專利名稱：環(huán)糊精接枝的生物相容兩親聚合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及新型的聚合物生物活性劑載體。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及用作生物活性劑載體的環(huán)糊精接枝的生物相容聚合物及其制備方法。
許多具有各種不同治療用功效的生物學(xué)活性分子如抗病毒劑、抗癌劑、肽/蛋白和DNA，通過重組DNA和其他技術(shù)的進(jìn)步已作為商品供應(yīng)了。然而，總是需要某種藥物和活性劑用的理想載體來(lái)提高其溶解性、釋放和療效。
環(huán)糊精(CD)是環(huán)狀寡糖，通常由6～8個(gè)葡糖單元組成，此種單元具有截錐形狀，包括由仲羥基基團(tuán)(2-OH和3-OH)構(gòu)成的寬開放邊和伯羥基基團(tuán)(6-OH)構(gòu)成的較窄邊。環(huán)糊精提供一種獨(dú)特的微觀-多相環(huán)境，因?yàn)榉肿拥耐饷媸怯H水的，而空洞則由于具有較高電子密度而表現(xiàn)為疏水。環(huán)糊精的包合性，即，客體分子與環(huán)糊精分子之間復(fù)合物的形成曾被廣泛研究。在固態(tài)或溶液中形成的復(fù)合物由客體分子和將客體分子保持在其空洞中的宿主環(huán)糊精組成，并靠范德華力，和在較小程度上，靠偶極-偶極相互作用維持穩(wěn)定。在水溶液中的包合復(fù)合物被認(rèn)為依靠疏水相互作用而進(jìn)一步穩(wěn)定化，即，依靠溶劑水將適當(dāng)尺寸和形狀的疏水溶質(zhì)推入到基本疏水的空洞中以便使溶劑達(dá)到其“最可能結(jié)構(gòu)”和使整個(gè)體系達(dá)到最低能量的傾向。
天然環(huán)糊精(α-，β-和γ-CD)作為藥物載體的實(shí)際應(yīng)用受到其在水中溶解度低的限制。安全是環(huán)糊精作為藥物載體的另一個(gè)主要擔(dān)憂，因?yàn)榄h(huán)糊精具有毒性。對(duì)母體環(huán)糊精進(jìn)行改性以改善安全性，同時(shí)維持其與各種被作用物形成包合復(fù)合物的能力一直是許多研究小組的目標(biāo)。有些小組還集中在改善藥品與環(huán)糊精之間的相互作用，而其他小組則試圖制備可以在化學(xué)上更精確規(guī)定的材料。
兩種最有希望的適合非經(jīng)腸給藥的環(huán)糊精衍生物是羥丙基β-環(huán)糊精(HPβCD或HPCD)和磺基丁基醚-β-環(huán)糊精(SBEβCD或SBE-CD)。HPβCD通常在對(duì)動(dòng)物或人類非經(jīng)腸給藥時(shí)據(jù)發(fā)現(xiàn)是安全的。[Pitha等人，《藥物科學(xué)雜志》84(8)，927-32(1995)]。在高劑量動(dòng)物研究(100～400mg/kg)中曾發(fā)現(xiàn)微小、可逆、組織學(xué)上的改變，而暗示發(fā)生了紅血細(xì)胞受損的較為顯著的血液學(xué)改變是在這些高劑量研究中被觀察到的。在人體研究中，未觀察到不利的影響。SBEβCD，據(jù)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對(duì)老鼠非經(jīng)腸給藥時(shí)也是安全的[Rajewski等人，《藥物科學(xué)雜志》84(8)，927-32(1995)]。然而，像大多數(shù)改性環(huán)糊精一樣，藥品與HPβCD之間的結(jié)合常數(shù)通常小于其與母體或未改性環(huán)糊精的常數(shù)。由于宿主分子的空間位阻的緣故，羥丙基取代度越高，樣品結(jié)合能力越差。
也曾制備過環(huán)糊精的疏水改性物，旨在改善某些CD-可包合樣品的制劑。據(jù)發(fā)現(xiàn)，通常在β-環(huán)糊精(DM-βCD或DMCD)的2-和6-位羥基基團(tuán)的部分甲基化，由于疏水相互作用的增加而導(dǎo)致較強(qiáng)的藥品結(jié)合能力。雖然甲基化環(huán)糊精高度可溶于水，但它們也具有較大毒性。DMβCD的毒性可通過以乙?；鶊F(tuán)對(duì)游離3-羥基基團(tuán)實(shí)施改性而大大降低。這表明，具有優(yōu)異生物相容性和包合能力的水溶性環(huán)糊精衍生物可以制備出來(lái)，只要小心選擇取代基團(tuán)?？刂迫〈葘?duì)平衡水溶性和復(fù)合能力也具有重要作用。當(dāng)取代基團(tuán)比甲基基團(tuán)更偏于疏水，例如，乙基基團(tuán)、乙?；鶊F(tuán)等時(shí)，整個(gè)環(huán)糊精衍生物就將變得實(shí)際上不溶于水。這些化合物已證明具有作為水溶性藥物的持續(xù)釋放(緩釋)載體的潛在用途。在烷基化環(huán)糊精當(dāng)中，七(2，6-二-O-乙基)-β-環(huán)糊精和七(2，3，6-三-O-乙基)-β-環(huán)糊精是首批與水溶性地爾硫卓、硝酸異山梨酯和肽裂欖素乙酸酯配合使用的緩釋載體。
另一方面，過?；哂兄械韧榛滈L(zhǎng)(C4～C5)的環(huán)糊精由于其多官能和生物適應(yīng)性因而是特別有用的新疏水載體。它們具有適合各種不同給藥途徑的寬泛適用性例如，七(2，3，6-三-O-丁酰)-β-環(huán)糊精(C4)的生物粘附性可用于口服或經(jīng)粘膜制劑，而七(2，3，6-三-O-戊酰)-β-環(huán)糊精(C5)的成膜性質(zhì)則對(duì)于經(jīng)皮制劑很有用。在口服用途中，嗎多明，一種水溶性和短半衰期藥物，其釋放因使用全?；?β-環(huán)糊精，而隨著其溶解度的降低明顯變緩，特別是當(dāng)使用碳鏈比丁基化衍生物長(zhǎng)的那些時(shí)。當(dāng)給小獵犬口服該復(fù)合物時(shí)，七(2，3，6-三-O-丁酰)-β-環(huán)糊精壓低了嗎多明的峰值血漿濃度值，并在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持足夠的藥物水平，而使用其他比七(2，3，6-三-O-丁酰)-β-環(huán)糊精鏈更短或更長(zhǎng)的衍生物則證明緩釋效果不足。這表明，七(2，3，6-三-O-丁酰)-β-環(huán)糊精可能是口服水溶性藥物，特別是在胃腸道中代謝的藥物用的有用載體。七(2，3，6-三-O-丁酰)-β-環(huán)糊精表現(xiàn)出的優(yōu)異和持續(xù)的效果可能是疏水性提高和粘膜粘附性二者共同作用的結(jié)果。由于其疏水性，七(2，3，6-三-O-丁酰)-β-環(huán)糊精以及其他疏水環(huán)糊精衍生物只能以固體或油狀制劑形式使用。另一方面，像天然β-環(huán)糊精一樣，其以濃度依賴方式造成組織刺激和溶血作用的膜毒性則是阻礙其在制藥中應(yīng)用的另一個(gè)限制。例如，DM-β-CD誘導(dǎo)人體紅細(xì)胞50％溶血的濃度低于所謂“生物適應(yīng)性”CD衍生物如2-羥丙基-β-CD、β-CD的磺基丁基醚和麥芽糖基-β-CD的對(duì)應(yīng)濃度。環(huán)糊精的溶血活性與膜組分被萃取，主要是通過與膽固醇的包合作用相聯(lián)系。但是，這一缺點(diǎn)可以通過烷基化CD的進(jìn)一步結(jié)構(gòu)改性加以克服，例如，七(2，6-二-O-甲基-3-O-乙酰)-β-CD(DMA-β-CD)，據(jù)發(fā)現(xiàn)，溶血作用弱得多，同時(shí)卻維持著與MD-β-CD相近的包合能力[Hirayama等人《藥物科學(xué)雜志》88(10)，970-5(1999)]。鑒于在口服后，環(huán)糊精被胃腸道吸收得很差，故環(huán)糊精的口服給藥極少會(huì)引起因環(huán)糊精本身被系統(tǒng)吸收導(dǎo)致的安全隱患。但是，環(huán)糊精可通過增加對(duì)某些營(yíng)養(yǎng)素和膽汁酸的胃腸道消除而引起二次系統(tǒng)效應(yīng)。此種效應(yīng)在δ-環(huán)糊精輔助膽汁酸的糞便消除中表現(xiàn)得最明顯。然而，此種消除作用的加強(qiáng)，只有在非常高的環(huán)糊精口服劑量(最高達(dá)飲食的20％)時(shí)才會(huì)觀察到。加強(qiáng)膽汁酸消除的二次效應(yīng)提高血清膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化率，其后果是血漿膽固醇水平的降低。
多年來(lái)制備了各種各樣的環(huán)糊精，以改善母體環(huán)糊精的生理化學(xué)性質(zhì)和包合能力，并且某些含環(huán)糊精藥物產(chǎn)品已獲得批準(zhǔn)。由于要改變所承載的藥物的溶解性能需要大量環(huán)糊精，故環(huán)糊精的毒性必須非常低才能安全地遞送需要?jiǎng)┝康乃幬?。因此，減少總劑量或者降低環(huán)糊精的內(nèi)在毒性可拓寬環(huán)糊精的藥物應(yīng)用范圍。
綜上所述，可以看出，提供一種改進(jìn)的含環(huán)糊精生物活性劑載體及其使用方法將是在技術(shù)上的一大進(jìn)步。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一類新的含聚合物的兩親環(huán)糊精，其中多個(gè)疏水環(huán)糊精或衍生環(huán)糊精部分通過適當(dāng)可生物降解的或不可生物降解的連接體而連接或接枝到一種生物相容親水聚合物主鏈上。任選地，一種或多種導(dǎo)向部分(TM)或其混合物也可以共價(jià)鍵連接到聚合物主鏈上。本發(fā)明CD-接枝聚合物可以通過適當(dāng)連接體將2～30個(gè)CD或其衍生物偶聯(lián)到親水聚合物，如聚乙二醇(PEG)或聚N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺)(HPMA)上而合成。要求的話，如上所述，一種或多種導(dǎo)向部分(TM)可任選地以共價(jià)鍵連接到該聚合物主鏈上。采用導(dǎo)向部分的目的是瞄準(zhǔn)特定細(xì)胞來(lái)遞送藥物。該合成的載體，即，疏水CD-接枝的親水聚合物，能改善藥物/載體復(fù)合物的溶解性和降低其細(xì)胞毒性。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是一幅曲線圖，顯示紫杉醇/CD復(fù)合物在50％血清中或10xPBS稀釋液中的穩(wěn)定性。
