專利名稱：應用bdnf/nt-3/ngf分子族成員治療運動神經(jīng)元疾病的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及運動神經(jīng)元疾病的治療方法，包括給需要這種治療的患者服用有效劑量的神經(jīng)營養(yǎng)因子，這種神經(jīng)營養(yǎng)因子是BDNF/NT-3/NGF分子族成員，并且支持運動神經(jīng)元的存活、生長、和/或分化，尤選BDNF或NT-3。本發(fā)明也提供了運動神經(jīng)元的培養(yǎng)方法，運動神經(jīng)元疾病的診斷方法，用于鑒別對運動神經(jīng)元有益或有害的因素的鑒別系統(tǒng)和運動神經(jīng)元疾病的動物模型。
運動神經(jīng)元和肌肉細胞之間的相互作用決定肌肉的緊張度，并引起肌肉有效地收縮，因此是所有自主性和非自主性運動的基礎。
運動神經(jīng)元傳統(tǒng)分類為上位運動神經(jīng)元或下位運動神經(jīng)元。上位運動神經(jīng)元位于大腦中央前回，并傳出長突往下到下位運動神經(jīng)元上的突觸，下位運動神經(jīng)元位于脊髓灰質(zhì)體的腹側(cè)灰質(zhì)區(qū)。脊髓的前側(cè)灰質(zhì)區(qū)，下位運動神經(jīng)元的軸突連合形成腹側(cè)根。這些軸突最后終止于一條或多條肌肉纖維。通過下位運動神經(jīng)元的纖維末端的樹枝狀分枝，每條下位運動神經(jīng)元與少則幾條多則100-200或更多肌肉纖維相連接形成一個“運動單元”。(Adams and Victor，1985，in“Principles of Neurology”Mc Graw-Hill，Inc，New York，P.37.)運動神經(jīng)元疾病導致不同程度的肌肉無力，引起功能喪失，輕則難于完成繁重任務，重則到完全癱瘓。下位運動神經(jīng)元疾病一般與弛緩癱瘓和肌肉張力下降相關。受單個神經(jīng)或脊髓中與其鄰近的該運動神經(jīng)元支配的相鄰肌肉會受到影響，引起程度很深的萎縮，整個肌肉組織的70-80%會受到影響。病態(tài)的運動神經(jīng)元變得過敏，它控制的肌肉纖維與其它單元離散間隙放電，產(chǎn)生一種可見的顫搐或自發(fā)性收縮。相反，當上位運動神經(jīng)元受損，一般結(jié)果是伴隨肌肉張力增加和腱反射亢進的痙攣癱瘓。通常是人體的整個肢體或半側(cè)軀體受到影響，而不是單個肌群受影響。萎縮是輕微的，典型的起因是廢用性痿縮，不出現(xiàn)自發(fā)性收縮。對代表上位或下位運動神經(jīng)受損的臨床癥狀進行鑒別有利于進行診斷和治療。
相當多的各種神經(jīng)機能障礙影響運動神經(jīng)元。例如，上位運動神經(jīng)元主要受腦血管意外，腫瘤、感染和創(chuàng)傷影響。然后，下位運動神經(jīng)元或前灰質(zhì)角細胞才受這些因素影響，但除此之外它還易患許多機能失調(diào)，其中前灰質(zhì)角細胞受損是最初癥狀，包括肌萎縮性外側(cè)硬化，嬰兒或幼年脊柱肌肉萎縮，脊髓灰質(zhì)炎和脊髓灰質(zhì)炎后綜合癥，遺傳性運動和感覺神經(jīng)病變，和中毒性運動神經(jīng)病變(如，長春花新堿)。
在這些主要的前側(cè)灰質(zhì)角細胞(AHC)機能失調(diào)中，肌萎縮性外側(cè)硬化(ALS或Lou Gehrig′s病)是最常見的(見Williams和Win-debank，1991，Mayoclin.Proc.6654-82 for yeview)。
ALS多數(shù)患者最初的不適是無力，上肢更為常見(Gubbay et al.，1985，J.Neurol.232295-300;Vejjajiva et al.，1967，J.Heurol.Sci.4299-314;Li et al.，1988，J.Neurol.Neuro-surg.Psychiatry 51778-784)。一般無力、萎縮、和其它神經(jīng)病證狀是不對稱性的，并且經(jīng)常是局部性的(Munsat et al.，1988，Neurol.38409-413)。肌肉痛性痙攣，感覺異常(刺麻感)和疼痛是常見的不適癥狀(Williams and Windebank，supra)。分布廣的自發(fā)性收縮經(jīng)常出現(xiàn)(id.)。這種疾病的發(fā)展快慢每個患者都不相同(Gubbay et al.，1985，J.Neurol，232295-300)，但實際上這種病所有情況的最終結(jié)果是完全功能喪失，廣泛性癱瘓(包括呼吸癱瘓)和死亡。
解剖學上，最顯著的改變是脊髓和相連的前側(cè)根萎縮和外側(cè)體的硬化(因此叫肌萎縮性外側(cè)硬化;Williams and Windebank，supra)。在ALS病中上位運動神經(jīng)元也受到牽涉和變性。盡管由于受上位運動神經(jīng)元的影響而經(jīng)常出現(xiàn)運動和前運動皮質(zhì)萎縮，但在顯微鏡下，大腦卻是正常的。中樞前皮質(zhì)中的貝茨氏細胞和其他錐體細胞廣泛性的受損，伴隨發(fā)生反應性神經(jīng)膠質(zhì)增生(Hammar et al.，1979，Exp，Neurol 63336-346)。
流行病學的研究表明環(huán)境因素和遺傳因素在疾病發(fā)展過程中起重要作用(Williams and Windebank，supra)。有人曾認為ALS是一種中年疾病，近來更傾向于認為它是一種老年疾病(id.)。
目前的療法包括對癥治療，減輕肌肉痛性痙攣、疼痛、易疲性。假體裝置用于補償肌肉無力，盡管如此，改變疾病進程的藥物療法還是極不成功的。促甲狀腺激素釋放激素的公認治療優(yōu)點也已遇到矛盾性的結(jié)果(Brooks，1989，Ann，N.Y.Acad.Sci.553431-461)。服用神經(jīng)節(jié)甙脂已經(jīng)無效(Lacomblez.et al.，1989，Neurol.391635-1637)。血漿取出法無論單用還是與免疫抑制療法結(jié)合應用都已沒有治療上的優(yōu)點(Olarte et al.，1980，Ann.Neurol，8644-645;kelemen et al.，1983，Arch，Neurol.40752-753。已報道抗病毒劑胍具有潛在的短期效果，但這種效果不能重現(xiàn)(Munsat et al.，1981，Neurol.311054-1055)在一個簡短的研究中報道服用支鏈氨基酸激活谷氨酸脫氫酶可降低患者衰退的速度(Platitakis et al.，1988，Lancet 11015-1018)。近來許多治療試驗，有些在進行之中，包括全身淋巴系統(tǒng)擴散，使用氨基酸N-乙酰半胖氨酸，N-乙酰蛋氨酸，L-蘇氨酸和長期鞘內(nèi)輸入促甲狀腺激素釋放激素(Williams and Windeband，supra)。
與ALS監(jiān)床和病理上相似的動物模型包括Mnd小鼠，它是一種常染色體支配的突變體，其表現(xiàn)是后加上的上位和下位運動神經(jīng)元累進性變質(zhì)(Messer and Flaherty，1986，J，Neurogen.3345-355);Wobble小鼠，由于肌肉失去神經(jīng)支配而表現(xiàn)出早年前肢軟弱和萎縮，以及在Brittany獚中表現(xiàn)出犬遺傳性脊柱肌肉萎縮(Sack et al.，1984，Ann Neurol.15369-373;Sillevis et al.，1989，J.Neurol，Sci，91231-258;Bird et al.，1971，Acta Neuropathol 1939-50)。
在近來1991年4月4日公開的WO91/04316PCT申請中(本文引用了該參考文獻)已經(jīng)表明睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)能夠促進運動神經(jīng)元在體內(nèi)和體外存活，含CNTF明膠海綿植入物易使在分離出的新生小鼠面神經(jīng)的運動神經(jīng)元存活。CNTF是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，它顯示的生物活性與包括BDNF，NT-3，和NGF在內(nèi)的運動神經(jīng)營養(yǎng)族因子所顯示的生物活性有很大差別。
