克、含銀杏內脂A0.12毫克)20毫升加入5％葡萄糖氯化鈉注射液250毫升靜脈滴注，qd，14天為一療程；腦多肽注射液20毫升加入5％葡萄糖氯化鈉注射液250毫升靜脈滴注，qd，14天為一療程；奧力?？? 10毫克，qd，po，30天為一療程。對照組血塞通注射液8毫升加入5％葡萄糖氯化鈉注射液250毫升靜脈滴注，qd，14天為一療程；腦多肽、奧力?？擞梅ㄍ?。兩組病人依病情需要加用甘露醇等治療，兩組病人于治療前后分別采靜脈血，進行血流變學檢查。
療效判定1、基本痊愈臨床癥狀和體征基本消失。2、顯效癱瘓肢體肌力恢復到4至5級，語言障礙部分恢復。3、有效癱瘓肢體肌力2級以上，語言障礙部分恢復。4、無效臨床癥狀和體征無變化。5、惡化病情加重。
結果1、臨床療效表1、兩組病人臨床療效比較

2、血液流變學變化表2兩組病人血液流變學變化

上述數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學處理后，P＜0.05兩組顯效率分別為85％和56％，治療組與對照組治療前后神經(jīng)功能缺損評分減少明顯(p＜0.001)兩組治療后血流變學指標間有顯著差異(p＜0.05)兩組比較治療組效果更好(p＜0.05)，結論本發(fā)明舒血寧注射液加用腦細胞活化劑及鈣離子拮抗劑治療腦梗死效果更佳。
本資料顯示本發(fā)明舒血寧注射液是一種強有力的自由基清除劑，有較強的抗氧化和清除自由基作用，可減輕腦水腫，預防動脈硬化的發(fā)生，還可以抗血小板聚集，降低血漿纖維蛋白原，抑制血栓的形成，增加腦血流，可使病人反應意識加快、記憶改善，改善腦供氧狀態(tài)，促進腦代謝作用，通過觀察證明舒血寧注射液治療腦梗塞療效明顯、迅速、安全，值得推廣。
試驗二、本發(fā)明注射液治療急性腦梗死效果評價資料與方法1、研究對象 急性腦梗死患者按1995年全國第四次腦血管學術會議通過的《各類腦血管病診斷要點》，并經(jīng)頭顱CT或MRI證實的腦梗死患者60例，用拋幣法隨機分為本發(fā)明舒血寧治療組和維腦路通對照組，治療組男18例，女12例，年齡37-75歲，平均62.4歲，其中重型病人3例，中型病人19例，輕型病人8例；對照組男19例，女11例，年齡41-74歲，平均61.5歲；其中重型3例，中型17例，輕型10例，兩組患者在年齡、性別、神經(jīng)功能缺損評分、合并病和并發(fā)癥經(jīng)卡方檢驗均無顯著差別。
2、治療方法 治療組用本發(fā)明舒血寧注射液10ml+10％葡萄糖200ml+胰島素4u每日1次靜滴，14日為1個療程。對照組用維腦路通1g+10％葡萄糖200ml+胰島素4u，兩組均同時用畢奧星15ml+生理鹽水200ml靜滴14日1療程，依病情需要加用甘露醇脫水治療。在治療前和14日后分別采靜脈血檢測NO、ET、SOD和MDA，四周后進行神經(jīng)功能缺損評分和ADL評分。
3、實驗室檢查 全部病人于入院當天和第二天清晨采空腹血，NO用硝酸還原酶法，ET用放射免疫分析法，SOD用鄰苯三酚自氧化酶法，MDA用硫代巴比妥TBA法，均銨說明書方法專業(yè)技師嚴格操作。
4、療效判定 參照第四次全國腦血管病會議評分標準基本痊愈功能缺損減少90-100％，病殘程度為0級；顯著進步功能缺損減少46-90％，病殘程度為1-3級；進步功能缺損減少18-45％；無變化功能缺損減少或增加17％；惡化功能缺損評分增加18％或死亡?？傆行蕿榛救?顯著進步+進步。ADL量表顯效治療后量表積分下降≥2/3；有效積分下降1/3-2/3；無效積分下降不足至1/3。
5、統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)處理均經(jīng)統(tǒng)計軟件包SPSS1.0分析處理。方法采用t檢驗和x2檢驗。
結果1、本發(fā)明注射液與對照組治療前后實驗室結果見表1。
2、本發(fā)明注射液與對照組治療前后神經(jīng)功能缺損評分見表2。
3、本發(fā)明注射液與對照治療前后ADL積分比較見表3。
表1 本發(fā)明注射液與對照組治療前后實驗室檢查比較(x±s)


