專利名稱：通過(guò)局部給藥預(yù)防和治療再狹窄的制作方法
背景技術(shù)：
本申請(qǐng)要求了于2001年9月28日提交的序列號(hào)為60/326,379的US申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)。
本發(fā)明一般屬于用于降低病態(tài)冠狀動(dòng)脈、外周動(dòng)脈和腦動(dòng)脈的血管再造后的再狹窄以及手術(shù)放置旁路移植物或移植器官后的狹窄或再狹窄的方法和組合物的領(lǐng)域，特指將諸如載脂蛋白A-I Milano之類(lèi)的物質(zhì)單獨(dú)或與脂質(zhì)制劑或其它膽固醇降低劑或脂質(zhì)調(diào)節(jié)劑聯(lián)合進(jìn)行局部給藥。
血管成形術(shù)、手術(shù)和其它血管干預(yù)因?yàn)橐约?xì)胞在短期內(nèi)快速生長(zhǎng)到腔內(nèi)為特征的加速的動(dòng)脈病變而變得棘手。這種生長(zhǎng)常常十分嚴(yán)重，其足以危害血液流向末端器官。
正如被用于動(dòng)脈粥樣硬化中血管表面形成斑塊(plaques)時(shí)那樣，血管旁路手術(shù)已被廣泛用于治療狹窄和閉合的血管。在旁路手術(shù)中，將一根或多根健康的血管越過(guò)狹窄或閉合部位移植到狹窄/閉合的血管中，以便在該狹窄或閉合的血管周?chē)至餮?，從而為血液供?yīng)受到該狹窄或閉合危害的組織重建足夠的血液供應(yīng)。這種手術(shù)常常能成功地為受到危害的組織進(jìn)行血管再造。
血管成形術(shù)已發(fā)展成為一種旁路手術(shù)中供選擇的治療，尤其是對(duì)被診斷為處于由斑塊異常沉積在血管壁腔壁上而形成血管狹窄或閉合的初期階段的患者更是如此。血管成形術(shù)一般包括將一根通常配有囊或可膨脹的金屬網(wǎng)狀物的導(dǎo)管引入到狹窄或閉合的動(dòng)脈區(qū)域，使該囊或絲網(wǎng)短暫地膨脹一次或多次以將血管內(nèi)的阻塞物或斑塊向血管內(nèi)皮的壁上進(jìn)行擠壓，從而壓縮該斑塊和/或?qū)⒃摪邏K擊碎并重建血流。但是，血管成形術(shù)治療可能會(huì)損傷血管，尤其是當(dāng)該囊過(guò)度膨脹或該網(wǎng)狀物過(guò)分?jǐn)U展時(shí)更是如此，從而造成了許多不希望出現(xiàn)的結(jié)果，如血管成形術(shù)區(qū)域內(nèi)皮細(xì)胞層的剝脫(移動(dòng))、血管內(nèi)壁部分從血管的剩余部分上分割下來(lái)并伴有血管閉合、或血管的內(nèi)膜層破裂。
動(dòng)物的動(dòng)脈損傷引致了最終使得動(dòng)脈變狹窄的血管修復(fù)過(guò)程。平滑肌細(xì)胞和炎癥細(xì)胞厚的新層或新內(nèi)膜在血管內(nèi)生長(zhǎng)，侵占了腔。動(dòng)物體內(nèi)的這種過(guò)程代表了在血管成形術(shù)、血管內(nèi)支架(stent)移植、器官移植、或旁路手術(shù)后臨床發(fā)生的過(guò)程，其極大地限制了這些用于治療阻塞性動(dòng)脈疾病的技術(shù)的長(zhǎng)期成功性。動(dòng)脈損傷和新內(nèi)膜增生的動(dòng)物模型已被用于研究導(dǎo)致人類(lèi)再狹窄的細(xì)胞事件，用以設(shè)計(jì)抑制組織生長(zhǎng)以試圖減少再狹窄并增加長(zhǎng)期臨床效果的治療策略。對(duì)于人的再狹窄而言，豬是特別有用的動(dòng)物模型。
限制血管再造后血管的狹窄或再狹窄的嘗試包括使用藥理學(xué)物質(zhì)和技術(shù)性方法。臨床上還沒(méi)有被批準(zhǔn)用于防止人再狹窄適應(yīng)征的藥物。正如Serruys等人，N.E.J.Med.1994；331489-495和Fischman等人，N.E.J.Med.1994；331496-501所報(bào)道的那樣，已經(jīng)表明一種技術(shù)性方法——血管內(nèi)放置支架可以部分降低冠狀動(dòng)脈干預(yù)后人的再狹窄。然而，支架本身在20-30％的情況中仍然易于產(chǎn)生明顯的再狹窄。
對(duì)進(jìn)行血管修復(fù)機(jī)理了解的增加使得出現(xiàn)了將藥物用于限制加速的動(dòng)脈病變的創(chuàng)新提議。已知包括單核細(xì)胞在內(nèi)的循環(huán)的白細(xì)胞恰好是當(dāng)動(dòng)脈粥樣硬化開(kāi)始時(shí)血管所征募的第一種細(xì)胞。當(dāng)處于病態(tài)動(dòng)脈壁中時(shí)，這些細(xì)胞可吞沒(méi)膽固醇和其它脂質(zhì)，并且還可以產(chǎn)生吸引其它細(xì)胞、使得其它細(xì)胞增生、或使基質(zhì)成分降解的物質(zhì)。這些繼發(fā)作用中的各種作用反過(guò)來(lái)又促進(jìn)了動(dòng)脈腔更大程度的內(nèi)膜變厚和更嚴(yán)重的狹窄或閉合。還沒(méi)有證據(jù)證實(shí)白細(xì)胞在血管再造后的再狹窄中扮演了相似的角色。雖然已經(jīng)將白細(xì)胞活化與人的再狹窄聯(lián)系起來(lái)(Pietersma等人，Circulation 1995；911320-1325；Mickelson等人，1996 JACC 28(2)345-353；Inoue等人，1996 JACC 28(5)1127-1133)，但是在血管再造后例如用糖皮質(zhì)激素進(jìn)行的廣泛的炎癥抑制并不能降低人的再狹窄(Pepine等人，Circulation 1990；811753-1761)。這種觀察是對(duì)使用廣泛有效和特異性很高的靶向治療用于預(yù)防再狹窄進(jìn)行的回顧性研究。廣泛治療，例如用肝素進(jìn)行的廣泛治療一直受到全身毒性和給藥限制因素的限制。特異性治療，例如用分子策略進(jìn)行的特異性治療不能抑制活化和加強(qiáng)血管修復(fù)過(guò)程的所有多余的細(xì)胞和分子途徑。
Ameli等人，Circulation 90(4)1935-41(1994)報(bào)道了一些流行病學(xué)研究，這些研究表明高密度脂蛋白(HDL)膽固醇水平和冠心病之間呈反比關(guān)系，并且HDL和冠狀囊血管成形術(shù)后的再狹窄之間也有相似的反比關(guān)系。其進(jìn)行了一項(xiàng)研究以測(cè)定是否HDL直接影響新內(nèi)膜形成，研究了重組的apoA-I Milano(apoA-IM，一種Arg-173被替代為CyS的人apoA-I的變體)對(duì)用膽固醇進(jìn)行喂養(yǎng)的兔子的囊損傷后內(nèi)膜增厚的影響。在股動(dòng)脈和骼動(dòng)脈囊損傷前5天，兔子開(kāi)始每隔一天靜脈內(nèi)注射40mg連接到磷脂載體上的apoA-IM，并持續(xù)給藥至損傷后5天(總劑量為200mg/動(dòng)物，或約11.4mg/kg/給藥)。在囊損傷后三周，與兩個(gè)對(duì)照組相比，進(jìn)行apoA-IM治療的兔子的內(nèi)膜厚度顯著降低。與兩個(gè)對(duì)照進(jìn)行的ANOVA比較表明，apoA-IM也顯著降低了內(nèi)膜-比-中膜的比例。正如由使用巨噬細(xì)胞-特異性單克隆抗體進(jìn)行的免疫組織化學(xué)研究所證實(shí)的那樣，與用載體進(jìn)行處理的動(dòng)物相比，在用apoA-IM進(jìn)行了治療的兔子中被巨噬細(xì)胞所覆蓋的內(nèi)膜損害部分顯著較少(25.3+/-17％比59.4+/-12.3％，P＜.005)。用apoA-IM進(jìn)行處理的動(dòng)物和只用載體進(jìn)行處理的對(duì)照組的主動(dòng)脈膽固醇含量沒(méi)有顯著差異。不幸地是，與其中損害與人更相似的豬不同，還不能用兔子所獲得的結(jié)果來(lái)預(yù)言人的結(jié)果。
因此，需要可促進(jìn)血管組織愈合并控制血管肌細(xì)胞增殖(增生)以預(yù)防血管成形術(shù)、血管旁路手術(shù)、器官移植、或血管疾病后血管的再狹窄并同時(shí)將快速再閉合的風(fēng)險(xiǎn)最小化的組合物和方法。
因此，本發(fā)明的目的是要提供用于減少病態(tài)冠狀動(dòng)脈、外周動(dòng)脈和腦動(dòng)脈血管再造后的再狹窄以及通過(guò)手術(shù)放置旁路移植物或移植器官后的狹窄或再狹窄的方法和組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是要提供一種簡(jiǎn)單有效的基因轉(zhuǎn)移方法。
本發(fā)明的概述在對(duì)病態(tài)冠狀動(dòng)脈、外周動(dòng)脈和腦動(dòng)脈進(jìn)行旁路手術(shù)、手術(shù)植入移植物或移植器官、或血管成形術(shù)、或穩(wěn)定不穩(wěn)定的斑塊之前或期間，可以將單獨(dú)或更優(yōu)選地是與脂質(zhì)載體如磷脂或其它藥物聯(lián)用的載脂蛋白A-I(ApoA-I)，優(yōu)選地變體形式如載脂蛋白A-I Milano(ApoA-IM)進(jìn)行局部給藥。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用INFILTRATOR、壁內(nèi)釋放裝置和/或其它持續(xù)控釋的方法將ApoA-IM進(jìn)行給藥，從而將有效劑量給藥于損傷部位?；谑褂肁poA-IM的豬模型，治療或預(yù)防再狹窄的有效劑量為0.2至0.4mg ApoA-IM/kg被傳遞到進(jìn)行治療的部位，或更特定地為4至6mg ApoA-IM/被治療的血管。溶液的粘度限制了用INFILTRATOR進(jìn)行的壁內(nèi)給藥的劑量上限。例如，該方法不能使用太粘以至于不能通過(guò)INFILTRATOR小孔的ApoA-IM溶液。正如被實(shí)施例所證明的那樣，有效量為0.3至0.4ml 14mg/ml的ApoA-IM溶液(其相當(dāng)于每個(gè)血管區(qū)段單次給藥4至6mg或?qū)τ?5kg豬各進(jìn)行治療的血管而言約0.2mg/kg)，優(yōu)選地與1-棕櫚?；?2-油酰基磷脂酰膽堿(POPC)以約1∶1的重量比聯(lián)合進(jìn)行給藥。
