專利名稱：新型肽及其藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有用Ser-Ser-Ser-Arg表示的氨基酸序列的新型肽、以同一肽為有效成分的藥物組合物、及以含有用Ser-Ser-Ser-Arg表示的氨基酸序列的肽與含有用Phe-Gly-Leu-Met-NH2表示的氨基酸序列的肽為有效成分的角膜疾病治療劑或皮膚創(chuàng)傷愈合促進(jìn)劑。
背景技術(shù)：
角膜是直徑約1cm、厚度約1mm的透明無血管的組織。角膜的透明性對(duì)視覺功能有很重要的影響，角膜的各種生理生化現(xiàn)象主要是以維持角膜透明性為目的的功能。
對(duì)于由角膜潰瘍、角膜上皮剝離、角膜炎或干眼癥等各種疾病引起的角膜上皮缺損，如果未并發(fā)混合感染，則能夠自然修復(fù)。但是，如果因某種原因?qū)е滦迯?fù)延遲，或沒有進(jìn)行修復(fù)，導(dǎo)致上皮缺損加重，則不僅對(duì)上皮的正常結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不良影響，而且能損傷至實(shí)質(zhì)或內(nèi)皮的結(jié)構(gòu)或功能。現(xiàn)有治療方法的原理為保護(hù)角膜表面免受外界刺激從而使上皮自然伸展，以便再覆蓋缺損部，為被動(dòng)性方法。近年來，隨著細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，逐漸明確了與細(xì)胞分裂·移動(dòng)·粘合·伸展等有關(guān)的因子，有報(bào)道稱在角膜上皮缺損的修復(fù)中，促進(jìn)角膜上皮伸展的化合物起著重要的作用(臨眼，46，738-743(1992)，眼科手術(shù)，5，719-727(1992))。
胰島素樣生長(zhǎng)因子與表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子等同樣是調(diào)節(jié)正常人體細(xì)胞生長(zhǎng)的生長(zhǎng)因子之一，其中，包括胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(以下稱為“IGF-I”)和胰島素樣生長(zhǎng)因子-II(以下稱為“IGF-II)。最近也有報(bào)道稱IGF-I能夠刺激甲狀腺細(xì)胞增殖(J.Biol.Chem.，264，18485～18488(1989))以及IGF-II能夠調(diào)節(jié)肌肉的生長(zhǎng)或分化(Hum.Mol.Genet.，3，1117～1121(1994))等。在眼科領(lǐng)域內(nèi)，IGF-I、IGF-II及其功能性衍生物促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)元的生存(特表平7-500839號(hào)公報(bào))，IGF-II對(duì)以角膜移植時(shí)的損傷為代表的廣范圍的所有損傷的治療有效(特開昭63-233925號(hào)公報(bào))，通過使用含有上述生長(zhǎng)因子的溶液，即使在低溫狀態(tài)下，也能夠使用于移植的角膜等眼組織保持新鮮的組織狀態(tài)(特開平5-25001號(hào)公報(bào)、特開平6-48901號(hào)公報(bào))。而且，也公開了通常含有生長(zhǎng)因子的凝膠配合物對(duì)前眼部為代表的創(chuàng)傷愈合有效(特開平2-112號(hào)公報(bào))的內(nèi)容。
另一方面，P物質(zhì)是由顯示血管擴(kuò)張、平滑肌收縮、促進(jìn)唾液腺分泌、利尿作用等的11個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽。對(duì)于P物質(zhì)而言，在眼科領(lǐng)域內(nèi)，也公開了其對(duì)眼科疾病中結(jié)膜杯狀細(xì)胞異常分泌的改善作用(國(guó)際專利WO95/13087號(hào)公開公報(bào))，報(bào)道了角膜炎等炎癥時(shí)P物質(zhì)的動(dòng)態(tài)(日本眼科學(xué)會(huì)雜志，91，982～987(1987)、日本眼科學(xué)會(huì)雜志，92，448～452(1988))等，進(jìn)行了各種研究。另外，在特開平10-17489號(hào)公報(bào)中記載了如下內(nèi)容如果將作為P物質(zhì)C末端側(cè)的四肽的Phe-Gly-Leu-Met-NH2(以下稱為“FGLM”)與IGF-I并用，則能夠促進(jìn)角膜上皮的創(chuàng)傷愈合，且FGLM是表現(xiàn)出這一作用的P物質(zhì)的肽段的最小單元。但是，IGF-I是由70個(gè)單氨基酸鍵合而成的多肽，IGF-I的哪一個(gè)氨基酸序列部位有助于表現(xiàn)出這一效果并未完全明確。
