專利名稱：治療運動神經(jīng)元疾病的疫苗和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
和背景本發(fā)明涉及用于治療運動神經(jīng)元病(MND)，特別是肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)的疫苗和方法。
運動神經(jīng)元病(MND)是一組侵犯腦(上級運動神經(jīng)元)和脊髓(下級運動神經(jīng)元)運動神經(jīng)元的相關(guān)疾病。運動神經(jīng)元是神經(jīng)細胞，腦沿著它以電沖動的形式向肌肉發(fā)出指令。運動神經(jīng)元的變性導(dǎo)致肌肉無力和消瘦。這通常最初發(fā)生在手或腿，一些肌肉群受到的影響多于其它的肌肉群。
有幾種MND的分類。在MND最多的病例中，上級和下級運動神經(jīng)元都發(fā)生變性。這種情況被稱為肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)，也被稱為Lou Gehrig’s病，其特點是肌無力、僵硬和(肌纖維)自發(fā)性收縮(肌束顫動)。也有不常見的類型，其中觀察到更有選擇性的上級運動神經(jīng)元(如原發(fā)性側(cè)索硬化，PLS)變性或者下級運動神經(jīng)元(如進行性肌萎縮，PMA)變性。進行性延髓麻痹(PBP或延髓發(fā)病)是一種以下咽、咀嚼和構(gòu)音困難開始的ALS，并且侵犯大約25％的ALS患者。
在這些MND的類型之間有相當(dāng)多的重疊。患PMA的人最后累及上級運動神經(jīng)元，在PMA和ALS兩者中一些人可能最終經(jīng)歷不同程度的構(gòu)音和下咽困難(延髓發(fā)作的ALS或PMA)。
ALS是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中控制隨意肌肉運動的神經(jīng)細胞的逐漸變性為特點的慢性、進行性的神經(jīng)變性疾病。通常在疾病開始的2-3年到10年內(nèi)，運動神經(jīng)元的進行性喪失導(dǎo)致漸進性的骨骼肌萎縮和不可逆的死亡。起初最常見在手部觀察到肌無力和萎縮以及前角細胞功能障礙的體征，而在腳部較少觀察到。開始發(fā)病的部分是隨機的，并且進展是不對稱的。僅在美國當(dāng)前有30,000人患有ALS，并且每年診斷到大約8,000個新發(fā)病例。
ALS以散發(fā)性(SALS)和家族性(FALS)的類型發(fā)生(Mulder等，1986；Munsat，1989)。原發(fā)性危險因子多半還不知道，然而所有ALS患者中5-10％是家族性的(FALS)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大約所有家族性類型中的20％患者在21號染色體上編碼Cu/Zn超氧化物歧化酶的1型基因中有突變(Rosen等，1993；Brown，1995)。SOD是催化超氧陰離子轉(zhuǎn)化成過氧化氫的酶，因此SOD能夠保護細胞不受這些有毒自由基的有害影響。由于沒有發(fā)現(xiàn)在酶活性、多肽的半衰期和抗蛋白酶解與開始發(fā)病的年齡和人疾病進展的速度之間的相關(guān)性(見Julien，2001的綜述)，因此似乎不同SOD突變體的毒性不應(yīng)歸于自由基清除活性的降低。表達各種SOD1突變體的轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)展了運動神經(jīng)元疾病，因而構(gòu)成公認的用于檢驗ALS和其它運動神經(jīng)元治療的動物模型。
最近，兩個獨立的科學(xué)家小組已經(jīng)鑒定了一種新的ALS基因(Hadano等，2001；Yang等，2001)。這種被稱為ALS2的新基因定位在2號染色體上，編碼名為alsin的蛋白。在患有青少年型肌萎縮性側(cè)索硬化(JALS)，也稱為ALS2的人和患有青少年型原發(fā)性側(cè)索硬化(JPLS)的人中新的ALS2基因都發(fā)生了突變。染色體不同區(qū)域的突變與不同的運動神經(jīng)元疾病有關(guān)。具體地，在患有ALS的人中發(fā)現(xiàn)了一個區(qū)域中的突變，而在患有JPLS的人中發(fā)現(xiàn)了在兩個其它區(qū)域中有突變。將來，帶有這些突變的轉(zhuǎn)基因小鼠必將構(gòu)成檢驗ALS治療的進一步模型。
在最近的10年中已經(jīng)進行了許多用來理解該病的病因?qū)W、預(yù)后和進展的研究。除了承認在導(dǎo)致其進展的環(huán)境方面它是一種多因素疾病外，還沒有取得一致的意見，而病因?qū)W仍然不清楚。
很顯然，現(xiàn)在在許多其它慢性和急性神經(jīng)變性疾病中發(fā)現(xiàn)了有助于ALS進展的許多因素。這些因素包括氧化應(yīng)激、興奮性毒性、營養(yǎng)支持的喪失和離子的不平衡。這些年來試圖象在其它慢性和急性神經(jīng)變性疾病中那樣，通過阻斷細胞毒性的不同介體來終止ALS的進展。這些臨床試驗中的大部分得到了否定的結(jié)果(Turner等，2001)。
氧化應(yīng)激是以能夠?qū)е逻\動神經(jīng)元死亡的自由基的積聚為特征的。自由基通過“氧化”而損傷細胞膜的組分、蛋白質(zhì)或遺傳物質(zhì)。當(dāng)SOD酶功能有障礙時可能會產(chǎn)生這些自由基，或者由于如在一些家族性ALS患者中發(fā)生遺傳變異，或者由于神經(jīng)細胞的化學(xué)環(huán)境的原因，或者由于谷氨酸興奮性毒性或其它原因可能產(chǎn)生這些自由基。許多ALS患者服用輔酶Z Q10和維生素E以中和自由基。
谷氨酸是象癲癇持續(xù)狀態(tài)、腦缺血、創(chuàng)傷性腦損傷、ALS、亨廷頓舞蹈病、山黧豆中毒和阿耳茨海默病(Alzheimer’s disease)等急性和慢性變性疾病中最常見的毒性介質(zhì)之一(Pitt等，2000)。谷氨酸是人CNS中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。L-谷氨酸存在于大多數(shù)突觸中，并且能夠表現(xiàn)出雙重活性在正常的功能中作為必需的神經(jīng)遞質(zhì)起關(guān)鍵作用，但是當(dāng)超過其生理水平時就變得有毒了。
對于脊髓運動神經(jīng)元，通過星形細胞中存在的谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白EAAT2在突觸活動之后迅速清除谷氨酸。在ALS患者的腦組織中發(fā)現(xiàn)了EAAT2活性和蛋白水平的降低(Rothstein等，1992)。這會導(dǎo)致細胞外谷氨酸濃度的升高以及運動神經(jīng)元的死亡。臨床上，谷氨酸釋放抑制劑利魯唑?qū)θ撕娃D(zhuǎn)基因小鼠兩者疾病病程的有益影響而導(dǎo)致成為公認的ALS的藥物治療。然而，在中和毒性影響方面，它可能干擾作為普遍存在的CNS神經(jīng)遞質(zhì)的谷氨酸的生理功能。
這些年來一直爭論ALS中免疫因子、細胞和分子的作用。如在許多其它神經(jīng)變性病中一樣，一直爭論炎癥是否與疾病傳播有關(guān)以及免疫抑制藥物在ALS中建議使用的量。而且，在許多ALS患者中觀察到ALS與抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體存在的相關(guān)性，這使一些研究者建議ALS是一種自體免疫性疾病。然而，還沒有提供結(jié)論性的證據(jù)來支持這種假說。