本發(fā)明涉及肌萎縮性外側(cè)硬化(Lou Gehrig′s)等運動神經(jīng)元疾病的治療方法，包括給需要這種治療的患者服用有效劑量的神經(jīng)營養(yǎng)因子，這種神經(jīng)營養(yǎng)因子是BDNF/NT-3/NGF分子族成員，并且支持運動神經(jīng)元的存活、生長和/或分化。據(jù)不完全發(fā)現(xiàn)BDNF和NT-3兩者都能增加培養(yǎng)的運動神經(jīng)元的膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶的活性，并且由坐骨神經(jīng)向脊髓逆向轉(zhuǎn)運。在本發(fā)明優(yōu)選的特定實施例中，BDNF或NT-3和第二種因子如CNTF一起用于運動神經(jīng)元疾病治療。
本發(fā)明也提供了促進體外運動神經(jīng)元的存活，生長和/或分化的方法，這種方法是給運動神經(jīng)元培養(yǎng)物加入有效濃度的BDNF/NT-3/NGF基因族成員。
在另外的實施例中，本經(jīng)明提供了一種鑒別體系，這種體系可以用來鑒別有BDNF或NT-3樣活性的因子，并且可應用于運動神經(jīng)元疾病的治療。
本發(fā)明還提供了運動神經(jīng)元疾病的動物模型，制備這些模型方法是給動物免疫接種BDNF/NT-3/NGF族成員或其衍生物，還可給動物服用抗BDNF/NT-3/NGF族成員的抗體或BDNF/NT-3/NGF的反義寡聚核苷酸。
BDNF 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子bFGF 基本纖維生長因子CAT 膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶NGF 神經(jīng)生長因子NT-3 神經(jīng)營養(yǎng)素-3

圖1.富含動物神經(jīng)元的培養(yǎng)物在無血清，化學定義的培養(yǎng)基中生長兩天，測定膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶活性(cpm/hr/well+/-SEM)。用磷酸鹽緩沖液(PBS)/0.5mg/ml BSA作稀釋劑平皿接種時以10pg/ml到100ng/ml濃度范圍加入BDNF。對照組只加入PBS/0.5mg/mlBSA。
圖2.富含運動神經(jīng)元的培養(yǎng)物在無血清、化學定義的培養(yǎng)基中生長兩天，測定膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶活性(cpm/hr/well+/-SEM)。在平皿接種時加入用PBS/0.5mg/ml BSA稀釋的GNTF，BDNF，bFGF，NGF和CNTF/BDNF濃度均為50mg/ml。對照組培養(yǎng)物加入PBS/0.5mg/ml BSA。
圖3.富含運動神經(jīng)元的培養(yǎng)物在無血清，化學定義的培養(yǎng)基中生長兩天，測定膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶活性(cpm/hr/well+/-SEM)。以10pg/ml到100ng/ml的濃度范圍在平皿接種時加入NT-3。
圖4.按第8部分描述的方法純化的重組體BDNF在背側(cè)根神經(jīng)節(jié)移出物生物測定中的劑量-反應曲線。
圖5.出生時單側(cè)面神經(jīng)損害后7天齡小鼠腦干面運動神經(jīng)元形態(tài)學。a)BDNF治療后的損害一側(cè);b)NT-3治療后的損害一側(cè);c)NGF治療后的損害一側(cè);d)作為對照BSA治療后的損害一側(cè);e)a)中相同動物的未損害側(cè)作為對照;f)損害且用CNTF治療后作為對照。放大×400。
為了使公開更清楚，且不作為限定，本發(fā)明的詳細描述分為以下幾部分(ⅰ)根據(jù)本發(fā)明所使用的BDNF/NT-3/NGF分子族成員;
(ⅱ)治療應用;
(ⅲ)體內(nèi)應用;
(ⅳ)診斷應用;
(ⅴ)檢測系統(tǒng);和(ⅵ)動物模型。
5.1 本發(fā)明所使用的BDNF/NT-3/NGF分子族成員已發(fā)現(xiàn)BDNF或NT-3?？烧T發(fā)運動神經(jīng)元培養(yǎng)物中膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性增加，這表明神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中特定成分可用來促進運動神經(jīng)元的存活，生長和/或分化(見后面的第6、7部分中例子)。觀察到的BDNF和NT-3逆向轉(zhuǎn)運到運動神經(jīng)元的位置腹側(cè)脊髓，支持神經(jīng)營養(yǎng)因子對運動神經(jīng)元直接作用的觀點(見下面的第9部分舉例)。
本發(fā)明提供了促進運動神經(jīng)元的存活、生長和/或分化的方法，這種方法是使用BDNF/NT-3/NGF分子族成員。
本發(fā)明優(yōu)選實施例中，使用BDNF/NT-3/NGF族成分，相對于未處理的運動神經(jīng)元而言，可導致用藥的運動神經(jīng)元中膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶活性增加。
在本發(fā)明的最佳實施例中，BDNF或NT-3用于促進運動神經(jīng)元的存活和/或分化，其中BDNF或NT-3已在1991年3月21日公開的WO91/03568PCT申請中和1991年3月21日公開的WO91/03569PCT申請中描述，本發(fā)明引用這兩篇文獻。如在下面第6和7部分舉例中所示，BDNF或NT-3可用來增加培養(yǎng)基中運動神經(jīng)元膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶活性。另外，BDNF/NT-3/NGF分子族的其他成員可按PCT申請中所提出的方法分辨。
只要確定能夠支持運動神經(jīng)元的生長和/或分化本文所參考引用的WO91/03568和WO91/03569參考文獻可以用于本發(fā)明。而且，合成的分子，盡管它不同于任何已知BDNF/NT-3/NGF分子族成員的基本結(jié)構(gòu)，它能支持運動神經(jīng)元的生長和/或分化，即可用于本發(fā)明。因為BDNF和NT-3比NGF更能增加運動神經(jīng)元中膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶活性，這種合成分子最好更類似于BDNF和NT-3而不是NGF。
本發(fā)明中所用的BDNF/NT-3/NGF族成分，可用本領域中任何已知方法制得。它們可從天然組織中純提，化學合成，或重組DNA表達體系如在原核和真核生物表達體系中生成。例如，象COS細胞體系。生成這些分子的方法包括PCT申請WO91/03568和WO91/03569中所描述的方法。