皮膚創(chuàng)傷為裂傷、擦傷、外科手術(shù)的切開創(chuàng)口、皮膚潰瘍、燒傷等表皮組織的損傷。這些皮膚創(chuàng)傷的治療通常為在對(duì)受傷部位實(shí)施應(yīng)急處理后，憑借生物體自身的恢復(fù)力來自然愈合，在這類自然愈合中，到恢復(fù)為止需要很長(zhǎng)時(shí)間，另外，由于疼痛也在持續(xù)，因此希望通過對(duì)受傷部位給予創(chuàng)傷治療劑等方式積極地促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。
創(chuàng)傷的愈合過程中，通過細(xì)胞的移動(dòng)或增殖，形成新的上皮組織或結(jié)締組織，因此與創(chuàng)傷愈合有關(guān)的促進(jìn)或刺激細(xì)胞移動(dòng)·分化·增殖的藥劑能夠成為創(chuàng)傷治療劑。作為此類創(chuàng)傷治療劑，已知有氯化溶菌酶、素高捷療眼膏(Solcoceryl)等。
但是，現(xiàn)有的創(chuàng)傷治療劑對(duì)創(chuàng)傷愈合的促進(jìn)作用不夠充分，存在無法在短期內(nèi)治愈創(chuàng)傷的問題。存在上述問題的原因在于這些創(chuàng)傷治療劑對(duì)作為創(chuàng)傷愈合過程中的重要因素的表皮再覆蓋、膠原合成、末梢循環(huán)改善、肉芽形成、血管形成等的作用小。
然而，還沒有與IGF-I的最小活性表達(dá)單元有關(guān)的報(bào)道，也沒有與由用Ser-Ser-Ser-Arg表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽有關(guān)的報(bào)道。另外，也沒有說明將含有用Ser-Ser-Ser-Arg表示的氨基酸酸序列的肽與含有用Phe-Gly-Leu-Met-NH2表示的氨基酸序列的肽并用對(duì)角膜損害的作用或?qū)ζつw疾病的作用。
通常情況下，如果將由多種氨基酸構(gòu)成的肽給予生物體，則經(jīng)代謝等作用容易將肽鍵切斷，另外，在為了作為藥物使用而進(jìn)行制劑的階段，容易發(fā)生分解。因此，雖然希望肽鏈盡可能短，但是必須維持藥理活性，因此尋找長(zhǎng)鏈肽的最小活性表達(dá)單元是藥物開發(fā)中的重要課題。IGF-I是由70個(gè)單氨基酸構(gòu)成的長(zhǎng)鏈肽，尋找IGF-I的最小活性表達(dá)單元在開發(fā)更有用的藥品方面是非常重要的課題。另外，使用這一最小活性表達(dá)單元，就具體的藥理作用、即對(duì)角膜疾病的作用或皮膚創(chuàng)傷的作用進(jìn)行研究也是非常有意義的課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人等合成了IGF-I的各種肽段，將肽段與P物質(zhì)或FGLM并用，實(shí)施與角膜上皮伸展有關(guān)的藥理試驗(yàn)，由此發(fā)現(xiàn)IGF-I的最小活性表達(dá)單元為用Ser-Ser-Ser-Arg表示的氨基酸序列(以下稱為“SSSR”)。另外，還發(fā)現(xiàn)如果并用含有用SSSR表示的氨基酸序列的肽與P物質(zhì)或FGLM，則能夠促進(jìn)角膜疾病的治愈及皮膚的創(chuàng)傷愈合。即，發(fā)現(xiàn)含有(1)氨基酸序列用Ser-Ser-Ser-Arg表示的肽或其類似物或其可藥用鹽類與(2)氨基酸序列用Phe-Gly-Leu-Met-NH2表示的肽或其類似物或其可藥用鹽類的組合物因各種因素的作用，可以有效地用作角膜疾病狀態(tài)下的角膜潰瘍、角膜上皮剝離、角膜炎或干眼癥等角膜疾病的治療劑或裂傷、擦傷、外科手術(shù)切開創(chuàng)口、皮膚潰瘍、燒傷等皮膚創(chuàng)傷或以此為起因的壞死等疾病的治療劑。需要說明的是本發(fā)明的角膜疾病治療劑及皮膚創(chuàng)傷愈合促進(jìn)劑可以與已經(jīng)確認(rèn)具有創(chuàng)傷愈合效果的抗壞血酸、抗壞血酸酯、抗壞血酸的鹽、泛酸、泛酸的鹽等配合使用。
