專利名稱：一種腫瘤抗原蛋白質(zhì)和腫瘤抗原肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腫瘤抗原蛋白質(zhì)和腫瘤抗原肽，特別是涉及一種用于治療肝癌和腸癌的腫瘤抗原蛋白質(zhì)和腫瘤抗原肽。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是威脅人類健康的一大類疾病。腫瘤的發(fā)生是一個非常復(fù)雜的過程。腫瘤細胞能夠發(fā)生和進展的一個重要因素在于其能夠逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視作用，因此如何激發(fā)和喚起機體的免疫系統(tǒng)識別并排斥“非己”成分的腫瘤細胞是尋找新的腫瘤治療方法的一個突破口。在對腫瘤的免疫治療研究的初期，人們發(fā)展了很多辦法來激發(fā)機體的免疫系統(tǒng)來排斥“非己”成分的腫瘤細胞，盡管這些方法在動物腫瘤模型的治療上取得了很好的療效，但是在人類腫瘤的治療上仍缺乏顯著的效果。
已知人體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，包括體液免疫與細胞免疫，尤其是T細胞免疫對腫瘤的殺傷抑制起著重要作用。隨著人們對免疫應(yīng)答反應(yīng)本質(zhì)的認識，人們發(fā)現(xiàn)不管免疫應(yīng)答的過程多么復(fù)雜，最終導(dǎo)致T細胞活化而產(chǎn)生殺傷效應(yīng)的就是與主要組織相容性復(fù)合體MHC相結(jié)合形成抗原肽復(fù)合物和共刺激信號，即細胞毒性T細胞(CTL)通過自身表面的T細胞受體(TCR)，識別表達于腫瘤細胞表面的腫瘤抗原蛋白質(zhì)/肽與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)I類抗原相結(jié)合形成的復(fù)合體，從而攻擊殺傷腫瘤細胞。
腫瘤抗原蛋白質(zhì)/肽的產(chǎn)生是由腫瘤細胞先表達成腫瘤抗原，其在細胞內(nèi)由各種蛋白酶分解成8～10個氨基酸大小的抗原肽，這些抗原肽與同時在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中產(chǎn)生MHC I類分子結(jié)合，通過高爾基復(fù)合體表達于細胞的表面，最終提呈給腫瘤抗原特異的CTL，從而誘發(fā)免疫應(yīng)答，殺傷清除腫瘤細胞。這種存在于腫瘤細胞中、能與MHC分子結(jié)合并誘發(fā)機體免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)抗原分子即為腫瘤抗原?？梢杂眠@些抗原誘導(dǎo)機體產(chǎn)生只針對腫瘤細胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而特異殺傷體內(nèi)的腫瘤細胞而達到治療或者防治腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的作用。因此近幾十年來，人們把用免疫方法治療腫瘤的重點放在尋找腫瘤特異和/或相關(guān)性抗原上。
在二十世紀(jì)五十年代，F(xiàn)oley等人把經(jīng)化學(xué)誘變產(chǎn)生腫瘤的小鼠用滅活的自身腫瘤細胞免疫后，再給該小鼠接種活的腫瘤細胞，這些腫瘤細胞被排斥而不能生長成腫瘤，小鼠則存活；與之對照，沒用滅活的自身腫瘤細胞免疫的小鼠接種活的腫瘤細胞后，腫瘤細胞不被排斥而生長成腫瘤，小鼠則死亡。此實驗以令人信服的證據(jù)證明了化學(xué)誘變的腫瘤存在腫瘤特異性抗原，但是這種保護反應(yīng)有著精確的特異性，即只針對相同類型的腫瘤而不針對不同類型的腫瘤，即使是對用同一致癌劑在同一小鼠上誘導(dǎo)的不同類型腫瘤也沒有保護作用。
1991年，T.Boon等首次從人黑色素瘤細胞中鑒定出腫瘤抗原蛋白質(zhì)，并命名為MAGE(科學(xué)，2541643-1647，1991)。隨后，人們又鑒定出來其它一些腫瘤抗原蛋白質(zhì)，可以分為腫瘤-睪丸(CT)抗原蛋白質(zhì)、分化抗原蛋白質(zhì)、突變的腫瘤抗原蛋白質(zhì)、過表達的腫瘤抗原蛋白質(zhì)和病毒抗原蛋白質(zhì)五類。其中，應(yīng)用于臨床上最為廣泛的是腫瘤-睪丸(CT)抗原蛋白質(zhì)。
腫瘤-睪丸(CT)抗原蛋白質(zhì)是目前鑒定的腫瘤抗原中最多的一類，它們編碼基因的特點是在很多類型的腫瘤中都有表達，如在黑色素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌中都有表達，但在除睪丸外的正常組織都不表達，在胎盤、卵巢、胰腺中有一定量的表達。因為睪丸是免疫特許部位，所以這一類抗原在治療上被認為是腫瘤特異性的抗原，是最有希望用作為腫瘤免疫治療用途的一類抗原。目前試用于臨床上的也主要就是這一類抗原，如MAGE-1和NY-ESO-1即是在一定類型的腫瘤中有高陽性率的表達，又有很好的免疫原性的抗原蛋白質(zhì)，用于腫瘤的免疫治療時有很好的前景。