圖2表示PEG-SS-AcCD的合成的反應(yīng)路線。
圖3表示PEG-SS-DECD的合成的反應(yīng)路線。
圖4表示PEG-GFLG-DECD的合成的反應(yīng)路線。
圖5表示PEG-C3-AcCD、PEG-C3--DECD和PEG-C3-BnCD的合成的反應(yīng)路線。
圖6表示PEG-L8-AcCD、PEG-L8--DECD的合成的反應(yīng)路線。
發(fā)明詳述在公開和描述本發(fā)明組合物及其用于遞送藥物的方法之前，應(yīng)了解，本發(fā)明不限于本文公開的特定構(gòu)型、工藝步驟和材料，因?yàn)榇朔N構(gòu)型、工藝步驟和材料可以有一定變化。還應(yīng)知道，這里所使用的術(shù)語(yǔ)僅為描述特定實(shí)施方案的目的而使用，不擬具有限制性，因?yàn)楸景l(fā)明范圍將僅由所附權(quán)利要求及其等價(jià)物限定。
必須注意，當(dāng)在本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求中使用時(shí)，單數(shù)形式包括多數(shù)所指項(xiàng)，除非在上下文中另行明確指出。
“活性劑”是指可作為本發(fā)明的客體分子起作用的那些藥劑?；钚詣┌ɑ瘜W(xué)品和其他物質(zhì)，只要能與環(huán)糊精或衍生環(huán)糊精接枝聚合物形成包合復(fù)合物，對(duì)任何疾病(如腫瘤、梅毒、淋病、流感和心臟病)具有抑制、抗代謝或預(yù)防作用，或者對(duì)任何致病劑具有抑制或毒性?；钚詣┌ㄔS多藥物，例如，抗癌劑、抗腫瘤劑、抗真菌劑、抗生素、抗病毒劑、心臟病藥物、神經(jīng)學(xué)藥物和毒品；生物堿(如喜樹堿)、抗生素、生物活性肽、類固醇、類固醇激素、多肽激素、干擾素、白介素、麻醉劑、核酸，包括反義寡核苷酸、殺蟲劑和前列腺素。活性劑還包括黃曲霉素、蓖麻毒素、環(huán)蛇毒素、藥薯、丙氧鳥苷、速尿、消炎痛、冬眠靈、氨甲蝶呤、西芬胺衍生物和類似物，包括西法丁、desatrines、綠藜蘆。它還包括各種黃酮衍生物和類似物，包括二羥基黃酮(白楊素)、三羥基黃酮、五羥基黃酮、六羥基黃酮、黃羊鹽、榭皮素、漆黃素；各種抗生素，包括青霉素衍生物(如氨芐西林)、環(huán)霉素(如阿霉素、柔紅霉素)、teramycins、四環(huán)素、鹽酸四環(huán)素、羥甲金霉素、布托康唑、艾力替新、胍哌四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯(如兩性霉素)、菲力平、制霉色基素、制霉素、各種嘌呤和嘧啶衍生物和類似物，包括5’-氟-尿嘧啶、5’-氟-2’-脫氧尿苷和別嘌呤醇；各種光敏物質(zhì)，尤其是用于光動(dòng)力學(xué)的單態(tài)和三態(tài)氧生成的那些、酞菁、卟啉及其衍生物和類似物；各種類固醇衍生物和類似物，包括膽固醇、異羥洋地黃毒苷元；各種香豆素衍生物和類似物，包括二羥基香豆素(馬力樹皮素)、雙香豆素；驅(qū)蟲豆素、大黃酸、大黃素、黑麥酮酸；各種二羥基苯丙氨酸衍生物和類似物，包括二羥基苯丙氨酸、多巴胺、腎上腺素和去甲腎上腺素(鹽酸去甲腎上腺素)。
“非經(jīng)腸(的)”是指，肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮下以及只要可行，靜脈和動(dòng)脈內(nèi)。
“生物相容”是指，該物質(zhì)為非致免疫、非致過敏并且將引起極小不希望的生理學(xué)反應(yīng)。它們可生物降解并且它們，在其缺乏特異結(jié)合性質(zhì)或生物識(shí)別性質(zhì)的意義上為“生物學(xué)中性的”。
“連接體”或“環(huán)節(jié)”被定義為在化學(xué)物質(zhì)中使用的特定化學(xué)部分或基團(tuán)，它們能將環(huán)糊精部分通過共價(jià)鍵連接到聚合物主鏈上并且可以是可生物降解或非可生物降解的。合適的連接體將在下面更具體地規(guī)定。
“藥物”應(yīng)指任何有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物或物質(zhì)，只要具有生物活性并適合或被用于治療目的。蛋白、激素、抗腫瘤劑、寡核苷酸、DNA、RNA和基因治療劑都被涵蓋在藥物的廣義定義內(nèi)。
“肽”、“多肽”和“蛋白”當(dāng)指肽或蛋白藥物時(shí)將可互換使用，且將不限于任何特定分子量、肽序列或長(zhǎng)度、生物活性或治療應(yīng)用的領(lǐng)域，除非具體指出。
“導(dǎo)向部分”指的是結(jié)合到特定生物物質(zhì)或部位上的那些部分。該生物物質(zhì)或部位被視為結(jié)合到它上面的導(dǎo)向部分的“標(biāo)靶”。合適的導(dǎo)向部分的例子包括抗原、半抗原、生物素、生物素衍生物、外源凝集素、半乳糖胺、巖藻糖胺部分、受體、底物、輔酶、輔助因子、蛋白、組蛋白、激素、維生素、類固醇、前列腺素、合成或天然多肽、碳水化合物、脂類、抗生素、藥物、地高辛、殺蟲劑、麻醉劑、神經(jīng)遞質(zhì)和各種核酸。
“核酸”被定義為任何取自任何來(lái)源的核酸序列。核酸包括所有類型RNA、DNA和寡核苷酸，包括在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或DNA測(cè)序中使用的探針和引物、反義寡核苷酸和硫代磷酸寡核苷酸。還包括合成核酸聚合物，例如，甲基膦酸酯寡核苷酸、磷酸三酯寡核苷酸、嗎啉代-DNA和肽核酸(PNA)，包括PNA夾子、DNA和/或RNA片斷和取自任何組織、細(xì)胞、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體、核糖體和其他細(xì)胞源的衍生物。
“環(huán)糊精(CD)”是一種環(huán)狀寡糖，由葡糖單體彼此偶聯(lián)在一起形成的錐形、中空分子組成，具有疏水內(nèi)部或空洞。本發(fā)明的環(huán)糊精可以是任何合適的環(huán)糊精，包括α-、β-和γ-環(huán)糊精及其組合、類似物、異構(gòu)體和衍生物。環(huán)糊精可以是天然的或者以疏水基團(tuán)改性的，正如下面將要更詳細(xì)地描述的。
在描述本發(fā)明的過程中，稱環(huán)糊精“復(fù)合物”指的是一種非共價(jià)包合復(fù)合物。包合復(fù)合物在本文中被規(guī)定為，一種環(huán)糊精或衍生的環(huán)糊精，起著“宿主分子”的作用，與一個(gè)或多個(gè)“客體分子”相結(jié)合，將它們?nèi)炕虿糠值匕蚣s束在環(huán)糊精或其衍生物的疏水空洞內(nèi)部——這樣形成的復(fù)合物。最優(yōu)選的CD是衍生物，諸如羧甲基CD、葡糖基CD、麥芽糖基CD、羥丙基環(huán)糊精(HPCD)、2-羥丙基環(huán)糊精、2，3-二羥丙基環(huán)糊精(DHPCD)、磺基丁基醚CD、?；?、乙基化的和甲基化的環(huán)糊精。也優(yōu)選能提供醛的氧化環(huán)糊精，和能提供醛的任何衍生物的氧化形式。還包括變換的形式如冠狀醚樣化合物和環(huán)糊精的高級(jí)同系物。
“受控釋放”的定義是被俘獲的客體分子/藥物僅通過用于合成該載體的某種鍵的斷裂從CD聚合物載體上的釋放。
本發(fā)明涉及新型CD-接枝、生物相容、兩親聚合物及其制備方法和作為生物活性劑載體的應(yīng)用。按照其最一般的定義，本發(fā)明涉及一種生物活性劑與至少一種CD-接枝聚合物偶聯(lián)物之間的復(fù)合物，該偶聯(lián)物包含生物相容親水聚合物主鏈如PEG和HPMA、聚-L-賴氨酸(PLL)和聚乙烯亞胺(PEI)，其上接枝了至少一個(gè)，優(yōu)選多個(gè)疏水改性CD。任選的是，一種導(dǎo)向部分(TM)可共價(jià)地連接到聚合物載體上。
優(yōu)選的含環(huán)糊精聚合物可用這樣一種含環(huán)糊精聚合物來(lái)定義，其中環(huán)糊精或衍生的環(huán)糊精部分通過單一間隔基臂連接到一種生物相容親水聚合物主鏈上，該間隔基臂是按照如下式1代表的方式連接到環(huán)糊精的2，3，或6-位的 (1)P是一種生物相容親水聚合物主鏈，分子量介于2,000～1,000,000道爾頓，優(yōu)選5,000～70,000道爾頓，最優(yōu)選20,000～40,000道爾頓。優(yōu)選的是，該生物相容聚合物主鏈?zhǔn)且环N親水聚合物，選自聚乙二醇(PEG)、N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺聚合物(HPMA)、聚乙烯亞胺(PEI)和聚賴氨酸(pLL)，可按現(xiàn)有技術(shù)已知的方式適當(dāng)?shù)胤舛瞬⑶乙部扇〈蠈?duì)聚合物的預(yù)期功能不產(chǎn)生不利影響的取代基。優(yōu)選的是，生物相容聚合物主鏈?zhǔn)蔷垡叶?PEG)聚合物。當(dāng)環(huán)糊精以其2、3或6位連接時(shí)，則對(duì)應(yīng)的R1O-、R2O-或R3O-基團(tuán)將被置換，并且吡喃型葡糖的2、3或6-碳原子將與連接體X共價(jià)連接；(2)R’是選自氫、組織-導(dǎo)向部分(TM)或細(xì)胞膜融合部分(FM)當(dāng)中的一種，正如本文所述，條件是，氫、導(dǎo)向部分和細(xì)胞融合部分的混合物可存在于同一聚合物主鏈上和/或聚合物組合物內(nèi)；(3)X是連接體，具有通式-Q-Z-Q’-其中Q以共價(jià)鍵鍵合在親水聚合物鏈上，或者直接地或者借助烷基側(cè)基或其他官能團(tuán)，且Q’以共價(jià)鍵鍵合在環(huán)糊精上。Q和Q’獨(dú)立地選自NR4、S、O、CO、CONH和COO。換句話說(shuō)，Q和Q’可包含胺、烷基胺、酰基胺、硫、醚、羰基、酰胺或酯部分。Z包含選自亞烷基二硫醚、[-(CH2)aS-S(CH2)a-]、亞烷基[-(CH2)a]-]、氧化烯(-[(CH2)aO]b(CH2)a-)或短鏈肽當(dāng)中的一種，其中a是1～10的整數(shù)，b是1～20的整數(shù)。優(yōu)選的是，Q是酰胺，Q’是胺、烷基胺或?；凡⑶疫B接體具有通式-CONH-Z-NR4-。最優(yōu)選的是，Q將通過亞烷基(-CH2)a基團(tuán)連接到衍生的聚合物鏈上。當(dāng)Z是亞烷基二硫醚、氧化烯或肽時(shí)，連接體是可生物降解的。當(dāng)Z是亞烷基時(shí)，連接體是不可生物降解的；(4)R1、R2、R3和R4獨(dú)立地選自H、烷基(Cn’H2n’+1)、鏈烯基(Cn’+1H2(n’+1)-1)或?；?Cn’H2n’+1CO)，其中n’是1～16的整數(shù)，優(yōu)選1～8，最優(yōu)選1～4。當(dāng)R1、R2、R3和R4是氫時(shí)，環(huán)糊精具有較為親水的本性。當(dāng)R1、R2、R3和R4之一或多個(gè)是烷基、鏈烯基或酰基基團(tuán)時(shí)，衍生的環(huán)糊精在性質(zhì)上變得較疏水。因此，當(dāng)R1、R2、R3和R4每一個(gè)是烷基、鏈烯基或?；鶗r(shí)，環(huán)糊精最為疏水。?；苌沫h(huán)糊精比烷基或鏈烯基衍生的環(huán)糊精更容易生物降解；(5)q是5、6或7的整數(shù)，這使得側(cè)基環(huán)糊精部分分別變成α-、β-或γ-環(huán)糊精衍生物。優(yōu)選的是，q是6或7，最優(yōu)選q是6。換句話說(shuō)，優(yōu)選的環(huán)糊精是β-環(huán)糊精；(6)w是使每個(gè)聚合物主鏈含有1.5～30，優(yōu)選2～15個(gè)環(huán)糊精部分/20KD(千道爾頓)聚合物主鏈的整數(shù)。整數(shù)“w”代表在聚合物組合物中環(huán)糊精部分的平均數(shù)目，因?yàn)榫酆衔锝M合物是一種聚合物鏈的混合物，其中每個(gè)聚合物鏈的鏈長(zhǎng)、分子量和環(huán)糊精部分的數(shù)目是可變的。因此，在此種聚合物組合物中每種聚合物具有某一重均分子量和環(huán)糊精部分的平均數(shù)，每20KD聚合物主鏈。