IGF-I由A、B、C及D的各結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，由于A結(jié)構(gòu)域及B結(jié)構(gòu)域具有與胰島素或IGF-II相類似的結(jié)構(gòu)，因此本發(fā)明人等著眼于IGF-I的C結(jié)構(gòu)域及D結(jié)構(gòu)域研究角膜上皮伸展作用。將構(gòu)成C結(jié)構(gòu)域的肽或構(gòu)成D結(jié)構(gòu)域的肽與P物質(zhì)并用，實(shí)施角膜上皮伸展試驗(yàn)時(shí)，確認(rèn)作為構(gòu)成C結(jié)構(gòu)域的肽的Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr(以下稱為“GYGSSSRRAPQT”)有活性。接下來，由于即使從GYGSSSRRAPQT的兩個(gè)末端分別切去2個(gè)氨基酸也能夠維持活性，因此使用丙氨酸掃描(alanine scanning)方法，合成Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro(以下稱為“GSSSRRAP”)的氨基酸依次轉(zhuǎn)換為丙氨酸的物質(zhì)，在P物質(zhì)或FGLM共存下，實(shí)施角膜上皮伸展試驗(yàn)時(shí)，由于含有用SSSR表示的氨基酸序列的肽全部表現(xiàn)出活性，因此判斷SSSR是表現(xiàn)出角膜上皮伸展作用所必需的最小的IGF-I的肽段。
本發(fā)明人等主要完成了以下4個(gè)發(fā)明。
第一個(gè)發(fā)明涉及氨基酸序列用Ser-Ser-Ser-Arg表示的新型肽或其衍生物或其可藥用鹽類。
該第一個(gè)發(fā)明的特征為發(fā)現(xiàn)了作為IGF-I最小活性表達(dá)單元的新型肽，即氨基酸序列用Ser-Ser-Ser-Arg表示的新型肽。氨基酸序列用Ser-Ser-Ser-Arg表示的肽或其衍生物(以下將該肽與其衍生物總稱為“SSSR衍生物”)只要是含有用Ser-Ser-Ser-Arg表示的氨基酸序列的新型肽即可，沒有特別的限定。該肽的衍生物是指在用Ser-Ser-Ser-Arg表示的肽上結(jié)合了對(duì)肽的活性表達(dá)沒有影響的1個(gè)或多個(gè)氨基酸的物質(zhì)，N末端用?；葟V泛用于肽的保護(hù)基保護(hù)的物質(zhì)，C末端用酯、酰胺等廣泛用于肽的保護(hù)基保護(hù)的物質(zhì)等，另外，也包括Ser殘基的羥基經(jīng)廣泛使用的保護(hù)基保護(hù)的物質(zhì)或Arg殘基的氨基用廣泛使用的保護(hù)基保護(hù)的物質(zhì)。更具體而言，作為SSSR衍生物，例如以SSSR、GSSSRRAP為代表，可以舉出Ser-Ser-Ser-Arg-Arg(以下簡(jiǎn)記為“SSSRR”)、Gyl-Ser-Ser-Ser-Arg(以下簡(jiǎn)記為“GSSSR”)、Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg(以下簡(jiǎn)記為“GSSSRR”)、Ala-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro(以下簡(jiǎn)記為“ASSSRRAP”)、Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Ala-Ala-Pro(以下簡(jiǎn)記為“GSSSRAAP”)、Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Ala-Ala-Ala-Pro(以下簡(jiǎn)記為“GSSSRAAAP”)等。構(gòu)成上述肽的氨基酸中存在L-體、D-體、DL-體，均包含在本發(fā)明內(nèi)。如在各項(xiàng)藥理試驗(yàn)中的具體結(jié)果所示，肽鏈中含有用SSSR表示的氨基酸序列的SSSR衍生物通過與P物質(zhì)或FGLM并用，全部表現(xiàn)出角膜上皮伸展效果及皮膚創(chuàng)傷愈合促進(jìn)效果。
本發(fā)明的SSSR衍生物可以使用肽自動(dòng)合成機(jī)、按照公知的方法進(jìn)行制造，其詳細(xì)內(nèi)容在實(shí)施例中敘述。
第二個(gè)發(fā)明涉及含有氨基酸序列用Ser-Ser-Ser-Arg表示的新型肽或其衍生物或其可藥用鹽類作為有效成分、配合有可藥用的添加物的藥物組合物。