到目前為止，最具代表性的鑒定腫瘤抗原蛋白質(zhì)的方法為基于特異性細胞免疫應(yīng)答基礎(chǔ)上的文庫篩選法、基于體液免疫應(yīng)答基礎(chǔ)上的cDNA表達文庫篩選法、組合肽文庫篩選、酸洗脫法和生物信息學(xué)方法。
肝癌和腸癌是人類腫瘤中最為常見與最為惡性的腫瘤，尤其是近些年來，發(fā)病率逐漸增加。肝癌由于惡性度高，生長迅速，一旦發(fā)現(xiàn)就已經(jīng)是中晚期，目前，對肝癌的治療主要是傳統(tǒng)的手術(shù)切除和放療等局部治療方法，但由于大部分患者確診時都已進入了中晚期，并且肝癌對放療與化療有相當(dāng)?shù)牡挚剐?。因此治療的效果和預(yù)后往往較差，肝癌病人的一年與五年存活率與其它各類腫瘤病人的存活率相比是很低的。尋找治療方法上的突破或者是新的治療方法一直是臨床腫瘤學(xué)家追求的目標(biāo)，人們期待著有新的方法來提高肝癌的早期診斷與病人良好的預(yù)后，以及術(shù)后清除體內(nèi)殘留的腫瘤細胞和防止腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可用于肝癌和腸癌治療的腫瘤抗原蛋白質(zhì)和腫瘤抗原肽。
本發(fā)明的目的是通過如下的技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明提供一種腫瘤抗原蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)通過細胞內(nèi)分解，能產(chǎn)生與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)-I類分子相結(jié)合的、在結(jié)合狀態(tài)能被T細胞所識別的肽片段，其具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列a)具有序列1所示的氨基酸序列；b)將(a)中的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代，缺失或添加突變所產(chǎn)生的衍生蛋白質(zhì)，且該衍生蛋白質(zhì)與(a)的蛋白質(zhì)具有相同的功能。
本發(fā)明提供一種DNA序列，它編碼所述的腫瘤抗原蛋白質(zhì)。
本發(fā)明所述的DNA序列具有序列2所示的核苷酸序列，其在基因文庫中登錄號為FATE AF249872。
本發(fā)明提供所述的蛋白質(zhì)作為腫瘤-睪丸抗原的應(yīng)用。
本發(fā)明提供所述的基因作為腫瘤-睪丸抗原基因的應(yīng)用。
本發(fā)明提供一種與所述腫瘤抗原蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的肽片斷同等功能的腫瘤抗原肽，其具有序列1中氨基酸序列的第140位～第148位的氨基酸序列。
本發(fā)明所述的腫瘤抗原蛋白質(zhì)在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的腫瘤抗原蛋白質(zhì)在制備治療腸癌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的腫瘤抗原肽在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的腫瘤抗原肽在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的腫瘤抗原蛋白質(zhì)和腫瘤抗原肽的優(yōu)益之處在于本發(fā)明首次將FATE基因鑒定為腫瘤-睪丸抗原基因；在使用免疫方法治療癌癥時，可以用這些抗原誘導(dǎo)機體產(chǎn)生只針對腫瘤細胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而在不殺傷正常細胞的同時，特異殺傷體內(nèi)的腫瘤細胞而達到治療或者防治腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的作用；同時，可以通過對該腫瘤抗原基因或抗體的檢測，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及是否有轉(zhuǎn)移進行診斷。


圖1是編碼本發(fā)明抗原蛋白質(zhì)的基因FATE在16種成人正常組織的RT-PCR檢測結(jié)果；圖中的1～16分別代表成人正常組織脾、前列腺、卵巢、小腸、大腸、白細胞、睪丸、心臟、肺、肝、腦、腎、胎盤、骨骼肌、胰腺、胸腺；圖2是編碼本發(fā)明抗原蛋白質(zhì)的基因FATE在肝癌的癌組織與配對的癌旁組織的RT-PCR結(jié)果；圖中的ca代表癌組織，adj代表配對的癌旁組織；