本發(fā)明的一種實(shí)施方案是一類新的CD-接枝生物相容聚乙二醇(PEG)聚合物，可用下面通式2代表
其中q、w、X、R、R1、R2、R3和R4如同通式1中所述，m和n是滿足下列條件的整數(shù)當(dāng)與w組合時(shí)，它們代表其分子量如同針對(duì)通式1中的親水聚合物所述的聚環(huán)氧乙烷聚合物鏈。換句話說(shuō)，如通式1所示，生物相容聚環(huán)氧乙烷親水聚合物主鏈的分子量?jī)?yōu)選介于5,000～1,000,000，更優(yōu)選介于5,000～70,000，最優(yōu)選20,000～40,000范圍內(nèi)。正如通式1所示，CD可借助單臂連接體X，通過CD分子的2、3或6位接枝到聚合物上，優(yōu)選通過CD分子的6位接枝。當(dāng)w具有與通式1相同的數(shù)值時(shí)，要理解，w被用來(lái)代表每20KD聚合物主鏈的環(huán)糊精單元數(shù)目，不是指含有順序銜接的“w”個(gè)聚乙二醇(CH2CHXO)單體的聚合物單元。換句話說(shuō)，聚合物主鏈含有“w”個(gè)沿聚合物主鏈間隔分布的含有環(huán)糊精側(cè)基的單體單元。間距可以是無(wú)規(guī)的或者是均勻的，取決于合成過程。
最優(yōu)選的是，含環(huán)糊精聚合物是具有如下通式3的含側(cè)基CD的聚乙二醇聚合物主鏈
其中Q、Q’、Z、R、R1、R2、R3、R4、a和q如同通式1中所述，w是使每個(gè)聚合物主鏈含有1.5～30，優(yōu)選2～15個(gè)環(huán)糊精單元/20KD聚合物鏈的整數(shù)，按平均計(jì)，m和n是滿足下列條件的整數(shù)當(dāng)與w組合時(shí)，它們代表分子量如同針對(duì)通式1中的親水聚合物所述的聚環(huán)氧乙烷聚合物鏈。正如在通式2中所解釋的，含有環(huán)糊精側(cè)基的單體聚乙二醇單元不是連續(xù)銜接的，而可以是無(wú)規(guī)或均一地沿聚合物主鏈間隔分布的。
屬于通式3范圍的具體β-環(huán)糊精共聚物載于下表1。
表1

在表1中，SS是-CH2CH2SSCH2CH2-，C3是-CH2CH2CH2-，L8是-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-，GFLG是四肽Gly-Phe-Glu-Gly。
作為藥物載體，本發(fā)明的這些新型CD-接枝聚合物與其單體前體相比具有以下優(yōu)點(diǎn)。
首先，它們的水溶性較高，毒性較低。聚乙二醇(PEG)是一種具有許多有用性質(zhì)的線型聚醚二醇，例如，溶解性、生物相容性好，因?yàn)槎拘?、致免疫性和抗原性極小并且排泄動(dòng)力學(xué)好。這些特征使得PEG在制藥研究中被研究得最廣泛并最終導(dǎo)致FDA(食品及藥物管理局)批準(zhǔn)用于內(nèi)服藥。因此，PEG可改變偶聯(lián)的環(huán)糊精的物理化學(xué)性質(zhì)和毒性，從而使其更為生物相容。
另外，這些CD-接枝的聚合物還提供提高的客體分子結(jié)合穩(wěn)定性。CD的疏水改性提供更為疏水的環(huán)糊精空洞內(nèi)部和外部，從而提高了包合復(fù)合物的穩(wěn)定性。另外，在一個(gè)聚合物主鏈中有多個(gè)CD，將增加局域CD濃度并在藥物結(jié)合上產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。因此，在結(jié)合到適當(dāng)客體藥物上以后，通過額外的疏水相互作用或離子相互作用，兩親共聚物可形成聚合物膠束。另外，這些含CD-接枝聚合物的藥物可通過胞吞作用而不是通過被動(dòng)的擴(kuò)散，被細(xì)胞吸收。
此外，CD-接枝聚合物可用于生物活性劑的受控釋放和導(dǎo)向-遞送。該聚合物很容易與適當(dāng)藥物形成特殊類型的聚合物膠束。被動(dòng)藥物的導(dǎo)向通過瞄準(zhǔn)特定細(xì)胞和器官可提高藥物效率，從而降低藥物在健康組織內(nèi)的積累和大大減少其毒性，因此如果需要的話允許給予較高劑量的藥物。在靜脈給藥以后，該聚合物膠束，據(jù)發(fā)現(xiàn)，具有持久的系統(tǒng)循環(huán)時(shí)間，因?yàn)樗鼈兂叽缧『途哂杏H水性外殼，這將大大減少被單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)(MPS)攝取的可能，還因?yàn)樗鼈兙哂休^高分子量從而防止腎臟的排泄。結(jié)合聚合物膠束的藥物在腫瘤中可累積到比采用游離藥物時(shí)更高的程度，并顯示向非標(biāo)靶區(qū)域如心臟內(nèi)分布的減少[Kwon等人，《J Control Rel》，29，17-23(1994)]。聚合物膠束在有害或發(fā)炎的組織中的積累可能是由于血管通透性的增加和淋巴引流受到損傷(通透性增加以及儲(chǔ)留(EPR)效應(yīng))造成的。EPR效應(yīng)被認(rèn)為是一種被動(dòng)導(dǎo)向方法，但藥物的導(dǎo)向可通過結(jié)合到導(dǎo)向部分如抗體或糖上，或者通過引入對(duì)溫度或pH值變化敏感的聚合物，而進(jìn)一步加強(qiáng)。導(dǎo)向膠束或pH敏感膠束可起到將藥物遞送給腫瘤、發(fā)炎組織或內(nèi)體腔室的作用，因?yàn)檫@些部位都與pH值低于正常組織的數(shù)值相聯(lián)系[Litzinger等人，《Biochim Biophys Acta》1113(20，201-27(1992)；Tannock等人，《癌癥研究》49(16)，4373-84(1989)；Helmlinger等人，《Nat Med》3(2)，177-82(1997)]。
PEG在商業(yè)上以各種分子量、低多分散性(Mw/Mn＜1.1)的產(chǎn)品供應(yīng)。根據(jù)其分子大小，可將它們主觀地劃分為低分子量PEG(Mw＜20,000)和高分子量PEG(Mw＞20,000)。PEG的最新應(yīng)用集中在將細(xì)胞毒性抗癌藥物固定在PEG上或?qū)EG接枝到蛋白、膠束或脂質(zhì)體上，這樣可降低系統(tǒng)毒性、延長(zhǎng)在體內(nèi)的停留時(shí)間、改變生物學(xué)分布和改善療效[Takakura等人，《Crit Rev Oncol，Hematol》18(3)，207-31(1995)；Duncan等人，《抗癌藥物》3(3)，175-210(1992)]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，PEG的腎清除率隨著分子量的增加而下降，靜脈給藥后最急劇的變化發(fā)生在MW＝30,000處。PEG在血液內(nèi)循環(huán)的半衰期(t1/2)也顯示伴隨和急劇的增加。例如，隨著分子量從6,000增加到50,000，PEG的t1/2從大約18min增加到16.5h。因此，抗癌藥物與分子量20,000或更高的PEG的結(jié)合可防止PEG-偶聯(lián)結(jié)合的化學(xué)物質(zhì)被迅速消除并提供被動(dòng)腫瘤積累效應(yīng)[Greenwald等人，《Crit Rev DrugCarrier Syst》17(2)，101-61(2000)]。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，羧基接枝的PEG(20,000道爾頓或25,000道爾頓，含有8～10個(gè)羧基/每個(gè)PEG分子)被用作原料與環(huán)糊精偶聯(lián)。為使空間位阻效應(yīng)維持在最低水平，讓CD部分以其空洞的小開放端(6-位)通過7個(gè)伯羥基之一連接到PEG主鏈上。另外，采用一種柔性線型連接體使CD部分與聚合物主鏈保持一定距離并讓它自由運(yùn)動(dòng)。由于本發(fā)明聚合物材料的生物相容性和聚合物的柔順性，它們所引起的毒性將最小，對(duì)周圍組織的機(jī)械刺激作用也最低。
將由含有溶解的藥物或者作為懸浮體或乳液的藥物的接枝聚合物溶液組成的劑量形式向身體給藥。關(guān)于在制劑中可加載多少藥物的唯一限制是功能之一，即，藥物加載量可增加到，直至聚合物所要求的性質(zhì)受到的不利影響達(dá)到不可接受的地步，或者直至制劑的性質(zhì)受到不利影響以致使制劑的給藥困難到不可接受的地步。一般而言，預(yù)計(jì)在大多數(shù)情況下，藥物將占到制劑重量的約0.01～50wt％，最常見約0.1％～25％。這些藥物加載量范圍不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。只要保持功能性，即使藥物加載量不在這些范圍內(nèi)，它仍屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)。
