專利名稱：氯胺酮和其代謝物的半抗原、免疫原、抗體和偶聯(lián)物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于制備免疫原、抗體和偶聯(lián)物的半抗原，用于競爭性免疫測試中檢測氯胺酮[(±)-2-(鄰-氯苯基)-2-(甲氨基)環(huán)己酮]和它的初級代謝物，去甲氯胺酮(norketamine)。
本發(fā)明也涉及檢測或測定氯胺酮和去甲氯胺酮的方法和試劑盒。
“檢測”是指定性分析物質(zhì)的有無。
“測定”是指定量分析物質(zhì)的數(shù)量。
氯胺酮(參見附圖-1)是已經(jīng)在臨床上使用了30年的短效腸胃外麻醉劑。該藥物在亞麻醉劑量時就引起深度鎮(zhèn)痛，沒有大多數(shù)其他常規(guī)麻醉劑相關的心臟呼吸受抑作用。盡管存在這些重要的臨床優(yōu)點，但是，煩擾的應急反應，包括神志不清和惡夢經(jīng)常伴隨氯胺酮的治療，限制它的臨床應用。雖然這些中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)副作用的起源仍不清楚，已經(jīng)有人推測，氯胺酮的代謝物可能在其中發(fā)揮重要作用，因為在氯胺酮誘導麻醉緊急情況中，母體藥物的循環(huán)濃度非常低。氯胺酮通過肝酶進行了廣泛的代謝，通過N去甲基化，主要產(chǎn)生了去甲氯胺酮(參見附圖-1)。該一級胺進一步在環(huán)己酮環(huán)系統(tǒng)的4，5和/或6位產(chǎn)生羥基化的去甲氯胺酮家族而發(fā)生代謝，其中主要成份是6-羥基去甲氯胺酮(參見附圖-1)。
現(xiàn)有技術目前，生物液體中氯胺酮和代謝物的測定主要是基于氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)和HPLC。這些色譜方法提供了良好的敏感度和選擇性，但需要衍生氯胺酮和它的代謝物。另外，這些方法作為篩選工具，太昂貴且耗時。
特定的結(jié)合反應，如抗體-抗原反應已經(jīng)廣泛用于檢測生物液體中存在的各種物質(zhì)的免疫測試中。
所以，例如，可以用放射免疫測定來測定氯胺酮和它的代謝物。放射免疫測定非常敏感，但需要放射核素示蹤物，例如125I和3H，在某些情況中，還需要一個初級萃取步驟。對于氯胺酮，沒有已知的RIA。
酶聯(lián)免疫吸附測試(ELISA)是非放射性活性的或選方法，可以用于定性和定量地測定氯胺酮和它的代謝物。另外，當2002年1月31日提交構(gòu)成優(yōu)選權(quán)的歐洲專利申請02075445.3時，還沒有已知檢測氯胺酮的ELISA。從那時開始，Neogen公司研制了針對氯胺酮的ELISA試劑盒，其與氯胺酮有100％的交叉反應性，與去甲氯胺酮有4.6％的交反應性?？梢韵嘈牛琋eogen試劑盒應用了針對摻入至少氯胺酮甲氨基表位的氯胺酮半抗原研制的抗體和偶聯(lián)物。
EP 0459 387 A2(Abbott實驗室)描述了對苯環(huán)利定和一些苯環(huán)利定衍生物的熒光極化測試。將苯環(huán)己胺衍生物與載體物質(zhì)偶聯(lián)以產(chǎn)生免疫原，與熒光素衍生物偶聯(lián)產(chǎn)生示蹤物?？贵w，優(yōu)選單克隆抗體是免疫原產(chǎn)生的。利用了前面提到的抗體和示蹤物研制了苯環(huán)利定和苯環(huán)利定衍生物的免疫測定方法。所述免疫測定方法對苯環(huán)利定、苯環(huán)利定代謝物和苯環(huán)利定類似物具有高度的特異性。它與氯胺酮沒有明顯的交叉反應(參見第8頁表3(c))。雖然苯環(huán)己胺衍生物與本發(fā)明的半抗原具有結(jié)構(gòu)相似性，但Abbott免疫測試中缺乏與氯胺酮的交叉反應性證實，在苯環(huán)上缺少氯和在環(huán)己基環(huán)上缺少羰基都是顯著的。
Owens等(′Antibodies against arylcyclohexylamines and their similarities inbinding specificity with the phencyclidine receptor′(J.Pharmacol.Exp.Ther.(1988)，246(2)，472-478))描述了針對苯環(huán)利定(PCP)類似分子5個表位的抗體，以確定與PCP受體結(jié)合的芳基環(huán)己胺的分子需求。從PCP衍生物和TCP類似物合成4個半抗原，即PCHP；PCHBA；tPPC和TCHP。從苯環(huán)己胺制成第5個半抗原PCHAP。這些半抗原與BSA結(jié)合產(chǎn)生用于制備抗體的免疫原。所產(chǎn)生的抗體對于PCP和一些相關化合物是高度特異的，但與氯胺酮具有非常低的交叉反應性(＜0.6％)(表2，第475頁)。半抗原PCHAP與本發(fā)明的半抗原不同之處在于苯環(huán)上沒有氯，環(huán)己環(huán)上沒有羰基。與氯胺酮沒有交叉反應性再次證實這兩個部分的缺失是顯著的。