在供選擇的實(shí)施方案中，并不直接提供該載脂蛋白，而是提供編碼該載脂蛋白的基因。將該基因以與蛋白所用方法相似的方法引入到血管中，然后在那里對(duì)蛋白進(jìn)行表達(dá)。該技術(shù)還可用于治療或預(yù)防再狹窄或其它心血管疾病的基因傳遞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，將支架用單獨(dú)的載脂蛋白、用與脂質(zhì)一起進(jìn)行制備的載脂蛋白、表達(dá)載脂蛋白的遺傳學(xué)工程細(xì)胞、編碼載脂蛋白的裸DNA、或其它藥物如抗增生劑涂布后局部釋放到受損部位。這實(shí)施方案還包括將上述列舉的涂布材料聯(lián)合涂布到支架上以獲得更大的效能。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該系統(tǒng)與聯(lián)合治療一起使用，用于與全身抗高血壓治療、脂質(zhì)調(diào)節(jié)和/或抗凝治療聯(lián)合的諸如載脂蛋白之類(lèi)的物質(zhì)局部釋放?？梢允褂玫乃幬锏膶?shí)例包括脂質(zhì)調(diào)節(jié)劑如煙酸、他汀類(lèi)藥物、以及貝特類(lèi)藥物(fibrates)；用于血糖控制的藥物；抗高血壓藥；和預(yù)防或延遲凝血或血小板聚集的物質(zhì)如其中所說(shuō)的物質(zhì)是阿司匹林、IIb/IIIa抑制劑、氯吡格雷或肝素。使用局部治療并聯(lián)合一種以上的組合——例如使用局部傳遞治療加抗凝加脂質(zhì)調(diào)節(jié)可以獲得最大的益處。這些治療可以在局部傳遞之前開(kāi)始、與局部傳遞同時(shí)開(kāi)始或在局部治療之后開(kāi)始。全身治療優(yōu)選地在該局部傳遞操作之前開(kāi)始。
附圖詳細(xì)說(shuō)明

圖1-4涉及其中將10只家豬用100mg/kg ETC-216，一種apoA-IM/POPC(重量比約為1/1)復(fù)合體(complex)(n＝5)或鹽水(n＝5)單次靜脈內(nèi)輸入來(lái)進(jìn)行治療的試驗(yàn)。將試驗(yàn)物質(zhì)在約3小時(shí)內(nèi)靜脈內(nèi)給藥，同時(shí)在每只動(dòng)物的兩個(gè)冠狀血管中進(jìn)行伴有支架展開(kāi)的過(guò)度牽張的經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀血管成形術(shù)。劑量是以該復(fù)合體的蛋白組分的重量為基礎(chǔ)的。動(dòng)物在第28天(8只動(dòng)物)或29天(1只動(dòng)物)被實(shí)施安樂(lè)死，然后進(jìn)行定量的冠狀血管造影術(shù)和血管內(nèi)超聲(IVUS)，將冠狀動(dòng)脈進(jìn)行灌注和固定以進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)分析。一只對(duì)照動(dòng)物在第27天時(shí)死亡，由該動(dòng)物僅收集使用其組織形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)。
圖1a和1b是定量的冠狀血管造影術(shù)數(shù)據(jù)(QCA)的圖，其是在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定的冠狀血管損傷前、緊接冠狀血管損傷和支架展開(kāi)后、和處死前，并且是以在接近支架的未展擴(kuò)(unstented)區(qū)段、在支架近端部分、支架整個(gè)長(zhǎng)度的平均區(qū)域、支架的遠(yuǎn)端部分、和遠(yuǎn)離支架的未展擴(kuò)區(qū)段所進(jìn)行的直徑測(cè)量(mm)為基礎(chǔ)的。從這些數(shù)據(jù)可以測(cè)得被展擴(kuò)(stented)區(qū)域的最大直徑和最小直徑。在展擴(kuò)和相鄰的未展擴(kuò)區(qū)段測(cè)定腔增量(損傷后的腔直徑減去損傷前的腔直徑)和腔損失(損傷后的腔直徑減去第28-29天追蹤觀察時(shí)的腔直徑)的QCA評(píng)估。所有血管(即右側(cè)冠狀動(dòng)脈(RCA)和左前下行動(dòng)脈(LAD)聯(lián)合)的QCA數(shù)據(jù)如圖1a所示，對(duì)于各種類(lèi)型的血管(即RCA或LAD)而言如圖1b所示。
圖2a和2b是用于測(cè)定在處死前(手術(shù)后28-29天)各被擴(kuò)展的冠狀血管的末端、中間和近端處支架和腔面積的血管內(nèi)超聲(IVUS)數(shù)據(jù)圖。這些測(cè)量之間的差異是新內(nèi)膜的面積。圖2a是對(duì)于所有血管(即RCA和LAD聯(lián)合)而言的，圖2b是對(duì)于各種類(lèi)型的血管(即RCA或LAD)而言的。
圖3a和3b是用來(lái)測(cè)定外膜邊界層(ABL)、外部彈性層(EEL)、內(nèi)部彈性層(IEL)、腔(L)、外膜(A)、中膜(M)、內(nèi)膜(I)的平均橫截面區(qū)域、內(nèi)膜與中膜比(I/M)和損傷得分的被擴(kuò)展動(dòng)脈的組織形態(tài)學(xué)分析。損傷得分是在被展擴(kuò)血管膨脹部位的近端(a)、中間(b)和遠(yuǎn)端(c)區(qū)段各測(cè)量12次而獲得的36次損傷測(cè)定的均值。將損傷記為0、1、2或3分，0表示完整的IEL(即沒(méi)有損傷)，3表示暴露于外膜的破裂的EEL(即最嚴(yán)重的損傷)。圖3a是所有血管(即RCA和LAD聯(lián)合)的組織形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)，圖3b是各種類(lèi)型的血管(即RCA或LAD)的組織形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)。
圖4表示組織形態(tài)學(xué)和IVUS變量之間的選擇相關(guān)性。
圖5a和5b表示所收集的組織形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)是由用INFILTRATOR——一種壁內(nèi)傳遞裝置給予0.3-0.4ml包含4-6mg蛋白/血管ETC-216，apoA-IM/POPC(重量比約為1/1)復(fù)合體(n＝6只豬)或蔗糖-甘露醇介質(zhì)(n＝6只豬)并且隨后在各動(dòng)物的兩根冠狀血管中用支架展開(kāi)進(jìn)行過(guò)度牽張的經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀血管成形術(shù)的家豬所獲得的。劑量表示復(fù)合體中蛋白組分的重量。所顯示的是用來(lái)測(cè)定外膜邊界層(ABL)、外部彈性層(EEL)、內(nèi)部彈性層(IEL)、腔(L)、外膜(A)、中膜(M)、內(nèi)膜(I)的平均橫截面區(qū)域、內(nèi)膜與中膜比(I/M)和損傷得分的被擴(kuò)展動(dòng)脈的組織形態(tài)學(xué)分析。損傷得分是在被擴(kuò)張血管膨脹部位的近端(a)、中間(b)和遠(yuǎn)端(c)區(qū)段各測(cè)量12次而獲得的36次損傷測(cè)定的均值。將損傷記為0、1、2或3分，0表示完整的IEL(即沒(méi)有損傷)，3表示暴露于外膜的破裂的EEL(即最嚴(yán)重的損傷)。圖5a表示了所有血管(即RCA、左旋血管(left circumflex)(LCX)和LAD聯(lián)合)的組織形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)，圖5b所示的是相對(duì)于各類(lèi)型的血管(即RCA、LCX或LAD)而言的組織形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)。
本發(fā)明的詳細(xì)描述已經(jīng)開(kāi)發(fā)出的系統(tǒng)聚焦于在進(jìn)行對(duì)病態(tài)冠狀動(dòng)脈、外周動(dòng)脈和腦動(dòng)脈的旁路手術(shù)、手術(shù)植入移植物或移植器官、或血管成形術(shù)、或穩(wěn)定不穩(wěn)定的斑塊之前或期間可用于治療或預(yù)防再狹窄的物質(zhì)的局部應(yīng)用。該局部給藥優(yōu)選地是用一種包括可以在一定時(shí)間內(nèi)緩慢釋放藥物的儲(chǔ)庫(kù)的裝置來(lái)進(jìn)行的。該儲(chǔ)庫(kù)可以是該裝置如支架的一部分，或者可以通過(guò)注入到特定的組織或器官中來(lái)產(chǎn)生，例如通過(guò)心包內(nèi)或INFILTRATOR給藥來(lái)進(jìn)行。其可以用可通過(guò)商業(yè)途徑獲得的導(dǎo)管來(lái)完成。