作為本發(fā)明目標(biāo)的組合物的顯著優(yōu)點(diǎn)在于接枝聚合物能提高藥物物質(zhì)的溶解度和穩(wěn)定性的能力。疏水CD和親水聚合物的組合賦予聚合物兩親的本性。就此而論，它在很大程度上起到環(huán)糊精包合和聚合物膠束體系的組合的作用。這對(duì)于疏水或水溶性較差的藥物，如環(huán)孢菌素A、藤霉素、噻喹努佛和紫杉醇的增溶來(lái)說(shuō)特別有利。
本發(fā)明組合物的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于該聚合物能提高許多藥物物質(zhì)化學(xué)穩(wěn)定性的能力。各種各樣藥物降解機(jī)理，據(jù)觀察，當(dāng)藥物在該聚合物存在時(shí)將得到抑制。例如，與相同藥物在有機(jī)助溶劑存在下的某些含水溶液相比，紫杉醇和環(huán)孢菌素A在本發(fā)明含水聚合物組合物中被顯著穩(wěn)定化。此種對(duì)紫杉醇和環(huán)孢菌素A的穩(wěn)定效應(yīng)只不過是對(duì)許多其他藥物物質(zhì)同樣也可以實(shí)現(xiàn)的效應(yīng)的一個(gè)例子而已。
加載在本發(fā)明CD-接枝聚合物上的藥物可通過各種途徑給藥，包括非經(jīng)腸、局部、經(jīng)皮、經(jīng)粘膜、吸入或插入到體腔中，例如采取經(jīng)口、陰道、頰、經(jīng)尿道、直腸、鼻子、口、肺部和耳朵給藥。
本發(fā)明適用于所有類型生物活性劑和藥物，包括核酸、激素、抗癌劑，并且它提供有效途徑遞送多肽和蛋白質(zhì)。對(duì)可采用的多肽或蛋白質(zhì)藥物的唯一限制是功能的限制問題。在某些情況下，多肽和蛋白質(zhì)藥物的功能或物理穩(wěn)定性還可以通過加入各種添加劑到多肽或蛋白質(zhì)藥物的水溶液或懸浮體中而提高。添加劑，例如，多元醇(包括糖)、氨基酸、表面活性劑、聚合物、其他蛋白和某些鹽都可使用。蛋白工程方面的發(fā)展可能提供提高多肽或蛋白固有穩(wěn)定性的可能。雖然此種設(shè)計(jì)或改性的蛋白就管制部門的定義而言可能被視為新的實(shí)體了，但這并不改變它們對(duì)本發(fā)明的適用性。
除了以肽或蛋白為基礎(chǔ)的藥物之外，其他來(lái)自所有治療和醫(yī)藥有用類別的藥物都可使用。這些藥物描述在許多著名的文獻(xiàn)中，例如，《Merck Index》、《內(nèi)科醫(yī)生必備參考》和《治療學(xué)的藥理學(xué)基礎(chǔ)》。
紫杉醇是一種二萜類天然產(chǎn)物，表現(xiàn)出令人鼓舞的抗卵巢、乳腺、頭和非小細(xì)胞肺癌的活性。最近，其用于治療乳腺癌和頑固性人體癌癥的紫杉醇形式已獲核準(zhǔn)。紫杉醇存在的主要問題之一是其水溶性極低。此種藥物的目前制劑含有30mg紫杉醇在5mL50/50 CremophoreEL(聚乙氧基化蓖麻油，一種增溶表面活性劑)和乙醇的混合物中。當(dāng)在鹽水中稀釋時(shí)，根據(jù)服用建議，紫杉醇的濃度是0.6～1.2mg/ml(0.7-1.4ml)。預(yù)料該稀溶液含有紫杉醇/Cremophor的混合“膠束”顆粒，且據(jù)報(bào)道，長(zhǎng)期貯存后物理上不穩(wěn)定，因?yàn)橄♂尩揭欢舛蕊@然將生成過飽和溶液。另外，Cremophor，一種不帶電荷的表面活性劑，據(jù)報(bào)道，能引起組胺的釋放并且與諸如嚴(yán)重過敏反應(yīng)之類的負(fù)面效應(yīng)相聯(lián)系[Sharma等人，《國(guó)際癌癥雜志》71(1)，103-7(1997)]。曾研究過環(huán)糊精衍生物是否能增溶紫杉醇的問題?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，甲基化環(huán)糊精的功效要比其他親水環(huán)糊精衍生物在改善紫杉醇的水溶性方面好得多(在50％CD濃度下，HPCD和DMCD能分別溶解約0.7和33mg/ml紫杉醇)。[Sharma等人，《藥物科學(xué)雜志》84(10)，1223-30(1995)]。然而，DMCD的毒性以及為復(fù)合治療含量的紫杉醇需要的高濃度限制了其臨床應(yīng)用。本發(fā)明CD-接枝的兩親聚合物由于制備和服用方便、毒性較低和活性劑釋放迅速和可控以及可導(dǎo)向遞送而提供相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)制劑的顯著優(yōu)點(diǎn)。
反義寡核苷酸及其類似物，例如，肽DNA(PNA)、嗎啉代-DNA、P-乙氧基DNA、甲基膦酸酯-DNA等，已證明在生物醫(yī)學(xué)研究中具有重要用途，但其在制藥方面的應(yīng)用在很大程度上一直受到穩(wěn)定性和/或溶解性，以及細(xì)胞攝取行為等方面的限制。目前尚沒有安全、完好地遞送反義寡核苷酸到體內(nèi)標(biāo)靶部位的有效手段，而這對(duì)于其中性類似物，例如，PNA、嗎啉代DNA、P-乙氧基DNA和甲基磷酸酯-DNA來(lái)說(shuō)尤其如此，因?yàn)樗鼈儾荒苡行У亟Y(jié)合到任何目前大多為聚合-陽(yáng)離子聚合物的反義寡核苷酸載體上。然而，本發(fā)明CD-接枝的兩親聚合物則可以成為中性類似物的有效載體，因?yàn)槊總€(gè)核苷單元都具有芳族堿基殘基，它們可作為潛在標(biāo)靶被環(huán)糊精包括進(jìn)去，從而使CD-接枝聚合物能夠通過CD包合機(jī)理的強(qiáng)化來(lái)結(jié)合寡核苷酸及其類似物。此種結(jié)合因在聚合物上的大量CD部分與反義寡核苷酸上的大量芳族堿基環(huán)之間的結(jié)合作用而可能變得非常牢固。另外，額外的離子相互作用(對(duì)于帶電荷的寡核苷酸來(lái)說(shuō))或疏水相互作用(對(duì)于不帶電荷的寡核苷酸類似物來(lái)說(shuō))也可增強(qiáng)反義寡核苷酸與CD-聚合物載體之間的結(jié)合。結(jié)果，最終結(jié)合的復(fù)合物可形成一種疏松或緊密，取決于其內(nèi)容物，的聚合物膠束，因此可安全地遞送反義寡核苷酸及其中性類似物到細(xì)胞中。
總之，本發(fā)明CD-接枝聚合物能通過大量CD-部分協(xié)同作用和外部疏水或離子相互作用改善藥物/結(jié)合復(fù)合物的穩(wěn)定性。很可能，包合是本發(fā)明聚合物的藥物-結(jié)合能力的主要機(jī)理。然而，離子相互作用和外部疏水相互作用(在CD空洞以外)也可能作出重要貢獻(xiàn)，取決于具體共聚物和客體的分子結(jié)構(gòu)。另外，恰當(dāng)構(gòu)造的本發(fā)明PEG-CD共聚物是優(yōu)異的紫杉醇增溶劑和安全治療用的載體。它們還可用作其他疏水藥物的增溶劑和載體。本發(fā)明CD-接枝兩親聚合物可溶于水并且是生物相容的，并具有非常慢的釋放動(dòng)力學(xué)特性，尤其當(dāng)它們含有高重量比例疏水部分時(shí)。另外，藥物/聚合物復(fù)合物的強(qiáng)結(jié)合常數(shù)造就了稀釋后被結(jié)合藥物的緩慢釋放，有時(shí)甚至需要以其他分子置換它。因此，它們可用作遞送某些水溶性藥物的口服制劑的成分。
再者，恰當(dāng)構(gòu)造的本發(fā)明CD-接枝聚合物可用來(lái)遞送反義寡核苷酸及其不帶電荷的類似物，乃至疏水肽和蛋白，因?yàn)橥獠渴杷嗷プ饔每蔀槭杷戳x寡核苷酸或疏水肽提供足夠的穩(wěn)定性。帶負(fù)電荷的寡核苷酸預(yù)計(jì)也是某些專門構(gòu)造的聚合物的良好客體分子，因?yàn)榫酆衔锏倪B接體中的堿性氮在適當(dāng)條件下能中和負(fù)電荷。
給出下面的例子旨在舉例說(shuō)明制備本發(fā)明組合物的方法和使用本發(fā)明組合物的方法。
實(shí)例1材料和方法帶有丙酸側(cè)基的PEG(PEG-10PA和PEG-8PA Mw＝～20KD，SunBio公司，Anyang市，南韓)在室溫、真空下干燥過夜。使用前，β-環(huán)糊精(TCI(美國(guó))，波特蘭，OR)在130℃和真空下干燥過夜。其他化學(xué)品來(lái)自Aldrich化學(xué)公司(密爾沃基，WI)，以原封供貨形式使用，不經(jīng)進(jìn)一步提純。在Waters系統(tǒng)上實(shí)施HPLC(高壓液相色譜)分析，系統(tǒng)配備RI檢測(cè)器和Ultrahydrogel 120和Ultrahygel 500SEC柱。1H-NMR被記錄在Varian 400MHz機(jī)上。
PECG-SS-CD(化合物2)的合成單-6-(6-氨基-3，4-二硫代-己基氨基)-6-脫氧-β-環(huán)糊精(化合物1)2，2’-二硫雙乙胺二氫氯化物(1.0g，4.44mol，F(xiàn)w＝225.2)溶解在30mL蒸餾水中，隨后加入1.0M KOH(8.88mol)和單-6-甲苯磺酰-β-環(huán)糊精(0.5g，F(xiàn)w＝1289)粉末。獲得的懸浮體在70℃油浴上攪拌過夜，隨后濃縮至約4mL?；旌衔锛虞d到Sephadex G-25柱(2.5×80cm)上，以0.1M TEA洗脫。得到約0.38g化合物1。
PEG-SS-CD(化合物2)羧基基團(tuán)接枝的PEG(2.24g，PEG-8PA，20KD，含約8個(gè)丙酸側(cè)基的聚乙二醇，平均分子量約20,000)溶解在25mL無(wú)水DMF中，混合物在冰上和氬氣保護(hù)下冷卻至0℃。向其中加入280μL三丁基胺(1.18mmol，F(xiàn)w＝185.36，d＝0.778)，隨后加入175μL氯甲酸異丁酯(IBCF，F(xiàn)w＝136.6，d＝1.053)在1mL DMF中的溶液?；旌衔镌?℃下攪拌1h。隨后，反應(yīng)混合物在室溫下慢慢加入到1.75g化合物2在100mLDMF中的溶液中。在室溫下攪拌過夜后，通過加入1mL水停止反應(yīng)?；旌衔锝?jīng)濃縮，隨后以60mL水稀釋。產(chǎn)物溶液在Sephadex G-50柱上以0.1M TEA洗脫隨后加醚沉淀以實(shí)現(xiàn)提純。1H-NMR分析指出，約5個(gè)CD部分偶聯(lián)到分子量約20,000道爾頓的PEG主鏈上。該產(chǎn)物的保留時(shí)間比原料PEG的長(zhǎng)約0.45min，根據(jù)HPLC色譜術(shù)測(cè)定[GPC柱，Rt(產(chǎn)物)＝17.33min，相比之下，Rt(PEG-8A)＝16.87min]。
1H-NMR(400MHz，D2O)δ，5.0(s，7H，H1’)，3.3-3.9(m，370H，41H-CD，329H-PEG).