在本發(fā)明的特定優(yōu)選實施例中，BDNF或NT-3可從表達BDNF的真核細胞(如BDNF轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢細胞(CHO))的條件培養(yǎng)基中分離。采用兩個步驟陽離子交換和凝膠過濾色譜法。以BDNF為例，用表達BDNF的細胞接種從Opticell生物反應器中(Charles River)收集到的條件培養(yǎng)基，并用蒸餾水以1.25∶1比率稀釋，然后連續(xù)裝在S-Sepharose Fast Flow(pharmacia)柱上。例如，稀釋總?cè)萘繛?0.6L經(jīng)大約5天時間過15ml(1.6cm內(nèi)徑)柱子。柱子用50ml 20mM MES緩沖液pH5.8洗滌，接著用含250mMNaCl的50ml相同緩沖液，再用不含NaCl的相同MES緩沖液洗滌直到在280nm處吸收值達到基線水平。然后用25ml 20mM N-二(羥乙基)甘氨酸緩沖液pH8.5洗滌，再用含100mM NaCl的15ml相同緩沖液洗滌。柱子依次用150ml，100mM到750mM NaCl梯度的20mM N-二(羥乙基)甘氨酸緩沖液pH8.5洗脫。流速大約為2.5ml/分鐘，洗脫液吸收值在280nm處單位滿刻度0.20吸收率的靈敏度下進行測定。含重組體BDNF的餾分可用DRG移出物生物測定法來鑒別。具有最高特定活性的餾分與NaCl濃度在500至750nm相對應。合并這些餾分，并用3KDa Omega(Ω)型膜或一個可使BDNF低程度非特異性結(jié)合的等同膜進行高壓超濾濃縮。濃縮樣品然后上到例如一種120ml(1.6cm內(nèi)徑)Sephacryl S-100HR凝膠過濾柱上(pharmacia)。填充柱子并用含400mM NaCl的20mM HEPES緩沖液pH7.6平衡。以0.25ml/分鐘速度洗脫柱子。收集餾分并用DRG移出物生物鑒定法測定BDNF的活性。在80和90ml之間的洗脫餾分含有生物活性的大腦源性重組生長因子。合并這些餾分并用還原性SDS聚丙烯酰胺電泳分析，進行N-末端序列測定和氨基酸的定量分析。在適當處調(diào)節(jié)容量。
BDNF/NT-3/NGF分子族包括由具有與BDNF，NT-3和NGF基本同源的區(qū)域的基因編碼的分子。本發(fā)明所用的BDNF/NT-3/NGF族成員可通過測試促進運動神經(jīng)元生存或分化的生物活性來選擇。舉例說明但不作為限定，表現(xiàn)出下列任何一作用的BDNF/NT-3/NGF族成員均可用于本發(fā)明(ⅰ)增加培養(yǎng)基中運動神經(jīng)元的存活時間;
(ⅱ)增加在培養(yǎng)基或體內(nèi)運動神經(jīng)元的軸突生長;
(ⅲ)增加在培養(yǎng)基或體內(nèi)運動神經(jīng)元相關分子的生成如，膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶或乙酰膽堿酯酶(見下面第6和7部分測定技術(shù)的舉例);
(ⅳ)減少體內(nèi)運動神經(jīng)元機能失調(diào)癥狀。
以上這些作用可用本領域中任何已知方法測定。優(yōu)選的非限定性實施方案，運動神經(jīng)元存活時間的增加可用Arakawa等人提到的方法測定(1990，J，Neurosci，103507-3515);運動神經(jīng)元軸突生長增加可用Pestronk等人(1980，Exp.Neurol，7065-82)或Brown等人(1981，Ann，Rev.Neurosci，419-42)提到的方法測定;運動神經(jīng)元相關分子的生成增加可用生物測定法，酶測定法，抗體結(jié)合，Nor-thern印跡分析測定法，等來測定，選用什么方法取決于所測定的分子;運動神經(jīng)元機能失調(diào)可通過分析運動神經(jīng)元功能紊亂的內(nèi)科表現(xiàn)例如無力，運動神經(jīng)元傳導速率，或功能喪失來確定。
在本發(fā)明的另一些實施例中，本發(fā)明的BDNF/NT-3/NGF族成員可與第二種因子聯(lián)合使用來支持運動神經(jīng)元存活和/或分化。第二種因子最好也能有效地促進運動神經(jīng)元的存活和/或分化。例如，在本發(fā)明中的較好實施例中，BDNF/NT-3/NGF族成員可與CNTF結(jié)合使用以促進運動神經(jīng)元的存活和/或分化。正如在下面第6部分討論的，BDNF與CNTF結(jié)合使用可觀察到對運動神經(jīng)元CAT活性具有至少一種疊加作用。
5.2治療應用本發(fā)明提供了治療運動神經(jīng)元疾病方法，包括給需要這種治療的患者服用有效量的神經(jīng)營養(yǎng)因子，這種神經(jīng)營養(yǎng)因子是BDNF/NT-3/NGF分子族成員并能支持運動神經(jīng)元的存活，生長或分化。
如本文所用的，所定義的運動神經(jīng)元紊亂指任何能影響運動神經(jīng)元正常功能的狀況。這種失調(diào)可能或不能特異性地或甚至選擇性地影響運動神經(jīng)元。例如，本發(fā)明可治療的運動神經(jīng)元紊亂包括但不局限于下面這些功能紊亂。如梗塞、感染、中毒、創(chuàng)傷、外科損傷、退化性疾病或惡性病，這些可影響到運動神經(jīng)元及神經(jīng)系統(tǒng)的其他成分。本發(fā)明方法也直接用于選擇性影響神經(jīng)元的疾病，如肌萎縮性外側(cè)硬化，并且包括但不局限于此，進行性脊柱肌肉萎縮，進行性延髓麻痹，初級外側(cè)僵化，嬰兒和幼年肌肉萎縮，童年進行性延髓麻痹(Fazia-Londe綜合癥)，脊髓灰質(zhì)炎和脊髓灰質(zhì)炎后綜合征和遺傳性運動感覺神經(jīng)病變(進行性神經(jīng)性腓骨肌萎縮)。
可用于本發(fā)明的BDNF/NT-3/NGF族成員在上文第5.1部分中已作描述。有效劑量可由本領域熟練技術(shù)人員已知的方法測得?？梢詫τ行┝亢投拘詣┝?如果有毒性的話)進行測定，任何一已知BDNF/NT-3/NGF族成分都沒有測定出毒付作用。最好在活體內(nèi)測得，以分辨出最佳劑量范圍。(參見下文第5.3部分)在本發(fā)明各種特定的實施例中BDNF/NT-3/NGF族的神經(jīng)營養(yǎng)因子可與至少一種有效劑量的其它藥劑一起使用，所說的這種其它藥劑本身也能促進運動神經(jīng)元的存活、生長和/或分化。例如BDNF/NT-3/NGF族成員可與CNTF一起給藥。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中BDNF和CNTF可一起給藥用于運動神經(jīng)元的治療。
在提及BDNF/NT-3/NGF家族成員的同時，本發(fā)明也包括使用BDNF/NT-3/NGF族神經(jīng)營養(yǎng)分子的片斷，衍生物、促效藥或拮抗藥。
本發(fā)明神經(jīng)營養(yǎng)因子可用任何藥學上可接受的載體形式給藥。給藥途徑可以是本領域中任何已知的給藥方式，包括，但不局限于，靜脈給藥，鞘內(nèi)給藥，皮下給藥，向相關組織內(nèi)注射，動脈內(nèi)，鼻內(nèi)，口服給藥或使用一種植入物。本發(fā)明提供藥物組合物，它包含BDNF/NT-3/NGF族的成員如BDNF或NT-3，并含有CNTF，和某種藥學上可接受的載體。
給藥后可導致本發(fā)明的神經(jīng)營養(yǎng)因子分散于整個人體或局部區(qū)域中。如在涉及到神經(jīng)系統(tǒng)的相離區(qū)域情況下，適合采用靜脈內(nèi)或鞘內(nèi)給以神經(jīng)營養(yǎng)因子。另外的情況下，但不限制本發(fā)明，當涉及到神經(jīng)系統(tǒng)的局部區(qū)域時，如因創(chuàng)傷或外科手術(shù)引起的運動神經(jīng)元疾病，適合采用局部給藥。在這種情況下，可以將一個含有神經(jīng)營養(yǎng)因子的植入物理入損傷區(qū)或其附近。合適的植入物包括但不局限于，凝膠、海綿、蠟、或微小顆粒型植入物。
5.3 體外應用本發(fā)明提供了一種提高運動神經(jīng)元存活、生長和/或分化能力的方法，包括露置運動神經(jīng)元在有效濃度的一種神經(jīng)營養(yǎng)性因子中，該因子是BDNF/NT-3/NGF分子家族的一個成員，這種方法可用于體內(nèi)(見上)或體外，優(yōu)選方案是，BDNF/NT-3/NGF家族成員是BDNF或NT-3。