第三個(gè)發(fā)明涉及含有(1)氨基酸序列用Ser-Ser-Ser-Arg表示的肽或其類似物或其可藥用鹽類與(2)氨基酸序列用Phe-Gly-Leu-Met-NH2表示的肽或其類似物或其可藥用鹽類作為有效成分的角膜疾病治療劑。
第四個(gè)發(fā)明涉及含有以上述成分(1)與上述成分(2)作為有效成分的皮膚創(chuàng)傷愈合促進(jìn)劑。
第三及第四個(gè)發(fā)明的特征為通過并用最小活性表達(dá)單元用Ser-Ser-Ser-Arg表示的肽與最小活性表達(dá)單元用Phe-Gly-Leu-Met-NH2表示的肽，表現(xiàn)出優(yōu)良的角膜上皮伸展效果及促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合促進(jìn)效果。
在第三及第四個(gè)發(fā)明中，氨基酸序列用Ser-Ser-Ser-Arg表示的肽或其類似物(以下將該肽與其類似物總稱為“SSSR類似物”)只要是含有用Ser-Ser-Ser-Arg表示的氨基酸序列的肽即可，沒有特別的限定。該肽的類似物是指在用Ser-Ser-Ser-Arg表示的肽上結(jié)合了對(duì)其活性表達(dá)沒有影響的1個(gè)或多個(gè)氨基酸的物質(zhì)，N末端用?；葟V泛用于肽的保護(hù)基保護(hù)的物質(zhì)，C末端用酯、酰胺等廣泛用于肽的保護(hù)基保護(hù)的物質(zhì)等，另外，也包括Ser殘基的羥基經(jīng)廣泛使用的保護(hù)基保護(hù)的物質(zhì)或Arg殘基的氨基用廣泛使用的保護(hù)基保護(hù)的物質(zhì)。更具體而言，作為SSSR類似物，例如，除了上述的SSSR衍生物以外，可以舉出GYGSSSRRAPQT等。構(gòu)成SSSR類似物的肽的氨基酸中存在L-體、D-體、DL-體，均包含在本發(fā)明內(nèi)。更優(yōu)選的方式為全部由L-體的氨基酸構(gòu)成的肽。
另外，氨基酸序列用Phe-Gly-Leu-Met-NH2表示的肽或其類似物(以下將該肽與其類似物總稱為“FGLM類似物”)只要是含有用Phe-Gly-Leu-Met-NH2表示的氨基酸序列的肽即可，沒有特別的限定。該肽的類似物是指在用Phe-Gly-Leu-Met-NH2表示的肽上結(jié)合了對(duì)其活性表達(dá)沒有影響的1個(gè)或多個(gè)氨基酸的物質(zhì)，或N末端用?；葟V泛用于肽的保護(hù)基保護(hù)的物質(zhì)。更具體而言，作為FGLM類似物，例如以P物質(zhì)、FGLM為代表，可以舉出作為美國(guó)專利3862114號(hào)中具體公開的由4～12個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽的Tyr-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2、Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2、Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2、Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2、Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2、Tyr-Phe-Gly-Leu-Met-NH2、Gly-Phe-Gly-Leu-Met-NH2等。作為更優(yōu)選的具體例，有P物質(zhì)、FGLM。構(gòu)成上述物質(zhì)的氨基酸中也存在L-體、D-體、DL-體，均包含在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明中更優(yōu)選的方案為全部由L-體的氨基酸構(gòu)成的肽。
在本發(fā)明中，作為可藥用鹽類，例如可以舉出鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、草酸鹽、甲磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽等。
在本發(fā)明中，并用SSSR類似體與FGLM類似體表現(xiàn)出促進(jìn)角膜上皮伸展及皮膚創(chuàng)傷愈合的作用。表現(xiàn)出這些作用的SSSR類似物的種類及FGLM類似物的種類沒有特別限定，作為更優(yōu)選的實(shí)施方案，可以舉出將作為IGF-I的最小活性表達(dá)單元的SSSR與作為P物質(zhì)的最小活性表達(dá)單元的FGLM組合使用的方案。