圖3是編碼本發(fā)明抗原蛋白質(zhì)的基因FATE在肝癌組織與配對的癌旁組織的Northern blot結(jié)果；圖中的ca代表癌組織，adj代表配對的癌旁組織；圖4是通過Western blot方法檢測的本發(fā)明抗原蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的重組蛋白與肝癌病人血清反應(yīng)的代表性結(jié)果；圖中的M代表蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)參照，1代表表達有本發(fā)明中的腫瘤-睪丸抗原重組蛋白的大腸桿菌裂解物與抗組氨酸標(biāo)簽的單克隆抗體反應(yīng)的結(jié)果，2代表純化的本發(fā)明中的腫瘤-睪丸抗原重組蛋白與抗組氨酸標(biāo)簽的單克隆抗體反應(yīng)的結(jié)果，3代表表達有本發(fā)明中的腫瘤-睪丸抗原重組蛋白的大腸桿菌裂解物與肝癌病人血清反應(yīng)的結(jié)果，4代表純化的本發(fā)明中的腫瘤-睪丸抗原重組蛋白與肝癌病人血清反應(yīng)的結(jié)果，5代表轉(zhuǎn)染有空表達載體的大腸桿菌裂解物與肝癌病人血清反應(yīng)的結(jié)果，6代表轉(zhuǎn)染有無關(guān)蛋白對照表達載體的大腸桿菌裂解物與肝癌病人血清反應(yīng)的結(jié)果；圖5是通過ELISA方法檢測的本發(fā)明中的腫瘤-睪丸抗原蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的重組蛋白與肝癌病人血清反應(yīng)的結(jié)果；其中X軸代表血清的稀釋度，Y軸代表波長為410nm時的吸光度； 分別代表重組蛋白與3個不同腫瘤病人血清反應(yīng)的結(jié)果。
具體實施例方式
實施例1、FATE基因的篩選以睪丸特異性表達為主題詞在美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)的基因數(shù)據(jù)庫(GenBank)與文獻檢索數(shù)據(jù)庫(PubMed)中檢索那些已經(jīng)有嚴(yán)格定義的在人正常組織中睪丸特異表達的基因，但它必須到目前為止沒有任何與腫瘤相關(guān)的報道。由此我們獲得了包括FATE基因在內(nèi)的數(shù)個在人正常組織中睪丸特異表達的基因，把他們作為我們下一步Unigene與SAGE數(shù)據(jù)庫分析的靶基因。
實施例2、Unigene與SAGE數(shù)據(jù)庫分析Unigene是一個將來源于同一個基因的所有Genbank序列自動進行歸類的網(wǎng)絡(luò)工具。在Unigene數(shù)據(jù)庫中，每一個Unigene基因包含有來源于各種組織的、但屬于同一個基因的片斷大小不同的序列，這些序列的組織來源與表達信息都被注明。SAGE(基因表達的系列分析)數(shù)據(jù)庫是一個可以對某一特定基因的表達譜進行定量和定性的在線工具。因此，應(yīng)用Unigene與SAGE數(shù)據(jù)庫，就可以對某一特定的基因的時間與空間性表達進行分析，從而獲得它的相關(guān)功能信息。在本發(fā)明過程中，三個標(biāo)準(zhǔn)被用來篩選候選基因，以期望獲得目的的腫瘤-睪丸(CT)抗原基因①候選基因必須是嚴(yán)格定義的在人正常組織中睪丸特異表達的基因，但它必須到目前為止沒有任何與腫瘤相關(guān)的報道。②在本發(fā)明過程中的Unigene數(shù)據(jù)庫分析中，候選基因的Unigene數(shù)據(jù)中必須含有來源于腫瘤的表達序列標(biāo)簽(EST)③在本發(fā)明過程中的SAGE數(shù)據(jù)庫分析中，如果候選基因存在SAGE標(biāo)簽，只有嚴(yán)格對應(yīng)候選基因的SAGE標(biāo)簽才能被應(yīng)用于候選基因的分析中。當(dāng)上述三個標(biāo)準(zhǔn)被采用后，候選基因FATE被認為是最有可能的腫瘤-睪丸抗原基因。在FATE基因的Unigene數(shù)據(jù)中，共有33個EST片段，雖然其中的31個EST來源于睪丸組織，但是另外的2個是來源于腫瘤組織；在FATE基因的SAGE數(shù)據(jù)中，F(xiàn)ATE基因沒有來源于腫瘤組織的SAGE標(biāo)簽。基于上述分析，認為FATE基因有可能是本發(fā)明中欲尋找的目的基因—腫瘤-睪丸抗原基因，下一步將設(shè)計實驗予以證明。
實施例3、用RT-PCR的方法來分析FATE基因的表達生物技術(shù)公司CLONTECH的16種商品化的人正常組織的cDNA(脾、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、大腸、白細胞、心臟、肺、肝、腦、腎、胰腺、胎盤、骨骼肌、胸腺)、來源于62例肝癌病人的癌組織與配對的癌旁組織的cDNA、來源于14例肺癌病人的癌組織與配對的癌旁組織的cDNA、來源于14例胃癌病人的癌組織與配對的癌旁組織的cDNA與來源于14例腸癌病人的癌組織與配對的癌旁組織的cDNA被用來檢測FATE基因在正常組織與腫瘤組織的表達情況。
