專利名稱：異種骨膠原基質(zhì)制備的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及骨外科修復(fù)材料和骨組織工程細(xì)胞外基質(zhì)材料等生物材料技術(shù)領(lǐng)域。更確切地說(shuō)，本發(fā)明涉及到一種采用生物和化學(xué)方法處理異種松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的方法，以獲得可移植的異種骨修復(fù)材料和骨組織工程細(xì)胞外基質(zhì)材料。
背景技術(shù)：
由于創(chuàng)傷、感染、腫瘤以及發(fā)育異常等原因使骨喪失了一些骨質(zhì)，形成較大的間隙，稱之為骨缺損。絕大多數(shù)骨缺損由于間隙大，成骨細(xì)胞難以爬過(guò)間隙而不能發(fā)生正常的愈合，最終形成骨不連。在美國(guó)，每年因?yàn)楦鞣N原因進(jìn)行骨移植的手術(shù)多達(dá)980000例，而在德國(guó)，這一數(shù)字也高達(dá)100000例(Kessler S，Wohlfart U M，Ingnatius A，et al.Solventdehydrated bone transplants to bridge segmental bone defectshistomorphologicaland biomechanical investigations in an animal model.Arch Orthop TraumaSurg，2001，121472～475)。
臨床證明，自體骨移植一直是治療骨缺損的最好方法。在病人體內(nèi)不會(huì)發(fā)生免疫反應(yīng)，移植骨中的細(xì)胞和生物活性分子能在受體部位繼續(xù)存活，并發(fā)揮相應(yīng)的功能，促進(jìn)骨缺損的愈合，但取骨部位容易發(fā)病，取骨量有限并且其尺寸和形狀常常受到限制。同種異體骨能提供大量不同形狀和尺寸的皮質(zhì)骨或松質(zhì)骨。但它容易引起免疫反應(yīng)，在骨缺損邊緣與宿主骨的連接速度較慢，并有傳染病毒性疾病的危險(xiǎn)，而且制樣、處理和存貯的成本很高，其應(yīng)用受到很大限制。人工合成可降解聚合物材料，其組成成分、分子量、力學(xué)性能、降解速度等都能預(yù)先設(shè)計(jì)和控制，也容易塑型和構(gòu)建多孔三維結(jié)構(gòu)，但很多此類材料的降解產(chǎn)物會(huì)使體內(nèi)酸度過(guò)高，容易誘發(fā)炎癥反應(yīng)。
為了克服這些缺點(diǎn)，人們開(kāi)始考慮新的骨替代材料，近十多年來(lái)發(fā)展起來(lái)的骨組織工程學(xué)，為大范圍骨缺損的修復(fù)開(kāi)辟了新的渠道。其中，能夠支持細(xì)胞粘附、增殖和分化以及釋放生物活性因子或種子細(xì)胞的基質(zhì)材料的開(kāi)發(fā)是骨組織工程成功與否的重要條件。天然異種骨具有來(lái)源豐富、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，是骨組織工程細(xì)胞外基質(zhì)材料和骨缺損移植材料的潛在來(lái)源之一，但是異種骨含有很多有機(jī)成分，其中很多酸溶性蛋白具有免疫原性，植入人體后能夠誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)，必須徹底脫除。骨基質(zhì)中的I型膠原，由于有規(guī)整的螺旋結(jié)構(gòu)，免疫原性較溫和。在膠原分子中95％的氨基酸具有Gly-X-Y的重復(fù)序列和三螺旋結(jié)構(gòu)，在兩端約5％的氨基酸不具有這種序列而不能形成螺旋結(jié)構(gòu)，這些區(qū)域與膠原的免疫原性有關(guān)，除掉這些區(qū)域可以大大減小免疫原性。因此，如何去除異種骨的抗原性物質(zhì)并保留其誘導(dǎo)成骨能力是異種骨研究首要解決的問(wèn)題。