實(shí)例2PEG-SS-AcCD(化合物3)的合成PEG-SS-CD(化合物2，1.0g，約5CD/20KD-PEG)在P2O5干燥器中進(jìn)行干燥，隨后與50mL無(wú)水吡啶共蒸發(fā)。殘余物在氬氣保護(hù)下溶解在30mL吡啶中，隨后加入2.0mL乙酐(Fw＝102.1，d＝1.08)中?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?日后放在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上干燥。粗產(chǎn)物通過從甲醇中反復(fù)醚沉淀達(dá)到提純。HPLC(GPC)分析顯示與原料聚合物相比，該產(chǎn)物比原料聚合物延長(zhǎng)0.46min(該產(chǎn)物Rt＝19.70min，比反應(yīng)物聚合物的Rt＝19.24min)。1H-NMR分析指出每20KD PEG含有約5個(gè)CD部分并且所有的羥基基團(tuán)都被乙?；?br> 1H-NMR(400MHz，D2O)δ，4.7-5.5(s，14H，H1’，H3’)，3.4-5.5(m，382H，35H-CD，347H-PEG)，2.05(m，20H，H-Ac).
實(shí)例3PEG-SS-DECD(化合物7)的合成PEG-SS-NH2(化合物4)羧基基團(tuán)接枝的PEG(PEG-8PA，2.6g，約2.0mmol COOH基團(tuán))溶解在30mL無(wú)水DMF中并在冰上冷卻至0℃。向其中加入三丁基胺(0.35mL，1.5mmol，F(xiàn)w＝185.36，d＝0.778)，隨后加入氯甲酸異丁酯(0.20mL，1.5mmol，F(xiàn)w＝136.6，d＝1.053)?；旌衔镌?℃下攪拌80min，然后小心地加入到2，2’-二硫雙乙胺(3.5g，F(xiàn)w＝152.2，23mmol)在50mL無(wú)水DMF中的溶液中?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?0h，在40℃、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至約20mL，隨后，在以50mL水稀釋之后向蒸餾水中透析(4×5L，26小時(shí)，Sigma D-0655，MWCO＝12,000)。透析溶液通過在40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)而濃縮，結(jié)果獲得4.1g漿。將漿溶解在10mL甲醇中，隨后通過加入80mL乙基醚使其沉淀。通過離心處理收集沉淀，并重復(fù)該沉淀過程2次。最終產(chǎn)物是白色粉末，重約2.2g。該產(chǎn)物在其HPLC(GPC)色譜中僅顯示一個(gè)完整的峰，保留時(shí)間(18.66min)比原料PEG-8PA(17.11min)長(zhǎng)約1.5min。
N-(β-環(huán)糊精-6-基)甘氨酸甲酯(化合物5)甘氨酸甲酯鹽酸鹽(1.5g，F(xiàn)w＝125.56，12mmol，Aldrich生產(chǎn))在氬氣保護(hù)下溶解在100mL無(wú)水DMF中。向其中加入DIPEA(2.1ml，12mmol，F(xiàn)w＝129.25，d＝0.724)，隨后加入6-單-甲苯磺酰環(huán)糊精粉末(3.0g，F(xiàn)w＝1289，～80％純，～1.8mmol)。
混合物在室溫下攪拌至澄清溶液。溫度慢慢升高到約70℃，隨后再攪拌4h?；旌衔镫S后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上、55℃下濃縮為漿。粗產(chǎn)物溶解在40mL熱水中，冷卻至室溫后加入～80mL丙酮而沉淀出來(lái)。過濾收集白色沉淀粉末，在真空下干燥過夜。獲得約2.3g要求的化合物5。該產(chǎn)物不經(jīng)進(jìn)一步提純直接用于下一步驟。
N-(七-2-O-乙基-6B，6C，6D，6E，6F，6G-六-O-乙基-β-環(huán)糊精-6A-基)-甘氨酸(化合物6)N-(β-環(huán)糊精-6-基)甘氨酸甲酯(化合物5，約2.0g，F(xiàn)w＝1206，～1.6mmol)溶解在15mL DMSO(二甲基亞砜)和15mL DMF(二甲基甲酰胺)中。溶液在冰浴上冷卻至0℃，隨后在氬氣保護(hù)下加入10g BaO和10g Ba(OH)2.H2O。向該白色懸浮體中慢慢加入20mL硫酸二乙酯，混合物在0℃攪拌1h，隨后在室溫下再攪拌24h。在1h時(shí)間內(nèi)再慢慢加入20mL硫酸二乙酯，隨后在室溫下再攪拌24h。在0℃，向該粘稠反應(yīng)混合物中慢慢加入60mL 5N氫氧化鈉，隨后混合物在室溫下再攪拌1h。對(duì)其以2×200mL氯仿進(jìn)行萃取。合并的有機(jī)相在用硫酸鈉干燥后濃縮至蠟狀產(chǎn)物。粗產(chǎn)物溶解在20mL甲醇中，隨后加入20mL蒸餾水。混合物在真空中過濾以除掉痕量沉淀。澄清的濾液進(jìn)行濃縮，結(jié)果獲得橙色泡沫固體(約1.8g)，它包含約50％要求的化合物6。該粗產(chǎn)物在P2O5干燥器中干燥過夜以后直接用于下一反應(yīng)中。
PEG-SS-DECD(化合物7)粗化合物6(1.4g，～0.46mmol)通過與2×20mL無(wú)水DMF共蒸發(fā)進(jìn)行干燥，隨后再溶解在20mL無(wú)水DMF中，繼而加入0.19mL三丁基胺(0.8mmol，F(xiàn)w＝185.36，d＝0.778)?；旌衔镌诒侠鋮s至0℃。向該冷溶液中慢慢加入氯甲酸異丁酯(60μL，0.46mmol，F(xiàn)w＝136.6，d＝1.053)在2mL DMF中的溶液?；旌衔镌?℃下攪拌1.5h，隨后在室溫下轉(zhuǎn)移到PEG-SS-NH2(化合物4，0.4g)在10mL無(wú)水DMF中的溶液中，隨后加入DIPEA(28μL，0.16mmol，F(xiàn)w＝129，d＝0.724)?；旌衔镌谑覝叵聰嚢柽^夜之后被濃縮為漿。漿與30mL乙基醚一起研制，從而產(chǎn)生橙色沉淀。通過過濾收集沉淀并以乙基醚洗滌。固體通過從甲醇中的醚沉淀2次而進(jìn)一步提純。獲得約0.55g淺橙色固體。1H-NMR指出該產(chǎn)物是所要求的PEG-SS-DECD產(chǎn)物，但僅有約1.5個(gè)CD部分偶聯(lián)到20KD PEG分子上并有約13個(gè)乙基基團(tuán)/每個(gè)環(huán)糊精。
1H-NMR(400MHz，D2O)δ，5.1(7H，m，H1’和H3’)，3.2-3.9(m，1041H，41H-CD，1000H-PEG)，2.78(m，30H，CH2-Et)，1.15(b，45，CH3-Et).
實(shí)例4PEG-GFLG-DECD(化合物11)的合成單-6-(N3-Boc-3-氨基-丙基氨基)-6-脫氧-β-環(huán)糊精(化合物8)單-Boc-1，3-二氨基-丙烷(3.5g，～3.0mol，按照J(rèn)ean FrancoisPons等人，《Eur.J.Org.Chem》，1998，853-859，中所描述的方法制備)通過與2.8mL(12mmol，F(xiàn)w＝185.36，d＝0.778)三丁基胺和30mL無(wú)水DMF一起共蒸發(fā)2次達(dá)到干燥。最終干燥的油與100mL無(wú)水DMF進(jìn)行混合，隨后加入DIPEA(2.1mL，12mmol，F(xiàn)w＝129，d＝0.742)。向該溶液中加入3.5g6-單-甲苯磺酰-6-O-β-環(huán)糊精?；旌衔镌谑覝叵聰嚢柚凉腆w完全溶解。隨后，混合物在70℃下、油浴中攪拌過夜。混合物在45℃、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至約10mL，隨后以100mL丙酮進(jìn)行沉淀。過濾收集白色沉淀，再以丙酮洗滌。獲得約3.2g產(chǎn)物。它含有約60％要求的化合物8，根據(jù)TLC(薄層色譜法)(Rf＝0.12，硅膠，在80∶10∶10/AcOH∶CHCl3∶H2O中展開，以5％磷鉬酸在95％乙醇中的溶液染色)估計(jì)。該產(chǎn)物直接送往下一步驟進(jìn)行乙基化。
單-(七-2-O-乙基-6B，6C，6D，6E，6F，6G-六-O-乙基-β-環(huán)糊精-6A-基)-1，3-二氨基-丙烷(化合物9)單-6-(N3-Boc-3-氨基-丙基氨基)-6-脫氧-β-環(huán)糊精(化合物8，3.0g)在0℃下溶解在40mL無(wú)水DMF和40mL DMSO中，隨后與10g氧化鋇和10mL氫氧化鋇合一水在氬氣保護(hù)下進(jìn)行混合?；旌衔锢鋮s至0℃，隨后慢慢加入20mL硫酸二乙酯?；旌衔镌?℃下攪拌6h，隨后在室溫下再攪拌2日。向反應(yīng)混合物中加入25mL冷氨，隨后在室溫下再攪拌3h。最終反應(yīng)混合物以50mL水稀釋，以3×100mL乙酸乙酯萃取。有機(jī)相以2×200mL飽和碳酸氫鈉和3×200ml水徹底洗滌，隨后以硫酸鈉干燥后進(jìn)行濃縮。在真空下干燥過夜后獲得約2.8g橙色固體。產(chǎn)物溶解在10mL三氟乙酸中。澄清溶液在室溫下攪拌3h，隨后加入15mL水?；旌衔镌谑覝叵略贁嚢?0min，隨后在45℃、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上干燥。殘余物溶解在150mL乙酸乙酯中，以3×100毫升飽和碳酸氫鈉和100mL鹽水進(jìn)行洗滌。有機(jī)相在以硫酸鈉干燥以后進(jìn)行濃縮。獲得約2.0g粗化合物9。該產(chǎn)物直接用于下一步驟的偶聯(lián)反應(yīng)中。
PEG-GFLF-DECD(化合物11)PEG-GFLG(四肽Gly-Phe-Leu-Gly接枝的PEG聚合物，化合物10，約4.5個(gè)GFLG肽在20,000D的PEG中，由PEG-8PA和GFLG肽制成)(2.0g，約0.4mmol-COOH，與30mL DMF共蒸發(fā)而干燥)在氬氣保護(hù)下溶解在30mL無(wú)水DMF和0.17mL三丁基胺(0.7mmol，F(xiàn)w＝185.36，d＝1.053)中。冷卻至0℃后，向其中加入0.078mL(0.6mmol)氯甲酸異丁酯在2mL DMF中的溶液?；旌衔镌?℃下攪拌1.5h，隨后在室溫下慢慢加入到2.0g化合物9在20mL DMF中的溶液中，隨后加入0.087mL DIPEA(0.5mmol)。混合物在室溫下攪拌過夜，濃縮至約10mL，以90mL冷乙基醚沉淀。過濾收集橙色沉淀并利用醚從甲醇中進(jìn)一步沉淀3次。最終產(chǎn)物為約2.2g。產(chǎn)物的保留時(shí)間(Rt＝18.42min)比原料PEG-GFLG聚合物(Rt＝17.76min)長(zhǎng)0.67min，按HPLC(GPC)色譜術(shù)測(cè)定。1H-NMR指出該產(chǎn)物是所要求的化合物11每20KD聚合物含有約4.5個(gè)四肽GFLG和1.8個(gè)CD部分并且每個(gè)CD部分具有約13個(gè)乙基基團(tuán)。
1H-NMR(400HMz，D2O)δ，7.20(5H，m，ArH-Phe)，5.1(2.8H，m，H1’-CD)，3.0-4.0(645H，m，41H-CD，574H-PEG，30H-Et)，1.1(15.6H，m，30H，CH3-Et)，0.9(6H，d，CH3-Leu).