在體外試驗的情況下，神經(jīng)營養(yǎng)性因子的有效量可根據(jù)具體情況按需要而定，因從不同的組織或不同種類得到的運動神經(jīng)元對神經(jīng)營養(yǎng)性因子顯示不同的敏感性。對任何特定的培養(yǎng)，最好建立一條神經(jīng)營養(yǎng)性因子濃度和運動神經(jīng)元反應性相關的劑量反應曲線，為估價運動神經(jīng)元存活、生長和/或分化，使用例如活體染色估價存活。相對照顯微鏡和/或神經(jīng)纖維染色測定軸突生長或測定運動神經(jīng)元相關化合物如膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)活性的技術(shù)，來比較露置在BDNF/NT-3/NGF家族成員神經(jīng)營養(yǎng)性因子中的運動神經(jīng)元與未露置在該因子中的神經(jīng)元是很有用的。測定CAT活性可用下述方法，例如，通過收集和溶解處理過或未處理過的運動神經(jīng)元在20mM Tris-鹽酸(pH8.6)溶液中，該溶液含有約0.1% Triton X-100，取出幾微升的等分試樣，用含有0.2ml[1-rC]乙酰輔酶A，300mM NaCl，8mM溴化膽堿、20mMEDTA和0.1mM新斯的明的50mM NaH2(pH7.4)緩沖液作為底物，運用micro-Fonnum方法測定CAT活性，該方法描述在Fonnum，1975，J.Neurochem.24407-409中，其完整的方法在此一并作為參考(也可參見下面的7.1.5節(jié))。
在一個非限制本發(fā)明的具體實施例中，運動神經(jīng)元可通過以下方法在體外制備和培養(yǎng)。從球狀物，感覺神經(jīng)節(jié)和粘性的腦膜無菌獲得和分離至少一部分脊髓，特別是從胚胎生物例如小鼠獲得的脊髓。然后分離腹側(cè)的脊髓，因為運動神經(jīng)元座落在脊髓的腹側(cè)(前側(cè))角上。將腹側(cè)脊髓分成小塊和在37℃下接種在含約0.1%胰蛋白酶和0.01%I型脫氧核糖核酸酶的無鈣和鎂的磷酸鹽緩沖液鹽水(PBS)中20分鐘，然后移去胰蛋白酶溶液，漂洗細胞并將其置于新鮮的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基如45%的Eagle′s最小基本培養(yǎng)基(MEM)，45% Ham′s營養(yǎng)混合培養(yǎng)基F12，5%加熱失活的胎牛血清，5%加熱失活的馬血清，谷氨酰胺(2mM)，青霉素G(0.5U/ml)和鏈霉素(0.5μg/ml)。組織可通過巴斯德玻璃管輕輕搗碎機械地分解，收集上清液并用尼龍濾器(始Nitex，Tetko;40m)過濾，過濾細胞懸浮物可使用Schnaar and Schaffer(1981，J，Neurosc.L204-217)的修改方法進行分級。新有步驟在4℃進行合適。將甲泛影酰胺溶解在F12MEM培養(yǎng)基(1∶1)中，建立下列不連續(xù)梯度溶液包括18%甲泛影酰胺基液(如0.5ml)，3ml 17%甲泛影酰胺;3ml 12%甲泛影酰胺和3ml 8%甲泛影酰胺過濾細胞懸浮物(即2.5ml)，通過逐級梯度溶液分層，試管在2500g下用離心機(如Sorvall HB4)離心15分鐘，離心液將使細胞分為三層第一部分(在0-8%界面)，第二部分(在8-12%界面)和第三部分(在12-17%界面)。第一部分富集運動神經(jīng)元，可取出小量(如約1ml)以無血清的定義培養(yǎng)基沖洗兩次，所說培養(yǎng)基可以是50% F12和50% MEM，加上谷酰胺(2mM)，胰島素(5μg/ml)，轉(zhuǎn)鐵蛋白(100μg/ml)，黃體酮(20nM)，腐胺(100μM)，亞硒酸鈉(30nM，參見Bottenstein and Sato，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76514-517)?？煽康募毎麛?shù)量可通過在錐蟲蘭存在下以血球計計數(shù)獲得。富集運動神經(jīng)元的懸浮物可以100，000細胞/cm2的密度接種在予先覆蓋有聚L-鳥氨酸(如10μg/ml)和昆布氨酸(Laminin如10μg/ml)的組織培養(yǎng)孔板(優(yōu)選的是6mm)上。然后加入神經(jīng)營養(yǎng)性因子，如在具體實施例中，BDNF的加入可達到最終濃度約0.01-100ng/ml，較好是約50nm/ml，或NT-3的加入可達到最終濃度約.01-100ng/ml，較好是約50ng/ml，或上述濃度的BDNF與濃度至少1ng/ml，較好是10ng/ml的CNTF合用。然后，運動神經(jīng)元培養(yǎng)物在95%空氣/5%CO2氣和相對濕度為100%37℃條件下保存在無血清的定義培養(yǎng)基中。
5.4 診斷應用本發(fā)明也提供了一種診斷病人運動神經(jīng)元紊亂的方法，包括比較取自病人和取自正常人的樣品中，是BDNF/NT-3/NGF家族成員的神經(jīng)營養(yǎng)性因子水平，以測定出在病人中與運動神經(jīng)元紊亂正性相關的神經(jīng)營養(yǎng)性因子的異常水平?？捎杀痉椒ㄔ\斷的運動神經(jīng)元紊亂包括但不限于如上5.2節(jié)列出的那些。
神經(jīng)營養(yǎng)性因子水平可由本領域的任何已知方法進行測定，這些方法包括但不限于酶聯(lián)免疫吸附“夾層”試驗或其它任何應用抗神經(jīng)營養(yǎng)性因子抗體的試驗，包括Western印跡分析和原位雜交，生物活性研究，Northern印跡分析等。
病人樣品可取自任何正常組織或體液，包括但不限于神經(jīng)和腦組織或腦脊髓液或血。
神經(jīng)營養(yǎng)性因子水平異?？山忉尀椴∪撕驼Ｈ松窠?jīng)營養(yǎng)性因子水平在統(tǒng)計學上的顯著差異。異?？梢允潜日Ｋ皆黾踊驕p少，病人可以是全身性的也可以僅是局部性的。使用神經(jīng)營養(yǎng)性因子會特別有益于表現(xiàn)出這種因子減少的病人(參見上5.2節(jié))。表現(xiàn)出神經(jīng)營養(yǎng)性因子增加的病人可表達出非正常因子或可能患因子受體缺乏病。具有少量，或非正常因子受體的病人可通過檢測取自病人的細胞以檢查正常神經(jīng)營養(yǎng)性因子受體來辨別，例如，通過比較這種細胞結(jié)合可測的標記的神經(jīng)營養(yǎng)性因子的能力和正常細胞的結(jié)合能力。具有少數(shù)受體或非正常受體的病人可能會也可能不會得益于補充神經(jīng)營養(yǎng)性因子治療，特別是得益于用神經(jīng)營養(yǎng)性因子拮抗劑類似物治療。
此外，BDNF或NT-3顯示出被運動神經(jīng)元逆行轉(zhuǎn)移的發(fā)現(xiàn)提供了一種診斷BDNF或NT-3相關性運動神經(jīng)元紊亂的方法。包括用某種方式將可測標記的BDNF或NT-3注入，使得標記的BDNF進入一種運動神經(jīng)，并測定標記的BDNF或NT-3是否逆向轉(zhuǎn)移，其中逆向轉(zhuǎn)移的失敗與運動神經(jīng)元機能失調(diào)相關。這種方法可用于但不限于診斷肌萎縮性測索硬化，進行性脊柱肌肉萎縮，嬰兒肌肉萎縮，脊髓灰質(zhì)炎，后灰質(zhì)綜合癥，進行性神經(jīng)性腓骨肌萎縮和神經(jīng)創(chuàng)傷或損傷。
5.5檢測系統(tǒng)本發(fā)明提供了辨別那些可用于治療運動神經(jīng)元紊亂的化合物的檢測系統(tǒng)，此試驗系統(tǒng)評價某種被測試劑阻礙BDNF或NT-3與運動神經(jīng)元結(jié)合的能力。相應地，本發(fā)明提供了一種檢測某試劑提高運動神經(jīng)元存活、生長或分化能力的方法，包括在標記的BDNF或NT-3能與運動神經(jīng)元結(jié)合的條件下，露置的培養(yǎng)物中運動神經(jīng)元于可測標記的BDNF或NT-3(或任何合適的BDNF/NT-3/NGF家族成員)。同時露置運動神經(jīng)元在測試試劑中，其中測試試劑對標記BDNF或NT-3結(jié)合的抑制表明試驗試劑可應用于治療運動神經(jīng)元紊亂。在這種試驗系統(tǒng)中為陽性的那些試驗試劑需要在體外或體內(nèi)進一步估價其提高培養(yǎng)中的運動神經(jīng)元存活生長或分化的能力。為陰性的試劑有些情況下可以是BDNF或NT-3樣活性的拮抗劑。
BDNF或NT-3可以用任何方法進行可測性標記，包括結(jié)合上放射性標記的氨基酸，和連接一個可測的“末端”到神經(jīng)營養(yǎng)性因子分子上，這樣一個末端可以是熒光性的，可以有酶活性，可以是一個與神經(jīng)營養(yǎng)性因子結(jié)合的抗體，可以是抗原性的，并能夠結(jié)合抗體(例如，部分myc抗原能與抗-myc抗體結(jié)合)。
按照本發(fā)明，可應用的試驗試劑包括，但不限于，是BDNF/NT-3/NGF家庭成員的神經(jīng)營養(yǎng)性因子或其片斷的衍生物，其它肽類化合物、肽衍生物，和非肽類化合物。