Owens等人(′Melecular requirements for an immunological model of thephencyclidine receptor′，生物學中作為分子探針的Sigma和PCP類似化合物，1988)描述了針對PCP和其他芳基環(huán)己胺的半抗原、免疫原和抗體的制備(表1，第667頁)。制備了4個半抗原PCHP；tPPC；PCHBA和PCHAP(參見

圖1，第665頁)。產(chǎn)生的抗體顯示對PCP和相關化合物的高水平交叉反應性，但對氯胺酮的低水平交叉反應性，如高IC50值所示(表1，第667頁)。氯胺酮的交叉反應性，又一次證實缺少氯和羰基是有意義的。
Leung等(′Comparative pharmacology in the rat of ketanine and its twoprincipal metabolites，norketamine and(z)-6-hydronorketamine，J Med Chem(1986)，29(11)，2396-2399)描述了從氯胺酮的初級代謝物，去甲氯胺酮合成(z)-6-羥基去甲氯胺酮(一種氯胺酮的次級代謝物)。他們也進行了氯胺酮、去甲氯胺酮和(z)-6-羥基去甲氯胺酮在大鼠上比較藥理學研究。Leung等人既沒有公開也沒有建議怎樣制備針對氯胺酮或去甲氯胺酮的半抗原、免疫原和抗體。
發(fā)明詳述在第一方面，本發(fā)明提供了在去甲氯胺酮的N位置用交聯(lián)劑派生半抗原。
優(yōu)選地半抗原具有下面的結(jié)構(gòu)式 其中R是二價鍵，X是末端基團。
最優(yōu)選地，R包括取代的或未取代的、直鏈的或支鏈的、飽和的或未飽和的亞烷基成分；和X包括羧酸或其酯；一種胺、馬來酰亞胺、鹵代羧酸或其酯、醛、二硫吡啶成分、乙烯砜成分或硫代羧酸或其酯。
所以，在優(yōu)選的實施方案的通式中，交聯(lián)劑包括-R-X。在本發(fā)明最廣泛的方面中，交聯(lián)劑也可以包括-R-X。
更優(yōu)選地，R是C1-5，最優(yōu)選地C3，取代或未取代，直鏈，飽和的亞烷基成分。
最優(yōu)選地，如果存在取代基時，取代基是羰基基團。
優(yōu)選地，X選自羧酸，硫代羧酸，二硫吡啶，馬來酰亞胺，或醛成分。最優(yōu)選地，X是羧基(COOH)或硫代乙?；?SCOCH3)成分。
最優(yōu)選地，半抗原選自下面去甲氯胺酮半抗原衍生物N-(4′-羧丙基)去甲氯胺酮(半抗原A)；N-(3′-乙?；虼?去甲氯胺酮(半抗原B)；和N-(3′-乙?；虼０被?去甲氯胺酮(半抗原C)。
這些新型半抗原是通過利用適當?shù)慕宦?lián)劑對去甲氯胺酮進行N-衍生化，優(yōu)選N烷基化制備。
得到的半抗原進一步在這些功能化位置進行修飾，以便與修飾或未修飾的載體物質(zhì)結(jié)合提供生產(chǎn)抗體的免疫原，和具有良好的敏感性和特異性的結(jié)合物(示蹤物)，以檢測或測定氯胺酮和去甲氯胺酮。
本發(fā)明公開了去甲氯胺酮的第一半抗原衍生物的制備。通過將它們與修飾或未修飾的產(chǎn)生抗原性的載體物質(zhì)結(jié)合，來制備免疫原。然后，對哺乳動物寄主注射得到的免疫原，引發(fā)特異抗體的產(chǎn)生，優(yōu)選多克隆抗體，然后用來研發(fā)氯胺酮和去甲氯胺酮的競爭性免疫測定，利用與標記試劑結(jié)合的半抗原作為檢測試劑。
本發(fā)明也提供了包括本發(fā)明的半抗原與產(chǎn)生抗原性的載體物質(zhì)結(jié)合的免疫原。優(yōu)選載體物質(zhì)是蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、合成多肽或半合成多肽。
另一方面本發(fā)明涉及抗本發(fā)明免疫原的抗體，抗體能夠結(jié)合至少一個去甲氯胺酮或去甲氯胺酮的結(jié)構(gòu)表位。優(yōu)選結(jié)構(gòu)表位是氯胺酮和去甲氯胺酮的芳基環(huán)己酮成分，更優(yōu)選是氯苯基環(huán)己酮成分，最優(yōu)選是鄰-氯苯基環(huán)己酮成分。
另一方面本發(fā)明涉及具有氯胺酮特異性的抗體，特征是與去甲氯胺酮具有超過100％，優(yōu)選地100-175％的交叉反應性。