在本發(fā)明者的實驗室中，最近觀察到在由于機械(軸突切開術(shù))或生物化學(xué)(谷氨酸、氧化性應(yīng)激)損害所導(dǎo)致的神經(jīng)變性的情況下，免疫系統(tǒng)起著關(guān)鍵性的作用。因而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)識別神經(jīng)系統(tǒng)(NS)抗原的活化的T細胞促進神經(jīng)再生或提供神經(jīng)保護。參考PCT公開號No.WO 99/60021的申請，其全部內(nèi)容在此引入作為參考。更具體地，在部分擠壓破碎的視神經(jīng)大鼠模型(Moalem等，1999)和在脊髓損傷的大鼠模型(Hauben等，2000)中顯示MBP反應(yīng)性T細胞具有神經(jīng)保護作用。直到最近，一直認為免疫系統(tǒng)排斥免疫細胞參與神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)。非常令人驚奇的是，發(fā)現(xiàn)NS特異的活化T細胞可用于促進神經(jīng)再生或保護神經(jīng)系統(tǒng)組織避免由于CNS或周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)損傷或疾病所導(dǎo)致的損害之后可能發(fā)生的第二次變性。
本發(fā)明者進而觀察到在CNS中，應(yīng)激狀態(tài)利用適應(yīng)性的免疫反應(yīng)來處理應(yīng)激，并且這種反應(yīng)受遺傳控制。因而，在視神經(jīng)的擠壓損傷或者向玻璃體內(nèi)注射毒性劑量的谷氨酸之后，顯示在抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)自身免疫病的成年小鼠或大鼠品系中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的存活率高于易感品系的兩倍以上。發(fā)現(xiàn)這種差異可歸因于有益的自身免疫T細胞反應(yīng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后該反應(yīng)在抗性品系中被自發(fā)地誘發(fā)，但不在易感品系中誘發(fā)。因而，假如調(diào)控得好的話，當(dāng)引起抗其自身的T細胞反應(yīng)時由于這種損傷而導(dǎo)致的神經(jīng)元的存活率將會較高。換句話說，已經(jīng)證實，引起保護性的自身免疫反應(yīng)來對抗應(yīng)激狀態(tài)以便保護動物避免損傷的后果。進一步觀察到，在調(diào)控這種反應(yīng)的能力被損害的動物或在缺乏成熟T細胞的動物(由于在出生時進行了胸腺切除)中，處理應(yīng)激狀態(tài)的能力降低了。結(jié)果，在這些動物中CNS損傷后神經(jīng)元的存活率顯著低于具有設(shè)置了保護性自身免疫T細胞介導(dǎo)反應(yīng)的有效機制的動物中神經(jīng)元的存活率(Kipnis等，2001)。
本發(fā)明人進一步發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)傷性CNS損傷后用與自身蛋白相像的非致病性合成共聚物，如共聚物1(Cop 1或格拉默)，一種由四種氨基酸酪氨酸-谷氨酸-丙氨酸-賴氨酸構(gòu)成的無規(guī)共聚物(在下文稱作“Cop 1”)，和聚(谷氨酸、酪氨酸)(在下文稱作“PoluYE”)以及通過由此活化的T細胞的免疫能夠用于提高保護性自身免疫，由此進一步減少創(chuàng)傷導(dǎo)致的損害，而且能夠進一步保護CNS避免受谷氨酸的毒性作用。參考相應(yīng)于WO 01/93893，都是2001年1月22日申請的我們在先的美國專利申請Nos.09/756,301和09/765,644，就好像這里已經(jīng)完全公開了一樣，其以整體形式在此引入作為參考，其公開了Cop 1、Cop 1-相關(guān)肽和多肽以及由此活化的T細胞保護CNS細胞避免受谷氨酸的毒性作用(USSN 09/756,301)以及防止或抑制CNS或PNS中神經(jīng)元的變性或者促進神經(jīng)的再生(USSN 09/765,644)。進一步參考我們于2001年6月28日申請的在先的美國專利申請No.09/893,344，就好像這里已經(jīng)完全公開了一樣，其整體在此引入作為參考，其公開了以前稱為polyGT，也稱為PolyYE的聚-Glu50Tyr50共聚物以及由此活化的T細胞，保護CNS細胞避免谷氨酸毒性，而且也防止或抑制CNS或PNS中神經(jīng)元的變性或促進神經(jīng)的再生。具體地，在所述的申請中顯示，用Cop-1免疫或用聚(谷氨酸、酪氨酸)免疫的小鼠視神經(jīng)纖維中，存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的數(shù)量顯著高于用PBS注射的小鼠。
公認的并且目前可以有效用于ALS治療的唯一藥物是利魯唑(2-氨基-6-(三氟甲氧基)苯并噻唑)，一種被認為是谷氨酸釋放的阻斷劑，其似乎在這種情況下可能通過抑制CNS中谷氨酸的傳遞而具有一些減少痙攣的效果。其以片劑形式口服。利魯唑不能治愈疾病或者改善癥狀。其通過延長患者約3個月的生命而在ALS患者中產(chǎn)生中等至顯著的效果，但是不改善肌肉的強度或神經(jīng)功能。
非常理想的是進一步提供治療包括ALS在內(nèi)的運動神經(jīng)元病的藥物。
本申請的本部分或任意其它部分中對任何參考文獻的引用或確認都不應(yīng)認為是承認該文獻是對本發(fā)明有用的現(xiàn)有技術(shù)。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)用Cop 1免疫能夠保護用作ALS模型的過度表達的人SOD 1的轉(zhuǎn)基因小鼠和面神經(jīng)軸突切開術(shù)后的小鼠都避免運動神經(jīng)元變性。這個發(fā)現(xiàn)以及Cop 1和PolyYE都能夠有效地保護視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞避免受谷氨酸毒性作用的事實表明，這些共聚物適合于治療運動神經(jīng)元病，特別是ALS。
申請在一個方面中，本發(fā)明涉及用于減少患運動神經(jīng)元病(MND)患者疾病進展、用于防止運動神經(jīng)元變性和/或防止受谷氨酸毒性作用的方法，包括用含有活性試劑的疫苗免疫所述的患者，其中該活性試劑從由Cop 1、與Cpo1相關(guān)的肽、與Cop 1-相關(guān)的多肽和PolyYE構(gòu)成的組中選出。
運動神經(jīng)元病(MND)是任何侵犯腦和脊髓中運動神經(jīng)元的疾病，包括肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、家族性(FALS)和散發(fā)性(SALS)ALS、原發(fā)性側(cè)索硬化(PLS)、進行性肌萎縮(PMA)、進行性延髓麻痹(PBP或延髓開始發(fā)病)及其結(jié)合的形式，如延髓開始發(fā)病的ALS和延髓開始發(fā)病的PMA。
在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括也用利魯唑或任何其它適合于治療MND，特別是ALS的藥物進行治療。
在另一個方面中，本發(fā)明提供用于減少運動神經(jīng)元病(MND)，特別是ALS中的疾病進展、防止在運動神經(jīng)元變性和/或防止受谷氨酸毒性作用的疫苗，包括從由Cop 1、與Cpo1相關(guān)的肽、與Cop 1-相關(guān)的多肽和聚(谷氨酸、酪氨酸)構(gòu)成的組中選出的活性試劑。
在進一步的方面中，本發(fā)明涉及從由Cop 1、與Cpo1相關(guān)的肽、與Cop 1-相關(guān)的多肽和聚(谷氨酸、酪氨酸)構(gòu)成的組中選出的活性試劑用于制備用于減少運動神經(jīng)元病(MND)，特別是ALS中的疾病進展、防止運動神經(jīng)元變性和/或防止受谷氨酸毒性作用的疫苗中的用途。
活性試劑可以不用任何佐劑施用，或者其可以在適合人臨床使用的佐劑中被乳化。適合人臨床使用的佐劑選自氫氧化鋁、氫氧化鋁凝膠和羥基磷酸鋁。在優(yōu)選的實施方案中，疫苗助劑是具有酸性等電點和Al∶P之比為1∶1(這里稱作鋁-磷酸)的無定形羥基磷酸鋁。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明疫苗的活性試劑是Cop 1。在另一個優(yōu)選的實施方案中，活性試劑是聚(谷氨酸、酪氨酸)。
另外，疫苗可以以包括施用利魯唑或任何其它適合治療ALS的藥物的藥方使用。