本發(fā)明中進行RT-PCR的條件應(yīng)用CLONTECH公司的advanced熱啟動DNA聚合酶，94℃、15秒；68℃、30秒；72℃、30秒，30循環(huán)，之后，72℃、6分鐘。進行RT-PCR的引物序列，正向引物ctg ttc ctg gca ccc tgt gca tcc；反向引物gat gcc gcc atgctg ttc acc c。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FATE基因在66％的肝癌標(biāo)本、21％的腸癌中表達，而與之配對的癌旁組織都不表達(如圖2)；在16種成人重要正常組織中，本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)FATE基因還在胰腺中有表達，其表達量大約是睪丸組織表達量的1/5(如圖1)，F(xiàn)ATE基因在肝癌中的表達量與在睪丸的表達量一致，而在腸癌中比睪丸低大約一倍?；谝陨蠈嶒灁?shù)據(jù)，本實施例中證明與實施例1中Unigene與SAGE數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果一致，F(xiàn)ATE基因是一個新的腫瘤-睪丸抗原基因。
實施例4、用Northern雜交的方法來分析FATE基因在肝癌與腸癌中的表達用TRIZOL試劑(PROMEGA)從肝癌與腸癌病人的癌組織與配對的癌旁組織中提取總RNA，接著應(yīng)用mRNA分離試劑盒(PROMEGA)從總RNA中分離mRNA。在甲酰胺、甲醛存在的條件下將2ug的mRNA變性，進行瓊脂糖電泳后轉(zhuǎn)到Hybond-N+尼龍膜(Amersham)上，用紫外交聯(lián)的方法固定。用地高辛DNA探針標(biāo)記試劑盒(Roche)標(biāo)記實施例2中擴增出來的DNA片段，以制作DNA探針，按照常規(guī)的Northern雜交方法與膜上的mRNA進行雜交，之后進行放射自顯影，檢測出本發(fā)明中的睪丸-腫瘤抗原蛋白質(zhì)基因FATE的mRNA。然后，將檢測出該基因mRNA所用的膜在1％SDS溶液中煮沸，除掉地高辛標(biāo)記的探針后，用標(biāo)記的管家基因G3PDH作探針，用同樣的方法進行Northern雜交，檢測出的mRNA作陽性對照。結(jié)果如圖3所示。從這一結(jié)果可以看出，本發(fā)明的腫瘤抗原蛋白質(zhì)基因的mRNA僅在癌組織中表達，而配對的癌旁組織不表達。與腫瘤-睪丸抗原基因的特性一致。
實施例5、FATE基因重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達應(yīng)用pQE30原核表達載體(INVOTRIGEN)，在大腸桿菌菌株M15(INVOTRIGEN)中，37℃生長條件下，IPTG誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)表達6小時。SDS-PAGE蛋白電泳對重組蛋白的表達進行鑒定。之后，應(yīng)用鎳離子親和層析柱子(INVOTRIGEN)將重組蛋白質(zhì)從大腸桿菌全蛋白中分離、純化出來。用抗重組蛋白帶有的6個組氨酸的單克隆抗體，通過Western雜交方法，對重組蛋白進行鑒定。表達腫瘤-睪丸抗原FATE的質(zhì)粒pQE30-FATE以及含有質(zhì)粒pQE30-FATE的大腸桿菌菌株M15被保存在中華人民共和國北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫系T細胞研究室的-80℃低溫冰箱中，保存日期為2002年5月26日。
實施例6、用Western雜交與ELISA方法檢測肝癌與腸癌病人血清中的抗FATE重組蛋白的抗體參照實驗醫(yī)學(xué)雜志，1871349，1998中的方法，篩選FATE mRNA轉(zhuǎn)錄本陽性的腫瘤病人的血清，發(fā)現(xiàn)在腫瘤病人的血清中存在抗FATE重組蛋白的抗體(圖4、5)。因此，F(xiàn)ATE是一個新的腫瘤-睪丸抗原，具有誘導(dǎo)腫瘤病人產(chǎn)生免疫應(yīng)答，排斥殺傷腫瘤細胞的能力，有應(yīng)用于腫瘤的臨床免疫治療的潛能。
實施例7、應(yīng)用腫瘤抗原肽體外誘導(dǎo)CTL的形成與CTL體外殺傷實驗參照中華普通外科雜志(17218，2002)中的實驗方法。將2×106/ml濃度的PBMC(外周血單核細胞)2ml培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板中，作為效應(yīng)淋巴細胞，同時，將另外一部分PBMC按2×106/ml濃度稀釋于RPMI 1640培養(yǎng)基中，加入具有序列1中的第140位～第148位的氨基酸序列的腫瘤抗原肽40ug/ml，37℃孵育2小時后，經(jīng)30GY60Coγ射線照射，離心，洗去剩余肽，用作為抗原提成細胞，按效應(yīng)細胞∶APC為1.3∶1的APC細胞數(shù)，將抗原提成細胞加入上述效應(yīng)細胞共同培養(yǎng)，于24小時后加入IL-2(澳大利亞Ludwig Institute for Cancer Research提供)25U/ml繼續(xù)培養(yǎng)。以后每隔7天，按效應(yīng)細胞∶抗原提成細胞為1.3∶1的抗原提成細胞細胞數(shù)量將抗原提成細胞加入效應(yīng)細胞中再刺激3次，于第28天檢測CTL的殺傷效應(yīng)。