在具體的，但非限定本發(fā)明的實施例中給出了一個例子，在允許BDNF結(jié)合的條件下，將放射性標記的BDNF與非標記的試驗試劑和運動神經(jīng)元在培養(yǎng)基中培養(yǎng)。作為比較，將相同的運動神經(jīng)元培養(yǎng)物露置于放射性標記的BDNF中(無試驗試劑)，如果試驗試劑能結(jié)合BDNF受體，它便可競爭性抑制標記BDNF的結(jié)合。當后來清洗細胞以除去未結(jié)合的BDNF時，包含試驗試劑的培養(yǎng)物可望較對照培養(yǎng)物具有較小的放射性。
5.6動物模型系統(tǒng)本發(fā)明進一步提供了運動神經(jīng)元系亂的動物模型系統(tǒng)，包括那些系統(tǒng)或全部缺失BDNF或NT-3的動物。BDNF或NT-3的全部缺失可以通過產(chǎn)生一種能表達抗BDNF或NT-3抗體的動物而完成，這類動物可以是用取自其它動物種類的BDNF或NT-3或那些被化學修飾成有較強免疫性的BDNF或NT-3免疫動物產(chǎn)生的。局部缺失可通過在局部引入抗BDNF或抗NT-3抗體產(chǎn)生，例如，通過在中央前回附近植入雜交瘤產(chǎn)生。更進一步，可制備轉(zhuǎn)基因動物，這種動物的內(nèi)源性BDNF或NT-3基因通過同源重組而且被“缺失”。
6實施例BDNF增加腹側(cè)脊髓運動神經(jīng)元培養(yǎng)物中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性6.1材料和方法6.1.1實驗動物所有試驗采用sprague-Dawleg小鼠(HSD或Zivic-Miller)胚胎(E14)，孕鼠用CO2窒息處死，然后迅速取出胚胎，置入冰凍的培養(yǎng)基中以備解剖用。
6.1.2.組織培養(yǎng)技術(shù)在無菌條件下，從孕14天的鼠胚胎中移出脊髓，脊髓從尾部和延髓(在第一脊神經(jīng)節(jié)處)切斷，去除感覺神經(jīng)節(jié)和粘性腦脊膜，然后將脊髓索部分分成腹側(cè)和中背部分分別培養(yǎng)。將腹側(cè)脊髓組織切成小塊，在0.1%胰蛋白酶(GIBCO)，0.01% I型脫氧核糖核酸酶(sigma)的無鈣鎂磷酸緩沖鹽液(PBS)中37℃培養(yǎng)20分鐘，然后去除胰蛋白溶液，沖洗細胞，然后加入到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基由45% Eagle′s最小必須培養(yǎng)基(MEM)，45% Ham′s營養(yǎng)混合物F12(F12)，5%熱失活胎牛血清(GIBCO)，5%熱失活馬血清(GIBCO)，谷氨酸(2mM)，青霉素G(0.5μ/ml)和鏈霉素(0.5μg/ml)組成。然后將組織用巴斯德管輕輕研磨機械分離，收集上清液，用尼龍過濾器(Nitex，Tetko;40μm)過濾。然后將過濾細胞懸浮液用于下述6.13部分所述的分餾步驟。
6.1.3對腹側(cè)脊髓細胞進行甲泛影酰胺密度梯度分級分離本分級分離的方法是Schnaar和Schaffner所述的方法(1981，J.Neurosci，1204-217)的改進方法。所有的步驟都在4℃溫度下進行。將甲泛影酰胺溶于F12MEM(1∶1)的培養(yǎng)基，建立一個不連續(xù)梯度液，包括18%甲泛影酰胺緩沖液(0.5ml)，3ml 17%甲泛影酰胺，3ml 12%甲泛影酰胺和3ml 8%甲泛影酰胺。由上述方法獲得的2.5ml過濾的腹側(cè)脊髓細胞懸浮液在梯度液中分層，試管用離心機(Sorvall HB4)2500g離心15分鐘，離心液分為三層細胞液第一部分(在0-8界面)，第二部分(在8-12%界面)，第三部分(在12-17%界面)，第一部分富含運動神經(jīng)元。在這0-8%的界面移出一小部分體積(大約1ml)，用含有50%F12和50% MEM谷氨酸(2mM)，胰島素(5μg/ml)轉(zhuǎn)鐵蛋白(100μg/ml)，孕酮(20nM)，腐胺(100μM)和亞硒酸鈉(30mM)的無血清定義培養(yǎng)基洗滌兩次(Bottenstein and Sato，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76514-517)。在錐蟲藍存在的條件下用細胞計數(shù)器計數(shù)活細胞。然后將第一部分的細胞懸浮液(富含運動神經(jīng)元)以密度為100，0000細胞/cm2接種到預先裝涂聚-L-鳥氨酸(Sigma，10μg/ml)和昆布氨酸(Laminin)(GIBCO;10μg/ml)的6mm培養(yǎng)孔中。接種的當天用生長因子(CNTF和BDNF)處理，在相對濕度近100%，溫度為37℃的95%空氣/5% CO2氣中將培養(yǎng)物保持在無血清定義培養(yǎng)基中。兩天后(48小時)采收細胞，測量膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT;Fonnum，1975，J，Neurochem.24407-409)和參見下述7.1.5節(jié)。
6.1.4 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)BDNF用CHO細胞產(chǎn)生和從CHO細胞條件培養(yǎng)基中純化，均質(zhì)度用丙烯酰胺凝膠和氨基酸序列分析評價(見下述8節(jié))。
6.1.5.睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)所有試驗所用的CNTF為在大腸桿菌中表達并純化的重組鼠CNTF。用Masiakowski et al.WO 91/04316中描述的方法。
6.1.6 其它因子研究中采用的NGF(2.55)用Mobley等，1976，Biochemistry 155543-5551)所述的方法從小鼠唾液腺中純化，基本的FGF從協(xié)作研究者獲得。
6.2 結(jié)果6.2.1 BDNF對膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶活性的效果與未處理的對照相比，用BDNF處理的富含運動神經(jīng)元培養(yǎng)物48小時后CAT活性顯示出有4-5倍的最大激發(fā)。如圖1所示，CAT活性的增長似乎取決于BDNF劑量，其最大反應劑量為大約10ng/ml。
6.2.2.BDNF和CNTF合用對膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的影響。
由于睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)顯示出提高小鼠運動神經(jīng)元在體外的存活能力(Wong等，1990，Soc.Neurosci.Abst.)。我們尋求確定這兩種因子(BDNF和CNTF)所引起的CAT活性增加是有疊加作用。結(jié)果表明，飽和濃度的BDNF(50ng/ml)和CNTF 50ng/ml共同使用對培養(yǎng)物中的運動神經(jīng)元的CAT活性不只是疊加增加(圖2)，表明兩種因子是協(xié)同作用并具有不同的調(diào)節(jié)通路。BDNF和CNTF的共同加入所得的最大相加效果比對照高出15倍。與對照培養(yǎng)物相比NGF或bFGF對CAT活性都不具顯著的影響(圖2B)。
脊髓腹側(cè)運動神經(jīng)元的退化和壞死是肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS;LouGehrig′s disease)，脊髓損傷和其它運動神經(jīng)元疾病病理生理過程的主要方面。上述結(jié)果表明，BDNF單獨或與CNTF一塊使用治療上述疾病時可以促進膽堿能表達。
7實施例NT-3處理增加脊髓運動神經(jīng)元培養(yǎng)物中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性7.1 材料和方法7.1.1 實驗動物Sprague-Dawley鼠(HSD或Zivic-Miller)的胚胎(階段E14)用于所有的實驗，通過CO2窒息處死懷孕鼠迅速摘取胚胎并放置在冰冷的培養(yǎng)基中，以備進一步分離。