附圖的簡要說明

圖1顯示用不含佐劑的Cop 1或PolyYE進行免疫來保護小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)避免受谷氨酸的毒性作用。
圖2A-B顯示用含Cop1(2A)或PolyYE(2B)的佐劑(CFA)進行免疫來保護小鼠RGCs避免受谷氨酸的毒性作用。
圖3A-B顯示用PolyYE(圖3A)或Cop 1(圖3B)進行的免疫對青光眼眼內(nèi)壓(IOP)模型中RGCs存活率的影響。
圖4A-4B描繪了過度表達人SOD 1突變體的轉(zhuǎn)基因小鼠(在下文中稱“ALS小鼠”)進行肌肉強度測試的結(jié)果。圖4A顯示用乳化于鋁-磷酸中的Cop 1免疫的ALS小鼠(1、2和4號小鼠)和非免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠(3、5和6號小鼠)每周在旋轉(zhuǎn)的垂直桿上的平均懸掛時間(秒)。圖4B描繪了3只用含Cop 1的鋁-磷酸免疫的ALS小鼠(黑色柱)與3只非免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠(對照，灰色柱)平均懸掛時間(基線的百分率％)的比較。為了比較疾病進展率，使所有動物肌肉無力開始的時間(時間為0)一致，使每個動物懸掛時間到其疾病開始發(fā)作前的自身基線時間標(biāo)準(zhǔn)化(基線時間-100％)。該附圖描繪了在疾病進展后的幾周里每組的懸掛時間的平均值±SEM。
圖5顯示用含Cop 1的鋁-磷酸免疫的ALS小鼠(黑色正方形)保存的體重與非免疫小鼠(灰色菱形)的比較。
圖6是顯示用含Cop 1的CFA免疫的ALS小鼠的期望壽命的曲線圖。脊髓運動神經(jīng)元的進行性喪失導(dǎo)致麻痹。沒有接種的對照(n＝15)在一個或更多的肢體中出現(xiàn)麻痹，并且在211±7(平均值±SD)天齡時死亡。經(jīng)Cop 1處理的小鼠存活了263±8天。
圖7顯示用含Cop 1的CFA免疫的ALS小鼠和用利魯唑處理的ALS小鼠的期望壽命。利魯唑處理的和用Cop 1免疫的ALS小鼠顯示分別比沒有接種的對照小鼠高9％和25％。
圖8顯示在Cop 1處理的和未處理的ALS小鼠中在指定的時間點所測量的平均旋轉(zhuǎn)活動。允許小鼠抓緊和握住下端帶有小環(huán)的垂直金屬線(直徑2mm)。通過計算機化的系統(tǒng)分別記錄它們的活動并且每日進行評價。為了統(tǒng)計學(xué)的評價，將旋轉(zhuǎn)活動歸一化到每只小鼠在從第40天到第60天的平均活動。以平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)表示數(shù)據(jù)。在下列時間段觀察到處理的和未處理的小鼠之間有顯著的差異第12天和第20天之間(P＜0.058)、第21天和第24天之間(P＜0.0079)以及第25天和第28天之間(P＜0.0017)。
圖9A-D顯示在面神經(jīng)軸突切開術(shù)之后通過給小鼠施用Cop 1來挽救運動神經(jīng)元。軸突切開術(shù)后8周，用Cop-1免疫接種的小鼠的腦干中熒光金標(biāo)記的運動神經(jīng)元的數(shù)量(圖9D)顯著多于在用含PBS的CFA注射的組中所獲得的數(shù)量(圖9B)。用Cop-1處理沒有影響未受到損傷的面神經(jīng)核中的運動神經(jīng)元的數(shù)量(圖9A，9C)。用含PBS的CFA免疫的對照沒有保護性效果。
本發(fā)明的詳述本發(fā)明提供用于減少患有MND，特別是ALS的患者疾病進展、防止運動神經(jīng)變性、延長生命和改善生命質(zhì)量、和/或避免受谷氨酸毒性作用的疫苗和方法，其包括用含有活性試劑的疫苗免疫所述的患者，其中該活性試劑從由Cop 1、Cpo1相關(guān)肽、Cop 1相關(guān)多肽或PolyYE構(gòu)成的組中選出，不使用佐劑或者在適合人臨床使用的佐劑中乳化。
正如這里使用的，術(shù)語“運動神經(jīng)元”(“motor neurons”和“motonneurons”)、術(shù)語“PolyYE”和“聚(谷氨酸、酪氨酸)”以及術(shù)語“Cop1”和“共聚物1”，每對都是可以互換使用的。
為了本發(fā)明的目的，“Cop 1或者與Cop 1相關(guān)的肽或多肽”意味著包括任何肽或多肽，包括無規(guī)共聚物，它們與髓鞘堿性蛋白(MBP)有功能性交叉反應(yīng)并能在抗原呈遞中與MBP競爭MHC-II類。
本發(fā)明的疫苗可能含有作為活性試劑的無規(guī)共聚物，該共聚物含合適量的帶正電荷的氨基酸如賴氨酸或精氨酸，與帶負電荷的氨基酸(優(yōu)選較少量)如谷氨酸或天冬氨酸的組合，可任選地與作為填充物的不帶電的中性氨基酸如丙氨酸或甘氨酸組合，并可任選地與適于賦予共聚物免疫原性的氨基酸如像酪氨酸或色氨酸之類的芳香族氨基酸組合。這種疫苗可包括公開于WO 00/05250中的那些共聚物中的任何一種，其全部內(nèi)容在此引入作為參考。
更具體地，用于本發(fā)明的疫苗含有至少一種共聚物，它選自含有一種氨基酸的無規(guī)共聚物，該氨基酸選自以下各組中至少三組中的每一種(a)賴氨酸和精氨酸；(b)谷氨酸和天冬氨酸；(c)丙氨酸和甘氨酸；和(d)酪氨酸和色氨酸。
用于本發(fā)明的共聚物可由L-或D-氨基酸或者其混合物組成。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，L-氨基酸存在于大多數(shù)的天然蛋白中。然而，D-氨基酸有商業(yè)供應(yīng)并可取代用于制備本發(fā)明中使用的三元共聚物和其它共聚物的一些或所有氨基酸。本發(fā)明考慮使用同時含D-和L-氨基酸的共聚物，以及基本上由L-或由D-氨基酸組成的共聚物。
在本發(fā)明的一個實施方案中，共聚物含有四種不同的氨基酸，每種氨基酸來自(a)到(d)組中不同的組。根據(jù)該實施方案，優(yōu)選的共聚物包含丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸和酪氨酸的組合，其帶有凈總正電荷且分子量為約2,000-40,000Da，優(yōu)選約2,000-13,000Da，最優(yōu)選地是平均分子量為約4,700-13,000Da的共聚物1。優(yōu)選的分子量范圍和制備優(yōu)選形式Cop 1的方法描述于美國專利No.5,800,808中，其全部內(nèi)容以整體形式在此引作參考。顯而易見這只是以實例的方式給出，并且如果與以上一般標(biāo)準(zhǔn)一致，那么疫苗的成分及成分的相對比例都可以變化。因而，共聚物可以是約15到約100個氨基酸長度的多肽，優(yōu)選約40到約80，優(yōu)選具有屬名格拉默乙酸鹽的共聚物。
在另一個實施方案中，共聚物含有三種不同的氨基酸，每種來自(a)到(d)組的三組中的不同組。這些共聚物在此稱為三元共聚物。
在一個實施方案中，用于本發(fā)明的三元共聚物含有酪氨酸、丙氨酸和賴氨酸，以下稱為YAK。這些三元共聚物中氨基酸的平均摩爾分數(shù)可以變化。例如，酪氨酸的摩爾分數(shù)可以是約0.005-0.250；丙氨酸的摩爾分數(shù)可以是約0.3-0.6；以及賴氨酸的摩爾分數(shù)可以是約0.1-0.5。平均分子量為2,000-40,000Da，優(yōu)選為約3,000-35,000Da。在更優(yōu)選的實施方案中，平均分子量為約5,000-25,000Da?？梢杂镁彼崛〈嚢彼?、用甘氨酸取代丙氨酸、和/或用色氨酸取代酪氨酸。
在另一個實施方案中，用于本發(fā)明的三元共聚物含有酪氨酸、谷氨酸和賴氨酸，以下稱為YEK。這些三元共聚物中氨基酸的平均摩爾分數(shù)可以變化谷氨酸的摩爾分數(shù)可以是約0.005-0.300，酪氨酸的摩爾分數(shù)可以是約0.005-0.250，以及賴氨酸的摩爾分數(shù)可以是約0.3-0.7。平均分子量為2,000-40,000Da，優(yōu)選為約3,000-35,000Da。在一個更優(yōu)選的實施方案中，平均分子量為約5,000-25,000Da?？梢杂锰於彼崛〈劝彼?、用精氨酸取代賴氨酸，和/或用色氨酸取代酪氨酸。