殺傷實驗按下述進行(1)采用非放射性細胞毒分析盒，測定CTL與靶細胞共培養(yǎng)后LDH釋放值檢測CTL的殺傷效應(yīng)。按照試劑盒推薦程序操作。所用的培養(yǎng)基為含3％FCS的無酚紅RPMI 1640，每種反應(yīng)均設(shè)3個復(fù)孔，同時測定靶細胞自發(fā)釋放值、靶細胞最大釋放值、效應(yīng)細胞自發(fā)釋放值、體積校正值和培養(yǎng)基背景值。應(yīng)用如下公式計算殺傷效應(yīng)殺傷效應(yīng)(％)＝(實驗值-效應(yīng)細胞自發(fā)釋放值-靶細胞自發(fā)釋放值)/(靶細胞最大釋放值-靶細胞自發(fā)釋放值)×100。(2)混合淋巴細胞與靶細胞共培養(yǎng)4小時后，觀察淋巴細胞與靶細胞的形態(tài)學(xué)變化。28天后，外周血單核細胞擴增了32倍，其中CD3陽性細胞的比例上升了16％(從54％到70％)，CTL比例上升了20％(從36％到56％)。當(dāng)效應(yīng)細胞∶靶細胞為10∶1時，CTL對腫瘤抗原肽(由上海吉爾生化有限公司合成)孵育的的自體淋巴母細胞的殺傷效應(yīng)為62.5％，對腫瘤抗原FATE陽性的腫瘤細胞的殺傷效應(yīng)為40.2％，兩者均明顯高于對自體淋巴母細胞的殺傷效應(yīng)(17.9％)和腫瘤抗原FATE陰性的腫瘤細胞的殺傷效應(yīng)(1.6％)；當(dāng)效應(yīng)細胞∶靶細胞為3.3∶1時，CTL對腫瘤抗原肽孵育的的自體淋巴母細胞的殺傷效應(yīng)為53.6％，明顯高于對自體淋巴母細胞的殺傷效應(yīng)(15.6％)。這些結(jié)果說明腫瘤抗原FATE的腫瘤抗原肽能從腫瘤病人的PBMC中有效的誘導(dǎo)出具有特異殺傷腫瘤細胞的CTL，從而增強腫瘤病人清除腫瘤的能力。
實施例8、CTL細胞被腫瘤抗原肽刺激后分泌IFNγ能力的檢測參照中華醫(yī)學(xué)雜志(811234，2001)中的實驗方法。用酶聯(lián)免疫斑點檢測法(ELISPOT)進行IFN-γ的定量。96孔平底硝酸纖維素板(購自法國Millipore公司)，用抗人IFNγ單抗(溶于pH9.6碳酸鹽緩沖液中，終濃度為2ug/ml)包被，4℃過夜；第2天經(jīng)含0.05％Tween 20的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，用含10％AB血清的RPMI 1640培養(yǎng)液室溫避光封閉1小時，再以0.05％Tween PBS洗滌，加入經(jīng)7天誘導(dǎo)的效應(yīng)細胞(effector cells，E)5×104個/孔。此后實驗分兩組進行，即效應(yīng)細胞與T2細胞組(E+T2)、效應(yīng)細胞與T2細胞加載腫瘤抗原肽組(E+T2腫瘤抗原肽)，每組各作兩復(fù)孔。單純T2細胞及加載了10ug/ml腫瘤抗原肽的T2細胞在無血清RPMI 1640中，37℃、5％CO2條件下孵育2小時，經(jīng)60Coγ射線100GY照射，用無血清RPMI 1640洗去多余的抗原肽后作為刺激細胞，以1×105個/孔加入各效應(yīng)細胞孔；該反應(yīng)體系在不含細胞因子及血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37℃、5％CO2條件下孵育18～20h后，用0.05％TweenPBS充分沖洗培養(yǎng)板以去除殘留細胞；隨后加入0.2ug/ml生物素標(biāo)記的抗人IFNγ二抗，于37℃孵育2小時，洗板；再加入堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素1ug/m，室溫下避光孵育1小時；洗板，加入底物顯色液，避光顯色5分鐘，用自來水沖洗，終止反應(yīng)。待反應(yīng)板晾干后，于解剖顯微鏡下計數(shù)每孔呈黑紫色的斑點數(shù)，求出兩復(fù)孔的平均值。E+T2腫瘤抗原肽組斑點數(shù)減去E+T2組斑點數(shù)即為腫瘤抗原特異的CTL細胞頻數(shù)。ELISPOT檢測中，以產(chǎn)生IFNγ的CD8+T細胞的頻數(shù)為指標(biāo)，分別在腫瘤組織表達FATE mRNA的患者中測出對腫瘤抗原FATE的應(yīng)答者，而在癌組織無FATEmRNA表達的患者中均未檢測到相應(yīng)的特異免疫應(yīng)答。在部分癌組織表達FATEmRNA，但血清無FATE抗體的腫瘤患者中，仍然可以檢測到CD8+T細胞對腫瘤抗原FATE與抗原肽的免疫應(yīng)答。本實驗為進一步應(yīng)用腫瘤抗原FATE及抗原肽治療腫瘤的臨床體內(nèi)實驗提供了依據(jù)。