本發(fā)明的角膜疾病治療劑及皮膚創(chuàng)傷愈合促進(jìn)劑可以使用廣泛使用的技術(shù)進(jìn)行調(diào)制，將SSSR類似物或其可藥用鹽類、與FGLM類似物或其可藥用鹽類分別制成單獨(dú)制劑或制成配合制劑，可以采用非經(jīng)口途徑或經(jīng)口途徑給藥，更優(yōu)選由非經(jīng)口途徑給藥。
作為角膜疾病治療劑的優(yōu)選給藥劑型，可以舉出滴眼劑、眼膏等。上述劑型可以采用廣泛使用的技術(shù)進(jìn)行調(diào)制。例如，滴眼劑可以使用氯化鈉等等滲劑、磷酸鈉等緩沖劑、苯扎氯銨等防腐劑等進(jìn)行調(diào)制。pH只要在眼科制劑允許的范圍內(nèi)即可，優(yōu)選在4～8的范圍內(nèi)。
角膜疾病治療劑的給藥量可以根據(jù)癥狀、年齡、劑型等進(jìn)行適當(dāng)選擇，如果是滴眼劑，則SSSR類似物或其可藥用鹽類的量可以為0.001～10％(w/v)(優(yōu)選為0.01～1％(w/v))，1日滴眼1次～數(shù)次即可。另外，F(xiàn)GLM類似物或其可藥用鹽類的量可以為0.00001～0.1％(w/v)(優(yōu)選為0.0001～0.01％(w/v))，1日滴眼1次～數(shù)次即可。
當(dāng)然，也可以將上述兩成分同時(shí)配合制成滴眼劑等制劑。
另外，作為皮膚創(chuàng)傷愈合促進(jìn)劑的優(yōu)選制劑形式，可以舉出軟膏劑、凝膠劑、巴布劑、貼付劑、洗劑、霜?jiǎng)婌F劑、氣霧劑、硬膏劑、懸浮劑、乳劑等，另外，可以選擇適當(dāng)?shù)娜軇┱{(diào)制液體劑型。另外，為了調(diào)制皮膚創(chuàng)傷愈合促進(jìn)劑，可以根據(jù)劑型添加填充劑、賦形劑、基質(zhì)、增量劑、pH調(diào)整劑、可溶化劑、懸浮化劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、保存劑、表面活性劑、抗氧化劑、分散劑、乳化劑、溶解劑、助溶劑等。
作為上述制劑的載體，例如，可以舉出白色凡士林、液體石蠟、凝膠化烴、十六烷醇、聚乙二醇、明膠、玉米淀粉、藻酸鈉、甲基纖維素、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、親水性液體石蠟、明膠、糊精、十六烷醇、硬脂醇、聚乙二醇、聚乙烯醇、甲氧基乙烯-馬來酸酐共聚物、聚乙烯基醚、以乙烯基吡咯烷酮為構(gòu)成成分的聚合物·共聚物、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯扎氯銨、橄欖油、山茶油、大豆油等油脂類、乳糖、水等。
本發(fā)明的皮膚創(chuàng)傷愈合促進(jìn)劑可以根據(jù)創(chuàng)傷部位或創(chuàng)傷的程度采用各種形式進(jìn)行給藥。例如，作為外用藥使用時(shí)，優(yōu)選將本藥直接涂布、噴霧或貼附在皮膚等所需要的部位(患部)上。
本發(fā)明的皮膚創(chuàng)傷愈合促進(jìn)劑的給藥量可以考慮癥狀、年齡、劑型等因素進(jìn)行適當(dāng)選擇。SSSR類似物或其可藥用鹽類的給藥量通常為每日0.001～1000mg，優(yōu)選為0.01～500mg，每日給藥1次或分?jǐn)?shù)次給藥。另外，F(xiàn)GLM類似物或其可藥用鹽類的給藥量通常為每日0.01～5000mg，優(yōu)選為0.1～1000mg，每日給藥1次或分?jǐn)?shù)次給藥。
當(dāng)然，可以將上述兩成分同時(shí)配合制成軟膏等制劑。
下面，給出制造例、制劑例及藥理試驗(yàn)結(jié)果，這些具體例用于更好地理解本發(fā)明，本發(fā)明的范圍并不限定于此。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明中使用的SSSR類似物的代表性制造例如下所述。