另一方面本發(fā)明包括本發(fā)明的半抗原共價結(jié)合可檢測的標記試劑的偶聯(lián)物。優(yōu)選地，該標記試劑選自酶、發(fā)光物質(zhì)、放射活性物質(zhì)或其混合物。更優(yōu)選地，該標記試劑是酶，優(yōu)選地是過氧化物酶，最優(yōu)選地是辣根過氧化物酶(HRP)。或者，或另外，發(fā)光物質(zhì)可以是生物發(fā)光、化學發(fā)光或熒光物質(zhì)。
本發(fā)明另外提供了制備抗體的方法，該方法包括免疫(接種)動物，優(yōu)選地是脊椎動物，最優(yōu)選地是哺乳動物，重復注射本發(fā)明的免疫原，和從被免疫(接種)的動物收集得到的血清。優(yōu)選地，該過程進一步包括將所述的血清抗體固定到載體上，優(yōu)選地是固體支持物，最優(yōu)選地是聚苯乙烯固體支持物。優(yōu)選地，該抗體是多克隆抗體?；蛘撸摽贵w是單克隆抗體。
另一方面本發(fā)明包括檢測或測定樣品中氯胺酮和去甲氯胺酮的方法，該方法包括將樣品與本發(fā)明的偶聯(lián)物或其混合物接觸，和與本發(fā)明的抗體或其混合物接觸；檢測或測定結(jié)合的偶聯(lián)物；和從校正曲線推測樣品中氯胺酮和去甲氯胺酮的存在或其數(shù)量。
另一方面本發(fā)明包括檢測或測定氯胺酮和去甲氯胺酮的試劑盒，該試劑盒包括本發(fā)明的偶聯(lián)物或其混合物；和本發(fā)明的抗體或其混合物。該試劑盒選擇性地可以包括所述偶聯(lián)物和所述抗體用于檢測或測定樣品中的氯胺酮和去甲氯胺酮的使用說明。
優(yōu)選地，該樣品是溶液，如生物液體。更優(yōu)選地該樣品是血清或尿。
在本發(fā)明的方法和試劑盒中，優(yōu)選地，(免疫原和偶聯(lián)物的)各個交聯(lián)劑是不同的。
另一方面本發(fā)明包括本發(fā)明的偶聯(lián)物或其混合物與本發(fā)明的抗體或其混合物在檢測或測定樣品中如生物液體中氯胺酮和去甲氯胺酮中的應用。
半抗原的制備半抗原N-(4′-羧丙基)去甲氯胺酮A，N-(3′-乙?；虼?去甲氯胺酮B和N-(3′-乙?；虼０坊?去甲氯胺酮C根據(jù)附圖2制備。用溴在四氯化碳對(鄰—氯苯)環(huán)戊酮1中進行溴化得到了α-溴-(鄰-氯苯)環(huán)戊酮2。用液氨處理溴代酮2得到1-[(鄰-氯苯)亞胺甲基]環(huán)戊醇3。去甲氯胺酮4是在200℃時，醇亞胺3熱重排后得到的。在氰氫化硼存在下，用琥珀醛酸(succinicsemialdehyde)對去甲氯胺酮4進行N-烷基化得到N-(4′-羧丙基)去甲氯胺酮(半抗原A)。在乙醇堿性溶液中，將去甲氯胺酮4與乙酸碘代丙硫酯(iodopropyl-thioacetate)反應得到N-(3′-乙?；虼?去甲氯胺酮(半抗原B)。通過去甲氯胺酮4與3-乙?；虼嵩贓DC鹽酸和吡啶存在時，在DMF中反應得到了N-(3′-乙?；虼０坊?去甲氯胺酮(半抗原C)。
根據(jù)附圖3，用6個步驟制備半抗原6-O-(3′-乙?；虼?去甲氯胺酮D。首先，在苯中，在碳酸鈉(Na2CO3)存在時，去甲氯胺酮4與氯甲酸甲酯回流，首先轉(zhuǎn)化成氨基甲酸甲酯衍生物5。用二異丙胺鋰(LDA)和三甲基甲硅烷基氯(TMSC)在四氫呋喃(THF)中，在-78℃處理氨甲酸甲酯5得到相應的三甲基甲硅烷基烯醇醚6。在Na2CO3存在下，用間-氯過苯甲酸(MCPBA)氧化6得到N保護的6羥基去甲氯胺酮7。在堿性條件下用烯丙基溴對6進行O-烷基化得到衍生物8。利用三甲基甲硅烷基碘除去8的甲氧基羰基保護基團，接著在氯仿中，在2′，2′-偶氮二(2-甲基丙腈)(AIBN)催化劑存在下回流，與硫代乙酸反應得到中等產(chǎn)量的半抗原6-O-(3′-乙?；虼?去甲氯胺酮D。
免疫原和偶聯(lián)物的制備雖然本發(fā)明的半抗原提供了確定的結(jié)構(gòu)表位，但它們本身不具備免疫原性，所以需要與載體物質(zhì)結(jié)合，當對宿主動物給藥時，將引發(fā)免疫原性應答。適當?shù)妮d體物質(zhì)通常含有聚(氨基酸)片段并且包括多肽、蛋白質(zhì)和糖蛋白。有用載體物質(zhì)的例證性實例是小牛血清白蛋白(BSA)、雞蛋白蛋白、小牛γ球蛋白、甲狀腺素結(jié)合球蛋白，鑰孔戚血藍蛋白(KLH)等。或者，可以利用具有足夠數(shù)目氨基的合成聚(氨基酸)，如賴氨酸，也可以是其他具有反應官能團的合成或天然多聚體物質(zhì)。特定地，可以將碳水化合物、酵母或多糖可以與半抗原結(jié)合制備免疫原。