與對照組比較*p＜0.05**P＜0.0 1，治療前后比較▲p＜0.05表2兩組治療前后神經(jīng)功能缺損評分比較(X±S)

與對照組比較*p＜0.05**P＜0.01，治療前后比較▲▲p＜0.01表3 兩組治療前后ADL評分比較(X±S)

▲與對照組比較p＜0.01討論急性腦梗死的病理生理機制復雜，與多種致病因素有關，其中NO、ET是局部血流調節(jié)因子，其動態(tài)平衡對維持腦血管舒縮功能有密切關系，當腦梗死后由于腦組織缺血缺氧，應激使ET增高，通過ET-A受體激活磷酸酯酶C產(chǎn)生三磷酸肌醇，繼而引起Ca2+內流，并產(chǎn)生自由基，而NO在腦缺血時則有神經(jīng)毒和神經(jīng)保護雙重作用。目前研究提示NO產(chǎn)生在最初幾個小時具有神經(jīng)保護作用。當腦梗死后NO迅速上升，24小時達到高峰，在腦梗死早期數(shù)分鐘內產(chǎn)生的NO是有利的，但數(shù)小時后到數(shù)天內產(chǎn)生的NO則對神經(jīng)有毒性。腦梗死后由于血管內皮因子的異常激發(fā)了大量自由基產(chǎn)生，遠遠超過機體的清除能力，造成自由基堆積和脂質過氧化反應，形成脂質過氧化物。MDA是氧自由基攻擊脂質導致過氧化物的代謝終產(chǎn)物，其含量反映了體內氧自由基的生成水平及其對腦組織的損傷程度。SOD可以催化超氧銀離子生成H2O2和O2，SOD，可以保護腦組織，是清除氧自由基的主要指標。本研究結果提示本發(fā)明注射液可以降低NO和ET的毒性作用，.提高SOD含量，從而有效拮抗過氧化損傷，清除自由基，保護腦細胞和減少細胞凋亡。另外銀杏內酯B具有很強的PAF受體阻斷作用，抑制PAF活性，降低全血粘度、血漿粘度及纖維蛋白元，減少血栓形成和改善微循環(huán)，能有效治療腦梗死而無明顯毒副作用，是治療和預防急性腦梗死的頗具應用前景的良藥。
權利要求
1.一種銀杏葉提取物，該提取物通過以下方法制備鮮銀杏葉清洗打漿，稠厚漿液用乙醇提取，醇提液用堿調pH8-10，過濾，濾液用酸調pH3-8，優(yōu)選5-6，過濾，濾液回收乙醇，獲得黑棕色粘稠物，熱水提取，水提液冷藏過濾，濾液上大孔樹脂柱脫鹽，梯度乙醇洗脫，回收乙醇，任選檢測濃銀杏葉提取液總黃酮含量及銀杏內酯含量。
2.根據(jù)權利要求1的銀杏葉提取物，其中用乙醇提取包括用3-8倍量50-95％乙醇及任選的少量抗氧化劑回流提取2-5小時，共提取2-5次。
3.根據(jù)權利要求1的銀杏葉提取物，其中冷藏的溫度一般為-30℃到5℃，優(yōu)選約-5到5℃，更優(yōu)選約0℃，冷藏時間為2分鐘到72小時，優(yōu)選約1-20小時。
4.銀杏葉注射液，該注射液由以下方法制備鮮銀杏葉清洗打漿，稠厚漿液用乙醇提取，醇提液用堿調pH8-10，過濾，濾液用酸調pH3-8，優(yōu)選5-6，過濾，濾液回收乙醇，獲得黑棕色粘稠物，熱水提取，水提液冷藏過濾，濾液上大孔樹脂柱脫鹽，梯度乙醇洗脫，回收乙醇，任選檢測濃銀杏葉提取液總黃酮及銀杏內酯含量，獲得銀杏葉提取物；將上述提取物用注射用水制成針劑。
5.根據(jù)權利要求4的銀杏葉注射液，其中用乙醇提取包括用3-8倍量50-95％乙醇及任選的少量抗氧化劑回流提取2-5小時，共提取2-5次。