在另一個實施方案中，用于本發(fā)明的三元共聚物含有賴氨酸、谷氨酸和丙氨酸，以下稱為KEA。這些多肽中氨基酸的平均摩爾分數(shù)也可以變化。例如，谷氨酸的摩爾分數(shù)可以是約0.005-0.300，丙氨酸的摩爾分數(shù)可以是約0.005-0.600，以及賴氨酸的摩爾分數(shù)可以是約0.2-0.7。平均分子量是2,000-40,000Da，優(yōu)選為約3,000-35,000Da。在一個更優(yōu)選的實施方案中，平均分子量是約5,000-25,000Da?？梢杂锰於彼崛〈劝彼帷⒂酶拾彼崛〈彼?、和/或用精氨酸取代賴氨酸。
在另一個實施方案中，用于本發(fā)明的三元共聚物含有酪氨酸、谷氨酸和丙氨酸，以下稱為YEA。這些多肽中氨基酸的平均摩爾分數(shù)可以變化。例如，酪氨酸的摩爾分數(shù)可以是約0.005-0.250，谷氨酸的摩爾分數(shù)可以是約0.005-0.300，以及丙氨酸的摩爾分數(shù)可以是約0.005-0.800。平均分子量在2,000-40,000Da之間，優(yōu)選在約3,000-35,000Da之間。在一個更優(yōu)選的實施方案中，平均分子量是約5,000-25,000Da?？梢杂蒙彼崛〈野彼?、用天冬氨酸取代谷氨酸、和/或用甘氨酸取代丙氨酸。
在更優(yōu)選的實施方案中，這些三元共聚物中氨基酸的摩爾分數(shù)大約是共聚物1優(yōu)選的摩爾分數(shù)。共聚物1中氨基酸的摩爾分數(shù)是谷氨酸約0.14，丙氨酸約0.43，酪氨酸約0.10以及賴氨酸約0.34。最優(yōu)選的共聚物1的平均分子量為約5,000-9,000Da。如果進行一個或多個下面的取代，此處公開的疫苗中共聚物1的活性預(yù)期仍保留天冬氨酸取代谷氨酸、甘氨酸取代丙氨酸、精氨酸取代賴氨酸和色氨酸取代酪氨酸。
更優(yōu)選的谷氨酸、丙氨酸和酪氨酸的三元共聚物或YEA，其單體摩爾比是約0.21比約0.65比約0.14。
更優(yōu)選的谷氨酸、丙氨酸和賴氨酸的三元共聚物或KEA，其單體摩爾比是約0.15比約0.48比約0.36。
更優(yōu)選的谷氨酸、酪氨酸和賴氨酸的三元共聚物或YEK，其單體摩爾比是約0.26比約0.16比約0.58。
更優(yōu)選的酪氨酸、丙氨酸和賴氨酸的三元共聚物或YAK，其單體摩爾比是約0.10比約0.54比約0.35。
可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的任何方法制備三元共聚物。例如，可在縮合條件下用期望摩爾比的氨基酸溶液制備三元共聚物，或者通過固相合成方法制造?？s合條件包括合適的溫度、pH和溶劑條件，供一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的氨基縮合形成肽鍵?？s合劑，例如二環(huán)己基碳化二亞胺，可用于促進肽鍵的形成。封閉基團可用于保護官能團，如側(cè)鏈部分以及一些氨基或羧基，避免不期望的副反應(yīng)。
例如，可使用在美國專利3,849,650中公開的方法，其中酪氨酸、丙氨酸、γ-芐基谷氨酸以及N-ε-三氟乙酰賴氨酸的N-羧基酐在室溫下無水二氧六環(huán)中用二乙胺作為引發(fā)劑進行聚合。用含溴化氫的冰醋酸可使谷氨酸的γ-羧基去封閉。用1摩爾哌啶除去賴氨酸的三氟乙?；?。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，通過選擇性去除與谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸或賴氨酸中任何一項有關(guān)的反應(yīng)，可對方法進行調(diào)整以制造含期望氨基酸，也即共聚物1中四個氨基酸中的三個的肽和多肽。對此應(yīng)用目的，術(shù)語“環(huán)境溫度”和“室溫”意指約20到約26℃的溫度范圍。
多肽合成期間或制造出三元共聚物以后，可調(diào)節(jié)三元共聚物的分子量。在多肽合成期間調(diào)節(jié)分子量，要調(diào)節(jié)合成條件或氨基酸的量，使多肽達到期望的大致長度時停止合成。合成之后，期望分子量的多肽可通過任何可用的大小選擇方法，如在分子量選擇柱或凝膠上的多肽層析，然后收集期望的分子量范圍。本發(fā)明的多肽也可被部分水解以除去高分子量的部分，例如通過酸或酶的水解，然后純化以除去酸或酶。
在一個實施方案中，可用以下方法制備期望分子量的三元共聚物，其中包括將受保護的多肽與氫溴酸反應(yīng)以形成具有期望分子量分布的三氟乙酰多肽。通過一次或多次試驗反應(yīng)確定反應(yīng)的持續(xù)時間和反應(yīng)溫度。試驗反應(yīng)期間，改變時間和溫度并測定給定批次試驗多肽的分子量范圍。將提供最佳分子量范圍的多肽批次所使用的試驗條件用于批量生產(chǎn)。因而，可通過以下方法制造具有期望分子量分布的三氟乙酰多肽，其中包括按試驗反應(yīng)已確定的反應(yīng)時間和溫度將受保護的多肽與氫溴酸反應(yīng)。接著用哌啶水溶液進一步處理具有期望分子量分布的三氟乙酰多肽，以形成具有期望分子量的低毒性多肽。
在優(yōu)選的實施方案中，使給定批次的受保護的多肽測試樣品在溫度約20-28℃下與氫溴酸持續(xù)反應(yīng)約10-50小時。通過進行幾次試驗反應(yīng)確定該批次的最佳條件。例如，在一個實施方案中，使保護多肽在溫度約26℃下與氫溴酸持續(xù)反應(yīng)約17小時。
因為Cop 1與跟MS-締合的HLA-DR分子的結(jié)合基序是已知的(Fridkis-Hareli等，1999)，很容易制備確定序列的多肽并按Fridkis-Hareli等(1999)所述的方法測試其與HLA-DR分子的肽結(jié)合溝的結(jié)合。這種肽的實例公開于WO 005249，其全部內(nèi)容在此引作參考。在所述申請中具體公開的肽中的32個在下表1中列出。預(yù)期這種肽和其它類似肽具有類似Cop 1的活性。這種肽和其它類似肽也被認為在與Cop 1相關(guān)的肽或多肽的定義范圍內(nèi)，并且其用途被認為是本發(fā)明的一部分。
根據(jù)本發(fā)明的“與Cop 1相關(guān)的多肽”的定義被解釋為包括其它合成的氨基酸共聚物，例如Fridkis-Hareli等2002描述的無規(guī)的四種氨基酸的共聚物，作為多發(fā)性硬化治療的候選共聚物，即含有苯丙氨酸、谷氨酸、丙氨酸和賴氨酸(聚FEAK)或酪氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸和賴氨酸(聚YFAK)的共聚物(14-，35-和50-聚體)，以及任何其它發(fā)現(xiàn)可被認為類似于Cop1和PolyYE的通用抗原的類似共聚物。
表1
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選用于本發(fā)明疫苗的共聚物是共聚物1，此處也稱為Cop 1，最優(yōu)選其屬名為格拉默乙酸鹽的乙酸鹽形式。格拉默乙酸鹽已經(jīng)在幾個國家被批準(zhǔn)用于治療多發(fā)性硬化(MS)，商品名為COPAXON_(Teva Pharmaceutical Ltd.，Petah Tikva，Israel的商標(biāo))。幾個臨床試驗表明Cop 1的耐受性良好，只有很少的副反應(yīng)且大多是在注射部位的輕度反應(yīng)(Johnson等，1995)。
如前面提到的，SOD 1基因中的突變是家族性ALS的一種遺傳學(xué)原因(Rosen等，1993；Brown，1995)。幾個表達突變SOD 1基因的小鼠模型產(chǎn)生了類似于人的運動神經(jīng)元變性(Gurney等，1994；Ripps等，1995；Kong和Xu，1998)。這些小鼠品系的原始特性已經(jīng)證明由突變酶引起的有害特性的顯著增加導(dǎo)致運動神經(jīng)元變性(見Bruijn和Cleveland，1996的綜述)。另外，這些分析確證了已經(jīng)在人類中觀察到的眾多病理特征(Hirano，1991；Chou，1992)。為了理解這種被稱為SOD 1改變的突變，產(chǎn)生了一種公認的測試家族性ALS治療的動物模型(ALS小鼠)。由于與SOD 1相關(guān)的家族性ALS和散發(fā)性ALS(占所有ALS病例的90％)有相似的癥狀和病理特征，因此帶有突變SOD 1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠是公認的測試家族性和散發(fā)性兩種ALS類型治療的動物模型，并且是被ALS治療定展基金(ALS-TDF)使用的模型。ALS小鼠產(chǎn)生了近似ALS的運動原病。運動功能障礙最終導(dǎo)致其死亡。