本發(fā)明的每個半抗原也可以與標記試劑，如酶(例如，辣根過氧化物酶)，具有熒光特性的物質(zhì)或放射活性標記物結(jié)合用于制備偶聯(lián)物(或檢測試劑)，用于免疫測定。熒光物質(zhì)可以是例如熒光素或其衍生物的單價殘基。
在用本發(fā)明的半抗原制備免疫原或偶聯(lián)物時，若其中存在硫代基團，如半抗原B，C和D，首先可以利用雜雙功能接頭將馬來酰亞胺，鹵素或乙烯砜基團導入到載體物質(zhì)或標記試劑(酶或標記物)中；這些雜雙功能接頭如N-(g-馬來酰亞胺基丁酰氧)琥珀酰亞胺酯(GMBS)；琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC)；(m-馬來酰亞胺基苯?；?-N-羥基琥珀酰亞胺(MBS)；琥珀酰亞胺基4-(對-馬來酰亞胺基苯基)丁酸酯(SMPB)；N-琥珀酰亞胺基(4-碘乙?；?氨基苯甲酸酯(SIAB)；溴乙?；拾彼酦-羥基琥珀酰亞胺；N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)；或乙烯砜(Pierce化學公司，美國)。然后，這樣修飾的載體物質(zhì)，或標記試劑可以通過半抗原，例如半抗原B，C和D上的硫基團結(jié)合起來。對于沒有硫基團的半抗原，如半抗原A，結(jié)合是與沒有預先修飾的載體物質(zhì)或標記試劑，利用標準結(jié)合方法，如混合甲醛，EDC或半抗原的琥珀酰亞胺活化來進行的。
為了證明半抗原與載體物質(zhì)具有足夠結(jié)合量，在免疫(接種)之前，利用基質(zhì)輔助UV激光吸收/離子時間-飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)對每個免疫原進行評估。本發(fā)明的各個免疫原適用于免疫接種，以便產(chǎn)生用于檢測氯胺酮和去甲氯胺酮的抗體。
免疫原的MALDI-TOF分析的一般過程利用Voyager STR生物光譜儀研究站激光吸收質(zhì)譜儀結(jié)合延遲萃取進行MALDI-TOF質(zhì)譜分析。用0.1％的三氟乙酸(TFA)水溶液稀釋每個待分析樣品，制備1mg/ml樣品溶液。利用芥子酸作為基質(zhì)分析等分試樣(1μl)，小牛血清白蛋白(Fluka)用作外部校準樣品。附圖5顯示BSA載體物質(zhì)的分析結(jié)果。正如將要看到的，出現(xiàn)的主要信號顯示這一樣品的平均質(zhì)子化質(zhì)量是m/z 66,404。在m/z 33,200的信號是與雙電荷形式的主要成分一致。另外觀察到的信號包括m/z 13,605。
抗血清的制備為了生產(chǎn)多克隆抗血清，將本發(fā)明的各個免疫原與弗氏佐劑混合，將混合物注射到宿主動物，如兔子、羊、小鼠、豚鼠或馬體內(nèi)。進一步注射(加強)，取血清樣評估抗體效價。當獲得了最佳效價時，取宿主動物血，生產(chǎn)適當體積的特異抗血清?？贵w純化程度取決于所應用目的。對于許多目的來說，不需要純化。但是，在其他情況中，如在固體支持物上固定抗體，進行純化步驟以除去不需要的物質(zhì)和消除非特異的結(jié)合。
本發(fā)明中制備的特異抗體可用作免疫測定中的試劑，用于檢測或測定生物液體中的氯胺酮和去甲氯胺酮。本發(fā)明的抗體能夠與氯胺酮和去甲氯胺酮的芳基環(huán)己酮成分結(jié)合，優(yōu)選地與氯苯環(huán)己酮成分結(jié)合，最優(yōu)選地與鄰—氯苯環(huán)己酮成分結(jié)合。
附圖簡要說明通過詳細描述典型技術方案及其附圖，本發(fā)明的上面和其他的特征和優(yōu)點將變得更為清晰。
圖1例舉說明氯胺酮和它的代謝物的結(jié)構(gòu)；圖2例舉說明制備半抗原A，B和C的反應路線；圖3例舉說明制備半抗原D的化學反應；圖4例舉說明氯胺酮和去甲氯胺酮的競爭性ELISA微量滴定板試驗；圖5例舉說明BSA載體物質(zhì)的MALDI-TOF質(zhì)譜圖；圖6例舉說明免疫原A的MALDI-TOF質(zhì)譜圖7例舉說明溴乙?；拾彼嵝揎椀腂SA的MALDI-TOF質(zhì)譜圖；圖8例舉說明免疫原B的MALDI-TOF質(zhì)譜圖；圖9例舉說明免疫原C的MALDI-TOF質(zhì)譜圖；圖10例舉說明去甲氯胺酮的13C-NMR圖。
圖11例舉說明半抗原A的13C-NMR圖。
圖12例舉說明半抗原B的13C-NMR圖。
實施例實施例1制備a-溴-(鄰-氯苯)環(huán)戊酮2在惰性氣體下向溶解在25毫升無水四氯化碳中的(鄰-氯苯)環(huán)戊酮1(21.0g，0.1mol)的溶液中，0℃下，在30分鐘的時期內(nèi)，滴加溶于100毫升四氯化碳中的溴(16.17g，0.1mol)。在加入所有溴后，形成了橙色懸浮液。在室溫下，攪拌懸浮液30分鐘，然后用10％(w/v)的二硫化鈉(2×100ml)洗滌。在無水硫酸鈉上干燥有機相，過濾和在減壓條件下蒸發(fā)至干，得到黑棕色油狀的α-溴-(鄰-氯苯)環(huán)戊酮2(24.0g，83％)，不進行純化用于實施例2。