被給藥的組合物可以是除去膽固醇和氧化脂質(zhì)的物質(zhì)(如與磷脂、他汀類(lèi)物質(zhì)、貝特類(lèi)物質(zhì)聯(lián)用的載脂蛋白)、編碼該類(lèi)物質(zhì)的DNA(例如，編碼載脂蛋白的DNA)或其它蛋白質(zhì)如在一氧化氮產(chǎn)生中所涉及的酶、和/或藥物如抗增生化合物如雷帕霉素、紫杉醇或抗體如替羅非班和阿昔單抗。
還可以使用組合治療，在所說(shuō)的組合治療中，藥物如ApoA-IM被局部給藥并且另一種藥物被全身給藥，例如全身抗高血壓治療、脂質(zhì)調(diào)節(jié)和/或抗凝治療?？梢允褂玫乃幬锏膶?shí)例包括脂質(zhì)調(diào)節(jié)劑如煙酸、他汀類(lèi)物質(zhì)、和貝特類(lèi)物質(zhì)；用于血糖控制的物質(zhì)；抗-高血壓藥；和預(yù)防或延遲凝血或血小板聚集的物質(zhì)，如其中所述的物質(zhì)是阿司匹林、IIb/IIIa抑制劑、氯吡格雷或肝素。
1.脂質(zhì)調(diào)節(jié)劑載脂蛋白制劑可起HDL作用的化合物包括合成的HDL，其包含與HDL關(guān)聯(lián)蛋白聯(lián)合的磷脂如磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、和其它磷脂，所說(shuō)的HDL關(guān)聯(lián)蛋白如apoA-I或其變體包括apoAI-Milano以及得自其的生物學(xué)活性的肽、逆脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)(RLT)肽、與HDL有關(guān)的酶如對(duì)氧磷酶、和apoE，其被單獨(dú)使用或與脂質(zhì)體或乳劑聯(lián)合進(jìn)行配制。這里所用的HDL關(guān)聯(lián)蛋白包括與HDL和具有相同連接或作用特性的合成肽相關(guān)聯(lián)的存在于HDL關(guān)聯(lián)蛋白中的序列。可增強(qiáng)HDL功能的化合物包括脂質(zhì)體，其中HDL穿梭般往返于細(xì)胞到脂質(zhì)體之間。University of British Columbia在WO 95/23592中對(duì)適宜的脂質(zhì)體制劑進(jìn)行了描述。
這里所描述的制劑典型地由α螺旋蛋白如ApoA-I、脂質(zhì)、以及載體組成。
ApoA-I和ApoA-IM是可用于治療或預(yù)防由于對(duì)病態(tài)冠狀動(dòng)脈、外周動(dòng)脈和腦動(dòng)脈進(jìn)行旁路手術(shù)、手術(shù)植入移植物或器官移植、或血管成形術(shù)所導(dǎo)致的狹窄的有代表性的成分。
血漿ApoA-I是一種由243個(gè)氨基酸組成的單多肽鏈，其一級(jí)序列是已知的(Brewer等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.80623-630(1978))。ApoA-I在細(xì)胞中是以267個(gè)氨基酸的前體合成的。這種前載脂蛋白原(preproapolipoprotein)A-I通過(guò)18個(gè)氨基酸的N-末端裂解首先在細(xì)胞內(nèi)被加工從而產(chǎn)生載脂蛋白原(proapolipoprotein)A-I，然后在血漿或淋巴中因特定蛋白酶活性被進(jìn)一步裂解了6個(gè)氨基酸從而產(chǎn)生載脂蛋白A-I。認(rèn)為ApoA-I分子所需的主要結(jié)構(gòu)是存在11或22個(gè)氨基酸的重復(fù)單元，假定其是以兩親性的螺旋構(gòu)型存在的(Segrest等人，F(xiàn)EBS Lett 38247-253(1974))。這種結(jié)構(gòu)與Apoa-I的主要生物學(xué)活性相關(guān)，所說(shuō)的主要生物學(xué)活性即脂質(zhì)結(jié)合和卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)活化。
人載脂蛋白AI-Milano(ApoA-IM)是ApoA-I的天然變體(Weisgraber等人，J.Clin.Invest 66901-907(1980))。在ApoA-IM中，氨基酸Arg173被氨基酸Cys173所代替。因?yàn)锳poA-IM每條多肽鏈包含一個(gè)Cys殘基，所以其可以以單體、均二聚物、或雜二聚物的形式存在。這些形式在化學(xué)上可以互換，并且在本文中術(shù)語(yǔ)ApoA-IM在這些形式之間并沒(méi)有差別。在DNA水平上，該變體形式是在該基因序列上由C至T的取代所產(chǎn)生的，即密碼子CGC變成TGC，從而使得在氨基酸173位上進(jìn)行了cys替代arg的轉(zhuǎn)換。但是，這種ApoA-I的變體是一種最引人注意的變體，這是因?yàn)锳poA-IM主體的特征為可顯著降低HDL-膽固醇水平而不會(huì)明顯增加動(dòng)脈疾病的風(fēng)險(xiǎn)(Franceschini等人，J.Clin.Invest 66892-900(1980))。
另一種有用的ApoA-I的變體是Paris變體，其中精氨酸151被半胱氨酸所代替。
在試驗(yàn)動(dòng)物和人初期臨床研究(Nanjee等人，Arterioscler ThrombVasc Biol.19979-989(1999)和Eriksson等人，Circulation.100594-598(1999))中已經(jīng)表明給予單獨(dú)的ApoA-I(Miyazaki等人，Arterioscer Thromb Vasc Biol.151882-1888(1995))或HDL(Badimon等人，Lab Invest.60455-461(1989)和J Clin Invest.851234-1241(1990))全身輸入可產(chǎn)生顯著的生物化學(xué)變化，還可以降低動(dòng)脈粥樣硬化損害的范圍和嚴(yán)重程度。如下面所詳細(xì)討論和被下面的實(shí)施例所證明的那樣，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其可在損害部位局部給藥并可顯著降低狹窄或再狹窄。
可以使用其他具有α螺旋特性的與HDL有關(guān)的載脂蛋白。實(shí)例包括Apo E、proApoA-I、ApoA-I Paris、ApoA-II、proApoA-II、ApoA-IV、ApoC-I、ApoC-II、和ApoC-III、這些蛋白中的α-螺旋序列、和被改性為包含一個(gè)或多個(gè)巰基(sulfhydral)的載脂蛋白，如Bielicki和Oda，Biochemistry 412089-2096(2002)所述的物質(zhì)。還可以使用另外的HDL關(guān)聯(lián)蛋白。實(shí)例包括對(duì)氧磷酶、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白、LCAT和磷脂轉(zhuǎn)移蛋白。上面的蛋白可以單獨(dú)使用、聯(lián)合使用、單獨(dú)與脂質(zhì)復(fù)合或聯(lián)合與脂質(zhì)復(fù)合。此外，還可以使用復(fù)合體的混合物。實(shí)例有由ApoA-I與脂質(zhì)所組成的復(fù)合體和由對(duì)氧磷酶和脂質(zhì)所組成的復(fù)合體以混合物形式給藥。另外的實(shí)例包括由一種以上蛋白組分所組成的復(fù)合體。例如，由ApoA-I、對(duì)氧磷酶和脂質(zhì)所組成的復(fù)合體是有用的。
脂質(zhì)脂質(zhì)與ApoA-I組成復(fù)合體可增強(qiáng)其功效。一般在給藥前將脂質(zhì)與ApoA-I進(jìn)行混合。將載脂蛋白和脂質(zhì)在水性溶液中以適宜比例進(jìn)行混合并且可以用現(xiàn)有技術(shù)中公知的方法來(lái)進(jìn)行復(fù)合，其包括冷凍-干燥、去污劑增溶然后透析、微流化、超聲處理、和勻化?？梢詫?fù)合效力最優(yōu)化，例如通過(guò)改變壓力、超聲頻率、或去污劑濃度來(lái)進(jìn)行優(yōu)化。制備載脂蛋白-脂質(zhì)復(fù)合體時(shí)常用的去污劑的實(shí)例是膽酸鈉。
在一些情況中，其希望在給藥前將脂質(zhì)和載脂蛋白進(jìn)行混合。脂質(zhì)可以在溶液中或可以是用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如超聲處理或擠出技術(shù)所形成的脂質(zhì)體或乳劑的形式。超聲處理一般是用頂式超聲處理器(tipsonifier)，如Branson頂式超聲處理器在冰浴中進(jìn)行的。一般將混懸液進(jìn)行幾次超聲處理循環(huán)。擠出可以用生物膜擠出機(jī)，如Lipex生物膜擠出機(jī)來(lái)進(jìn)行。在擠出過(guò)濾器中所設(shè)定的孔徑大小可以產(chǎn)生特定大小的單層脂質(zhì)體泡囊。還可以通過(guò)使其通過(guò)不對(duì)稱的陶瓷過(guò)濾器，如可以從Norton Company，Worcester Mass.通過(guò)商業(yè)途徑獲得的Ceraflow Microfilter或聚碳酸酯過(guò)濾器或通常所公知的其他類(lèi)型的聚合材料(即塑料)進(jìn)行擠出來(lái)形成脂質(zhì)體。
在一些情況中，其優(yōu)選地將單獨(dú)載脂蛋白以基本上不含脂質(zhì)的方式進(jìn)行給藥來(lái)對(duì)受損的動(dòng)脈進(jìn)行治療。將無(wú)菌的水性溶液加入到載脂蛋白中?？梢詫⒃谠撊芤褐械妮d脂蛋白進(jìn)行給藥以對(duì)受損的動(dòng)脈進(jìn)行治療?；蛘?，可以在給藥前將復(fù)合體的冷凍干燥制劑用水性溶液進(jìn)行水化。在其它情況中，在給藥于受損血管前將在水性溶液中的復(fù)合體的凍干制劑進(jìn)行解凍直至獲得一種均勻的溶液。