1、SSSR的制造使用肽自動(dòng)合成機(jī)430A(Applied Biosystems公司生產(chǎn))，按已經(jīng)設(shè)定的軟件、根據(jù)叔丁氧羰基(BOC)法合成保護(hù)肽樹脂。起始原料使用N-甲基-(4-甲氧基苯基)乙酰胺[Boc-Arg(Tos)PAM]樹脂載體(0.5mmol(scale))。在本合成方法中，為了除去作為Na-氨基保護(hù)基的Boc基，使用30％三氟乙酸(TFA)/二氯甲烷、70％TFA/二氯甲烷，洗滌時(shí)使用N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)/二氯甲烷。作為縮合劑的N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)及1-羥基苯并三唑(HOBt)與N-保護(hù)氨基酸的Boc-Ser(OBzl)衍生物相對(duì)于氨基分別使用4當(dāng)量，反應(yīng)溶劑使用二甲亞砜(DMSO)-NMP(8∶2)?？s合反應(yīng)結(jié)束后，作為完全封閉殘留氨基的操作，使用乙酸酐/N，N-二異丙基乙胺(DIEA)防止生成缺陷肽。除去Boc基，反復(fù)進(jìn)行Boc-Ser(OBzl)的縮合，構(gòu)筑最終保護(hù)肽。利用無水氫氟酸(HF)處理(HF∶對(duì)甲酚＝8∶2(V/V)，-2～-5℃，60分鐘)，從得到的保護(hù)肽樹脂上切去肽，并脫離全部的保護(hù)基。反應(yīng)后，蒸餾除去HF，用0.1％三氟乙酸水溶液萃取肽，將粗產(chǎn)物制成凍干粉末后，用于分離提取精制。使用島津制作所生產(chǎn)的HPLC LC8A(柱YMC生產(chǎn)ODS 30×240mm)，用乙腈/水(含有0.1％TFA)、以0.5～2％的梯度(80分鐘)進(jìn)行分離提取精制。收集得到的目標(biāo)物質(zhì)的高純度餾分，蒸餾除去乙腈后，進(jìn)行凍干，得到目標(biāo)化合物的TFA鹽70mg(收率32％)。
氨基酸分析(水解條件6N HCl，110℃，22小時(shí))Ser(3)2.74，Arg(1)1.00HPLC分析[ColumnYMC Pak ODS-A(4.6mml.D.×150mm)，Eluent1-60％ CH3CN/5mM CF3CF2COOH(25min)，Temp.25℃，F(xiàn)low rate1.0ml/min，Detector220nm]純度(HPLC)98.5％質(zhì)譜(ESI-MS)MH+＝436.2(Theor.＝436.25，mono isotopic)2、SSSR類似物的制造進(jìn)行與SSSR同樣的操作，制造GSSSR、SSSRR、GSSSRR、GSSSRRAP、ASSSRRAP、GSSSRAAP、GSSSRAAAP。以下給出代表性肽的物性。
(1)GSSSR氨基酸分析(水解條件6N HCl，110℃，22小時(shí))Ser(3)2.76，Gly(1)1.00，Arg(1)1.00
HPLC分析[ColumnYMC Pak ODS-A(4.6mml.D.×150mm)，Eluent1～60％ CH3CN/5mM CF3CF2COOH(25min)，Temp.25℃，F(xiàn)low rate1.0ml/min，Detector220nm]純度(HPLC)98.5％質(zhì)譜(ESI-MS)MW＝492.3(Theor.＝492.5)(2)SSSRR氨基酸分析(水解條件6N HCl，110℃，22小時(shí))Ser(3)2.76，Arg(2)2.00HPLC分析[ColumnYMC Pak ODS-A(4.6mml.D.×150mm)，Eluent1-60％ CH3CN/0.1％ CF3COOH(25min)，Temp.25℃，F(xiàn)low rate1.0ml/min，Detector220nm]純度(HPLC)99.7％質(zhì)譜(ESI-MS)MW＝591.5(Theor.＝591.6)(3)GSSSRR氨基酸分析(水解條件6N HCl，110℃，22小時(shí))Ser(3)2.73，Gly(1)0.98，Arg(2)2.00HPLC分析[ColumnYMC Pak ODS-A(4.6mml.D.×1 0mm)，Eluent1-60％ CH3CN/0.1％ CF3COOH(25min)，Temp.25℃，F(xiàn)low rate1.0ml/min，Detector220nm]純度(HPLC)99.3％質(zhì)譜(ESI-MS)MW＝648.5(Theor.＝648.7)(4)GSSSRRAP氨基酸分析(水解條件6N HCl，110℃，22小時(shí))Ser(3)2.68，Gly(1)0.99，Ala(1)1.01，Arg(2)2.00HPLC分析[ColumnYMC Pak ODS-A(4.6mml.D.×150mm)，Eluent1-60％ CH3CN/0.1％ CF3COOH(25min)，Temp.25℃，F(xiàn)low rate1.0ml/min，Detector220nm]純度(HPLC)98.6％質(zhì)譜(ESI-MS)MW＝816.7(Theor.＝816.9)[制劑例]本發(fā)明中使用的代表性制劑例如下所示。