實(shí)例5PEG-C3-AcCD，PEG-C3-DECD和PEG-C3-BnCD的合成單-6-(γ-氨基-丙基-氨基)-6-脫氧-β-環(huán)糊精(化合物12)單-6-甲苯磺酰-6-脫氧-環(huán)糊精(6.5g，F(xiàn)w＝1269)在室溫和劇烈攪拌下溶解在200mL無(wú)水DMF和60mL二氨基丙烷中。澄清的混合物在室溫下攪拌2h，隨后在65℃下再攪拌20h。混合物在45℃下濃縮至約20mL。在室溫下向其中加入200mL冷異丙醇。過濾收集白色沉淀。將該固體再次溶解在25mL水和25mL TEA中。在0℃下向其中慢慢加入300mL丙酮。過濾收集沉淀，并另外重復(fù)再沉淀程序2次。最終產(chǎn)物為約5.5g。它含有約80％要求的化合物12和約20％游離環(huán)糊精。產(chǎn)物不經(jīng)進(jìn)一步提純直接用于下一反應(yīng)中。
PEG-C3-CD(化合物13)單-6-(γ-氨基-丙基氨基)-6-脫氧-β-環(huán)糊精(化合物12，6.2g)采用與上面PEG-SS-CD合成中描述的同一方法偶聯(lián)到PEG-8 PA(4.1g)上。GPC提純以后獲得約4.3g純產(chǎn)物。產(chǎn)物的保留時(shí)間(17.87min)比原料PEG-8PA(17.11min)長(zhǎng)0.76min。1H-NMR指出該產(chǎn)物是所要求的化合物13，含有約4.5個(gè)CD部分每20KDPEG分子中。
1H-NMR(400HMz，D2O)δ，5.0(7H，s，H1’-CD)，3.4-3.9(412H，m，41H-CD，371H-PEG).
PEG-C3-AcCD(化合物15)PEG-C3-CD(1.0g，～4.5個(gè)CD/20KDPEG)采用與PEG-SS-AcCD制備中描述的同一方法進(jìn)行乙酰化。獲得約1.0g產(chǎn)物，其保留時(shí)間(17.99min)比原料聚合物(PEG-C3-CD，17.87min)僅長(zhǎng)約7.2s。然而，1H-NMR指出該產(chǎn)物是所要求的化合物15，該聚合物含有約4.5個(gè)CD部分每20KD PEG分子并且在側(cè)鏈CD上的羥基有約90％被乙?；?br> 1H-NMR(D2O)δ，4.9-5.4(14H，m，H1’-CD和H3’-CD)，3.2-4.5(m，490H，35H-CD，455 H-PEG)，2.03(d，64H，CH3CO-).
PEG-C3-BnCD(化合物16)PEG-C3-CD(化合物13，0.9g，～4.5個(gè)CD/20KD PEG)通過與20mL無(wú)水吡啶共蒸發(fā)而干燥，隨后在氬氣保護(hù)下再次溶解在30mL吡啶中。在室溫下(反應(yīng)溫度升高時(shí)用冰冷卻)，向其中慢慢加入3mL丁酰氯(Fw＝106.55，d＝1.026)?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?h后，加入甲醇(5.0mL)，隨后在室溫下再攪拌30min?；旌衔镌谛D(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至蠟狀固體。該固體溶解在20mL甲醇中并以20mL水稀釋。澄清溶液向2×5L20％異丙醇/水中進(jìn)行透析。不透明的透析溶液在室溫下、Speed-Vac中進(jìn)行濃縮。顆粒利用醚從甲醇中進(jìn)一步沉淀3次。產(chǎn)物實(shí)際不溶于水，但非常容易溶解在甲醇和氯仿中。收率＝90％。1H-NMR指出產(chǎn)物是要求的化合物16側(cè)鏈環(huán)糊精上的羥基基團(tuán)中約80％被丁酰化。
1H-NMR(CDCl3)δ，4.6-5.3(14H，m，H1’and H3’)，3.2-4.5(m，541，35H-CD，486H-PEG)，2.30(m，36H，CH3CH2CH2CO-，1.65(m，36H，CH3CH2CH2CO-)，0.95(m，54H，CH3CH2CH2CO-).
實(shí)例6PEG-L8-AcCD和PEG-L8-DECD的合成單-6-(8-氨基-3，6-二氧基-辛基氨基)-6-脫氧-β-環(huán)糊精(化合物17)在500mL圓底燒瓶中、氬氣保護(hù)下加入2，2’-(亞乙基二氧基)雙(乙基胺)(300mL，F(xiàn)w＝148)和單-6-甲苯磺酰-β-環(huán)糊精(24.4g，F(xiàn)w＝1269，在P2O5干燥器中干燥過夜)。懸浮體在室溫下攪拌至所有固體完全溶解(～1.0h)。混合物在75℃下再攪拌4h。反應(yīng)混合物慢慢倒入到1.8L冷異丙醇中。過濾收集沉淀并以異丙醇洗滌。沉淀溶解在200mL溫水(50℃)中，隨后在攪拌下慢慢倒入到1.8L冰冷的異丙醇中。冷卻至-20℃后，過濾收集沉淀。該異丙醇沉淀過程再重復(fù)2次。獲得約24g白色粉末。HPLC分析(GPC，以0.1M硝酸鈉洗脫)顯示，產(chǎn)物含有約85％要求的化合物(Rt＝39.21min)和約15％未改性的β-CD(Rt＝32.25min)，未檢測(cè)到游離二胺反應(yīng)物。于是，該產(chǎn)物被直接用于下一偶聯(lián)步驟中。
1H-NMR(400HMz，D2O)δ，4.97(7H，m，H1’)，3.7-3.9(26H，m，7H3’，7H5’，6H6’，6H6”)，3.3-3.6(24H，m，7H2/，7H4’，1H6’，1H6”，8H-連接體)，2.71(4H，m，CH2N-連接體).
PEG-L8-CD(化合物18)PEG-8PA(4.0g，約8-COOH/PEG--20K，約1.7mmol COOH，在P2O5干燥器中干燥過夜并與50mL無(wú)水DMF共蒸發(fā))溶解在50mL無(wú)水DMF和0.54mL三丁基胺(TBA，F(xiàn)w＝185.36，d＝0.778，2.27mmol)中。澄清的混合物在冰上冷卻，隨后在0℃下加入0.29mL氯甲酸異丁酯(IBCF，F(xiàn)w＝136.6，d＝1.053，2.2mmol)。混合物在0℃下再攪拌1h，隨后在室溫下慢慢加入到單-6-(8-氨基-3，6-二氧基-辛基氨基)-6-脫氧-β-環(huán)糊精(化合物17，5.0g，F(xiàn)w＝1336，～80％純，～2，6mmol，在P2O5干燥器中干燥過夜)在50mL無(wú)水DMF中的溶液中。攪拌過夜后，混合物在50℃、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至約20mL?；旌衔镆?0mL水稀釋并在Sephadex-G-50柱(2.5×80cm，以0.1M TEAA洗脫，pH＝10.0，收集到8mL/mL)上提純。各個(gè)級(jí)分用GPC-HPLC分析，聚合物級(jí)分合并分成2部分部分A級(jí)分9～30；部分B級(jí)分31～35。
兩部分都在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮為蠟狀固體，隨后再溶解在15mL甲醇中。產(chǎn)物用5mL TEA和120mL乙基醚沉淀。過濾收集白色沉淀。部分A和部分B分別重4.7g和0.55g。1H-NMR分析確認(rèn)兩部分都是要求的產(chǎn)物PEG-L8-CD產(chǎn)物，但區(qū)別在于環(huán)糊精加載量不同部分A和部分B，平均每20KD-PEG聚合物，分別含有約5.5和8.5個(gè)環(huán)糊精部分。
1H-NMR(400MHz，D2O)δ，部分A5.0(s，7H，H1’)，3.3-3.9(382H，m，41H-CD，12H連接體，329H-PEG；部分B5.0(s，7H，H1’)，3.3-3.9(256H，m，41H-CD，12H連接體，203H-PEG).
PEG-L8-AcCD(化合物19)PEG-L8-CD(化合物18，1.0g，約5.5CD/20KD PEG，在P2O5干燥器中干燥過夜)通過與40mL無(wú)水吡啶共蒸發(fā)達(dá)到干燥，隨后在氬氣保護(hù)下再溶解在40mL無(wú)水吡啶中。向其中加入3.0mL乙酐?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?日，在45℃、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至約10mL。向其中慢慢加入90mL乙基醚。過濾收集沉淀。產(chǎn)物通過再?gòu)募状贾羞M(jìn)行3次醚沉淀達(dá)到進(jìn)一步提純。最終白色粉末在真空下干燥，稱重結(jié)果為1.07g。1H-NMR確認(rèn)，產(chǎn)物是要求的產(chǎn)物19每20KD PEG含有約5.5個(gè)CD部分，并且聚合物的側(cè)鏈CD部分上的羥基基團(tuán)中約90％被乙?；?。
1H-NMR(D2O)δ，4.9-5.4(14H，m，H1’-CD和H3’-CD)，3.2-4.5(m，422H，34H-CD，12H-連接體，376H-PEG)，2.03(d，64H，CH3CO-).