7.1.2 組織培養(yǎng)方法將脊髓從妊娠14天的小鼠胚胎中無菌地摘取并按在上面的6.1.2節(jié)中敘述的已有技術(shù)制備。
7.1.3.用甲泛影酰胺密度梯度分級分離腹側(cè)脊髓細胞分級分離方法是按在6.1.3節(jié)中所述進行，不同的是在接種當天用NT-3處理細胞。如圖3所示，與未處理的對照組相比，以NT-3處理能引起運動神經(jīng)元CAT活性的3-4倍的最大激發(fā)。CAT活性的增長依賴于劑量，最大增長可達1ng/ml。
7.1.4 神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(NT-3)如下面第8節(jié)所述制備BDNF的方法，NT-3是由CHO細胞產(chǎn)生的，并是從CHO細胞條件培養(yǎng)基中純化得到的同種純化物。并由銀染色聚丙酰胺凝膠和氨基酸序列分析進行評價。
7.1.5.膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的分析通過溶解細胞于含有0.1% Triton X-100的20mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris-HCl)(pH8.6)溶液中得到培養(yǎng)物。取2微升的細胞溶解物按micro-Fonnum方法(Fonnum，1975，J.Neurochem.24407-409)進行膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性分析。最后的底物組合物由0.2mM[1-14C]乙酰輔酶A(NEN，54.4mCi/mmol)，300mM氯化鈉，8mM溴化膽堿，20mM EDTA和0.1mM新斯地明的50mM磷酸二氫鈉(pH7.4)緩沖液組成。在這種酶和底物濃度下，使酶反應連續(xù)進行90-120分鐘。膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶誘導的特異性可通過在測定過程中加入一種特定的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性抑制劑來進行檢查。該抑制劑為N-羥乙基-4-(1-萘基乙烯基)苯基偶氮二氫基吡啶(HNP)(White and Cavallito 1970，J，Neurochem.171579-1589)。
7.2 結(jié)果如上述所討論的，在脊髓腹側(cè)運動神經(jīng)元的衰退和死亡是肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化(ALS，Lou Gehrig′s病)，脊髓損傷和其他運動神經(jīng)元疾病病生理過程的主要因素。目前的結(jié)果表示NT-3處理的運動神經(jīng)元中增強了膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性，這表明NT-3可用于治療這些疾病而促進膽堿能的表達。
8實施例從中國倉鼠卵巢細胞的條件培養(yǎng)基中純化重組腦源性生長因子的步驟8.1 材料和方法通過由陽離子交換和凝膠過濾色譜法組成的兩個步驟，將重組BDNF從CHO細胞條件培養(yǎng)基中分離出來。
對從Opticell生物器(Charles River)中收集到的接種了可表達BDNF的CHO細胞的條件培養(yǎng)基 用蒸餾水稀釋(比例1.25∶1)。4℃下連續(xù)裝入15ml(1.6cm內(nèi)徑)S-瓊脂糖快速S-Sepharose Fast Flow(pharmacia)柱中。10.6升(稀釋過的)總體積過柱五天。該柱用pH5.8和50ml的20mM MES緩沖液(4-嗎啉乙烷-磺酸溶液，用氫氧化鈉調(diào)pH到5.8)洗滌，再經(jīng)50ml含有250mM氯化鈉的同樣的緩沖液洗滌，再經(jīng)不含氯化鈉同樣的MES緩沖液洗滌直到在250nm處的吸收率達到基線水平。然后該柱用25ml pH8.5的20mM N-二(羥乙基)甘氨酸緩沖液洗滌。再經(jīng)15ml含有100mM氯化鈉的同樣緩沖液洗滌。接著，該柱用150毫升，100mM到750mM梯度氯化鈉的20mM N-二(羥乙基)甘氨酸緩沖液(pH8.8)進行洗脫，流速為2.5ml/分鐘，洗脫的吸收率在280nm，單位滿刻度0.2吸收率的靈敏度下進行檢測。含有重組BDNF的餾分經(jīng)脊神經(jīng)節(jié)(DRG)移出生物檢定進行鑒別。最高特異性活性的餾分與氫氧化鈉濃度在500和750mM之間相對應。這些餾分合并(45ml)并使用KDa Omega型膜高壓膜超濾出濃縮至2ml，選擇可使BDNF低非特異結(jié)合的膜。濃縮的樣品再置于120ml(1.6cm內(nèi)徑)Sephaeryl S-100 HR凝膠過濾柱上(Pharmacia)。該柱填充后以pH7.6含有400mM氯化鈉的20mM HEPES緩沖劑平衡。該柱以0.25ml/分鐘的速度洗脫，收集2ml量的餾分并以DRG移植生物檢定法對BDNF活性進行檢定，發(fā)現(xiàn)在80到90毫升之間洗脫的流分含有生物活性重組BDNF，合并這些餾分并采用還原性SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，N-末端序列測定和氨基酸定量分析法進行分析。凝膠電泳(18%聚丙烯酰胺)顯示兩條與細胞素C同時遷移的相近分離譜帶。N-末端分析和氨基酸定量分析使用標準的步驟來進行。
N-末端序列分析表明，分離出的物質(zhì)由全長度BDNF(約66%)和缺少前6個氨基酸殘基的截斷BDNF組成。樣品的氨基酸定量分析顯示蛋白質(zhì)濃度大約平均值為0.043mg/ml，根據(jù)這個值的計算，最終純生物活性BDNF的產(chǎn)量為0.430毫克，DRG移植生物檢定要求該材料半飽和量大約為1.2ng/ml。
8.2結(jié)果BDNF的氨基酸定量分析純化的BDNF的氨基酸定量分析在貝克曼(Beckman)6300氨基酸分析儀上完成，結(jié)果(表Ⅰ)表明，蛋白質(zhì)的平均濃度約為0.043Mg/ml，圖4描繪了通過標準DRG移植生物檢定所得出的BDNF量數(shù)曲線。
表Ⅰ BDNF序列分析樣品1腦來源的神經(jīng)營養(yǎng)性因子餾分＃23，BDNF＃2，100μl，20mM HEPES和400mM NaCl。
樣品用75%丙酮冰凍(-20℃)過夜沉淀，在13000rpm下離心10分鐘收集蛋白沉淀物，溶解在70%三氟乙酸中的蛋白質(zhì)被測定序列周期 序列Ⅰ 序列Ⅱ 參照1 His 17.5pmol Arg 18.6pmol His2 Ser 14.1 Gly 8.5 Ser3 Asp 26.2 Glu 8.8 Asp4 Pro 25.0 Leu 10.8 Pro5 Ala 36.0 Ser 12.3 Ala6 Arg 54.6 Val 19.0 Arg7 Arg 44.1 - Arg8 Gly 16.9 Asp 8.2 Gly9 Glu 13.6 Glu10 Leu 10.7 Leu11 Ser 7.4 Ser12 Val 15.7 Val13 - Cys14 Asp 8.1 Asp15 Ser 4.0 Ser16 Ile 5.0 Ile估計量蛋白Ⅰ36.0×2.5＝90.1pmol(ALa-5)蛋白Ⅱ19.0×2.5＝47.7pmol(Val-6)蛋白Ⅰ和蛋白Ⅱ的比率為2.1。
9 實施例125I-BDNF和125I-NT-3向鼠腹側(cè)脊髓的逆向轉(zhuǎn)運。
9.1 材料和方法9.1.1 神經(jīng)營養(yǎng)因子用前面第8節(jié)所述方法，在條件培養(yǎng)基中制備重組體。BDNF和NT-3用乳過氧化物酶方法對BDNF和NT-3進行放射性碘標記(Yipet al;1983，J.Neurosci.32172-2182)至3000-7800cpm/fmol的特定活性。在轉(zhuǎn)移研究前除去游離125I。
9.1.2.實驗動物雄性Sprague-Dawley鼠(250-300g)從Zivic Miller獲得，用于所有的逆向轉(zhuǎn)移研究。