實施例21-[(鄰-氯苯)亞胺甲基]環(huán)戊醇3的制備在-78℃下，向液氨溶液(100ml)用1小時分批加入粗制化合物2(24.0g，0.0834mol)。然后，攪拌混合物4小時，允許氨蒸發(fā)過夜。用四氫呋喃懸浮得到的固體殘留物，過濾除去沉淀。在減壓條件下濃縮濾液，用石油醚研磨得到的殘留物。濾出得到的沉淀，在P2O5下干燥過夜得到白色固體的1-[(鄰-氯苯)亞胺甲基]環(huán)戊醇3的游離堿(16.8g，90％)。
IR(KBr)3210.9；1635.9；763.3cm-1NMR13C(CDCl3)183.4；138.2；130.3；130.0；129.8；127.2；84.9；38.6(2C)；23.6(2C)ppm.
M.P.(石油醚)88-90℃將20g(0.089mol)化合物3的游離堿溶解于25ml異丙醇中，在該溶液中加入100毫升乙醚的鹽酸溶液(2N)制備1-[(鄰-氯苯)亞胺甲基]環(huán)戊醇鹽酸鹽3。然后，攪拌混合物10分鐘，過濾得到的沉淀，用乙醚洗滌，干燥得到白色固體的混合物3的鹽酸鹽(23.14g，100％)。
M.P.144-146℃實施例3[2-氨基-2-(鄰-氯苯基)]環(huán)己酮(去甲氯胺酮)4的制備在200℃，化合物3的鹽酸鹽(20g，0.077mol)以一份一份地加入到250ml的Dowtherm-ATM中，在200℃攪拌該混合物15分鐘。在10℃冷卻該反應混合物，除去形成的沉淀，通過過濾丟棄。用醚中稀釋濾液，用水萃取(2×200ml)。用醚洗滌合并的水相，用6N氫氧化鈉調(diào)節(jié)堿性，用醚萃取(2×150ml)。用水洗滌合并的醚層，干燥和濃縮至干。在硅膠(70％己烷/30％乙酸乙酯)上快速色譜純化殘留物，得到去甲氯胺酮游離堿4(13.75g，80％)，無色油狀物。
IR(薄膜)3381.47；3310.15；3064.64；1939.96；2864.94；1712.61和757.0。
NMR13C(CDCl3)212.85；140.47；133.11；131.08；129.01；128.36；127.24；66.52；41.35；39.06；28.42；22.23(圖10)。
實施例4N-(4′-羧丙基)去甲氯胺酮-半抗原A的制備在0℃時向15％的琥珀醛酸溶液(5ml，8.018mmol，811.7mg)中加入四氫呋喃(20ml)、去甲氯胺酮4(1.38g，6.17mmol和氰基硼氫化鈉(388mg，6.17mmol)。在室溫下攪拌該混合物2小時，薄層層析(10％甲醇的氯仿液)證明，起始物質(zhì)(去甲氯胺酮4)不再存在。向這一溶液中，加入20ml 1N鹽酸，再攪拌該反應混合物1小時。在減壓下蒸發(fā)四氫呋喃，用氫氧化鈉(1N)將剩余水溶液中和到pH7，并且用氯仿(3×50ml)萃取。用5％的碳酸氫鈉溶液(50ml)、水(50ml)洗滌合并的有機層，在無水硫酸鈉上干燥，過濾和濃縮至干。通過在硅膠上層析(10％甲醇的氯仿液)純化殘留物，得到0.8g(38.8％)的N-(4′-羧丙基)去甲氯胺酮(半抗原A)的白色吸濕泡沫。
IR(薄膜)3354.76；3056.10；1721.05；1265.70；736.68。
NMR13C(CDCl3)208.26；175.37；135.33；134.27；131.47；129.85；129.76；127.08；70.49；42.72；39.02；38.21；34.7；29.01；24.54；21.93(圖11)。
實施例5N-(3′-乙?；虼?去甲氯胺酮-半抗原B的制備在去甲氯胺酮4(2.5g，0.011mol)50ml無水乙醇溶液中加入三乙胺，TEA，(2ml)和乙酸碘代丙基硫酯(2.95g，0.0121mol)?；旌衔飻嚢杌亓?8小時(TLC顯示反應完成)。蒸發(fā)溶液至干，通過在硅膠(60％己烷/40％乙酸乙酯)上層析純化殘留物，獲得1.8g(48％)的N-(3′-乙?；虼?去甲氯胺酮(半抗原B)的亮黃色油形式。
IR(薄膜)3354.33；3063.62；2937.2；2863.86；1692.95(br)和757.97。
NMR13C(CDCl3)209.27；196.51；138.84；134.11；131.6；129.52；129.04；127.06；70.21；41.2；39.83；39.6；30.99；30.92；28.22；27.15和22.2(圖12)。