PEG-L8-DECD(化合物20)PEG-L8-CD(化合物18，1.0g，約5.5個(gè)CD/20KD PEG，在P2O5干燥器中干燥過夜)溶解在5mL無(wú)水DMSO和5mL無(wú)水DMF中，溶液在氬氣保護(hù)下在冰上冷卻至0℃。向其中加入0.75g氧化鋇和0.75g氫氧化鋇合一水粉末，緊接著在1h時(shí)間內(nèi)分3份加入3mL硫酸二乙酯。懸浮體在0℃下攪拌2h，隨后在4℃再攪拌2日。隨后在0℃下加入80mL冷乙基醚，隨后在0℃下再攪拌30min。過濾收集橙色沉淀并溶解在50mL50％甲醇/水中?；旌衔锵?L 0.01N HCl，隨后向2×5L水中進(jìn)行透析。最終透析溶液進(jìn)行濃縮，獲得約1g蠟狀產(chǎn)物。將其通過從甲醇中進(jìn)行2次醚沉淀達(dá)到進(jìn)一步提純。1H-NMR分析指出，每20KD-PEG中有約4個(gè)CD，且每個(gè)CD部分帶有約11個(gè)乙基基團(tuán)。這就是說(shuō)，約30％CD部分在烷基化過程中從PEG主鏈上脫除。
1H-NMR(400HMz，D2O)δ，4.9-5.3(7H，m，H1’-CD)，3.1-4.0(540H，m，41H-CD，469H-PEG，8H-連接體，22H-CH2-乙基)，1.2(33H，m，CH3-乙基)按照實(shí)例1～6和圖4～8制備了13種代表性環(huán)糊精-接枝的PEG聚合物(表1)，其中連接體為可生物降解的(X＝-SS-或-GFLG-)或者非可生物降解的(-C3-或-L8-)。側(cè)基環(huán)糊精部分或者是天然的β-CD(PEG-X-CD)或者是以疏水基團(tuán)改性的，包括乙基(PEG-X-DECD)、乙?；?PEG-X-AcCD)或丁?；?PEG-C3-BnCD)。用GPC-HPLC來(lái)監(jiān)測(cè)制備過程的每一步驟，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有的最終產(chǎn)物都具有比對(duì)應(yīng)PEG前體長(zhǎng)的保留時(shí)間。所有產(chǎn)物聚合物的結(jié)構(gòu)都用1H-NMR分析加以確認(rèn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們的CD含量從平均1.5個(gè)CD到8.5個(gè)CD每20KD PEG主鏈不等(表2)。它們?nèi)几叨热芙庠诖蠖鄶?shù)有機(jī)溶劑(氯仿、甲醇、乙醇等)中。它們也高度溶于水，但PEG-C3-BnCD除外。
表2.某些環(huán)糊精接枝的PEG共聚物的結(jié)構(gòu)特征聚合物名稱 tRCD數(shù) CDs/ CD改性**(min*) 20Kd聚合物**PEG-ss-CD 19.34 3.9 無(wú)PEG-ss-AcCD 19.24 3.9 ～100％乙?；疨EG-C3-CD 18.07 4.8 無(wú)PEG-C3-AcCD 17.86 4.8 ～80％乙?；疨EG-L8-CD(A)18.12 4.6 無(wú)PEG-L8-AcCD(A) 17.98 4.6 ～95％乙酰化PEG-L8-CD(B)18.43 5.9 無(wú)PEG-L8-AcCD(B) 18.08 5.9 ～84％乙?；疨EG-L8-CD(C)18.71 5.4 無(wú)PEG-L8-AcCD(C) 18.53 5.4 ～100％乙?；疨EG-GFLG-DECD 2.5～67％乙基化PEG-L8-DECD 18.0 3.9 ～67％乙基化PEG-C3-BnCD4.5 ～80％丁?；?Waters Ultrahydrogel GPC柱(120和500)，以0.1M硝酸鈉洗脫；**按照在Varian 400HMz上記錄的1H-NMR圖譜計(jì)算；
實(shí)例7紫杉醇與CD聚合物或CD單體的復(fù)合物的制備(A)共-溶解方法該方法適合所有與水溶性聚合物的復(fù)合物聚合物(或單體對(duì)照)的水溶液(一般約100mg/mL)與等體積(一般40～2000μL)紫杉醇溶液(C紫杉醇＝0.1～8.0mg/ml，甲醇中)進(jìn)行混合?；旌衔镌谑覝叵路趸s半小時(shí)。隨后，在室溫下、離心濃縮機(jī)中除掉溶劑。濃縮的漿或蠟狀固體通過加入水或PBS緩沖液而再生成原來(lái)的體積。經(jīng)過30min再生以后，混合物通常是澄清或略微渾濁的溶液。未溶解的紫杉醇顆粒采用超濾(0.2μm濾材)或離心(20min，20,800g和室溫)除掉。上層清液中的紫杉醇濃度根據(jù)以對(duì)應(yīng)環(huán)糊精聚合物溶液作為背景標(biāo)定在290nm的紫外吸收率進(jìn)行定量。
(B)透析方法該方法適合制備所有紫杉醇/聚合物復(fù)合物溶液聚合物的甲醇溶液(一般約100mg/mL)與等體積(一般100μL)紫杉醇溶液(1～3mg/ml，甲醇中)進(jìn)行混合。澄清的混合物在室溫下孵化約半小時(shí)。隨后，在室溫下向2L水中透析(MWCO＝12,000)過夜。透析溶液一般為澄清溶液。痕量紫杉醇顆粒通過超濾(0.2μm濾材)或離心(20min，20,800g和室溫)除掉。澄清溶液貯存在4℃或更低的溫度下。
實(shí)例8反義寡核苷酸/CD-聚合物復(fù)合物的制備環(huán)糊精PEG聚合物(50mg/ml)與一定數(shù)量21-聚體-熒光標(biāo)記的寡核苷酸在20mM Tris-HCl緩沖液(pH＝7.4)中進(jìn)行混合。溶液在Speed-Vac中干燥，隨后采用相同數(shù)量水再生。溶液形式的DNA/聚合物復(fù)合物采用1％瓊脂糖凝膠在pH＝7.4的TAE緩沖液中進(jìn)行分析。
表3.紫杉醇或寡核苷酸用某些該共聚物和用其他現(xiàn)有CD衍生物承載之間的比較聚合物 CD部分/ 紫杉醇加載量寡核苷酸承載聚合物(mg/50mg聚合物*) (mg/50mg聚合物*)PEG-ss-CD3.9 ＜0.05ND**PEG-ss-AcCD 3.9 0.8 NDPEG-C3-CD4.8 ＜0.05NDPEG-C3-AcCD 4.8 ～2.0 NDPEG-L8-CD(A) 4.6 ＜0.05NDPEG-L8-AcCD(A) 4.6 ～2.6 NDPEG-L8-CD(B) 5.9 ＜0.05NDPEG-L8-AcCD(B) 5.9 ～2.9 NDPEG-ss-DECD 1.5 0.4 ～0.06PEG-GFLG-DECD2.5 3.0 ～0.2PEG-C3-DECD 2.6 ＜1.0 ～0.15PEG-L8-DECD 3.9 ＜1.0 ～0.2對(duì)照樣HP-CD(來(lái)自Sigma) ＜0.05(SBE)7-CD(來(lái)自Cydex) ＜0.05DM-CD(來(lái)自Sigma) ～0.2(第1天)EP-CD(來(lái)自Sigma) ＜0.05*在1.0mL水或PBS中的藥物量，在50mg聚合物或其他CD衍生物存在下。
**未檢測(cè)到。
實(shí)例9紫杉醇/CD復(fù)合物在50％血清中的或以PBS稀釋到10倍以后的穩(wěn)定性(A)在50％胎牛血清中的穩(wěn)定性紫杉醇/PEG-L8-AcCD(2.0mg/50mg在1.0mL PBS緩沖液中)或紫杉醇/DMCD(0.5mg/50mg在1.0mL PBS緩沖液中)復(fù)合物溶液按照實(shí)例7的方法A中所描述的那些制備。50μL復(fù)合物溶液分別以等體積胎牛血清稀釋。兩種混合物分別在室溫下孵化2h、21h、49h和144h后，在室溫下以20,8000g進(jìn)行離心分離。每種上層清液中的紫杉醇濃度通過測(cè)定在230nm的紫外吸收率加以定量。
(B)以PBS稀釋到10倍以后的穩(wěn)定性紫杉醇/PEG-L8-AcCD(2.0mg/50mg在1.0mL PBS緩沖液中)或紫杉醇/DMCD(0.5mg/50mg在1.0mL PBS緩沖液中)復(fù)合物溶液按照實(shí)例10中所描述的那些制備。50μL復(fù)合物溶液分別以450μL PBS緩沖液稀釋。兩種混合物分別在室溫下孵化2h、21h、49h和144h后，在室溫下以20,8000g進(jìn)行離心分離。每種上層清液中的紫杉醇濃度通過測(cè)定在230nm的紫外吸收率加以定量。
表4.紫杉醇/PEG-L8-AcCD和紫杉醇/DMCD復(fù)合物在50％血清中的或以PSBS稀釋后的穩(wěn)定性試驗(yàn)一覽表

實(shí)例10紫杉醇從紫杉醇/PEG-L8-AcCD和紫杉醇/DMCD復(fù)合物的釋放以及游離共聚物的細(xì)胞毒性游離紫杉醇從紫杉醇/PEG-L8-AcCD復(fù)合物的有效釋放由該復(fù)合物的細(xì)胞毒性得到證實(shí)。紫杉醇/PEG-L8-AcCD復(fù)合物制劑(本發(fā)明)和目前市售供應(yīng)的紫杉醇/Cremophor制劑(紫杉醇，Bristol-MyersSquibb)這兩種復(fù)合物，在所有3種試驗(yàn)的細(xì)胞系中按照下面描述的改進(jìn)的MTT檢驗(yàn)法進(jìn)行了測(cè)定，獲得相近的IC50值。但是，單獨(dú)PEG-L8-AcCD自己在最高試驗(yàn)濃度下都顯示不出可檢測(cè)的細(xì)胞毒性，而cremophor則在約0.5mg/ml(表5)濃度下殺死了一半細(xì)胞1.將細(xì)胞按照約5,000細(xì)胞/孔鋪在96-孔板上的每孔0.1mL的培養(yǎng)基中，并在37℃下孵育24h；2.除掉舊培養(yǎng)基并在每孔中加入新鮮培養(yǎng)基80μL；3.在每個(gè)孔中加入20μL樣品溶液(按5倍系列稀釋，每種樣品至少8種濃度)；4.細(xì)胞孵育3或4日；5.除掉培養(yǎng)基。加入80μL新鮮培養(yǎng)基連同20μLMTS溶液(Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent #G358A)。在37℃孵育2～4h；6.讀取在490nm的吸光度；7.計(jì)算IC50，以無(wú)細(xì)胞孔作為空白對(duì)照樣，無(wú)藥物孔作為100％存活對(duì)照樣。