根據(jù)本發(fā)明，盡管SOD過度表達產(chǎn)生了氧化應(yīng)激條件，但是用在CFA或適合人使用的佐劑中乳化的Cop 1的疫苗免疫的ALS小鼠顯示避免了運動神經(jīng)的變性。因而，用含有“普遍的”弱自身反應(yīng)抗原Cop1的CFA接種的ALS小鼠(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，263±8天，n＝14)與未處理的相匹配的對照(211±7天；n＝15；P＜0.0001)相比，生命延長了52天。接種顯著地改善了臨床和臨床前期中的運動活性。另外，用Cop 1接種也預(yù)防了面神經(jīng)軸突切開術(shù)之后的急性運動神經(jīng)元變性接種小鼠中存活的運動神經(jīng)元幾乎比軸突切開術(shù)對照的高200％(P＜0.05)。這些結(jié)果暗示自身免疫保護的觀念可以擴展到包括運動神經(jīng)元病。其也可能有戲劇性的臨床意義。
根據(jù)本發(fā)明的免疫使用的佐劑是基于鋁的佐劑。含有病毒來源的抗原如乙肝病毒表面抗原或b型流感嗜血桿菌莢膜多糖疫苗是更常使用的佐劑，這些佐劑第一次與合成共聚物，特別是Cop 1一起使用。
盡管本發(fā)明包含任何其它合適的劑量，但是Cop 1或PolyYE的給藥劑量將由醫(yī)師根據(jù)病人的年齡和疾病的階段決定并且可以在從10-80mg的范圍內(nèi)選擇。至少每月給藥一次或者至少每2或3個月給藥一次，或者以更少的頻率給藥，但是根據(jù)患者的情況，本發(fā)明預(yù)見了免疫之間的任何其它合適的間隔。
本發(fā)明的疫苗可以通過任何合適的方式給藥，包括口服、肌肉內(nèi)、皮下和皮內(nèi)給藥，使用或不使用佐劑。
當(dāng)與利魯唑或任何其它適合治療MND，特別是ALS的藥物一起給藥時，根據(jù)制造商的說明書，在免疫接種的同一天和此后的每天給予附加的藥物，與疫苗處方無關(guān)。例如，利魯唑的每日劑量是100mg。
以下實施例舉例說明了本發(fā)明的某些特征，但不是對本發(fā)明范圍的限定。
實施例材料和方法動物8-13周齡的C57BL/6J系小鼠由魏茲曼科學(xué)研究所動物繁殖中心提供(Rehovot，Israel)。在用于實驗之前，通過腹膜內(nèi)給予80mg/kg氯胺酮和16mg/kg賽拉嗪麻醉小鼠。過度表達含有甘氨酸93→丙氨酸(G93A)基因的缺陷型人突變體SOD 1等位基因的轉(zhuǎn)基因小鼠(B6SJL-TgN(SOD 1-G93A)1Gur(即這里的“ALS小鼠”)購自杰克遜實驗室(Bar Harbor，ME，USA)。根據(jù)實驗動物管理和使用委員會(IACUC)制定的規(guī)則來使用動物。
材料Cop 1(中值分子量7,200道爾頓)來自TevaPharmaceuticals Ltd.(Petah Tikva，Israel)。羥基磷酸鋁凝膠(REHYDRAPHOSTM疫苗佐劑，即這里的鋁-磷酸)購自Reheis(NJ，USA)。如果沒有其它說明，含有0.5mg/ml結(jié)核桿菌的完全弗氏佐劑(CFA)購自Difco(Detroit，Michigan，USA)。
免疫用在CFA或Cop 1-鋁-磷酸中乳化的Cop 1(100μl總體積中含有100μg)免疫小鼠。將鋁-磷酸與Cop 1以1∶4的比例劇烈混合。在小鼠脅腹的一個位置皮下(SC)注射每種疫苗。給對照小鼠注射含有甘露醇的CFA或者鋁-磷酸。
谷氨酸注射用27號針頭在鞏膜的上部刺穿麻醉的C57B BL/6J小鼠的右眼，用帶30號針頭的10μl Hamilton注射器插入玻璃體。向小鼠注射溶于鹽水中總體積為1μl的L-谷氨酸(200nmol)。
標(biāo)記小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGC)在實驗結(jié)束前標(biāo)記RCGs72小時。將小鼠麻醉并置于立體定位裝置中。暴露顱骨并且保持干燥和清潔。確認前囟并作標(biāo)記。將注射點指定在位于離腦表面2mm深、在前后軸中在前囟后2.92mm，以及距中線0.5mm的側(cè)向。在左右半球中指定的坐標(biāo)軸上的頭皮中鉆一個窗口。然后用Hamilton注射器施用神經(jīng)示蹤物染料熒光金(5％鹽水溶液；Fluorochrome，Denver，CO)，(1μl，在每個半球中的速率為0.5μl/min)，接著縫合傷口上的皮膚。染料的逆向攝入提供了活細胞的標(biāo)記。
評估小鼠RGC的存活率給予小鼠致死量的戊巴比妥(170mg/kg)。摘除眼球，分離視網(wǎng)膜，并在低聚甲醛(4％PBS)中制成平展的完整標(biāo)本。在4-6個選定的相同大小的視野中(0.7mm2)計數(shù)標(biāo)記的細胞。選定的視野位于距視神經(jīng)盤(0.3mm)大致相同的距離處，以克服作為離視神經(jīng)盤距離函數(shù)的RGC密度的變化。由不了解小鼠所受處理的觀察者在熒光顯微鏡(放大800倍)下對視野進行計數(shù)。計算每個視網(wǎng)膜中每個視野RGC的平均數(shù)。
肌萎縮性側(cè)索硬化模型用在鋁-磷酸中乳化的Cop-1(100μl總體積中含100μg，在每只小鼠的側(cè)腹皮下注射)接種3只75天齡的ALS小鼠。一周后和此后每月給予小鼠強化注射。另外3只轉(zhuǎn)基因小鼠不進行免疫，用作為疾病自發(fā)性進展的對照。通過盲試每只小鼠在旋轉(zhuǎn)的垂直桿上懸掛的時間來評價肌肉強度。由于大多數(shù)動物能夠在轉(zhuǎn)桿上懸掛的最大時間是5分鐘，因此每個實驗持續(xù)到5分鐘。
肌肉強度試驗根據(jù)以前描述的方法(Kong和Xu，1998)進行試驗。讓小鼠抓緊和握住下端帶有小環(huán)的垂直金屬線(直徑2mm)。垂直金屬線允許小鼠使用前腿和后腿抓住金屬線。金屬線在垂直方向以24rpm進行圓周運動(圓半徑是10cm)。用計時器記錄小鼠能夠在金屬線上懸掛的時間。因為大多數(shù)小鼠在5分鐘內(nèi)跌落，因此試驗在5分鐘時中斷。通常每周試驗小鼠一次并且持續(xù)試驗直到小鼠不再能在金屬線上懸掛為止。
數(shù)據(jù)分析通過Mantel-Cox檢驗和Cox’s正比危險回歸分析的方法分析存活率數(shù)據(jù)。使用SPSS-PC軟件程序(SPSS，Chicago，IL)通過單因素方差分析，然后通過兩兩比較Student-Neuman-Keuls方法檢驗統(tǒng)計學(xué)意義。
實施例1.通過用乳化于鋁-磷酸的Cop 1進行主動接種來保護神經(jīng)元避免受谷氨酸的毒性作用第一次檢驗是否可以通過用乳化于CFA或鋁-磷酸中的Cop 1的主動接種來阻斷谷氨酸誘導(dǎo)的毒性。CFA是不允許用于人的佐劑，經(jīng)常僅在實驗室動物實驗中使用。鋁-磷酸和其它基于氫氧化鋁的佐劑得到FDA和其它權(quán)威機構(gòu)的允許，廣泛地在獸用以及人疫苗中使用。
在C57BL/6J小鼠脅腹的一個部位皮下注射在CFA或在鋁-磷酸中乳化的Cop 1(在100μl總體積中含100μg)，并且7天后將谷氨酸(200nmol)注射到小鼠的玻璃體中。7天后計數(shù)存活的RGC。將沒有進行任何預(yù)先免疫隨后受谷氨酸毒性作用的小鼠RGC的存活率作為100％。
如表2中所示，在注射谷氨酸前用含有Cop 1的CFA或鋁-磷酸預(yù)先免疫7天的小鼠產(chǎn)生了顯著的保護視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞避免受谷氨酸毒性作用的保護作用，但是乳化于鋁-磷酸中的Cop 1的保護作用顯著高于CFA。
表2通過用含Cop 1的CFA或鋁-磷酸主動接種來保護神經(jīng)元避免受谷氨酸的毒性作用
*P＜0.05；雙尾Student’s t檢驗.