實施例6N-(3′-乙?；虼０坊?去甲氯胺酮-半抗原C的制備向溶于10ml無水DMF的去甲氯胺酮4(2.5g，0.011mol)溶液中，在氮氣條件下加入3-乙酰基硫代丙酸(1.79g，0.012mol)，EDC鹽酸鹽(2.53g，0.013mol)和吡啶(1.9g，0.024mol)。然后，在室溫下攪拌該混合物2小時(TLC表明反應中沒有起始物質(zhì))。將混合物蒸發(fā)至干，在硅膠(50％己烷/50％乙酸乙酯)上快速層析純化粗制產(chǎn)物，得到2.3g(62％)的N-(3′-乙?；虼０坊?去甲氯胺酮(半抗原C)的黃色油形式。
IR(薄膜)3353.79；3066.59；2944.2；2867.78；1736.06；1682(br)和760.16。
實施例7半抗原A與BSA的結(jié)合-免疫原A將在水(0.5ml)中溶解104mg的EDC鹽酸鹽，立即加入到溶于DMF(1ml)的半抗原A溶液(70mg，0.22mmol)中。在混合后，將這一溶液加入到溶于10ml水的BSA(200mg)溶液中。立即加入Sulfo-NHS(52mg)，在室溫下攪拌過夜溫育反應混合物。然后，用磷酸緩沖鹽水溶液(PBS)，pH7.2透析混合物24小時(換液3次)，冷凍干燥。
根據(jù)MALDI-TOF(參見附圖6)，出現(xiàn)的信號表明，這一樣品的平均質(zhì)子化質(zhì)量是m/z 69,227。這些數(shù)據(jù)表明，每分子BSA已經(jīng)結(jié)合了平均9.7個分子的半抗原A。
實施例8溴代乙?；拾彼嵝揎椥∨Ｑ灏椎鞍椎闹苽湎駼SA(1g)的0.1M硼酸緩沖液(pH8.5，45ml)中，冷卻到0℃滴加溶于DMF(5ml)的N-琥珀酰亞胺溴乙?；拾彼?0.375g，0.13mmole)。在滴加過程中，維持pH為8.0，在0℃攪拌溶液1小時。調(diào)節(jié)pH到7，在4℃下用蒸餾水透析該溶液24小時(換液3次)。冷凍干燥該溶液得到990mg溴乙?；拾彼嵝揎椀腂SA。
根據(jù)MALDI-TOF(參見附圖7)，出現(xiàn)主要信號表明，這一樣品的平均質(zhì)子化質(zhì)量為m/z 73,264。在m/z 36,644的信號是與雙電荷形式的主要成分一致。這些數(shù)據(jù)表明，溴乙?；拾彼嵝揎椓似骄?8.6個賴氨酸基團。
實施例9半抗原B與溴乙酰基甘氨酸修飾BSA的結(jié)合-免疫原B將半抗原B(70mg)溶解于0.12M碳酸鉀的80％甲醇/20％水溶液中(1ml)。然后，在氮氣下放置混合物10到15分鐘(TLC表明沒有半抗原B，形成新的化合物具更低的Rf)。加入磷酸鹽緩沖液(1ml-pH7)終止反應，加入幾滴0.5M鹽酸，將pH調(diào)節(jié)到7。逐滴將該溶液加入修飾的BSA溶液(200mg溶于10毫升水)中，在4℃攪拌過夜(避光保護)。用蒸餾水透析溶液24小時(換液3次)，冷凍干燥。
根據(jù)MALDI-TOF(參見附圖8)，存在的主要信號表明，這一樣品的平均質(zhì)子化質(zhì)量m/z是75,860。信號m/z38,077是與雙電荷形式的主要成分一致。這些數(shù)據(jù)表明，平均8.8個分子的半抗原B結(jié)合到一個溴乙?；拾彼嵝揎椀腂SA上。
實施例10半抗原C與溴乙?；拾彼嵝揎桞SA的結(jié)合-免疫原C用與半抗原B相同的方法(實施例9)，將半抗原C與溴乙?；拾彼嵝揎椀腂SA結(jié)合。
根據(jù)MALDI-TOF(參見附圖9)，存在的信號表明，這一樣品的平均質(zhì)子化質(zhì)量m/z 76,424。信號m/z 38,050與雙電荷形式的主要成分一致。這些數(shù)據(jù)表明，平均10.2個半抗原C分子結(jié)合一個溴乙?；拾彼嵝揎椀腂SA。
實施例11半抗原A與HRP的結(jié)合-偶聯(lián)物A將10mg的EDC鹽酸鹽溶解于800μl的水中，立即加入到溶于200μlDMF中的2mg半抗原A溶液中。混合后，將這一溶液加入溶于1ml水的HRP(20mg)中。立即加入Sulfo-NHS(5mg)，在黑暗中室溫下，溫育反應混合物過夜。通過用pH7.2 PBS預平衡的2PD-10柱(Pharmacia)系列進行脫鹽除去過量的半抗原。然后用10L PBS(pH7.2)4℃時透析半抗原-HRP偶聯(lián)物過夜實施例12溴乙?；拾彼嵝揎桯RP的制備用實施例8描述的相同方法，進行溴乙?；拾彼嵝揎桯RP的制備。