9.1.3.逆向轉(zhuǎn)移研究以每公斤體重3ml的水合氯醛(4%)和戊巴比妥鈉(88%)混合物麻醉鼠。暴露坐骨神經(jīng)并在閉孔內(nèi)肌腱遠側(cè)0.4cm處弄破10秒鐘，損傷的目地是暴露最大數(shù)量的受體點以使BDNF接近。損傷后，在損傷位置注入2μl含有125I-標記的BDNF或NT-3的10mg/ml BSA的液或注入末標記的BDNF，NT-3或NGF(超過100倍)PBS/BSA緩沖液。16ng BDNF 14ng NT-3的總量被注入(分別為4×106和2.2×106cpm)。傷口被縫合，讓鼠恢復18小時。殺死鼠，取出腰4和腰5脊髓片斷并切成右(同側(cè)的)和左(對側(cè)的)兩半。樣品放置在4%仲甲醛磷酸鹽(pH7.4)緩沖液中，以gamma計數(shù)器計數(shù)。數(shù)據(jù)以每個右或左脊髓轉(zhuǎn)移的125I神經(jīng)營養(yǎng)因子的渺摩爾(10-18摩爾)±S.E.M表示。
9.2 結(jié)果表Ⅱ顯示了在損傷坐骨神經(jīng)部位注入125I-BDNF的鼠脊髓中有-BDNF的積累。在注射的一邊觀察到有計數(shù)(每分鐘300-400計數(shù)，相當于約50渺摩爾)，但是與在對測邊積累的背景計數(shù)相近。對測邊出現(xiàn)低的積累計數(shù)可能起源于通過系統(tǒng)循環(huán)從注射邊泄漏到有意義邊。對脊髓轉(zhuǎn)移研究來說這種背景計數(shù)通常是注射邊的15-25%，并在整個試驗中保持相對不變。超過100倍的BDNF明顯阻礙轉(zhuǎn)移，而NGF和NT-3(＞100倍)僅部分阻礙轉(zhuǎn)移。脊髓組織的乳液自動放射照片分析揭示有大的腹側(cè)角神經(jīng)元(在腹側(cè)角的背外側(cè)四分體中)被標記，這種神經(jīng)元形態(tài)上表現(xiàn)為運動神經(jīng)元。在背側(cè)脊髓中，僅可見背景標記表Ⅱ125I-BDNF逆向轉(zhuǎn)移至鼠脊髓渺摩爾注射 R L125I-IBDNF+PBS 56±15 10±4125I-BDNF+BDNF 7±3* 3±1125I-BDNF+NT-3 35±1 6±3125I-BDNF+NGF 48±5 8±3所有試驗中BDNF注入右邊損傷的座骨神經(jīng)。
結(jié)果用3-4只動物的平均數(shù)±S.E.M表示。
R.右脊髓;L.左脊髓＊P.與125I-BDNF+PBS比較＜0.05
表Ⅲ揭示了NT-3也被轉(zhuǎn)移到脊髓中去，超過100倍的同源配位體明顯減少轉(zhuǎn)移，但NGF和BDNF對NT-3的轉(zhuǎn)移沒有明顯作用。
表Ⅲ125I-NT-3逆向轉(zhuǎn)移至鼠脊髓渺摩爾NT-3注射 R L125I-NT-3+PBS 37±3 14±9125I-NT-3+NT-3 16±7* 11±6125I-NT-3+BDNF 28±5 10±2125I-NT-3+NGF 32±6 18±4結(jié)果用3-4只動物的平均數(shù)±S.E.M.表示。
R，右脊髓;L，左脊髓＊P與125I-NT-3+PBS比較＜0.0510.實施例 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)性因子和神經(jīng)營養(yǎng)物-3支持新生鼠的損傷運動神經(jīng)元存活下列數(shù)據(jù)由Max-Planck精神病學院神經(jīng)化學和神經(jīng)生物化學系的M.Sendtner，B.Holtmann，R.Kolbeck，H.Thoenen和Y.-A.Barche的手稿提供。
10.1材料和方法10.1.1 外科學和組織學方法按照Sendtner等人(1990，Nature，345440-441)描述的方法進行幼鼠右側(cè)面神經(jīng)橫切實驗。概括地說，新生Wistar鼠通過低溫麻醉，直接在右耳后切出約3mm長的口子。面部神經(jīng)在基突乳突處暴露，在距這個位置約1mm處橫切兩神經(jīng)根。凝膠泡沫(Spongostan，Paesel，F(xiàn)rankfurt，Germany)被切成小塊(1×1×3mm)，浸入含有5μg BSA(Cohn Fraction V，Sigme，Deisenhofen，Germanoy)或營養(yǎng)因子的30μl PBS中。凝膠泡沫插于損傷部位，固定在覆蓋這個部位的韌帶下。皮膚以絲織物(Ethikon3-0)濕潤，并將該動物歸還給它們的母親。出生后七天，通過超劑量乙醚和經(jīng)血管灌注50ml 4%甲醛處死動物。解剖腦干，固定1小時后，以水沖洗，用遞增濃度的乙醇(70-100%)脫水，在石蠟打底后，將全部腦干用系列切片機(Reichert-Jung 2050 Supercut)制成系列切片(7μm)，切片以羥甲苯基紫羅蘭(Sigma，Deisenhofen，Germany)染色，對比邊和損傷邊的面部運動神經(jīng)元核仁在光學顯微鏡(放大125×)下計數(shù)，按Sendtnea等人描述的方法每隔5片計數(shù)，其計數(shù)沒有用分裂核進行校正。
10.1.2 NGF，BDNF和NT-3的產(chǎn)生和特性從成熟雄性鼠的頜下腺分離神經(jīng)生長因子(2.5S)，重組鼠BDNF和NT-3均可通過重組牛痘病毒轉(zhuǎn)染的兔腎細胞產(chǎn)生，并可從上清液純化。
10.2 結(jié)果如果面部運動神經(jīng)元軸突被切斷和損傷，則80%以上的損傷細胞可在幾天內(nèi)變化退化。CNTF應用于損傷部位顯示出增加這種細胞的存活率將近100%，在相同的條件下，應用5μg NGF不能明顯提高運動神經(jīng)元的存活能力。
與用NGF處理的動物相反，如果BDNF應用于切斷的面部神經(jīng)，可觀察到較高的存活率。平均50%的損傷運動神經(jīng)在損傷后一周仍然存活(表Ⅳ)。損傷部位神經(jīng)元的存活率范圍為765至4580。在僅765個神經(jīng)元可被測得的動物中，包含營養(yǎng)因子的凝膠泡沫已從損傷部位移位，這可能解釋這一個實驗中觀察到的BDNF的低存活作用。
和用BDNF的結(jié)果一樣，在NT-3處理后也能提高運動神經(jīng)元的存活能力(表Ⅳ)。然而其作用小于BDNF的作用，平均27%的損傷運動神經(jīng)元可在損傷部位被挽救，相比而言BSA可使18%的運動神經(jīng)元被挽救，NT-3提高存活能力的作用在統(tǒng)計學上具有顯著意義(P＜0.05)。
形態(tài)上，以BDNF和NT-3處理動物的損傷運動神經(jīng)元細胞體較小，顯示出典型的反應性變化(表5)。BDNF和NT-3處理的動物中，細胞核被移位，染色質(zhì)溶解顯著，然而，當與用BSA-凝膠泡沫處理的對照動物比較時，細胞核體積顯得較大，(圖5)。
表Ⅳ新生鼠面神經(jīng)損傷后運動神經(jīng)元的存活能力神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用
10.3討論在本發(fā)明的研究中，我們發(fā)現(xiàn)BDNF能夠支持新生鼠大量面部運動神經(jīng)元軸索切斷后的存活。此外，雖活性較低，NT-3似乎對這些細胞也有活性。相反NGF卻不支持這些細胞軸突切斷后的存活。這些數(shù)據(jù)說明，神經(jīng)營養(yǎng)因子基因家族成員能以類似CNTF的方式在體內(nèi)影響運動神經(jīng)元的存活。
本文引用了幾篇對比文獻，其中所述內(nèi)容全部一并引用作為參考。
權(quán)利要求
1.一種治療運動神經(jīng)元紊亂的方法，包括給需要該治療的病人使用有效量的神經(jīng)營養(yǎng)性因子，該因子(ⅰ)是BDNF/NT-3/NGF分子家族的一個成員，(ⅱ)支持運動神經(jīng)元的存活、生長或分化。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中BDNF/NT-3/NGF分子家族的成員是BDNF。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中BDNF/NT-3/NGF分子家族的成員是NT-3。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的運動神經(jīng)元紊亂是由肌萎縮性側(cè)索硬化引起的