國(guó)內(nèi)外關(guān)于異種骨的加工方法很多，早在1937年Orell就首次將脫蛋白骨應(yīng)用于臨床，該方法稱為Os Purum法，將異種骨除去軟組織后用KOH去結(jié)締組織，隨后用丙酮脫脂，在鹽溶液中脫蛋白。在此后的幾十年里，出現(xiàn)了Kiel骨、Oswestry骨和Anorganic骨等多種脫蛋白骨，在這些處理方法中，通常使用NaClO、H2O2和乙二胺等化學(xué)試劑來(lái)破壞膠原和其它蛋白質(zhì)。通過(guò)脫鈣、深低溫冷凍、煮沸、射線輻照等方法也能減小或消除其抗原性。目前在骨移植手術(shù)中使用的異種骨多采用煅燒骨和經(jīng)一些物理和化學(xué)方法處理的無(wú)機(jī)骨，為了避免劇烈的免疫排斥反應(yīng)，通常去除了膠原等重要的有機(jī)成分，這種處理方法使移植骨的力學(xué)性能很差，因而限制了它的使用(Salama R.Xenogeneic bone grafting in humans.Clin Orthop，1983，174113～121)。羅卓荊等人采用離心技術(shù)、超聲波技術(shù)和化學(xué)處理技術(shù)相結(jié)合的方法處理牛松質(zhì)骨，獲得了一種無(wú)免疫原性并具有一定機(jī)械支撐能力的大塊形異種骨移植材料(羅卓荊和胡蘊(yùn)玉，新型塊形脫脂去抗原異種骨移植材料及其制備方法，中國(guó)專利號(hào)ZL97108538.2)。楊志明等人采用物理化學(xué)處理方法，將來(lái)源于豬骨或異種骨制成生物衍生骨支架，引入高分子材料或活性成分，構(gòu)建生物衍生組織工程骨(楊志明和秦廷武，生物衍生組織工程骨及其制備方法，中國(guó)專利號(hào)ZL00132082.3)。這些加工方法能夠脫除異種骨的抗原性物質(zhì)并保留其天然網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但采用H2O2等強(qiáng)氧化性試劑脫除抗原性物質(zhì)對(duì)有機(jī)成分的破壞較大，也必然影響其力學(xué)強(qiáng)度，特別是松質(zhì)骨材料，本身的力學(xué)強(qiáng)度就很低，文獻(xiàn)報(bào)道牛松質(zhì)骨經(jīng)H2O2處理后，其力學(xué)強(qiáng)度明顯降低，處理24小時(shí)降低43.7％，其壓縮極限強(qiáng)度為5.3564MPa，處理96小時(shí)降低92.8％，僅為0.6896MPa(羅卓荊，胡蘊(yùn)玉，候德門，趙婷。牛松質(zhì)骨力學(xué)強(qiáng)度與去抗原處理時(shí)限的相關(guān)性實(shí)驗(yàn)。第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996；17(6)434～436)。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服已有方法的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的是研究一種骨膠原基質(zhì)的制備方法，在去除或減小免疫原性的同時(shí)，盡量保持天然骨的骨礦結(jié)構(gòu)和部分有機(jī)膠原結(jié)構(gòu)，以增加移植骨的整體力學(xué)強(qiáng)度，并保留適當(dāng)?shù)某晒切阅堋?br> 本發(fā)明主要涉及一種新型異種骨膠原基質(zhì)的制備方法，其主要的技術(shù)特征是采用一系列生物和化學(xué)方法對(duì)牛、豬等異種骨進(jìn)行處理。