實施例13半抗原B與溴乙?；拾彼嵝揎桯RP的結(jié)合-偶聯(lián)物B將10mg半抗原B溶于0.5ml的0.12M碳酸鉀溶液(80％甲醇/20％水)。在室溫下維持得到的溶液10分鐘。向溶液中加入1ml 50mM磷酸鹽緩沖液(pH7)終止反應，用0.5M鹽酸調(diào)節(jié)pH到7-7.5。逐滴將500μl該溶液加入實施例12的溴乙?；拾彼嵝揎桯RP溶液(20mg溶于1ml水中)中，在黑暗中4℃下攪拌混合物過夜。然后，利用兩個PD-10柱(Pharmacia生物技術公司)純化半抗原-HRP偶聯(lián)物，用PBS(pH7.2)洗脫，用10L水透析過夜。
實施例14半抗原C與溴乙?；拾彼嵝揎桯RP的結(jié)合-偶聯(lián)物C用實施例13中半抗原B所用的同樣方法將半抗原C與溴乙酰基甘氨酸修飾的HRP結(jié)合。
實施例15實施例10中制備的免疫原C的抗體的制備用弗氏完全佐劑(FCA)配制實施例10中制備的免疫原的水溶液，形成溶于50％(v/v)FCA中4mg/ml免疫原的乳液。用這一乳液免疫接種三只綿羊(1次免疫接種)，在每個動物側(cè)腹4個位置各進行0.25ml的皮下注射。第二次免疫接種(加強1)含有2mg/ml免疫原，隨后免疫接種(第2次到11次)含有1mg/ml免疫原。在50％(v/v)弗氏不完全佐劑(FIA)中乳化所有的加強液，并且以和第一次免疫接種相同的方法注射，一個月一間隔連續(xù)一年。每次加強免疫接種后7到14天進行血液取樣。處理每個樣品得到抗血清，進一步用辛酸和硫酸沉淀純化得到免疫球蛋白G(IgG)組分。通過競爭性ELISA微量滴定板測試評估IgG組分，如下面實施例16所述。
實施例16氯胺酮和去甲氯胺酮的競爭性ELISA的研制用免疫原C(半抗原C-BSA)(實施例10)產(chǎn)生的抗血清IgG包被加強結(jié)合的96孔聚丙烯微量滴定板，在10mM Tris(pH8.5)中稀釋(125ul/孔)。用標準ELISA檢測板技術(checkerboard techniques)確定適當?shù)陌豢贵w稀釋倍數(shù)。在37℃溫育平板2小時，用含有吐溫20的Tris緩沖鹽水(TBST)洗滌4次，輕敲干燥。制備0，0.1，0.5，1.5，25，100和500ng/ml的氯胺酮和去甲氯胺酮在TBST中的標準溶液，并將50μl每個濃度的標準液加入到合適的孔(附圖4)。將在含有EDTA、D-甘露醇、蔗糖、乙基汞硫代水楊酸鈉(thimerosal)和BSA的Tris緩沖液(pH7.2)中稀釋的75μl的偶聯(lián)物(半抗原A-HRP)(實施例11)加入到各個孔中，如附圖4所示。也利用標準ELISA檢測板技術測定合適稀釋的偶聯(lián)物。在37℃溫育平板2小時。在10分鐘內(nèi)用TBST洗滌6次除去過量、未結(jié)合的偶聯(lián)物。
在平板的每個孔中加入125μl的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液，然后在黑暗中，在室溫下溫育15到20分鐘。每個孔中加入125μl 0.2M H2SO4終止反應。然后，利用微量滴定板讀數(shù)器測量450nm處吸光值。試驗數(shù)據(jù)見下表1。
表1氯胺酮和去甲氯胺酮的競爭性微量滴定板試驗產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，利用了針對免疫原C(半抗原C-BSA)產(chǎn)生的抗血清(實施例10)和偶聯(lián)物A(半抗原A-HRP)作為檢測試劑(實施例11)。
A450＝450nm處的吸光值B＝450nm處，xng/ml標準濃度的吸光值
B0＝450nm處0ng/ml標準濃度的吸光值IC50＝產(chǎn)生50％B/B0的標準濃度％CR＝基于對氯胺酮的特異性的交叉反應百分數(shù)，這是本發(fā)明說明書中術語“交叉反應性”的含義。
實施例17氯胺酮和去甲氯胺酮的競爭性ELISA的交叉反應性為了確定氯胺酮和去甲氯胺酮的競爭性ELISA的特異性，制備溶于TBST中下面濃度的標準溶液0，0.1，0.5，1，5，25，100和500ng/ml。利用每個氯胺酮競爭性ELISA標準系列，繪制校準曲線，利用這些來確定這些物質(zhì)的免疫測試交叉反應性。這一研究結(jié)果表示在表2中，根據(jù)下式計算潛在的交叉反應劑苯環(huán)利定和右甲嗎喃的交叉反應性％CR＝IC50，氯胺酮/IC50，CR×100其中％CR是交叉反應性百分數(shù)，IC50，氯胺酮是導致信號50％置換的氯胺酮濃度，IC50，CR是導致信號50％置換的潛在交叉反應試劑的濃度。
表2氯胺酮和去甲氯胺酮的競爭性ELISA交叉反應性
IC50，CR＝導致50％信號置換的潛在交叉反應試劑的濃度％CR＝基于氯胺酮的特異性的交叉反應性百分數(shù)
權(quán)利要求