實施例2通過用含或不含佐劑的Cop 1或者PolyYE接種來保護神經(jīng)元避免受谷氨酸的毒性作用谷氨酸毒性是ALS神經(jīng)變性的危險因素之一。為了檢查用不含佐劑的Cop 1和PolyYE進行的免疫對保護神經(jīng)元避免受谷氨酸毒性作用的效率，將C57BL小鼠的視網(wǎng)膜暴露到過量的谷氨酸中。將C57BL小鼠分成4個實驗組1.沒有免疫的動物-陰性對照，n＝92.每只小鼠用25μg PolyYE免疫的動物，n＝103.每只小鼠用225μg PolyYE免疫的動物，n＝104.每只小鼠用75μg Cop 1免疫的動物，n＝7在眼內(nèi)注射谷氨酸7天前，用溶于100μl PBS的PolyYE或Cop 1免疫處理組。對暴露于增高水平的谷氨酸7天后存活的RGC數(shù)量進行計數(shù)，并且計算占正常眼的百分數(shù)。結(jié)果顯示于圖1。所有處理組(2-4組)中RGC的存活率顯著高于陰性對照組(p＜0.001，t檢驗)。
在另外的實驗中，在眼內(nèi)注射谷氨酸前7天，用乳化于鋁-磷酸中的Cop 1(100μg)(n＝8)或僅用鋁-磷酸(n＝8)或用乳化于CFA的PolyYE(100μg)(n＝24)或僅用佐劑(陰性對照)(n＝27)(100μl)處理C57B1小鼠。對暴露于增高水平的谷氨酸7天后存活的RGCs數(shù)量進行計數(shù)。計算存活的RGC占未處理組中全部RGC喪失的百分率作為保護率。結(jié)果顯示于圖2A-B中。在Cop 1處理組(圖2A)和PolyYE處理組(圖2B)中RGC的存活率顯著高于僅接受佐劑的陰性對照組。
在谷氨酸毒性模型中檢驗高分子量尺寸(中值分子量12,600，15,500和22,000道爾頓)的Cop 1。如上面描述的，在急性谷氨酸毒性模型中測定在RGC中誘發(fā)的特異性神經(jīng)保護性反應(yīng)的效能。在眼內(nèi)注射谷氨酸(200nmol)以前14天，免疫C57BL/6小鼠(每個實驗共5組，每組10只動物)，在谷氨酸注射后7天檢查RGC的存活率。檢驗每種分子量Cop 1的3種劑量，并且與陰性對照(僅谷氨酸)和陽性對照(谷氨酸毒性前7天，注射75μg分子量為7,200道爾頓的Cop 1)進行比較。
實施例3.青光眼模型中用Cop 1和PolyYE接種的神經(jīng)保護效果青光眼是一種進行性的視神經(jīng)元喪失的慢性神經(jīng)變性疾病，最終導(dǎo)致失明。逐漸增高的眼內(nèi)壓(IOP)被認為是主要危險因素，并且相信是神經(jīng)元死亡的主要原因。因此，生化試劑或設(shè)計用于降低IOP的手術(shù)是當(dāng)今標(biāo)準(zhǔn)的治療方法。然而，降低IOP并不總是足以停止神經(jīng)元的喪失。而且，視神經(jīng)變性有時發(fā)生在缺乏IOP增高的青光眼中，一種稱為正常壓力的青光眼疾病(約在三分之一的青光眼患者中發(fā)生)。因而，神經(jīng)保護性治療被認為是合適的。我們使用了大鼠IOP慢性增高的模型來檢查Cop 1或PolyYE接種在減少神經(jīng)元死亡方面的能力，神經(jīng)元死亡發(fā)生在持續(xù)應(yīng)激的情況下，如同其可能在ALS患者中發(fā)生的那樣。由于青光眼是如ALS一樣的慢性神經(jīng)變性疾病，因此在青光眼模型中提供的神經(jīng)保護可能指示在ALS中有類似的神經(jīng)保護作用。
按如下方法誘導(dǎo)高IOP使用發(fā)射藍-綠氬激光輻照的Haag-Streit狹縫燈，直接向麻醉的成年雄性Lewis大鼠的右眼鞏膜外層的4個靜脈中的3個以及針對270度的邊緣叢靜脈應(yīng)用80-120次。使用1瓦的激光束持續(xù)0.2秒，在鞏膜外層靜脈產(chǎn)生100mm大小的斑點，在邊緣叢靜脈產(chǎn)生50mm大小的斑點。1周后在第2次使用激光時，除了對所有的應(yīng)用斑點大小都是100mm外，使用相同的參數(shù)。直接對所有的4條鞏膜外層靜脈和360度的邊緣叢靜脈輻照24小時。
為了測量IOP的提高，向大鼠腹膜內(nèi)注射10mg/ml馬來酸乙酰丙嗪，一種不減少IOP的鎮(zhèn)靜藥，將Localin應(yīng)用到角膜，5分鐘以后用Tono-Pen XL眼壓計(自動化的眼科儀器，Ellicott City，MD，USA)測量兩眼中的壓力。計算每只眼10次測量的平均值。如在下表3所示，在第一次激光處理后一周，IOP的水平達到大約30mmHg，直到實驗結(jié)束(第一次激光處理后3周)也沒有任何顯著性的改變。
為了測定RGC的存活率，第一次激光處理后3周，直接將親水性的神經(jīng)示蹤物染料葡聚糖四甲基羅丹明(羅丹明葡聚糖)(分子探針，Oregon，USA)應(yīng)用到眼神經(jīng)的眶內(nèi)部分。只有幸免于高IOP的仍然具有功能并且其細胞體仍然存活的軸突，才能攝入染料并且證明為標(biāo)記的RGC。24小時后處死大鼠，摘除視網(wǎng)膜，完整地固定，在Zeiss熒光顯微鏡中放大800倍計數(shù)標(biāo)記的RGC。計數(shù)每個視網(wǎng)膜的4個視野，所有的都具有相同的直徑(0.076mm2)并且距視盤相同的距離。由不了解視網(wǎng)膜身分的觀察者計數(shù)RGC。
表3總結(jié)了3周后具有正常IOP的大鼠和用激光誘導(dǎo)的IOP增加的大鼠中RGC的存活率表3
3a.在青光眼IOP模型中PolyYE接種對RGC存活率的影響在第一次激光處理后1小時，用在CFA中乳化的PolyEY(500μg)免疫SPD大鼠(n＝9)。一個對照組用無抗原的CFA免疫(n＝7)，第二個對照組僅注射PBS(n＝5)。如圖3A所示，盡管在整個實驗期間IOP仍然是升高的，PolyEY免疫的大鼠，但不是PBS免疫的大鼠與未免疫的大鼠相比顯示其RGC的存活率顯著增加。計算在接受處理的組中存活的細胞占非免疫組中喪失的全部細胞的百分率作為RGC的保護率。
3b.在青光眼IOP模型中Cop 1的接種對RGC存活率的影響使用IOP增高的大鼠模型時，當(dāng)在IOP開始增高時或者一周后給予Cop 1(含500μg的CFA)顯示能夠減少神經(jīng)元的損失(見圖3B)，盡管IOP仍然很高并且神經(jīng)變性已經(jīng)開始。另外，與降低IOP的藥物溴莫尼定(brimonodine)一起給予Cop 1的接種導(dǎo)致RGC的保護率高于僅使用溴莫尼定(見圖3B，插圖)。
實施例4.Cop 1免疫防止轉(zhuǎn)基因SOD 1突變體小鼠(ALS小鼠)中運動神經(jīng)的變性為了檢驗Cop 1免疫是否能夠避免運動神經(jīng)元變性的進展，當(dāng)ALS小鼠SOD 1(n＝3)75天時，用含Cop 1的鋁-磷酸免疫小鼠，一周后給予強化。接著每30天免疫一次。ALS小鼠的對照組不用Cop 1免疫。然后通過盲性檢測在旋轉(zhuǎn)垂直桿上懸掛的時間每周測試幾次小鼠的肌肉強度。每個實驗持續(xù)5分鐘。
圖4A-B中描述了小鼠肌肉無力的發(fā)展情況。圖4A描述了每周每個動物的平均懸掛時間(結(jié)果是平均值±SEM)。如圖顯示的，Cop 1免疫動物中的兩只動物顯示懸掛時間長于非免疫的小鼠。
在單個小鼠中肌肉強度降低開始發(fā)生的情況不同。為了評估接種對每只小鼠下降速率的影響，將任何特定時間的肌肉強度與下降開始前一周的強度進行比較。
圖4B顯示單個轉(zhuǎn)基因小鼠中肌肉強度下降的同步圖。顯而易見，不管在免疫當(dāng)天其強度如何，用Cop-1免疫的小鼠顯示顯著低的肌肉強度下降率。因而，與未免疫的動物相比，它們保持較長時間運動的能力。
Cop 1免疫的有益影響也反映在小鼠體重方面。如圖5所示，隨著疾病的進展，Cop 1免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠也顯示了較緩慢的體重降低。在86-111天齡之間，所有未免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠體重降低了2克。相反，在Cop 1免疫組中有1只小鼠體重沒有變化，2只小鼠體重增加2克。
Cop 1的免疫也影響轉(zhuǎn)基因小鼠的死亡率。隨著疾病的進展，小鼠變得麻痹和死亡。Cop 1的免疫顯著延長了轉(zhuǎn)基因小鼠的生命而未處理的小鼠在疾病開始發(fā)作后的2、3和4周時死亡，有1只Cop 1免疫的小鼠在疾病開始發(fā)作后存活了4周，其它兩只存活了7周(表4)。在死亡的時間上，Cop 1免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠平均是3周，長于未免疫的小鼠。
表4.Cop 1的免疫延長了過度表達人SOD-1的突變體轉(zhuǎn)基因小鼠的生命
實施例5.Cop-1的處理增加了ALS小鼠的期望壽命用在含有5mg/ml結(jié)核桿菌的CFA(Difco Laboratories，Heidelberg，Germany)乳化的Cop 1(75μg)接種14只60天齡的ALS小鼠。將乳劑(總體積200μl)注射到后足墊，隨后每日在飲用水中給予小鼠口服的Cop 1(12.5mg/kg/天)。每日觀察并且每周稱重在60天齡用Cop-1免疫的小鼠和未處理的對照小鼠。監(jiān)測小鼠的運動活性和死亡率。以第一次出現(xiàn)震顫和/或肢體顫動，或者當(dāng)抓住尾巴將小鼠懸在空中時后肢垂下(而不是展開)時的年齡(以天數(shù)表示)確定癥狀開始發(fā)作的年齡。正反射的喪失被認為是預(yù)示疾病的末期。脊髓運動神經(jīng)元的逐漸喪失導(dǎo)致麻痹。如圖6所示，非接種對照組(n＝14)的一個或更多的肢體變得麻痹并在211±7天齡(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)前死亡。Cop-1處理的小鼠存活了263±8天。因而，用Cop-1接種顯著地增加了ALS小鼠的期望壽命(圖6)。