優(yōu)選的脂質(zhì)是磷脂類(lèi)物質(zhì)，最優(yōu)選地包括至少一種磷脂，有代表性的是大豆磷脂酰膽堿、蛋磷脂酰膽堿、大豆磷脂酰甘油、蛋磷脂酰甘油、棕櫚?；王；?磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、或二硬脂酰磷脂酰甘油。其他有用的磷脂類(lèi)物質(zhì)包括，例如，磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、鞘磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、N-(2，3-二(9-(Z)-十八碳烯氧基))-丙-1-基-N，N，N-三甲基銨氯化物、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、腦磷脂、心磷脂，腦苷脂、磷酸二(十六烷基)酯、二油?；字Ｄ憠A、二棕櫚?；字Ｄ憠A、二棕櫚酰基磷脂酰甘油、二油?；字８视汀⒂仓?棕櫚?；字Ｄ憠A、二-棕櫚?；字Ｒ掖及?、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基-磷脂酰絲氨酸、和二油酰基-磷脂酰膽堿。還可以使用不包含磷的脂質(zhì)，包括硬脂胺、十二烷基胺(docecylamine)、乙?；貦八狨?、和脂肪酸酰胺。
使用的另外的脂質(zhì)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的并且可以列舉許多眾所周知的來(lái)源，例如，McCutcheon’s Detergents andEmulsifiers and McCutcheon’s Functional Materials，AlluredPublishing Co.，Ridgewood，N.J.。一般而言，希望該脂質(zhì)在37℃、35℃或32℃下是液晶。液晶態(tài)的脂質(zhì)一般可以比凝膠態(tài)的脂質(zhì)更有效地接受膽固醇。因?yàn)榛颊咭话憔哂屑s37℃的中心溫度，所以在37℃下為液晶的脂質(zhì)在治療過(guò)程中一般為液晶態(tài)。
制劑中脂質(zhì)的濃度可以發(fā)生變化。普通技術(shù)人員可以對(duì)這些濃度進(jìn)行改變以將用不同脂質(zhì)組分進(jìn)行的治療或?qū)μ囟ɑ颊哌M(jìn)行的治療最優(yōu)化。ApoAI與脂質(zhì)以1∶0.5至1∶3的重量比組合，對(duì)于清除膽固醇而言優(yōu)選使用更多的脂質(zhì)。優(yōu)選地用約1∶1的比例來(lái)產(chǎn)生最均勻的組合群體并用于產(chǎn)生穩(wěn)定和可再生的批次。
其它脂質(zhì)調(diào)節(jié)藥還可以將化合物與可特定地增加HDL水平(即不是作為降低LDL的副產(chǎn)物)的化合物一起進(jìn)行給藥，從而改善HDL膽固醇與總膽固醇的比例，和這些物質(zhì)任何組合的給藥都可以有效改善HLD與總血膽固醇水平的比例。
藥物的實(shí)例包括脂質(zhì)調(diào)節(jié)劑如煙酸、他汀類(lèi)物質(zhì)、和貝特類(lèi)物質(zhì)。
抗增生藥可以用INFILTRATOR來(lái)釋放藥物如抗增生劑如紫杉醇和托泊替康(Biochemical Pharmacology，2001；61(1)119-127)。
基因傳遞在供選擇的實(shí)施方案中，可以將編碼待傳遞蛋白的基因進(jìn)行給藥，而不是將蛋白進(jìn)行給藥。可以用在質(zhì)?；虿《据d體中的遺傳物質(zhì)的直接轉(zhuǎn)移來(lái)獲得基因轉(zhuǎn)移，或者可以通過(guò)在細(xì)胞或載體如陽(yáng)離子脂質(zhì)體中的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移來(lái)進(jìn)行傳遞。該類(lèi)方法在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的并且對(duì)于在這里所描述的基因介導(dǎo)的毒素治療中的應(yīng)用而言是易于接受的。正如Francis等人，Am.J.Pharmacogenomics 1(1)55-66(2001)所綜述的那樣，基因治療提供了一種預(yù)防和治療心血管疾病的新方法。病毒載體系統(tǒng)中的技術(shù)進(jìn)步和梭原素(fusigenic)脂質(zhì)體載體的發(fā)展對(duì)于涉及動(dòng)物模型中脈管系統(tǒng)和心肌的有效基因治療策略的發(fā)展而言是很重要的。已經(jīng)對(duì)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)作為遺傳(家族性高膽固醇血癥)和獲得性閉合性血管疾病(動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄、動(dòng)脈血栓形成)以及心臟病癥的供選擇的治療的可能性進(jìn)行了評(píng)估，所說(shuō)的心臟病癥包括心衰、心肌局部缺血、移植冠狀動(dòng)脈硬化和高血壓。還可參見(jiàn)，Teiger等人，J.Cardiovasc.Pharmacol.33(5)726-732(1999)。
Wolff等人，Biotechniques 11474-85(1991)進(jìn)行的研究證明將裸DNA注射到肌肉中可以產(chǎn)生DNA序列中所編碼蛋白的長(zhǎng)期和低表達(dá)水平?？梢杂靡环N壁內(nèi)裝置如INFILTRATOR將裸DNA給藥于平滑肌層并使其表達(dá)用于治療受損血管的蛋白或其α螺旋狀區(qū)域。轉(zhuǎn)移載體可以是用于將基因傳遞到細(xì)胞內(nèi)的任何核苷酸構(gòu)造(例如，質(zhì)粒)，或可以是用于傳遞基因的通常策略的一部分，例如，作為重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒的一部分(Ram等人，Cancer Res.5383-88，(1993))。已經(jīng)對(duì)用于轉(zhuǎn)染的適宜方法進(jìn)行了描述，所說(shuō)的用于轉(zhuǎn)染的適宜方法包括病毒載體、化學(xué)轉(zhuǎn)染子、或物理-機(jī)械法如電穿孔和DNA的直接擴(kuò)散，所說(shuō)的描述例如，Wolff，J.A.等人，Science，247，1465-1468，(1990)；和Wolff，J.A.Nature，352，815-818，(1991)。這里所用的質(zhì)?；虿《据d體是可以將基因以不發(fā)生降解的方式轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)并包括在所傳遞到的細(xì)胞中產(chǎn)生基因表達(dá)的啟動(dòng)子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體得自病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒。優(yōu)選的病毒載體是腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、AIDS病毒、神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)性病毒(neuronal trophic virus)、辛德比斯和其它RNA病毒，包括那些具有HIV主鏈的病毒。還優(yōu)選的是可共享這些病毒適于作為載體的性質(zhì)的任何病毒族。優(yōu)選的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括鼠Maloney白血病病毒、MMLV、和表達(dá)MMLV作為載體的所需性質(zhì)的逆轉(zhuǎn)錄病毒。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能比其它病毒載體攜帶更多的遺傳有效負(fù)載，即，轉(zhuǎn)基因或標(biāo)記基因，因此，其是一種常用的載體。但是，其在非增生的細(xì)胞中無(wú)用。逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科的動(dòng)物病毒，包括任何類(lèi)型、亞科、屬、或向性。Verma，I.M.，在MICROBIOLOGY-1985，American Society for Microbiology，229-232頁(yè)，華盛頓(1985)中的“用于基因轉(zhuǎn)移的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體”中對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行了一般性描述。用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行基因治療的方法的實(shí)例在US專利號(hào)4,868,116和4,980,286；PCT申請(qǐng)WO 90/02806和WO 89/07136；以及Mulligan，(Science 260926-932(1993))中進(jìn)行了描述。