實施例9、突變的腫瘤抗原蛋白質(zhì)的制備及其血清抗體篩選應(yīng)用眾所周知的方法制備了如下隨機突變的DNA，將序列號2中的第534個堿基由T突變?yōu)镚，由此也就將序列號1中的第141個氨基酸由L突變?yōu)镽；將序列號2中的第552個堿基由G突變?yōu)镃，由此也就將序列號1中的第147個氨基酸由R突變?yōu)镻。將突變的DNA克隆到表達載體中，表達突變的腫瘤抗原，詳細參照實施例4。應(yīng)用制備的突變的腫瘤抗原參照實施例5篩選腫瘤病人的血清，發(fā)現(xiàn)在腫瘤病人的血清中也存在著這些突變腫瘤抗原的抗體。由于該實施例中的突變位點是隨機選定的，這說明在腫瘤病人的血清中也存在針對其它位點的突變產(chǎn)生的腫瘤抗原蛋白質(zhì)的抗體。該實施例說明突變的腫瘤抗原也有誘導(dǎo)腫瘤病人產(chǎn)生免疫應(yīng)答，排斥殺傷腫瘤細胞的能力，有應(yīng)用于腫瘤的臨床免疫治療的潛能。
應(yīng)用本發(fā)明的腫瘤抗原蛋白質(zhì)和腫瘤抗原肽可以提供活化抗腫瘤免疫的醫(yī)藥、可提供腫瘤的診斷方法?？贡景l(fā)明中的腫瘤抗原蛋白質(zhì)或腫瘤抗原肽的抗體可用于親和層析、cDNA文庫的篩選、免疫學(xué)診斷或醫(yī)藥的制備。
序列表包括序列1和序列2序列1為腫瘤-睪丸抗原蛋白質(zhì)FATE的氨基酸序列序列長度183拓撲學(xué)線性序列種類肽來源生物名人(Homo sapiens)組織種類肝癌組織序列特征特征的記號肽存在位置1..183序列1Met Ala Gly Gly Pro Pro Asn Thr Lys Ala Glu Met Glu Met Ser Leu15 10 15Ala Glu Glu Leu Asn His Gly Arg Gln Gly Glu Asn Gln Glu His Leu20 25 30Val Ile Ala Glu Met Met Glu Leu Gly Ser Arg Ser Arg Gly Ala Ser35 4045Gln Lys Lys Gln Lys Leu Glu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Ala Ser Ala50 55 60Lys Arg Val Trp Asn Met Thr Ala Thr Arg Pro Lys Lys Met Gly Ser65 70 75 80Gln Leu Pro Lys Pro Arg Met Leu Arg Glu Ser Gly His Gly Asp Ala85 90 95His Leu Gln Glu Tyr Ala Gly Asn Phe Gln Gly Ile Arg Phe His Tyr100 105 110Asp Arg Asn Pro Gly Thr Asp Ala Val Ala Gln Thr Ser Leu Glu Glu
115 120125Phe Asn Val Leu Glu Met Glu Val Met Arg Arg Gln Leu Tyr Ala Val130 135 140Asn Arg Arg Leu Arg Ala Leu Glu Glu Gln Gly Ala Thr Trp Arg His145 150 155 160Arg Glu Thr Leu Ile Ile Ala Val Leu Val Ser Ala Ser Ile Ala Asn165 170 175Leu Trp Leu Trp Met Asn Gln180序列2為腫瘤-睪丸抗原蛋白質(zhì)基因FATE的核苷酸序列序列長度1137鏈型雙鏈拓撲學(xué)線性序列種類cDNA至mRNA假設(shè)序列無反義無起源生物名人(Homo sapiens)組織種類肝癌組織序列特征特征的表示記號5’UTR存在位置1..112特征的表示記號CDS存在位置113..664特征的表示記號3’UTR存在位置665..1095特征的表示記號polyA位點存在位置1096..1137
序列2AGAGGATCCC AATTTAGCTG CGCACAGGGA GGTGATTTTC TGAGTGTGAC TCCTCTGTTC60CTGGCACCCT GTGCATCCTT AGCCATAGCT TACAAGAGAA CAGCTGGTTG TGATGGCAGG 120AGGCCCTCCC AACACCAAGG CGGAGATGGA AATGTCCCTG GCAGAAGAAC TGAATCATGG 180ACGCCAAGGG GAAAACCAAG AGCACCTGGT GATAGCAGAA ATGATGGAGC TTGGATCTCG 240GTCCCGGGGT GCCTCCCAGA AGAAGCAGAA GTTGGAACAA AAAGCTGCTG GCTCTGCTTC 300AGCCAAACGA GTTTGGAATA TGACTGCCAC CCGACCCAAG AAAATGGGGT CCCAGCTGCC 360AAAGCCCAGA ATGCTGAGAG AATCAGGCCA TGGGGATGCC CATCTCCAGG AGTACGCTGG 420CAATTTCCAA GGCATACGTT TCCATTATGA TCGCAACCCA GGGACAGATG CAGTGGCGCA 480GACTAGCCTG GAAGAGTTCA ATGTACTGGA GATGGAAGTC ATGAGAAGAC AGCTGTATGC 540AGTCAACCGG CGTCTGCGCG CCCTGGAGGA ACAGGGCGCC