1、滴眼劑使用廣泛使用的方法調(diào)制以下處方的滴眼劑。
處方例1100ml中SSSR 1mg氯化鈉900mg氫氧化鈉 適量鹽酸 適量滅菌精制水適量可以與處方例1同樣地調(diào)制100ml中含有SSSR 0.01mg、0.05mg、0.1mg、0.5mg、5mg、10mg、50mg、100mg的滴眼液。
處方例2100ml中GSSSR 1mgFGLM 100mg氯化鈉900mg氫氧化鈉 適量鹽酸 適量滅菌精制水適量可以與處方例2同樣地調(diào)制100ml中含有FGLM 1mg、5mg、10mg、50mg、500mg、1000mg的滴眼液。
處方例3100ml中SSSR 1mgFGLM 100mg氯化鈉 900mg氫氧化鈉 適量鹽酸 適量滅菌精制水 適量可以與處方例3同樣地調(diào)制SSSR(0.01mg、0.05mg、0.1mg、0.Smg、10mg、50mg、100mg)與FGLM(1mg、5mg、10mg、50mg、500mg、1000mg)任意組合而成的滴眼液。
2、軟膏劑處方例4100g中SSSR 10mgFGLM 100mg液體石蠟 10g白色凡士林 適量通過適當(dāng)改變SSSR的添加量及FGLM的添加量，可以調(diào)制各種濃度的軟膏。
處方例5100g中GSSSR 1mgP物質(zhì) 100mg液體石蠟 10g白色凡士林適量與處方例5同樣地通過適當(dāng)改變GSSSR的添加量及P物質(zhì)的添加量，可以調(diào)制各種濃度的軟膏。
處方例6100g中SSSRR5mgFGLM 100mg液體石蠟 10g白色凡士林 適量通過適當(dāng)改變SSSRR的添加量及FGLM的添加量，可以調(diào)制各種濃度的軟膏。
處方例7100g中GSSSRR50mgP物質(zhì) 10mg抗壞血酸 3mg液體石蠟 10g親水性液體石蠟適量通過適當(dāng)改變GSSSRR的添加量及P物質(zhì)的添加量，可以調(diào)制各種濃度的軟膏。
(1)對(duì)角膜上皮伸展的作用(體外)使用雄性的日本白色家兔的角膜，基于Nishida等的方法(J.CellBiol.，97，1653～1657(1983))，以在角膜片的組織培養(yǎng)體系中的角膜上皮伸展長(zhǎng)度為指標(biāo)，研究藥物對(duì)角膜上皮伸展的影響。
(實(shí)驗(yàn)方法)將從家兔角膜片上切下的角膜塊(1組6個(gè))在含有待檢化合物的培養(yǎng)液(TC-199)中，在37℃·5％CO2的條件下培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后，將角膜塊在乙醇-冰醋酸(容積比95∶5)混合液中固定，用石蠟包埋，制成切片。將切片脫石蠟后，進(jìn)行蘇木精-曙紅染色，在顯微鏡下測(cè)定上皮細(xì)胞層的伸展長(zhǎng)度。
作為對(duì)照，使用在不合待檢化合物的培養(yǎng)液中進(jìn)行同樣培養(yǎng)得到的角膜塊。
(待檢化合物)實(shí)驗(yàn)中使用的肽的代表例如表1所示。
(結(jié)果)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。需要說明的是表中的伸展率為以對(duì)照組的伸展長(zhǎng)度為基準(zhǔn)(100％)算出的各6例的平均值。
表1

如表1所示，單獨(dú)使用SSSR類似物、單獨(dú)使用P物質(zhì)及單獨(dú)使用FGLM時(shí)未確認(rèn)對(duì)角膜上皮伸展有影響，如果在含有SSSR類似物與P物質(zhì)(或FGLM)兩者的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，則確認(rèn)對(duì)角膜上皮有顯著的伸展促進(jìn)作用。
(2)對(duì)皮膚創(chuàng)傷愈合的作用皮膚創(chuàng)傷愈合的效果可以用以下給出的方法進(jìn)行試驗(yàn)。
使大鼠吸入乙醚麻醉，用推子剃去背部的體毛，用脫毛膏進(jìn)行脫毛。24小時(shí)后，使用直徑5mm的皮膚活組織檢查用打孔器，在背部皮膚上等間隔地形成5個(gè)表皮·真皮的全層性創(chuàng)傷，確認(rèn)止血后，每日1次分別涂布含有SSSR的軟膏、含有FGLM的軟膏及含有SSSR與FGLM的軟膏。涂布各軟膏前，拍攝大鼠背部創(chuàng)傷的照片，測(cè)定創(chuàng)傷面積。通過比較含有SSSR的軟膏、含有FGLM的軟膏及含有SSSR與FGLM的軟膏涂布后的各創(chuàng)傷面積，能夠研究對(duì)皮膚創(chuàng)傷愈合的效果。