采用的技術(shù)路線如下(1)異種骨材料的來(lái)源和加工從屠宰場(chǎng)獲得新鮮的?；蜇i的腿骨，經(jīng)充分去除軟組織、軟骨和骨髓后，洗凈，置于-20℃的冰箱中冷凍24小時(shí)。用低速鋸切割使干骺端分離，骨骺端松質(zhì)骨加工成塊狀，其長(zhǎng)軸與骨小梁的排列方向保持一致，用于制備組織工程細(xì)胞外基質(zhì)材料或骨缺損填充材料；骨干中部加工成圓柱體或條形，用于制備骨缺損移植材料。
(2)脫脂處理加工好的骨塊用40～60℃壓力水反復(fù)沖洗，然后用0.01～5mol/L堿液室溫浸泡24h，將骨塊置于含脫脂劑的脂肪提取器中于50～60℃下脫脂48～72h，每24h將骨塊取出在離心機(jī)上以4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心30分鐘左右，清除骨塊內(nèi)細(xì)胞成分和脂肪等物質(zhì)，脫脂劑可以采用1∶1～1∶3的甲醇/氯仿、甲酸乙酯、乙酸甲酯、異丙醇或丙酮等有機(jī)溶劑。
(3)部分脫鈣處理骨塊在0.1～5mol/L酸性溶液中室溫下部分脫鈣5～10分鐘，再用雙蒸水反復(fù)透析至pH值為6，以去除殘留的酸液。
(4)脫非膠原蛋白骨塊放入含有pH為7.4的脫非膠原蛋白混合液中，該混合液的組成為含氮堿性有機(jī)物、Tris緩沖液和鹽類，置于4℃的冰箱中脫除非膠原蛋白，時(shí)間為24h，可以采用尿素或鹽酸胍作為非膠原蛋白脫除劑。
(5)蛋白酶消化骨塊用0.05～0.5％的蛋白酶消化，加入少量巰基酶抑制劑防腐，用緩沖溶液控制溶液的pH為7.8～8.0，骨液比為1∶1～1∶6，在37℃條件下消化48h。再用4mol/L NaCl浸泡12～24h，以脫除溶解的非膠原蛋白和部分膠原蛋白。
經(jīng)蛋白酶消化，能進(jìn)一步脫除骨塊中的非膠原蛋白，并使骨塊中剩余的膠原脫去端肽，變成無(wú)端肽膠原，消除膠原的免疫原性。
(6)消毒和包裝骨塊用重蒸水反復(fù)沖洗，50℃下真空干燥24h，三層聚乙烯薄膜封裝，環(huán)氧乙烷消毒2小時(shí)，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)
1.采用生物和化學(xué)方法制備的松質(zhì)骨材料，保留了原骨的骨礦成分和大部分膠原蛋白，其中的膠原成分經(jīng)蛋白酶消化后，切除了能夠引起免疫原性的端肽，因而免疫原性大大降低，膠原的存在使材料的力學(xué)強(qiáng)度大大改善，同時(shí)，該材料具有較好的孔隙率和孔道連通，為成骨細(xì)胞等種子細(xì)胞的爬行替代提供了良好的條件，適合用作骨組織工程細(xì)胞外基質(zhì)材料。
2.采用生物和化學(xué)方法制備的皮質(zhì)骨材料，除了具有低免疫原性和一定的孔隙率之外，還具有優(yōu)異的力學(xué)性能，如按照該方法制備的牛皮質(zhì)骨材料，其拉伸楊氏模量可達(dá)6000Mpa左右，最大應(yīng)力可達(dá)110Mpa左右，與人長(zhǎng)骨的力學(xué)性能較為接近，在植入體內(nèi)后，消除了其它植骨材料如金屬等由于與人骨力學(xué)性能的差異而引起的“應(yīng)力遮擋”效應(yīng)。適合用作骨缺損移植材料。
3.本發(fā)明所制備的材料具有各種不同的外形，可以根據(jù)臨床上的需要裁切成各種不同的形狀，也可以根據(jù)需要用抗生素或其它藥物進(jìn)行進(jìn)一步處理或在其表面引入活性肽、生長(zhǎng)因子、可降解聚合物等進(jìn)行修飾。
本發(fā)明的意義在于采用生物和化學(xué)方法相結(jié)合研制出了新型異種骨膠原基質(zhì)，為骨移植外科和骨組織工程的發(fā)展提供廉價(jià)的生物材料，以滿足市場(chǎng)的需求。