作為陽性對照，給予15只ALS小鼠日劑量(30mg/kg)的利魯唑，其是當(dāng)前給予ALS患者的唯一藥物。如圖7顯示，利魯唑處理的小鼠顯示存活率相對于對照增加了9％，而Cop 1處理的小鼠顯示相對于對照增加了25％。
除了生命周期幾乎增加25％外，疾病發(fā)作(通過運動完成情況表現(xiàn)出來)被延遲，預(yù)示有益之處也表現(xiàn)在臨床前期和臨床期的生命質(zhì)量中(圖8)。讓小鼠抓緊和握住下端帶有小環(huán)的垂直金屬線(直徑2mm)。使用轉(zhuǎn)桿裝置(LMTB，Berlin)評估在40天和60天齡之間的夜間運動活動(從晚上8點到早上8點)獲得每只小鼠的正常值。通過計算機化的系統(tǒng)分別記錄每只小鼠的活動并且每日評估。為了進行統(tǒng)計學(xué)評價，將轉(zhuǎn)桿活動歸一化為每只小鼠從第40天到第60天的平均活動。將數(shù)據(jù)表示為平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。通過方差分析(ANOVA)比較轉(zhuǎn)桿測試和體重。利用SPSS-PC軟件程序(SPSS，Chicago，IL)通過單因素方差分析然后通過兩兩比較Student-Neuman-Keuls方法檢驗統(tǒng)計學(xué)意義。在下列時間階段觀察到在Cop-1處理的小鼠和未處理的小鼠之間的顯著性差異第12天和第20天之間(p＜0.058)，第21天和第24天之間(p＜0.0079)以及第25天和第28天之間(p＜0.0017)。
實施例6.用無佐劑的Copl處理ALS小鼠將ALS小鼠分成11個實驗組(每組15只動物)1.未處理的小鼠-陰性對照組。
2.利魯唑處理的小鼠-30mg/kg/天3.用含Cop 1的CFA免疫的小鼠-初始接種75μg，隨后每日口服Cop 1(12.5mg/kg-陽性對照組。
4.兩次注射75μg Cop 1免疫的小鼠第一次注射在第45天，第二次注射在第59天。
5.如#4組的方法免疫的小鼠，隨后在第87天時單次注射100μg Cop 1。
6.兩次注射150μg Cop 1免疫的小鼠第一次注射在第45天，第二次注射在第59天。
7.兩次注射75μg Cop 1免疫的小鼠第一次注射在第83天，第二次注射在第97天。
8.同#4組，用利魯唑30mg/kg/天免疫。
9.同#5組，用利魯唑30mg/kg/天免疫。
10.同#6組，用利魯唑30mg/kg/天免疫。
11.同#7組，用利魯唑30mg/kg/天免疫。
在處理開始前兩周，開始每周監(jiān)測一次小鼠的運動和體重。將動物死亡的末期標(biāo)準(zhǔn)定義為當(dāng)被放置在平坦表面上的任何一邊時在30秒內(nèi)不能自己翻身。根據(jù)動物試驗方案的要求由一名獨立的獸醫(yī)作出決定。
實施例7.面神經(jīng)軸突切開術(shù)后給予Cop-1保護運動神經(jīng)元免受變性已知成年大鼠面神經(jīng)的橫切導(dǎo)致易見的20％到35％軸突切開的運動神經(jīng)元的晚期變性。因此，面神經(jīng)的軸突切開術(shù)提供了一種ALS模型，其是以進行性運動神經(jīng)元喪失為特征的疾病。在面神經(jīng)軸突切開術(shù)模型中免疫對神經(jīng)元的存活率和功能的影響預(yù)示減少ALS患者運動神經(jīng)元喪失的治療潛能。
在這個實驗中使用34只C57BL/6JO1 aHsd系(HarlanWinkelmann，Borchen，Germany)成年雌性小鼠(12周，20-25克)。將對照動物進行單側(cè)面神經(jīng)軸突切開術(shù)，并且不處理或者注射乳化于CFA的PBS。將實驗組中的小鼠(n＝10)用Cop 1(總計100μg)或者注射PBS(n＝9)進行免疫，兩者都乳化于CFA，7天后進行面神經(jīng)軸突切開術(shù)。第三組小鼠(n＝8)在軸突切開術(shù)前不進行免疫，第四組小鼠(n＝7)保持原樣。
7天后在麻醉的小鼠(每公斤體重100mg氯胺酮_加5mg甲苯噻嗪_)中進行面-面吻合(FFA)，用兩根11-0神經(jīng)弓上的縫合線(Ethicon EH 7438G，Norderstedt，Germany)通過顯微外科將殘余面神經(jīng)的近端重新連接到遠端。用3根4-0的皮膚縫合線將傷口封閉。為了對恢復(fù)進行評估，將30μl熒光逆行標(biāo)記物熒光金的1％水溶液加2％二甲基亞砜(DMSO)注射到每個須墊的肌肉中，來逆行標(biāo)記供應(yīng)須墊肌肉的面部運動神經(jīng)元。7天以后，將小鼠重新麻醉并用0.9％氯化鈉穿心灌注，隨后用含4％低聚甲醛的pH7.4，0.1M的磷酸緩沖液固定20分鐘。切除大腦并用振動切片機經(jīng)腦干切成50μm厚的冠狀切片。用Zeiss Axioskop 50落射熒光顯微鏡通過為熒光金定制的HQ-Schmalband-濾色鏡(AHF Analysentechnik，Tubingen，Germany)觀察切片。
如圖9A-D和表5所示，在軸突切開術(shù)后8周，在Cop-1接種的小鼠中熒光金標(biāo)記的運動神經(jīng)元的平均數(shù)量顯著高于注射了含PBS的CFA組或未處理的對照組(P＜0.05)。用Cop 1處理不影響未損傷的面神經(jīng)核中運動神經(jīng)元的數(shù)量。用含PBS的CFA免疫的對照沒有保護效果。
在將熒光金注射到須墊后的逆行神經(jīng)元標(biāo)記顯示，在用含Cop-1的CFA免疫的小鼠(圖9A)和注射含PBS的CFA的小鼠(圖9C)之間，在完整的面神經(jīng)核中運動神經(jīng)元的定位或數(shù)量沒有差異。相反，在用含Cop 1的CFA預(yù)處理小鼠之后(圖9B)，受損的面神經(jīng)核含有的標(biāo)記運動神經(jīng)元顯著多于用含PBS的CFA預(yù)處理的對照動物中的受損面神經(jīng)核中(圖9D)。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示。通過應(yīng)用單因素方差分析(ANOVA)和用Bonferroni-Holm校正的非配對數(shù)據(jù)的兩兩比較t檢驗來檢測不同實驗組之間的差異。認為P值小于0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
實施例8.在急性軸突切開術(shù)后給予Cop-1保留運動神經(jīng)元的活性為了確定在Cop-1處理的經(jīng)軸突切開的小鼠中發(fā)現(xiàn)的大量多于對照的運動神經(jīng)元是否與功能改善相關(guān)，對拂動(whisking)行為進行了生物統(tǒng)計學(xué)分析。在完整的對照小鼠中記錄拂動(whisking)行為的基線參數(shù)。在正常生理情況下，mystacial觸須向前豎起。其同時掃動，稱為“拂動(whisking)”或“嗅”，每秒發(fā)生5-11次。這種運動活動的主要運動是通過豎毛肌進行須毛的伸展和縮回，其受面神經(jīng)的頰分支支配。當(dāng)橫切面神經(jīng)時，觸須呈向尾部方向并保持不動。
使用這個模型，評價了下列參數(shù)(i)前突(須毛的向前運動)，通過中間矢狀面和毛體之間向嘴側(cè)開放的角度(小角度代表大的前突)而測得；(ii)拂動頻率，用每秒前突和縮回(被動的向后運動)的周期來代表；(iii)幅度-最大縮回和最大前突之間度數(shù)上的差別；(iv)前突過程中的角速度，以度數(shù)/秒表示；以及(v)前突過程中的角加速度，以度數(shù)/秒表示。
接受面神經(jīng)軸突切開術(shù)和Cop-1接種的小鼠證明其拂動活性顯著好于其它組的小鼠。這通過幅度、前突過程中的角速度以及前突過程中的角加速度更好地得到了證明(表6)。
表5用Cop-1接種對運動神經(jīng)元存活率的影響組 未受損的面神經(jīng)核受損的面神經(jīng)核A保持原樣的小鼠(n＝7)1559±1351707±90*B，C，DB僅進行FFA(n＝8) 1434±106670±178*A，DC在PBS/CFA注射后進行FFA(n＝9)1605±142766±104*A，DD用含Cop-1的CFA接種后進行FFA 1640±1861172±152*A，B，C(n＝10)圖9中顯示結(jié)果的數(shù)值。通過向保持原樣的小鼠(A組)和僅接受FFA處理的小鼠(B組)、注射含PBS的CFA后進行FFA處理的小鼠(C組)以及用含Cop 1的CFA接種后進行FFA處理(D組)的小鼠中注射1％熒光金(30μl)進行逆行標(biāo)記的面神經(jīng)核周體的數(shù)量(平均值±SD)。上標(biāo)字母表明有顯著性差異值的組(*P＜0.05)。為了進行圖象分析，使用與圖象分析軟件Optimas 6.5(Optimas，Bothell，WA)結(jié)合的CCD視頻照相機系統(tǒng)(Optronics Engineering Model DEI-470，Goleta，CA)在計算機屏幕上手工計數(shù)逆行標(biāo)記的面神經(jīng)運動神經(jīng)元(42)。應(yīng)用分餾器原理(43)，通過對在經(jīng)過手術(shù)的和未經(jīng)過手術(shù)的兩個側(cè)面上的面神經(jīng)核的50μm厚切片的每一個的第二個切面上，計數(shù)所有具有可見細胞核的逆行標(biāo)記的運動神經(jīng)元。由兩名對大鼠所接受的處理不知曉的觀察者進行計數(shù)。
表6.Cop-1接種對面神經(jīng)軸突切開術(shù)后拂動行為恢復(fù)的影響