ACCTGGCGCC ACAGGGAGAC 600CCTGATCATC GCCGTGCTGG TGTCGGCCAG CATTGCCAAC CTGTGGCTGT GGATGAACCA 660GTGATCGCCC CAGCGCGGCC TCCGTATTGG AGCCCTCCCT GCTTCCCCTT CTTTCTTTCC 720TCTTTCCCCA GGCCGCCACT GCCCTTGCCC CTTTCATCTC CCAGCAGCCC TCAGGAGCGT 780CAGGATCATT TTCAACTCTG GTTAGGCCTC CTACCTGGGG AGGCCAGGTC ACTGCACTGG 840GAGGTCCTGG CTGCTGCGAA GCTGGAGGAG GACTGCGTGG GCTGAGATGC CACCCTTTGA 900AGGGTGAACA GCATGGCGGC ATCTGGGCCC CACAGTAACA CCTAGTGGCA ACCTTGCCTT 960CCTGACCTCA GCGGCCCTTC TGTTCCATCC TCTGTGGGCA GGGGTGTGGC TTTGTTTTCC 1020TCCCTCGTTT GCTTCCACCT CGTGCACAGC GCTCTGCACA GACAACACGC TCAATAAAAG 1080TTCAGCCATA GCAGCAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 1137
SEQUENCE LISTING<110>北京大學(xué)<120>一種腫瘤抗原蛋白質(zhì)和腫瘤抗原肽<130>PI034447<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>183<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Met Ala Gly Gly Pro Pro Asn Thr Lys Ala Glu Met Glu Met Ser Leu1 5 10 15Ala Glu Glu Leu Asn His Gly Arg Gln Gly Glu Asn Gln Glu His Leu20 25 30Val Ile Ala Glu Met Met Glu Leu Gly Ser Arg Ser Arg Gly Ala Ser35 40 45Gln Lys Lys Gln Lys Leu Glu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Ala Ser Ala50 55 60Lys Arg Val Trp Asn Met Thr Ala Thr Arg Pro Lys Lys Met Gly Ser65 70 75 80Gln Leu Pro Lys Pro Arg Met Leu Arg Glu Ser Gly His Gly Asp Ala85 90 95His Leu Gln Glu Tyr Ala Gly Asn Phe Gln Gly Ile Arg Phe His Tyr100 105 110Asp Arg Asn Pro Gly Thr Asp Ala Val Ala Gln Thr Ser Leu Glu Glu115 120 125Phe Asn Val Leu Glu Met Glu Val Met Arg Arg Gln Leu Tyr Ala Val130 135 140Asn Arg Arg Leu Arg Ala Leu Glu Glu Gln Gly Ala Thr Trp Arg His145 150 155 160Arg Glu Thr Leu Ile Ile Ala Val Leu Val Ser Ala Ser Ile Ala Asn165 170 175Leu Trp Leu Trp Met Asn Gln180<210>2<211>1137<212>DNA<213>Homo sapiens<400>2agaggatccc aatttagctg cgcacaggga ggtgattttc tgagtgtgac tcctctgttc60
ctggcaccct gtgcatcctt agccatagct tacaagagaa cagctggttg tgatggcagg 120aggccctccc aacaccaagg cggagatgga aatgtccctg gcagaagaac tgaatcatgg 180acgccaaggg gaaaaccaag agcacctggt gatagcagaa atgatggagc ttggatctcg 240gtcccggggt gcctcccaga agaagcagaa gttggaacaa aaagctgctg gctctgcttc 300agccaaacga gtttggaata tgactgccac ccgacccaag aaaatggggt cccagctgcc 360aaagcccaga atgctgagag aatcaggcca tggggatgcc catctccagg agtacgctgg 420caatttccaa ggcatacgtt