腺病毒載體相對(duì)較穩(wěn)定和易于以高滴度來(lái)運(yùn)轉(zhuǎn)，并且可以在氣霧劑制劑中被進(jìn)行釋放，可以對(duì)非分裂性細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。已經(jīng)對(duì)復(fù)制-有缺陷的腺病毒的構(gòu)造進(jìn)行了描述(Berkner等人，J.Virology611213-1220(1987)；Massie等人，Mol.Cell.Biol.62872-2883(1986)；Haj-Ahmad等人，J.Virology57267-274(1986)；Davidson等人，J.Virology611226-1239(1987)；Zhang “用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和PCR分析進(jìn)行的重組腺病毒的產(chǎn)生和鑒別”BioTechniques15868-872(1993))。用這些病毒作為載體的益處是在一定程度上限制了其向其它細(xì)胞類(lèi)型的擴(kuò)散，這是因?yàn)槠淇梢栽谧畛醣桓腥镜募?xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，但是不能形成新的有傳染性的病毒顆粒。已經(jīng)表明在直接體內(nèi)傳遞到呼吸道上皮、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮、CNS實(shí)質(zhì)和許多其它組織部位后重組的腺病毒可以獲高效的基因轉(zhuǎn)移(Morsy，J.Clin.Invest.921580-1586(1993)；Kirshenbaum，J.Clin.Invest.92381-387(1993)；Roessler，J.Clin.Invest.921085-1092(1993)；Moullier.Nature Genetics4154-159(1993)；La Salle，Science259988-990(1993)；Gomez-Foix，J.Biol.Chem.26725129-25134(1992)；Rich，Human Gene Therapy4461-476(199 3)；Zabner，Nature Genetics675-83(1994)；Guzman，Circulation Research731201-1207(1993)；Bout.Human Gene Therapy53-10(1994)；Zabner，Cell75207-216(1993)；Caillaud，Eur.J.Neuroscience51287-1291(1993)；和Ragot，J.Gen.Virology74501-507(1993))。
重組的腺病毒通過(guò)與特定的細(xì)胞表面受體進(jìn)行結(jié)合來(lái)完成基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，在所述與特定的細(xì)胞表面受體結(jié)合后，病毒通過(guò)受體所介導(dǎo)的胞吞而被內(nèi)在化，其方式與野生型或復(fù)制有缺陷的腺病毒相同(Chardonnet and Dales，Virology40462-477(1970)；Brown andBurlingham，J.Virology12386-396(1973)；Svensson and Persson，J.Virology55442-449(1985)；Seth等人，J.Virol.51650-655(1984)；Seth等人，Mol.Cell.Biol.41528-1533(1984)；Varga等人，J.Virology656061-6070(1991)；Wickham等人，Cell73309-319(1993))。
痘病毒載體大并且具有一些插入基因的部位，其耐熱并且可以在室溫下進(jìn)行儲(chǔ)存。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是被設(shè)計(jì)成可以抑制被該病毒抗原所激發(fā)的宿主有機(jī)體的免疫響應(yīng)的病毒載體。優(yōu)選的這種類(lèi)型的載體將攜帶白介素8或10的編碼區(qū)域。
病毒載體的處理能力(導(dǎo)入基因的能力)比大多數(shù)將基因引入到細(xì)胞中的化學(xué)或物理方法更高。典型地，病毒載體包含無(wú)結(jié)構(gòu)的早期基因、有結(jié)構(gòu)的晚期基因、RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄物、復(fù)制和包殼所需的末端反向重復(fù)、以及控制病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的啟動(dòng)子。當(dāng)被設(shè)計(jì)成載體時(shí)，病毒一般具有一個(gè)或多個(gè)被移除的早期基因和代替被除去的病毒DNA的被插入到病毒基因組中的基因或基因/啟動(dòng)子盒。這種類(lèi)型的構(gòu)造可以攜帶高至約8kb的外源遺傳物質(zhì)。被除去的早期基因的必需功能一般是由被設(shè)計(jì)用來(lái)表達(dá)反式早期基因的基因產(chǎn)物的細(xì)胞系所供給的。
在病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒中被插入的基因通常包含啟動(dòng)子、和/或用于幫助控制所需基因產(chǎn)品的表達(dá)的增強(qiáng)子。啟動(dòng)子一般是當(dāng)位于相對(duì)于轉(zhuǎn)錄開(kāi)始的位置而言相對(duì)固定的位置上時(shí)起作用的DNA序列或序列們。啟動(dòng)子包含RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子的基本相互作用所需的核心元素，并且可以包含上游元件和效應(yīng)元件。在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中控制由載體進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄的優(yōu)選的啟動(dòng)子可以得自各種來(lái)源，例如，病毒的基因組，所說(shuō)病毒如多瘤病毒、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、B型肝炎病毒并且最優(yōu)選地是巨細(xì)胞病毒，或得自異源哺乳動(dòng)物的啟動(dòng)子，例如β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子作為SV40的限制片段可以方便的獲得，其還包含SV40病毒的復(fù)制原點(diǎn)(Fiers等人，Nature，273113(1978))。人巨細(xì)胞病毒的直接早期啟動(dòng)子作為HindIIIE限制片斷可方便地獲得(Greenway，P.J.等人，Gene18355-360(1982))。當(dāng)然，得自宿主細(xì)胞或相關(guān)種屬的啟動(dòng)子在這里也是有用的。
增強(qiáng)子一般指的是在距離轉(zhuǎn)錄起始部位的不固定距離上起作用的DNA的序列并且相對(duì)于該轉(zhuǎn)錄單元而言可以是5′(Laimins，L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.78993(1981))或3′(Lusky，M.L.等人，Mol.Cell Bio.31108(1983))。此外，增強(qiáng)子可以位于內(nèi)含子內(nèi)(內(nèi)含子)(Banerji，J.L.等人，Cell 33729(1983))以及其本身的編碼序列內(nèi)(Osborne，T.F.等人，Mol.Cell Bio.41293(1984))。其長(zhǎng)度通常為10至300bp，并且其通常以順式形式起作用。增強(qiáng)子可以起增加由附近啟動(dòng)子所進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄的作用。增強(qiáng)子常常還包含介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的效應(yīng)元件。啟動(dòng)子也可包含介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的效應(yīng)元件。增強(qiáng)子常常決定基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。雖然現(xiàn)在許多增強(qiáng)子序列已知來(lái)自哺乳動(dòng)物的基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰島素)，但是其代表性的是來(lái)自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。優(yōu)選的實(shí)例是在復(fù)制原點(diǎn)最近側(cè)(late side)上的SV40增強(qiáng)子(bp100270)、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、位于復(fù)制原點(diǎn)最近側(cè)上的多瘤病毒增強(qiáng)子、和腺病毒增強(qiáng)子。
該啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子可以被光或可觸發(fā)其功能的特定的化學(xué)事件所特異性活化?？梢杂迷噭┤缢沫h(huán)素和地塞米松來(lái)對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。還有通過(guò)暴露于輻射如γ輻射或烷化化療藥來(lái)增強(qiáng)病毒載體基因表達(dá)的方法。
優(yōu)選地，該啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子區(qū)域作為組成型啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子將被轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄單位區(qū)域的表達(dá)最大化。還優(yōu)選地是該啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子區(qū)域在所有真核細(xì)胞類(lèi)型內(nèi)是有活性的。這種類(lèi)型的優(yōu)選的啟動(dòng)于是CMV啟動(dòng)子(650個(gè)堿基)。其它優(yōu)選的啟動(dòng)子有SV40啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(全長(zhǎng)啟動(dòng)子)、和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LTF。已經(jīng)表明所有特定的調(diào)節(jié)元件都可以被克隆并用于構(gòu)造在特定的細(xì)胞類(lèi)型中被選擇性表達(dá)的表達(dá)載體。
在宿主真核細(xì)胞中所用的表達(dá)載體還可以包含可以影響mRNA表達(dá)的轉(zhuǎn)錄終止所必需的序列。這些區(qū)域被轉(zhuǎn)錄為編碼組織因子蛋白的mRNA未轉(zhuǎn)譯部分中的聚腺苷?；瑪嗟男问?。3′未轉(zhuǎn)譯的區(qū)域還包括轉(zhuǎn)錄末端部分。優(yōu)選地，該轉(zhuǎn)錄單元還包含聚腺苷酸化區(qū)域。這種區(qū)域的一個(gè)益處是其增加了轉(zhuǎn)錄單元象mRNA一樣被加工和轉(zhuǎn)運(yùn)的可能性。已經(jīng)建立了聚腺苷酸化信號(hào)在表達(dá)構(gòu)造中的識(shí)別和應(yīng)用。優(yōu)選地，在該轉(zhuǎn)基因構(gòu)造中使用同源的聚腺苷酸化信號(hào)。在該轉(zhuǎn)錄單元一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該聚腺苷酸化區(qū)域得自SV40早期聚腺苷酸化信號(hào)并由約400個(gè)堿基所組成。還優(yōu)選地是該被轉(zhuǎn)錄的單元單獨(dú)或與上面的序列相聯(lián)合地包含其他標(biāo)準(zhǔn)序列從而改善了得自該構(gòu)造的表達(dá)或該構(gòu)造的穩(wěn)定性。
該病毒載體可以包括編碼標(biāo)記產(chǎn)品的核酸序列。這種標(biāo)記產(chǎn)品被用來(lái)測(cè)定該基因是否已被傳遞到細(xì)胞中和一旦被傳遞是否被表達(dá)。對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞而言可選擇的適宜標(biāo)記物的實(shí)例有二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸腺嘧啶脫氧核苷激酶、新霉素、新霉素類(lèi)似物G418、hydromycin、和嘌呤霉素。當(dāng)該類(lèi)可選擇的標(biāo)記物被成功地轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中時(shí)，如果被放置在選擇壓力下時(shí)，被改造的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞可存活。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在這些蛋白內(nèi)編碼ApoA-I、ApoA-IV、ApoE、對(duì)氧磷酶或α-螺旋狀區(qū)域的DNA的壁內(nèi)傳遞是在帶有或不帶有脂質(zhì)的情況下被傳遞到動(dòng)脈以對(duì)受損的血管進(jìn)行治療的。
還可以傳遞編碼許多不同蛋白的DNA。例如，如Chen等人，Jpn.J.Pharmacol.89(4)327-336(2002)所描述的那樣，心血管基因轉(zhuǎn)移不僅是用于研究心血管生物學(xué)和病理學(xué)中特定基因功能的有效技術(shù)，而且還是一種用于治療心血管疾病的有希望的策略。從20世紀(jì)90年代中期以來(lái)，作為一種心血管基因治療可能的候選物，一氧化氮合酶(NOS)——催化由L-精氨酸形成一氧化氮(NO)的酶——已經(jīng)受到了相當(dāng)大的注意，這是因?yàn)镹O在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要和多樣的作用，在許多心血管疾病過(guò)程中都出現(xiàn)了NO的生物學(xué)異常，所說(shuō)的心血管疾病包括腦血管痙攣、動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后的再狹窄、移植血管病、高血壓、糖尿病、陽(yáng)痿和傷口愈合延遲。有三種NOS同工型，即，內(nèi)皮的(eNOS)、神經(jīng)元的(nNOS)和可誘導(dǎo)的(iNOS)NOS。三種NOS同工型都已經(jīng)被用于心血管基因轉(zhuǎn)移研究中，并取得了令人鼓舞的結(jié)果。
Kipshidze等人，J.Am.Coll.Cardio.39(10)1686-1691(2002)描述了通過(guò)將反義寡核苷酸進(jìn)行壁內(nèi)傳遞來(lái)降低新內(nèi)膜的形成。
Turunen等人，Mol Ther 6(3)306(2002)，描述了用與可以結(jié)合到基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的肽-基元(motif)(HWGF)相結(jié)合的核靶向的lacZ-和TIMP-1-編碼腺病毒進(jìn)行的基因治療。與對(duì)照腺病毒相比，在體內(nèi)，局部血管內(nèi)導(dǎo)管介導(dǎo)的HWGF-靶向的TIMP-1-編碼腺病毒(AdTIMP-1(HWGF))的基因轉(zhuǎn)移顯著降低了兔子主動(dòng)脈囊剝脫模型中的內(nèi)膜增厚。
這里所公開(kāi)的方法的優(yōu)點(diǎn)是其在需要治療的部位可以在更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)提供傳遞和釋放。
用于全身治療的藥物可以將各種不同的藥物全身和/或局部給藥。這些藥物包括用于血糖控制的物質(zhì)；抗-高血壓藥；抗炎藥如甾類(lèi)抗炎藥、環(huán)加氧酶-2(COX-2)抑制劑，如西樂(lè)葆(Celebrex)、VIOXX、和環(huán)加氧酶抑制劑如布洛芬和非甾類(lèi)抗炎藥、以及預(yù)防或延遲凝血或血小板聚集的物質(zhì)如其中所說(shuō)的物質(zhì)是阿司匹林、IIb/IIIa抑制劑、氯吡格雷或肝素。
支架涂層還可以將支架僅用載脂蛋白、用與脂質(zhì)一起進(jìn)行配制的載脂蛋白、表達(dá)載脂蛋白或其他蛋白的細(xì)胞、編碼治療蛋白的DNA、或具有局部作用的藥物如紫杉醇、雷帕霉素或其他抗增生化合物來(lái)進(jìn)行涂布。然后該涂層在損傷、斑塊或待治療區(qū)域釋放藥物。
可藥用的載體該藥物組合物一般包括可藥用的載體。可以使用許多可藥用的載體。實(shí)例是使用蔗糖-甘露醇。一般用生理鹽水作為可藥用的載體。其它適宜的載體包括葡萄糖、海藻糖、蔗糖、無(wú)菌水、進(jìn)行了緩沖的水、0.4％的鹽水、和0.3％的甘氨酸，并且可進(jìn)一步包括用于增強(qiáng)穩(wěn)定性的糖蛋白，如白蛋白、載脂蛋白、脂蛋白、球蛋白等等。這些組合物可以用常規(guī)的眾所周知的滅菌技術(shù)來(lái)進(jìn)行滅菌。可以將所得的水性溶液進(jìn)行用于應(yīng)用的包裝或在無(wú)菌的條件下進(jìn)行過(guò)濾并凍干，可以在給藥前將該冷凍干燥的制劑與無(wú)菌的水性溶液相結(jié)合。該組合物可以根據(jù)需要包含可藥用的輔料以使其接近生理學(xué)條件，所說(shuō)的輔料如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、以及滲透壓調(diào)節(jié)劑，例如，醋酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、和氯化鈣。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，ApoA-I以凝膠、或可在給藥部位形成凝膠的聚合物溶液的形式來(lái)進(jìn)行給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，藻酸鈣和某些其他聚合物可以形成可延展的離子水凝膠。例如，可以通過(guò)海藻酸的陰離子鹽(一種由海藻分離出來(lái)的碳水化合物聚合物)與鈣陽(yáng)離子的交聯(lián)來(lái)制備水凝膠，可以通過(guò)增加鈣離子或藻酸根的濃度來(lái)增加其強(qiáng)度。