圖1是本發(fā)明所涉及的異種皮質(zhì)骨膠原基質(zhì)材料加工過(guò)程示意圖，1為從屠宰場(chǎng)獲得的新鮮豬或牛腿骨，經(jīng)去除軟組織和其它成分后冷凍；2為截取的骨干部分；3為加工好的材料。
圖2是本發(fā)明制備的圓柱狀和條狀材料的外形照片。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1一種牛皮質(zhì)骨膠原基質(zhì)材料的制備方法本發(fā)明所述的皮質(zhì)骨材料應(yīng)取自骨干中部(參見(jiàn)附圖1)。加工過(guò)程應(yīng)在冷凍后采用低速鋸切割，以免溫度較高破壞膠原。加工好的骨塊用50℃壓力水反復(fù)沖洗，然后用0.1mol/LNaOH溶液室溫浸泡24h，將骨塊置于含有甲酸乙酯的索氏提取器中于60℃下脫脂72h，每24h將骨塊取出在離心機(jī)上以4000轉(zhuǎn)/min的速度離心30min左右，清除骨塊內(nèi)異物；骨塊在0.5mol/L HCl溶液中室溫下部分脫鈣10min，再用雙蒸水反復(fù)透析至pH值為6，以去除殘留的酸液；骨塊放入含有4mol/L HCl胍、50mmol/L Tris-HCl和0.5Mmol/LCaCl2，pH為7.4的溶液中，并置于4℃的冰箱中脫除非膠原蛋白，時(shí)間為24h；骨塊用0.1％的胰蛋白酶消化，加入少量疊氮化鈉溶液防腐，用Na2HPO4和NaH2PO4的緩沖溶液控制溶液的pH為7.8，骨液比為1∶3，在37℃條件下消化48h。再用4mol/LNaCl浸泡12～24h，以脫除溶解的非膠原蛋白和部分膠原蛋白；骨塊用重蒸水反復(fù)沖洗，50℃下真空干燥24h，三層聚乙烯薄膜封裝，環(huán)氧乙烷消毒2小時(shí)，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2一種牛松質(zhì)骨膠原基質(zhì)材料的制備方法本發(fā)明所述的松質(zhì)骨材料應(yīng)取材于骨骺端，取其長(zhǎng)軸與骨小梁排列方向一致。加工過(guò)程應(yīng)在冷凍后采用低速鋸切割成塊狀，以免溫度較高破壞膠原。加工好的骨塊用50℃壓力水反復(fù)沖洗，然后用0.05mol/LNaOH溶液室溫浸泡24h，將骨塊置于含有1∶1的甲醇/氯仿混合溶劑的索氏提取器中于55～60℃下脫脂72h，每24h將骨塊取出在離心機(jī)上以4000轉(zhuǎn)/min的速度離心30min左右；骨塊在0.1mol/LHCl溶液中室溫下部分脫鈣10min，再用雙蒸水反復(fù)透析至pH值為6，以去除殘留的酸液；骨塊放入含有6mol/L尿素的溶液中，并置于4℃的冰箱中脫除非膠原蛋白，時(shí)間為24h；骨塊用0.1％的胰蛋白酶消化，加入疊氮化鈉溶液防腐，用Na2HPO4和NaH2PO4的緩沖溶液控制溶液的pH為7.8，骨液比為1∶4，在37℃條件下消化36h。再用4M NaCl溶液浸泡12h；骨塊用重蒸水反復(fù)沖洗，50℃下真空干燥24h，三層聚乙烯薄膜封裝，環(huán)氧乙烷消毒2小時(shí)，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明制備的圓柱狀和條狀材料的外形見(jiàn)圖2所示的照片。
權(quán)利要求