6.根據(jù)權利要求1的銀杏葉注射液，其中冷藏的溫度一般為-30℃到5℃，優(yōu)選約-5到5℃，更優(yōu)選約0℃，冷藏時間為2分鐘到72小時，優(yōu)選約1-20小時。
7.銀杏提取物，其特征在于由以下方法制備取鮮銀杏葉洗凈干燥后用帶打漿機打成漿，加3-8倍量60-95％，優(yōu)選約70％乙醇及抗氧化劑(例如基于鮮銀杏葉總重量的0.001-2wt％)回流提取2-5小時，共提取2-5次，合并醇提取液加入堿水溶液中調PH8-10，靜置2-6小時，過濾，再用酸，優(yōu)選鹽酸回調PH3-8，減壓回收乙醇得黑棕色粘稠物，加入3-8倍量熱蒸餾水攪勻煮沸10-25分鐘，20-40分鐘后過濾，濾渣再加熱水煮兩次合并濾液，冷藏過夜再次濾去不溶物，濾液上大孔樹脂柱用蒸餾水洗去鹽分，再用梯度乙醇從低濃度到高濃度洗脫，收集30％-80％乙醇洗脫部分，回收乙醇至無醇味，得濃銀杏葉提取液，任選檢測含量，獲得銀杏葉提取液。
8.銀杏葉注射液，其特征在于由以下方法制備銀杏葉提取液的制備取鮮銀杏葉洗凈干燥后用帶打漿機打成漿，加3-8倍量60-95％，優(yōu)選約70％乙醇及少量抗氧化劑(例如基于鮮銀杏葉總重量的0.001-2wt％)回流提取2-5小時，共提取2-5次，合并醇提取液加入堿水溶液中調PH8-10，靜置2-6小時，過濾，再用酸，優(yōu)選鹽酸回調PH3-8，減壓回收乙醇得黑棕色粘稠物，加入3-8倍量熱蒸餾水攪勻煮沸10-25分鐘，20-40分鐘后過濾，濾渣再加熱水煮兩次合并濾液，冷藏過夜再次濾去不溶物，濾液上大孔樹脂柱用蒸餾水洗去鹽分，再用梯度乙醇從低濃度到高濃度洗脫，收集30％-80％乙醇洗脫部分，回收乙醇至無醇味，得濃銀杏葉提取液，任選檢測含量，獲得銀杏葉提取液；取上步之濃銀杏葉提取液適量，補足量注射用水(相當于0.5g-5g生藥/ml)并加0.05-0.25％針用活性炭，0.02％-0.06％抗氧化劑，例如NaHSO3、0.02％-0.06％EDTA-Na2煮沸5-25分鐘過濾，濾液再過超微濾膜(例如分子截留量為一萬的超微濾膜)，灌裝，根據(jù)需要分別制成不同規(guī)格針劑，熔封后滅菌(例如100℃滅菌15-30分鐘)即得可供肌注或靜滴的銀杏葉注射液成品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種銀杏葉提取物，該提取物通過以下方法制備鮮銀杏葉清洗打漿，稠厚漿液用乙醇提取，醇提液用堿調pH8－10，過濾，濾液用酸調pH3－8，優(yōu)選5－6，過濾，濾液回收乙醇，獲得黑棕色粘稠物，熱水提取，水提液冷藏過濾，濾液上大孔樹脂柱脫鹽，梯度乙醇洗脫，回收乙醇，任選檢測濃銀杏葉提取液總黃酮含量。本發(fā)明還涉及銀杏葉注射液，其制備包括進一步將上述提取物制成注射液。本發(fā)明的銀杏葉提取物和注射液有效成分如總黃酮、銀杏內酯等含量高，治療效果優(yōu)異。
文檔編號A61P9/00GK1481793SQ0315005
公開日2004年3月17日 申請日期2003年7月31日 優(yōu)先權日2003年7月31日
發(fā)明者郭東宇 申請人:郭東宇