表5.不同紫杉醇制劑和載體對(duì)照樣在3種不同細(xì)胞系中的IC50*比較制劑IC50(ng/ml)HelaHT1080 MCF7紫杉醇/PEG-L8-AcCD 3.0 2.0 2.0紫杉醇/Cremophor 3.0 4.0 2.0Cremophor500,000 500,000 500,000PEG-L8-AcCD ＞10,000,000＞10,000,000＞10,000,000*按照改進(jìn)的MTT檢驗(yàn)法評(píng)估50％細(xì)胞存活率的濃度實(shí)例11共聚物及其可能的生物降解產(chǎn)物的溶血活性為進(jìn)一步考察本發(fā)明聚合物及其可能的生物降解產(chǎn)物的細(xì)胞毒性，與市售CD單體對(duì)照，就各自對(duì)新鮮人血細(xì)胞的溶血作用進(jìn)行了試驗(yàn)。溶血程度以占蒸餾水中血紅蛋白的總流出量的百分?jǐn)?shù)給出(表6)。
1.通過以1000g離心10min從全血中離析出紅血細(xì)胞。
2.除掉血漿，將紅血細(xì)胞再懸浮于通常的緩沖鹽水中(PBS，0.154M氯化鈉和0.01M磷酸鹽，pH＝7.4)。通過離心(1000g，10min)使紅血細(xì)胞成丸粒狀。
3.重復(fù)步驟2兩次，以除掉從損壞的細(xì)胞釋放的血紅素。
4.以PBS將最終丸粒稀釋成為約12(或5％)，按離心沉降測(cè)定，的紅細(xì)胞比容。
5.在37℃PBS緩沖液中平衡的、2mL從0到50mg/ml的在PBS緩沖液中系列濃度的聚合物或環(huán)糊精溶液在37℃進(jìn)行平衡。向其中加入100μL紅血細(xì)胞懸浮體，隨后通過緩緩倒置來(lái)混合樣品。樣品在37℃下孵育30min。
6.完整細(xì)胞和細(xì)胞碎片通過以1000g離心5min來(lái)成粒。上層清液用分光光度計(jì)在543nm分析的數(shù)值作為血紅素釋放量。
表6.不同PEG-CD聚合物及其前體單體與市售CD衍生物的溶血活性比較。
成分或 溶血CD單體 (HC50.mM)PEG-L8-AcCD NDPEG-L8-DECD NDPEG-L8-CDNDCD-L8-NH225(SBE)7-CD NDDM-CD1.0βCD 4.0HPβCD 35以上數(shù)據(jù)顯示，本發(fā)明新型PEG-CD聚合物具有作為紫杉醇的安全藥物載體的巨大潛力(表3，表4，表5和表6)。在50mg/ml聚合物存在下，紫杉醇能夠在水中溶解至少達(dá)2.2mg/ml的濃度，這相當(dāng)于游離紫杉醇在水中溶解度的10,000倍以上，且比羥丙基-β-環(huán)糊精(HPCD)和甲基-β-環(huán)糊精(DMCD)在近似條件下[Sharma等人，《藥物科學(xué)雜志》84(10)，1223-30(1995)]分別至少好1000倍和20倍。溶解度的急劇增加可能是由于至少以下3個(gè)因素的組合1)CD部分的局部濃度提高；2)借助協(xié)同作用使結(jié)合常數(shù)增加，紫杉醇的結(jié)構(gòu)具有三個(gè)苯基基團(tuán)圍繞著大的稠合、萜環(huán)體系；以及3)在CD空洞外面的額外疏水相互作用。
正如所料，偶聯(lián)到PEG聚合物上以后，β-環(huán)糊精的毒性明顯降低。從所有具有環(huán)糊精側(cè)鏈的PEG聚合物都未檢測(cè)到細(xì)胞毒性，正如MTT和溶血檢驗(yàn)所指出的(表5和表6)。即便是單體(結(jié)構(gòu)單元)，其毒性也比天然β-環(huán)糊精小得多。另一方面，由于CD部分在本發(fā)明共聚物中的重量比才不到25％，按照1H-NMR測(cè)定，在我們的實(shí)驗(yàn)濃度中(50mg共聚物/ml水)的實(shí)際CD濃度小于12.5mg/ml。換句話說(shuō)，環(huán)糊精紫杉醇的重量比，在本發(fā)明聚合物復(fù)合物中小于6∶1。因此，具有非生物降解連接體的該共聚物是具有非常高效的藥物釋放特性、非常安全的藥物載體(表5)。另外，可生物降解連接體也可接受，如果需要加速藥物釋放的話。
給出上面的實(shí)例的目的僅在于舉例說(shuō)明，不應(yīng)視為以任何方式構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明化合物和方法的各種修改方案可在不偏離本發(fā)明精神和范圍的條件下仍可制定出來(lái)，要知道本發(fā)明唯一地由所附權(quán)利要求規(guī)定。
權(quán)利要求
1.一種具有通式1的環(huán)糊精接枝生物相容聚合物 其中P是一種生物相容親水聚合物主鏈，分子量介于2,000～1,000,000道爾頓；R’是氫或?qū)虿糠?；X是連接體，具有通式-Q-Z-Q’-其中Q以共價(jià)鍵鍵合在親水聚合物鏈上，或者直接地或者借助烷基側(cè)基或其他官能團(tuán)，且Q’以共價(jià)鍵鍵合在環(huán)糊精的2、3或6位上從而分別置換OR1、OR2或OR3基團(tuán)；Q和Q’獨(dú)立地選自NR4、S、O、CO、CONH和COO；Z是選自亞烷基二硫醚[-(CH2)aS-S(CH2)a-]、亞烷基[-(CH2)a]-]、氧化烯(-[(CH2)aO]b(CH2)a-)或短鏈肽當(dāng)中的一種，其中a是1～10的整數(shù)，b是1～20的整數(shù)；R1、R2、R3和R4獨(dú)立地選自H、烷基(Cn’H2n’+1)、鏈烯基(Cn’+1H2(n’+1)-1)或酰基(Cn’H2n’+1CO)，其中n’是1～16的整數(shù)；q是5、6或7的整數(shù)；w是使每個(gè)聚合物主鏈含有1.5～30個(gè)環(huán)糊精部分/20KD聚合物主鏈的整數(shù)。
2.權(quán)利要求1的環(huán)糊精接枝生物相容聚合物，其中該生物相容聚合物選自聚乙二醇(PEG)、N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺聚合物(HPMA)、聚乙烯亞胺(PEI)、聚賴氨酸、其衍生物及其聚合物。
3.權(quán)利要求2的環(huán)糊精接枝生物相容聚合物，其中每個(gè)聚合物主鏈包含2～15個(gè)環(huán)糊精部分/20KD聚合物主鏈。
4.權(quán)利要求3的環(huán)糊精接枝生物相容聚合物，其中生物相容聚合物的分子量介于約5,000～70,000。
5.一種具有通式2的環(huán)糊精接枝生物相容聚合物 其中R’是氫或?qū)虿糠?；X是連接體，具有通式-Q-Z-Q’-其中Q以共價(jià)鍵鍵合在親水聚合物鏈上，或者直接地或者借助烷基側(cè)基或其他官能團(tuán)，且Q’以共價(jià)鍵鍵合在環(huán)糊精的2、3或6位上從而分別置換OR1、OR2或OR3基團(tuán)；Q和Q’獨(dú)立地選自NR4、S、O、CO、CONH和COO；Z是選自亞烷基二硫醚[-(CH2)aS-S(CH2)a-]、亞烷基[-(CH2)a]-]、氧化烯(-[(CH2)aO]b(CH2)a-)或短鏈肽當(dāng)中的一種，其中a是1～10的整數(shù)，b是1～20的整數(shù)；R1、R2、R3和R4獨(dú)立地選自H、烷基(Cn’H2n’+1)、鏈烯基(Cn’+1H2(n’+1)-1)或?；?Cn’H2n’+1CO)，其中n’是1～16的整數(shù)；q是5、6或7的整數(shù)；w是提供2～15個(gè)環(huán)糊精單元/20KD PEG主鏈的整數(shù)，且m和n是滿足下列條件的整數(shù)當(dāng)與w組合時(shí)，它們代表其分子量介于5,000～70,000的聚環(huán)氧乙烷聚合物鏈，條件是生物相容聚合物主鏈上的含由w代表的接枝環(huán)糊精單元的單體單元不一定要前后銜接，而是可以無(wú)規(guī)或均勻地沿聚合物主鏈分布。
6.一種具有通式3的環(huán)糊精接枝生物相容聚合物 其中R’是氫或?qū)虿糠?；Q以共價(jià)鍵鍵合在親水聚合物鏈上，或者直接地或者借助烷基側(cè)基或其他官能團(tuán)，且Q’以共價(jià)鍵鍵合在環(huán)糊精的2、3或6位上從而分別置換OR1、OR2或OR3基團(tuán)；Q和Q’獨(dú)立地選自NR4、S、O、CO、CONH和COO；Z是選自亞烷基二硫醚[-(CH2)aS-S(CH2)a-]、亞烷基[-(CH2)a]-]、氧化烯(-[(CH2)aO]b(CH2)a-)或短鏈肽當(dāng)中的一種，其中a是1～10的整數(shù)，b是1～20的整數(shù)；R1、R2、R3和R4獨(dú)立地選自H、烷基(Cn’H2n’+1)、鏈烯基(Cn’+1H2(n’+1)-1)或酰基(Cn’H2n’+1CO)，其中n’是1～16的整數(shù)；q是5、6或7的整數(shù)；w是提供2～15個(gè)環(huán)糊精單元/20KD PEG主鏈的整數(shù)，且m和n是滿足下列條件的整數(shù)當(dāng)與w組合時(shí)，它們代表其分子量介于5,000～70,000的聚環(huán)氧乙烷聚合物鏈，條件是親水聚合物鏈上的含由w代表的環(huán)糊精單元的單體單元不一定要前后銜接，而是可以無(wú)規(guī)或均勻地沿聚合物鏈分布。
7.權(quán)利要求4～6之一的環(huán)糊精接枝生物相容聚合物，其中Q是C(O)NH，Q’是NR4且a是2。
8.權(quán)利要求4～6之一的環(huán)糊精接枝生物相容聚合物，其中Z是-(CH2)2S-S(CH2)2-；R4是C2H5，R1是C2H5；R2是H并且R3是C2H5。
9.含有權(quán)利要求1～6之一的環(huán)糊精接枝生物相容聚合物，和活性劑的組合物。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中活性劑是疏水藥物、蛋白或肽類藥物、核酸或寡核苷酸。
11.權(quán)利要求11的組合物，其中活性劑是紫杉醇。
全文摘要
公開一種兩親生物相容環(huán)糊精接枝的聚合物，含有疏水改性的環(huán)糊精部分、線型連接體和生物相容親水聚合物鏈，其中所述環(huán)糊精部分借助所述連接體接枝到所述生物相容親水聚合物主鏈上。本發(fā)明環(huán)糊精－接枝的聚合物可用作生物活性劑的載體。公開此種環(huán)糊精－接枝的生物相容聚合物的制備和使用方法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1617890SQ02827707
公開日2005年5月18日 申請(qǐng)日期2002年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月30日
發(fā)明者L·王, D·E·魯夫納 申請(qǐng)人:真塔薩盧斯有限責(zé)任公司