將該藻酸鹽溶液與ApoA-I進(jìn)行混合從而形成一種在該混懸液硬化前可直接注射于患者的藻酸鹽混懸液。然后，該混懸液由于在體內(nèi)存在的生理學(xué)濃度的鈣離子而在短期內(nèi)硬化。可以合成改性的藻酸鹽衍生物，例如，可更迅速降解的物質(zhì)或用疏水性水不穩(wěn)定鏈進(jìn)行衍生化的物質(zhì)，例如(-己內(nèi)酯的低聚物，其具有形成水凝膠的改良的能力。此外，可以用與上面所描述的藻酸鹽的交聯(lián)的方法相似的方法來(lái)將多糖進(jìn)行交聯(lián)從而形成水凝膠，所說(shuō)的多糖通過(guò)與單價(jià)陽(yáng)離子進(jìn)行接觸而膠化，包括細(xì)菌多糖，如吉蘭糖膠，和植物多糖，如角叉菜膠。可用來(lái)形成水凝膠的物質(zhì)的其他的實(shí)例包括聚膦嗪和聚丙烯酸酯，其是離子交聯(lián)的、或嵌段共聚物如Pluronics TM或Tetronics TM、可以分別由溫度或pH來(lái)交聯(lián)的聚環(huán)氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物。其他材料包括聚合物如聚乙烯吡咯烷酮、透明質(zhì)酸和膠原。還可以使用是十分粘的液體或具有觸變性，并可以隨著時(shí)間的流逝通過(guò)結(jié)構(gòu)的緩慢演化形成凝膠的聚合物如多糖。例如，可以使用可形成一種具有類(lèi)似發(fā)膠的粘度的可注射凝膠的透明質(zhì)酸。改性的透明質(zhì)酸衍生物特別有用。還可以使用聚合物混合物。例如，可以使用混合時(shí)通過(guò)氫鍵膠化的聚環(huán)氧乙烷和聚丙烯酸的混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將5％w/w聚丙烯酸的溶液與5％w/w聚環(huán)氧乙烷(聚乙二醇、聚氧化乙烯)100,000的混合物聯(lián)用以在一定的時(shí)間過(guò)程中形成一種凝膠，例如可以在幾秒鐘內(nèi)迅速形成一種凝膠。
還可以使用可共價(jià)交聯(lián)的水凝膠前體。例如，可以將一種水溶性的聚胺，如殼聚糖與一種水溶性的二異硫氰酸酯，如聚乙二醇二異硫氰酸酯進(jìn)行交聯(lián)。異硫氰酸酯將可以與胺進(jìn)行反應(yīng)從而形成一種化學(xué)交聯(lián)的凝膠。還可以利用醛與胺的反應(yīng)，例如與聚乙二醇二醛的反應(yīng)。還可以使用羥基化的水溶性聚合物。
或者，可以使用包含一旦與自由基引發(fā)劑進(jìn)行接觸時(shí)可以通過(guò)自由基反應(yīng)來(lái)進(jìn)行交聯(lián)的取代基的聚合物。例如，如在WO 93/17699中所描述的那樣，可以使用包含可被光化學(xué)交聯(lián)的烯屬不飽和基團(tuán)的聚合物。此外，如Matsuda等人，ASAID Trans.，38154-157(1992)所公開(kāi)的那樣，可以使用包含可被光化學(xué)交聯(lián)的肉桂?；乃苄跃酆衔?。
該凝膠材料可以通過(guò)噴霧(在開(kāi)放式操作中)或通過(guò)INFILTRATOR或?qū)Ч?在封閉式操作中)來(lái)進(jìn)行應(yīng)用。一般而言，在凝固或聚合時(shí)將單獨(dú)的ApoA-I、與脂質(zhì)聯(lián)用的ApoA-I、或與脂質(zhì)復(fù)合的ApoA-I與這些凝膠進(jìn)行混合，然后使其在被治療脈管的表面緩慢向外擴(kuò)散。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，將該可藥用的載體涂布在支架上?？梢赃x擇以時(shí)間依賴方式來(lái)釋放本發(fā)明物質(zhì)的載體。普通技術(shù)人員可以對(duì)該載體進(jìn)行變化以獲得最優(yōu)的支架涂層從而獲得本發(fā)明物質(zhì)從該支架上時(shí)間依賴性的釋放。
II.治療方法在主要實(shí)施方案中，在對(duì)病態(tài)冠狀動(dòng)脈、外周和腦動(dòng)脈進(jìn)行旁路手術(shù)、用手術(shù)植入移植物或器官移植、或血管成形術(shù)、或?qū)Σ环€(wěn)定的斑塊進(jìn)行穩(wěn)定之前或進(jìn)行操作期間，用儲(chǔ)庫(kù)裝置如INFILTRATOR將膽固醇降低劑如載脂蛋白A-I(ApoA-I)，優(yōu)選變體形式如載脂蛋白A-IMilano(ApoA-IM)單獨(dú)進(jìn)行局部給藥或更優(yōu)選地將其與脂質(zhì)載體如磷脂或另一種藥物聯(lián)合進(jìn)行局部給藥，從而將有效劑量給藥于損傷部位。在其它實(shí)施方案中，可以使用相同的技術(shù)和材料以減少斑塊破裂的后果，所說(shuō)的后果包括血栓形成和局部缺血。
在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，與全身治療聯(lián)合開(kāi)始進(jìn)行局部治療，例如，與用于降低再狹窄、減少或預(yù)防斑塊破裂、降低血膽固醇、降低動(dòng)脈粥樣硬化損傷性膽固醇、減少凝血、調(diào)節(jié)一種或多種血液脂質(zhì)(即脂質(zhì)調(diào)節(jié)劑)、降低炎癥、或控制血壓的物質(zhì)聯(lián)用?？梢允褂玫乃幬锏膶?shí)例包括脂質(zhì)調(diào)節(jié)劑如煙酸、他汀類(lèi)物質(zhì)、和貝特類(lèi)物質(zhì)；用于控制血糖的物質(zhì)；抗-高血壓藥；和預(yù)防或延遲凝血或血小板聚集的物質(zhì)，如其中所說(shuō)的物質(zhì)是阿司匹林、IIb/IIIa抑制劑、氯吡格雷或肝素。這些另外的物質(zhì)一般以其正常的治療劑量被全身給藥。
可以通過(guò)將局部傳遞治療與一種或多種組合聯(lián)用來(lái)獲得最大的益處，例如使用局部傳遞加抗凝加脂質(zhì)調(diào)節(jié)。這些治療可以在局部傳遞之前開(kāi)始、與局部傳遞同時(shí)開(kāi)始或在局部傳遞之后開(kāi)始。該全身治療優(yōu)選地在局部傳遞操作之前開(kāi)始。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)一種壁內(nèi)傳遞裝置來(lái)將Apo A-I制劑進(jìn)行給藥，所說(shuō)的壁內(nèi)釋放裝置如得自IntraventionalTechnologies，Inc，San Diego，CA(現(xiàn)在被Boston Scientific所擁有)的INFILTRATOR。Pavlides等人，Cathet.Cardiovasc.Diagn.41(3)287-292(1997)描述了另一種有用的裝置。其它的傳遞手段可以使用在血管成形術(shù)前、在囊膨脹期間或膨脹后，由儲(chǔ)庫(kù)傳遞藥物的導(dǎo)管。
在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，在治療前或在治療時(shí)將ApoA-IM制劑以單劑量進(jìn)行給藥。治療包括血管成形術(shù)，病態(tài)冠狀動(dòng)脈、外周動(dòng)脈或腦動(dòng)脈的旁路手術(shù)，植入血管支架，植入所移植的器官或組織，和穩(wěn)定斑塊。
如下面ApoA-IM實(shí)施例中所做的那樣，優(yōu)選劑量是通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究來(lái)決定的。以ApoA-IM的劑量為基礎(chǔ)，考慮膽固醇移除功效、半衰期、和其它相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)之間的差異，可以容易地計(jì)算出其他載脂蛋白的劑量?；蛘?，可以通過(guò)考慮該制劑抗氧化、抗炎和抗血栓形成性質(zhì)在功效上的差異來(lái)容易地計(jì)算其他載脂蛋白的劑量。以得自ApoA-IM的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，可以相似地決定不同制劑所存在的脂質(zhì)和脂質(zhì)的數(shù)量。
一般而言，該制劑被給藥于治療部位。局部傳遞時(shí)的實(shí)際劑量顯著低于獲得相同局部劑量時(shí)所需的被全身給藥的劑量，但是，局部濃度卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以前將ApoA-I全身給藥的研究所獲得的濃度。如上面所表明的那樣，ApoA-IM的優(yōu)選劑量為4至6mg ApoA-IM/血管(一般用約4至18mg ApoA-IM的總劑量可以對(duì)至多三個(gè)區(qū)段進(jìn)行治療)，或?qū)τ?0kg的哺乳動(dòng)物而言為約0.05至0.3mg ApoA-IM/kg體重。蛋白與脂質(zhì)的優(yōu)選比例為1∶0.5至1∶3，對(duì)于膽固醇的清除而言可以使用更多的脂質(zhì)，但是出于制劑的穩(wěn)定性和連續(xù)性考慮，更優(yōu)選更為接近等量的蛋白與脂質(zhì)，以便管理部門(mén)批準(zhǔn)。對(duì)于除這些包含apoA-IM制劑之外制劑的蛋白與脂質(zhì)的比例而言，在各種蛋白與脂質(zhì)比例下進(jìn)行試驗(yàn)，并且確定所述穩(wěn)定性以及連續(xù)性以及各特征(如復(fù)合體大小以及膽固醇流量)，以便管理部門(mén)批準(zhǔn)。
雖然已經(jīng)證明單次給藥有效，但是也可以進(jìn)行多劑量給藥。例如，在進(jìn)行操作后4周，相對(duì)于對(duì)照組而言，在第-1、0、1、2、和3天靜脈內(nèi)給予20mg ApoA-IM/kg體重使得所有囊過(guò)度膨脹損傷的血管都表現(xiàn)出增加的腔面積。