在保持原樣的小鼠(A組)和僅接受FFA處理的小鼠(B組)、注射含PBS的CFA后接受FFA處理的小鼠(C組)以及注射含Cop-1的CFA后接受FFA處理的小鼠(D組)中，正常的和正在恢復(fù)的拂動行為的生物統(tǒng)計學(xué)。數(shù)值是平均值±SD。上標(biāo)字母表明有顯著差異值的組(*P＜0.05)。在臉的每一側(cè)C-排的兩根大毛用于生物統(tǒng)計學(xué)分析。在輕度乙醚麻醉下，用鋒利的小剪刀剪去小鼠所有的其它觸須。用可攜式數(shù)字攝像機(Panasonic NV DX-110 EG)把生動的研究小鼠的活動錄在錄象磁帶上3-5分鐘。校準(zhǔn)刻度后，在50HZ(每秒50個視野)下采集拂動行為的視頻圖象樣品，視頻照相機快門開放4毫秒。將圖象記錄在AY-DVM 60 EK袖珍暗盒上。緩慢回顧視頻片段，選取每只小鼠1.5秒的片段部分用于拂動的生物統(tǒng)計學(xué)分析。使用的選擇標(biāo)準(zhǔn)是頭的位置穩(wěn)定、拂動的頻率以及觸須的前突度數(shù)。通過2D/手動的高級的視頻系統(tǒng)PEAK Motus 2000(PEAK PerformanceTechnologies，Englewood，CO)捕捉所選取的片段?？臻g模型由3個參考點(鼻尖和兩眼的內(nèi)角)構(gòu)成。在空間模型中每個觸須用兩個點代表其底部和毛干上距底部0.5cm的點。
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權(quán)利要求
1.一種用于減少患有運動神經(jīng)元疾病(MND)的患者的疾病進展、和/或防止運動神經(jīng)變性、和/或避免受谷氨酸毒性作用的方法，其包括用含有活性試劑的疫苗免疫所述的患者，該活性試劑從由Cop1、與Cop1相關(guān)的肽、與Cop1相關(guān)的多肽和聚(谷氨酸、酪氨酸)構(gòu)成的組中選出。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的運動神經(jīng)元疾病是肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的運動神經(jīng)元疾病是原發(fā)性側(cè)索硬化(PLS)、進行性肌萎縮(PMA)或進行性延髓麻痹(PBP或延髓發(fā)病)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項的方法，其中所述的疫苗包括不含有佐劑的活性試劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項的方法，其中所述的疫苗含有在適合人臨床使用的佐劑中乳化的活性試劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述的佐劑從由氫氧化鋁、氫氧化鋁凝膠和羥基磷酸鋁構(gòu)成的組中選出。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述的佐劑是具有酸性等電點并且Al∶P之比為1∶1的無定形的羥基磷酸鋁。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任何一項的方法，其中所述的活性試劑是Cop1。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任何一項的方法，其中所述的活性試劑是與Cop1相關(guān)的肽、與Cop1相關(guān)的多肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任何一項的方法，其中所述的活性試劑是聚(谷氨酸、酪氨酸)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任何一項的方法，其中每月至少服用一次所述的疫苗。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任何一項的方法，其中每2-3個月至少服用一次所述的疫苗。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任何一項的方法，其中所述的治療包括服用另一種用于治療MND的藥物，如利魯唑。
14.一種用于減少運動神經(jīng)元疾病(MND)患者的疾病進展、和/或防止運動神經(jīng)變性、和/或避免受谷氨酸毒性作用的疫苗，包括從由Cop1、與Cop1相關(guān)的肽、與Cop1相關(guān)的多肽和聚(谷氨酸、酪氨酸)構(gòu)成的組中選出的活性試劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的疫苗，其中所述的運動神經(jīng)元疾病是肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的疫苗，其中所述的運動神經(jīng)元疾病是原發(fā)性側(cè)索硬化(PLS)、進行性肌萎縮(PMA)和進行性延髓麻痹(PBP或延髓發(fā)病)。
17.根據(jù)權(quán)利要求14-16中任何一項的方法，其中所述的疫苗包括不含有佐劑的活性試劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求14-16中任何一項的方法，其中所述的疫苗含有在適合人臨床使用的佐劑中乳化的活性試劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的疫苗，其中所述的佐劑從由氫氧化鋁、氫氧化鋁凝膠和羥基磷酸鋁構(gòu)成的組中選出。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的疫苗，其中所述的佐劑是具有酸性等電點并且Al∶P之比為1∶1的無定性羥基磷酸鋁。
21.根據(jù)權(quán)利要求14-20中任何一項的疫苗，其中所述的活性試劑是Cop1。
22.根據(jù)權(quán)利要求14-20中任何一項的疫苗，其中所述的活性試劑是Cop1相關(guān)肽或Cop1相關(guān)多肽。
23.根據(jù)權(quán)利要求14-20中任何一項的疫苗，其中所述的活性試劑是聚(谷氨酸、酪氨酸)。
24.根據(jù)權(quán)利要求14-23中任何一項的疫苗，其中每月至少服用一次所述的疫苗。
25.根據(jù)權(quán)利要求14-23中任何一項的疫苗，其中每2-3個月至少服用一次所述的疫苗。
26.根據(jù)權(quán)利要求14-25中任何一項的疫苗，用于與另一種用于治療MND的藥物，例如利魯唑一起服用。
27.一種活性試劑在制備用于減少運動神經(jīng)元疾病(MND)患者的疾病進展、和/或防止運動神經(jīng)變性和/或避免受谷氨酸的毒性作用的疫苗中的用途，其中所述的活性試劑從由Cop1、與Cop1相關(guān)的肽、與Cop1相關(guān)的多肽和聚(谷氨酸、酪氨酸)構(gòu)成的組中選出。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的用途，其中所述的運動神經(jīng)元疾病是肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)。
29.根據(jù)權(quán)利要求27的用途，其中所述的運動神經(jīng)元疾病是原發(fā)性側(cè)索硬化(PLS)、進行性肌萎縮(PMA)或進行性延髓麻痹(PBP或延髓發(fā)病)。
30.根據(jù)權(quán)利要求27-29中任何一項的用途，其中所述的疫苗包括不含有佐劑的活性試劑。
31.根據(jù)權(quán)利要求27-29中任何一項的用途，其中所述的疫苗含有在適合人臨床使用的佐劑中乳化的活性試劑。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的用途，其中所述的佐劑從由氫氧化鋁、氫氧化鋁凝膠和羥基磷酸鋁構(gòu)成的組中選出。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的用途，其中所述的佐劑是具有酸性等電點并且Al∶P之比為1∶1的無定性羥基磷酸鋁。
34.根據(jù)權(quán)利要求27-33中任何一項的用途，其中所述的活性試劑是Cop1。
35.根據(jù)權(quán)利要求27-33中任何一項的用途，其中所述的活性試劑是Cop1相關(guān)肽或Cop1相關(guān)多肽。
36.根據(jù)權(quán)利要求27-33中任何一項的用途，其中所述的活性試劑是聚(谷氨酸、酪氨酸)。
37.根據(jù)權(quán)利要求27-36中任何一項的用途，其中每月至少服用一次所述的疫苗。
38.根據(jù)權(quán)利要求27-36中任何一項的疫苗，其中每2-3個月至少服用一次所述的疫苗。
39.根據(jù)權(quán)利要求27-38中任何一項的疫苗，其中所述的疫苗與另一種用于治療MND的藥物，例如利魯唑一起給藥。
全文摘要
一種用于減少運動神經(jīng)元疾病(MND)，特別是肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)患者的疾病進展、和/或防止運動神經(jīng)變性、和/或避免受谷氨酸的毒性作用的疫苗，包括一種活性試劑，其中該活性試劑從由Cop1、與Cop－1相關(guān)的肽、與Cop－1相關(guān)的多肽和聚(谷氨酸、酪氨酸)構(gòu)成的組中選出。所述的活性試劑優(yōu)選為Cop1或聚(谷氨酸、酪氨酸)，并且可以與或不與佐劑一起使用。
文檔編號A61P25/28GK1617736SQ02827701
公開日2005年5月18日 申請日期2002年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月6日
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