1.一種異種骨膠原基質(zhì)制備的新方法，其特征在于采用一系列生物和化學(xué)方法對(duì)牛、豬等異種骨進(jìn)行處理，過(guò)程如下(1)異種骨材料的來(lái)源和加工選取新鮮的牛或豬的腿骨，經(jīng)充分去除軟組織、軟骨和骨髓后，洗凈，冷凍，切割分離干骺端，將骨骺端松質(zhì)骨加工成塊狀，其長(zhǎng)軸與骨小梁的排列方向保持一致，骨干中部加工成圓柱體或條形；(2)脫脂處理加工好的骨塊用40～60℃壓力水反復(fù)沖洗，然后用0.01～5mol/L堿液室溫浸泡24h，將骨塊用脫脂劑于50～60℃下脫脂48～72h，每24h將骨塊取出在離心機(jī)上以4000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心30分鐘左右，清除骨塊內(nèi)細(xì)胞成分和脂肪等物質(zhì)；(3)部分脫鈣處理骨塊在0.1～5mol/L酸性溶液中室溫下部分脫鈣5～10分鐘，再用雙蒸水反復(fù)透析至pH值為6，以去除殘留的酸液；(4)脫非膠原蛋白骨塊放入含有pH值為7.4的非膠原蛋白脫除劑的混合液中，該混合液的組成為含氮堿性有機(jī)物、Tris緩沖液和鹽類，置于4℃的冰箱中脫除非膠原蛋白，時(shí)間為24h；(5)蛋白酶消化骨塊用0.05～0.5％的蛋白酶消化，加入少量巰基酶抑制劑防腐，用緩沖溶液控制溶液的pH為7.8～8.0，骨液比為1∶1～1∶6，在37℃條件下消化48h，再用4mol/LNaCl浸泡12～24h，以脫除溶解的非膠原蛋白和部分膠原蛋白；(6)消毒和包裝
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異種骨膠原基質(zhì)制備的新方法，其特征在于脫脂劑采用1∶1～1∶3的甲醇/氯仿、甲酸乙酯、乙酸甲酯、異丙醇或丙酮。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異種骨膠原基質(zhì)制備的新方法，其特征在于采用尿素或鹽酸胍作為非膠原蛋白脫除劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述方法制備的異種骨膠原基質(zhì)，其特征在于降低或消除牛、豬等異種松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的免疫原性，膠原蛋白和骨礦成分之比約為1∶2，其中的膠原蛋白經(jīng)過(guò)蛋白酶處理已切除了端肽，所得的材料為白色塊狀、圓柱狀或條狀，保留了天然骨的網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)，采用牛皮質(zhì)骨制備的膠原基質(zhì)材料的拉伸楊氏模量達(dá)6000Mpa左右，最大應(yīng)力達(dá)110Mpa左右。
全文摘要
本發(fā)明涉及骨外科修復(fù)材料和骨組織工程細(xì)胞外基質(zhì)材料等生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種異種骨膠原基質(zhì)制備的新方法。本方法選取牛、豬等異種骨，主要經(jīng)異種骨來(lái)源和加工—脫脂處理—部分脫鈣—脫非膠原蛋白—蛋白酶消化，最后消毒包裝得新型的異種骨膠原基質(zhì)，該材料保留了原骨的骨礦成分和大部分膠原蛋白，其中的膠原成分經(jīng)蛋白酶消化后，切除了能夠引起免疫原性的端肽，因而免疫原性大大降低。在具有較強(qiáng)力學(xué)性能的同時(shí)，該材料具有較好的孔隙率和孔道連通，適合用作骨組織工程細(xì)胞外基質(zhì)材料和骨缺損移植材料，為骨移植外科和骨組織工程的發(fā)展提供廉價(jià)的生物材料。
文檔編號(hào)A61L27/24GK1456363SQ0311795
公開(kāi)日2003年11月19日 申請(qǐng)日期2003年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月27日
發(fā)明者王遠(yuǎn)亮, 何創(chuàng)龍, 楊立華, 夏烈文 申請(qǐng)人:重慶大學(xué)