1.在去甲氯胺酮的N位置用交聯(lián)劑衍生的半抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的半抗原，其中半抗原具有下面的結(jié)構(gòu)式 其中R是二價鍵，X是末端基團。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的半抗原，其中R選自取代或未取代的、直鏈或支鏈、飽和或不飽和的亞烷基成分；X選自羧酸或其酯；胺，馬來酰亞胺，鹵代羧酸或其酯，醛，二硫吡啶成分，乙烯砜成分或硫代羧酸或其酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的半抗原，其中R是C1-5，最優(yōu)選地C3，被取代或未被取代的，直鏈，飽和亞烷基成分。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的半抗原，其中X選自羧酸，硫代羧酸，二硫吡啶，馬來酰亞胺，或醛成分；優(yōu)選地X是羧基(COOH)或硫代乙?；?SCOCH3)成分。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的半抗原，其中半抗原選自下面的去甲氯胺酮半抗原衍生物N-(4′-羧丙基)去甲氯胺酮；N-(3′-乙酰基硫代丙基)去甲氯胺酮；和N-(3′-乙酰基硫代丙酰胺基)去甲氯胺酮。
7.包括前述權(quán)利要求中的任一項所述半抗原與產(chǎn)生抗原性的載體物質(zhì)結(jié)合的免疫原，所述載體物質(zhì)優(yōu)選地選自蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、合成多肽或半合成多肽。
8.權(quán)利要求7所述的免疫原的抗體，所述抗體能夠結(jié)合至少一個去甲氯胺酮或氯胺酮的結(jié)構(gòu)表位。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗體，其中結(jié)構(gòu)表位是芳基環(huán)己酮成分，優(yōu)選地是氯苯基環(huán)己酮成分，最優(yōu)選地是鄰-氯苯環(huán)己酮成分。
10.含有權(quán)利要求1-6中的任一項所述的半抗原與可檢測的標記試劑共價結(jié)合的偶聯(lián)物，所述標記試劑優(yōu)選地選自酶、發(fā)光物質(zhì)、放射活性物質(zhì)或其混合物。
11.制備權(quán)利要求8或9所述的抗體的方法，所述方法包括步驟免疫接種動物，優(yōu)選地是脊椎動物，最優(yōu)選地是哺乳動物，方法是重復給予權(quán)利要求7所述的免疫原，并且從免疫接種的動物回收血清。
12.檢測或測定樣品中的氯胺酮和去甲氯胺酮的方法，所述方法包括將樣品與權(quán)利要求10所述的偶聯(lián)物或其混合物接觸，和與權(quán)利要求8或9的抗體或其混合物接觸；檢測或測定結(jié)合的偶聯(lián)物；和從校準曲線推測樣品中氯胺酮和去甲氯胺酮的存在或數(shù)量。
13.檢測或測定氯胺酮和去甲氯胺酮的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求10所述的偶聯(lián)物或其混合物，和權(quán)利要求8或9所述的抗體或其混合物。
14.權(quán)利要求10的偶聯(lián)物或其混合物和權(quán)利要求8或9的抗體或其混合物在檢測或測定樣品如生物液體中氯胺酮和去甲氯胺酮的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了在去甲氯胺酮的N位置或在羥基去甲氯胺酮或羥基氯胺酮的0位置用交聯(lián)劑衍生的半抗原。本發(fā)明也提供了包括所述半抗原與產(chǎn)生抗原性的載體物質(zhì)結(jié)合的免疫原，以及抗所述半抗原的抗體。另外，本發(fā)明涉及包括所述半抗原與可檢測的標記試劑共價結(jié)合的半抗原偶聯(lián)物。本發(fā)明也提供了利用了本發(fā)明的偶聯(lián)物和抗體檢測或測定氯胺酮和它的初級代謝物，去甲氯胺酮的方法和試劑盒。
文檔編號A61K47/48GK1496974SQ0313668
公開日2004年5月19日 申請日期2003年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月31日
發(fā)明者羅伯特·I·麥康奈爾, 羅伯特 I 麥康奈爾, O 本奇克, 埃爾·O·本奇克, P 菲茨杰拉德, 斯蒂芬·P·菲茨杰拉德, V 拉蒙特, 約翰·V·拉蒙特 申請人:蘭多克斯實驗室有限公司