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的運動神經(jīng)元紊亂是由損傷引起的
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的運動神經(jīng)元紊亂是由進行性脊柱肌肉萎縮引起的。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的運動神經(jīng)元紊亂是由嬰兒或幼年性肌肉萎縮引起的。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的運動神經(jīng)元紊亂是由脊髓灰質(zhì)炎或脊髓灰質(zhì)炎后綜合癥引起的。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的運動神經(jīng)元紊亂是由進行性神經(jīng)性腓骨肌萎縮引起的。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的BDNF/NT-3/NGF家族的成員與有效量的至少一種能提高運動神經(jīng)元存活，生長或分化能力的其它試劑共同使用。
11.如權(quán)利要求10的方法，其中的其它試劑是睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子。
12.一種可用于治療運動神經(jīng)元紊亂的藥物組合物，包括一種支持運動神經(jīng)元存活、生長或分化的BDNF/NT-3/NGF家族成員與一種藥理上可接受的載體。
13.如權(quán)利要求12的藥物組合物，其中的BDNF/NT-3/NGF家族成員是BDNF。
14.如權(quán)利要求12的藥物組合物，其中的BDNF/NT-3/NGF家族成員是NT-3。
15.一種提高運動神經(jīng)元存活、生長和/或分化能力的方法，包括將運動神經(jīng)元暴露在有效濃度的神經(jīng)營養(yǎng)性因子中，該營養(yǎng)因子是BDNF/NT-3/NGF分子家族的一種成員，它們能提高運動神經(jīng)元的存活、生長或分化能力。
16.如權(quán)利要求15的方法，它是在體外進行的。
17.如權(quán)利要求15的方法，它是在體內(nèi)進行的。
18.如權(quán)利要求15的方法，其中的BDNF/NT-3/NGF家族成員是BDNF。
19.如權(quán)利要求15的方法，其中的BDNF/NT-3/NGF家族成員是NT-3。
20.一種診斷病人運動神經(jīng)元紊亂的方法，包括比較取自病人和取自正常人的樣品中的是BDNF/NT-3/NGF家族成員的神經(jīng)營養(yǎng)性因子水平含量，以測定在病人中與運動神經(jīng)元紊亂正性相關的神經(jīng)營養(yǎng)性因子的異常水平。
21.如權(quán)利要求20的方法，其中的BDNF/NT-3/NGF家族成員是BDNF。
22.如權(quán)利要求20的方法，其中的BDNF/NT-3/NGF家族成員是NT-3。
23.如權(quán)利要求20的方法，其中的運動神經(jīng)元紊亂是肌萎縮性側(cè)索硬化。
24.一種測試能提高運動神經(jīng)元存活、生長或分化能力的試驗試劑的檢測方法，包括(a)在標記的BDNF能同運動神經(jīng)元結(jié)合的條件下暴露運動神經(jīng)元在可測的標記BDNF中，(b)同時暴露所說運動神經(jīng)元在試驗試劑中，其中試驗試劑對標記BDNF結(jié)合的抑制作用表明該試驗試劑可用于治療運動神經(jīng)元紊亂。
25.一種測試能提高運動神經(jīng)元存活、生長或分化能力的試驗試劑的檢測方法，包括(a)在標記的NT-3能同運動神經(jīng)元結(jié)合的條件下暴露運動神經(jīng)元在可測的標記的NT-3中，(b)同時暴露所說運動神經(jīng)元在試驗試劑中，其中試驗試劑對標記的NT-3結(jié)合的抑制作用標志著試驗試劑用于治療運動神經(jīng)元紊亂的實用性。
26.一種制備基本上純化的重組BDNF的方法，包括(ⅰ)在一種真核細胞中表達重組BDNF;(ⅱ)收集由步驟(ⅰ)的真核細胞產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基;(ⅲ)用蒸餾水稀釋培養(yǎng)基;(ⅳ)將稀釋的培養(yǎng)基上S-瓊脂糖(凝膠)柱(Sepharose)以約100-750mM的鹽梯度洗脫;(ⅴ)收集洗脫餾分;(ⅵ)合并具有BDNF活性的組分;(ⅶ)濃縮步驟(ⅵ)的組分，(ⅷ)將步驟(ⅶ)的濃縮組分上Sephacryl S-100HR凝膠過濾柱;和(ⅸ)以含有400mM NaCl(PH7.6)的溶液洗脫步驟(ⅷ)的柱子。
27.一種制備基本上純化的重組NT-3的方法，包括(ⅰ)在一種真核細胞中表達重組NT-3;(ⅱ)收集由步驟(ⅰ)的真核細胞產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基;(ⅲ)用蒸餾水稀釋培養(yǎng)基;(ⅵ)將稀釋的培養(yǎng)基上S-瓊脂糖(凝膠)柱，以約100-750mM的鹽梯度洗脫，(ⅴ)收集洗脫物流出組分，(ⅵ)合并具有NT-3活性的組分，(ⅶ)濃縮步驟(ⅵ)的組分，(ⅷ)將步驟(ⅶ)的濃縮組分上Sephacryl S-100HR凝膠過濾柱，(ⅸ)以含有約400NaCl(PH7.6)的溶液洗脫步驟(ⅷ)的柱子。
28.一種診斷BDNF相關運動神經(jīng)元紊亂的方法，包括注射可測的標記的BDNF，以使得標記的BDNF進入一種運動神經(jīng)，測定標記的BDNF是否逆向轉(zhuǎn)移，如果逆向轉(zhuǎn)移失敗，說明運動神經(jīng)元功能喪失。
29.如權(quán)利要求28的方法，其中的紊亂屬于下列一組疾病中的一種肌萎縮性側(cè)索硬化，進行性脊柱肌肉萎縮，嬰兒肌肉萎縮，脊髓灰質(zhì)炎，脊髓灰質(zhì)炎后綜合癥，進行性神經(jīng)性腓骨肌萎縮，神經(jīng)創(chuàng)傷或損傷。
30.一種診斷NT-3相關性運動神經(jīng)元紊亂的方法，包括用某種方式將可測的標記的NT-3注入，使標記的NT-3進入一種運動神經(jīng)，測定標記的NT-3是否逆向轉(zhuǎn)移，其中，逆向轉(zhuǎn)移的失敗與運動神經(jīng)元機能失調(diào)相關。
31.如權(quán)利要求30的方法，其中的紊亂屬于下列一組疾病中的一種肌萎縮性側(cè)索硬化，進行性脊柱肌肉萎縮，嬰兒肌肉萎縮，脊髓灰質(zhì)炎，脊髓灰質(zhì)炎后綜合癥，進行性神經(jīng)性腓骨肌萎縮，神經(jīng)創(chuàng)傷或損傷。
全文摘要
本發(fā)明涉及運動神經(jīng)元紊亂例如肌萎縮性側(cè)索硬化(Lou Gehriy氏病)的治療方法，包括給需要該治療的病人使用有效量的神經(jīng)營養(yǎng)性因子，該因子是BDNF/NT-3/NGF分子家族的一個成員。本發(fā)明部分地基于BDNF和NT-3均能增加運動神經(jīng)元培養(yǎng)物中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的發(fā)現(xiàn)。在本發(fā)明特定優(yōu)選實施例中BDNF或NT-3和一種第二試劑如CNTF的聯(lián)合使用，可用于治療運動神經(jīng)元疾病。本發(fā)明也提供提高運動神經(jīng)元在體外存活，生長和/或分化能力的方法，診斷方法和檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)可被用于辨別具有BDNF或NT-3樣活性。
文檔編號A61KGK1071585SQ92105070
公開日1993年5月5日 申請日期1992年5月19日 優(yōu)先權(quán)日1991年7月10日
發(fā)明者V·王, C·拉濟祖斯基, P·迪施特凡諾 申請人:里珍納龍藥品有限公司, 馬克斯普朗克科學促進協(xié)會