tccattatga tcgcaaccca gggacagatg cagtggcgca 480gactagcctg gaagagttca atgtactgga gatggaagtc atgagaagac agctgtatgc 540agtcaaccgg cgtctgcgcg ccctggagga acagggcgcc acctggcgcc acagggagac 600cctgatcatc gccgtgctgg tgtcggccag cattgccaac ctgtggctgt ggatgaacca 660gtgatcgccc cagcgcggcc tccgtattgg agccctccct gcttcccctt ctttctttcc 720tctttcccca ggccgccact gcccttgccc ctttcatctc ccagcagccc tcaggagcgt 780caggatcatt ttcaactctg gttaggcctc ctacctgggg aggccaggtc actgcactgg 840gaggtcctgg ctgctgcgaa gctggaggag gactgcgtgg gctgagatgc caccctttga 900agggtgaaca gcatggcggc atctgggccc cacagtaaca cctagtggca accttgcctt 960cctgacctca gcggcccttc tgttccatcc tctgtgggca ggggtgtggc tttgttttcc1020tccctcgttt gcttccacct cgtgcacagc gctctgcaca gacaacacgc tcaataaaag1080ttcagccata gcagcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 113權(quán)利要求
1.種腫瘤抗原蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)通過細胞內(nèi)分解，能產(chǎn)生與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)-I類分子相結(jié)合的、在結(jié)合狀態(tài)能被T細胞所識別的肽片段，其具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列(a)具有序列1所示的氨基酸序列；(b)將(a)中的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代，缺失或添加突變所產(chǎn)生的衍生蛋白質(zhì)，且該衍生蛋白質(zhì)與(a)的蛋白質(zhì)具有相同的功能。
2.一種權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)作為腫瘤-睪丸抗原的應(yīng)用。
3.種權(quán)利要求1所述的腫瘤抗原蛋白質(zhì)在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
4.一種權(quán)利要求1所述的腫瘤抗原蛋白質(zhì)在制備治療腸癌藥物中的應(yīng)用。
5.一種DNA序列，它編碼權(quán)利要求1所述的腫瘤抗原蛋白質(zhì)。
6.一種權(quán)利要求5所述的DNA序列，其特征在于，具有序列2所示的核苷酸序列，其在基因文庫中登錄號為FATE AF249872。
7.一種權(quán)利要求5所述的基因作為腫瘤-睪丸抗原基因的應(yīng)用。
8.一種具有與權(quán)利要求1所述的腫瘤抗原蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的肽片斷同等功能的腫瘤抗原肽，其具有序列1中氨基酸序列的第140位～第148位的氨基酸序列。
9.一種權(quán)利要求8所述的腫瘤抗原肽在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
10.一種權(quán)利要求8所述的腫瘤抗原肽在制備治療腸癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種腫瘤抗原蛋白質(zhì)和腫瘤抗原肽。該腫瘤抗原蛋白質(zhì)通過細胞內(nèi)分解，能產(chǎn)生與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)－I類分子相結(jié)合的、在結(jié)合狀態(tài)能被T細胞所識別的肽片段。編碼該腫瘤抗原蛋白質(zhì)的DNA序列具有在基因文庫中登錄號為FATE AF249872的序列的核苷酸序列。該腫瘤抗原蛋白質(zhì)/腫瘤抗原肽可用于制備治療肝癌或腸癌的藥物。
文檔編號A61P35/00GK1548457SQ0313641
公開日2004年11月24日 申請日期2003年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月15日
發(fā)明者陳慰峰, 董學(xué)員 申請人:北京大學(xué)