根據(jù)藥理試驗(yàn)的結(jié)果可知，如果并用含有作為IGF-I的最小活性表達(dá)單元的用Ser-Ser-Ser-Arg表示的氨基酸序列的SSSR類似物與含有用Phe-Gly-Leu-Met-NH2表示的氨基酸序列的FGLM類似物，則能夠顯著促進(jìn)角膜上皮伸展及皮膚創(chuàng)傷愈合。因此，如果組合給予SSSR類似物與FGLM類似物，則上述藥劑協(xié)同起效，發(fā)揮作為角膜潰瘍、角膜上皮剝離、角膜炎、干眼癥等角膜疾病的治療劑或裂傷、擦傷、外科手術(shù)的切開創(chuàng)口、皮膚潰瘍、燒傷等皮膚創(chuàng)傷或起因于此的壞死等疾病的愈合劑的效果。
權(quán)利要求
1.一種氨基酸序列用Ser-Ser-Ser-Arg表示的肽或其衍生物或其可藥用鹽類。
2.一種藥物組合物，所述藥物組合物含有氨基酸序列用Ser-Ser-Ser-Arg表示的肽或其衍生物或其可藥用鹽類為有效成分，與可藥用的添加物配合而成。
3.一種角膜疾病治療劑，所述角膜疾病治療劑含有下述成分1)氨基酸序列用Ser-Ser-Ser-Arg表示的肽或其類似物或其可藥用鹽類，2)氨基酸序列用Phe-Gly-Leu-Met-NH2表示的肽或其類似物或其可藥用鹽類。
4.如權(quán)利要求3所述的角膜疾病治療劑，其中，角膜疾病為角膜潰瘍、角膜上皮剝離、角膜炎或干眼癥。
5.如權(quán)利要求3所述的角膜疾病治療劑，其中，劑型為滴眼劑。
6.一種皮膚創(chuàng)傷愈合促進(jìn)劑，所述皮膚創(chuàng)傷愈合促進(jìn)劑含有下述成分1)氨基酸序列用Ser-Ser-Ser-Arg表示的肽或其類似物或其可藥用鹽類，2)氨基酸序列用Phe-Gly-Leu-Met-NH2表示的肽或其類似物或其可藥用鹽類。
7.如權(quán)利要求6所述的皮膚創(chuàng)傷愈合促進(jìn)劑，其中，皮膚創(chuàng)傷為裂傷、擦傷、外科手術(shù)的切開創(chuàng)口、皮膚潰瘍或燒傷。
8.如權(quán)利要求6所述的皮膚創(chuàng)傷愈合促進(jìn)劑，其中，劑型為軟膏劑。
9.一種角膜疾病的治療方法，所述治療方法為將同時(shí)含有治療有效量的下述成分1)和2)以及可藥用的添加物的組合物給予需要治療的患者，所述成分1)為氨基酸序列用Ser-Ser-Ser-Arg表示的肽或其類似物或其可藥用鹽類，成分2)為氨基酸序列用Phe-Gly-Leu-Met-NH2表示的肽或其類似物或其可藥用鹽類。
10.如權(quán)利要求9所述的治療方法，其中，角膜疾病為角膜潰瘍、角膜上皮剝離、角膜炎或干眼癥。
11.如權(quán)利要求9所述的治療方法，其中，劑型為滴眼劑。
12.一種促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合的治療方法，所述治療方法為將同時(shí)含有治療有效量的下述成分1)和2)以及可藥用的添加物的組合物給予需要治療的患者，所述成分1)為氨基酸序列用Ser-Ser-Ser-Arg表示的肽或其類似物或其可藥用鹽類，成分2)為氨基酸序列用Phe-Gly-Leu-Met-NH2表示的肽或其類似物或其可藥用鹽類。
13.如權(quán)利要求12所述的治療方法，其中，皮膚創(chuàng)傷為裂傷、擦傷、外科手術(shù)的切開創(chuàng)口、皮膚潰瘍或燒傷。
14.如權(quán)利要求12所述的治療方法，其中，劑型為軟膏劑或貼付劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型肽及其藥物用途。本發(fā)明的目的在于尋找胰島素樣生長(zhǎng)因子－I的最小活性表達(dá)單元，開發(fā)其在眼科及皮膚科領(lǐng)域內(nèi)的藥物用途。并用含有作為胰島素樣生長(zhǎng)因子－I的最小活性表達(dá)單元的用Ser－Ser－Ser－Arg表示的氨基酸序列的肽和用Phe－Gly－Leu－Met－NH
文檔編號(hào)A61K38/30GK1599748SQ0282416
公開日2005年3月23日 申請(qǐng)日期2002年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月3日
發(fā)明者西田輝夫, 干誠(chéng), 中村雅胤 申請(qǐng)人:參天制藥株式會(huì)社, 西田輝夫