將參考下面非限制性的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明。
經(jīng)皮的冠狀動(dòng)脈干預(yù)是現(xiàn)在用于增加患有冠狀動(dòng)脈局部缺血患者狹窄血管腔的主要方法。這些操作是通過(guò)通常被成為“氣脹術(shù)”的經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀血管成形術(shù)(PTCA)來(lái)進(jìn)行的。在大多數(shù)情況中，該操作是通過(guò)支架在被膨脹區(qū)域展開(kāi)以增加血管直徑從而增加血流并緩解局部缺血來(lái)完成的。主要缺陷是操作后被稱為再狹窄的血管腔閉合。在不存在支架時(shí)，術(shù)后早期反彈和血栓形成的發(fā)生率很成問(wèn)題，因此，目前大多數(shù)囊操作還包括支架的展開(kāi)。雖然支架展開(kāi)操作改善了后果，但是術(shù)后被展擴(kuò)血管的新內(nèi)膜生長(zhǎng)可造成再狹窄和再發(fā)性局部缺血或其他冠狀血管事件，包括心肌梗死。因此，需要一些用于預(yù)防用囊和支架進(jìn)行了處理的血管的新內(nèi)膜生長(zhǎng)的方法來(lái)改善術(shù)后的結(jié)果。選擇豬模型作為用于此研究的適宜試驗(yàn)系統(tǒng)。文獻(xiàn)中的證據(jù)表明豬模型中的動(dòng)脈擴(kuò)張和再狹窄與人再狹窄的情形相似。因此，可以用這種模型來(lái)對(duì)可能用于臨床再狹窄治療的治療物質(zhì)進(jìn)行評(píng)估。
實(shí)施例1單一高劑量靜脈內(nèi)給予ETC-216——一種包含由ApoA-IM和棕櫚?；?油酰基-磷脂酰膽堿(POPC)所組成的復(fù)合體的制劑，對(duì)被展擴(kuò)豬冠狀動(dòng)脈中過(guò)度牽張的經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀血管成形術(shù)(PTCA)中再狹窄的作用。
這項(xiàng)研究的目的是要測(cè)定在進(jìn)行冠狀動(dòng)脈PTCA和支架放置過(guò)程中進(jìn)行ETC-216的單一靜脈內(nèi)藥物傳遞對(duì)血管損傷的豬模型中的再狹窄的作用。
材料和方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇豬模型來(lái)作為用于此研究的適宜實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。文獻(xiàn)中的證據(jù)表明豬模型中的動(dòng)脈擴(kuò)張和再狹窄與人再狹窄中的相似。因此，可以用這種模型對(duì)可能可用于治療再狹窄的治療物質(zhì)進(jìn)行評(píng)估。使動(dòng)物至少有7天的時(shí)間來(lái)適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，并且在開(kāi)始研究前對(duì)動(dòng)物進(jìn)行檢查以確保其健康。
在留驗(yàn)期間和手術(shù)前，使動(dòng)物單獨(dú)居住進(jìn)行飼養(yǎng)。每天清潔兩次動(dòng)物籠子。對(duì)動(dòng)物籠子的溫度和濕度(70-78°F；30-80％RH)進(jìn)行監(jiān)測(cè)以將其維持在70-80℃和30-80％的相對(duì)濕度下。房間里的氣流足以提供每小時(shí)用100％新鮮的進(jìn)行了過(guò)濾的空氣進(jìn)行幾次交換。用自動(dòng)計(jì)時(shí)裝置來(lái)提供日夜12-小時(shí)循環(huán)交替。在手術(shù)后，使動(dòng)物在恢復(fù)室中進(jìn)行恢復(fù)，然后將其放回到籠子里。除進(jìn)行手術(shù)的日子里動(dòng)物被禁食一整夜外，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，每天給動(dòng)物喂食一餐得自Newco(Rancho Cucamonga，CA)的豬飼料(Southwest Farms Hog FinisherDiet)。通過(guò)一種自動(dòng)供水系統(tǒng)使動(dòng)物隨意飲用新鮮的水。
對(duì)動(dòng)物隨機(jī)進(jìn)行選擇并將其分成兩個(gè)研究組。當(dāng)動(dòng)物因手術(shù)操作或認(rèn)為是由于手術(shù)操作而導(dǎo)致的并發(fā)癥死亡或不得不被安樂(lè)死時(shí)，指定另外的動(dòng)物進(jìn)行研究。
試驗(yàn)物質(zhì)包括ETC-216，一種由Esperion Therapeutics，Inc.提供的重組的載脂蛋白A-I Milano/1-棕櫚?；?2-油酰基磷脂酰膽堿(POPC)復(fù)合體，其為易于注射的溶液或鹽水形式。ETC-216溶液包含約14mg/ml apoA-IM蛋白，蛋白與POPC的比例為重量比約1∶1。
對(duì)這種研究而言選擇靜脈內(nèi)給藥，這是因?yàn)檫@是將用于人類(lèi)臨床研究的途徑。根據(jù)動(dòng)物體重來(lái)對(duì)劑量進(jìn)行選擇。將試驗(yàn)物質(zhì)以100mg/kg體重的劑量進(jìn)行給藥。這種劑量是以該復(fù)合體的載脂蛋白含量為基礎(chǔ)的。因此，在該研究中平均一只豬接受約3000-3500mg藥物。對(duì)照動(dòng)物使用鹽水。
用成年的家豬(重約30-35kg，一只重50kg)來(lái)進(jìn)行手術(shù)。使動(dòng)物正常進(jìn)食和居住。在手術(shù)前將豬禁食一整夜并于手術(shù)前3天對(duì)其進(jìn)行口服325mg阿司匹林的預(yù)處理并且其后每天進(jìn)行該處理直至安樂(lè)死。在手術(shù)開(kāi)始前3天給動(dòng)物使用噻氯匹定(250mg)并在手術(shù)后每天給藥，給藥14天。在禁食一整夜16小時(shí)后，將動(dòng)物固定并給其肌內(nèi)(IM)注射乙酰丙嗪(0.5mg/kg)、氯胺酮(20mg/kg)、和阿托品(0.05mg/kg)；通過(guò)靜脈內(nèi)(IV)給予硫噴妥(5-8mg/kg)來(lái)誘導(dǎo)麻醉；并在氣管插管后通過(guò)1-2％異氟烷來(lái)進(jìn)行維持。在操作期間進(jìn)行機(jī)械換氣、動(dòng)脈血壓(BP)和連續(xù)的心電圖(ECG)監(jiān)測(cè)。在手術(shù)后2天每天給動(dòng)物使用鹽酸地爾硫(cardizem)(120mg)。
手術(shù)操作包括暴露頸動(dòng)脈，然后將一個(gè)8F鞘插入到該頸動(dòng)脈中。在進(jìn)行動(dòng)脈器械操作前給動(dòng)物使用托西溴芐銨(250mg IV)、鹽酸普萘洛爾(inderal)(1mg)和肝素(10,000U IV)。在手術(shù)操作開(kāi)始前90分鐘給動(dòng)物使用ETC-216或鹽水，從而在約3小時(shí)內(nèi)將整個(gè)劑量進(jìn)行給藥。在熒光鏡的引導(dǎo)下，使一根8F AL-0.75引導(dǎo)導(dǎo)管前進(jìn)到頸動(dòng)脈口。在冠狀動(dòng)脈內(nèi)給予硝酸甘油(200mcg)后，進(jìn)行血管造影術(shù)以對(duì)血管的大小進(jìn)行評(píng)估。在第一個(gè)血管中完成支架過(guò)度牽張的損傷，然后在第二個(gè)血管中重復(fù)進(jìn)行。在所有的情況中，將支架在LAD和RCA中展開(kāi)。用作為解剖學(xué)參考的斜或間隔支的位置使支架在LAD和RCA中在直徑平均為2.7至3.0mm的區(qū)段展開(kāi)。所有的支架都是用一種囊來(lái)展開(kāi)的，所說(shuō)的囊在30秒內(nèi)膨脹1至3次至6-8個(gè)大氣壓以達(dá)到最終支架動(dòng)脈的比例約為1.3∶1。開(kāi)始進(jìn)行血管造影術(shù)以對(duì)準(zhǔn)支架位置并進(jìn)行重復(fù)以確認(rèn)在支架展開(kāi)部位跡象為損傷區(qū)段明顯“遞升”或“遞降”的損傷。將該導(dǎo)管撤回，將進(jìn)行了結(jié)扎的頸動(dòng)脈和皮膚切口閉合。為了預(yù)防感染，在該操作結(jié)束時(shí)給所有的動(dòng)物都使用抗生素。動(dòng)物從麻醉中恢復(fù)過(guò)來(lái)，回到動(dòng)物飼養(yǎng)室中，喂食添加有如上所述的藥物的常規(guī)飼料。
血管造影術(shù)和IVUS測(cè)量用定量的冠狀動(dòng)脈血管造影術(shù)(QCA)來(lái)在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)平均和最小的腔直徑進(jìn)行評(píng)估，即，在損傷前、緊接損傷后和安樂(lè)死前28-29天隨訪時(shí)進(jìn)行評(píng)估。
在定量期間所用術(shù)語(yǔ)的定義冠狀血管造影術(shù)MLD＝平均腔直徑R1＝近端區(qū)段的參考區(qū)段(未展擴(kuò)的)Prox.＝被展擴(kuò)動(dòng)脈的近端區(qū)段Mid.＝被展擴(kuò)動(dòng)脈的中間區(qū)段Dist.＝被展擴(kuò)動(dòng)脈的遠(yuǎn)端區(qū)段R2＝遠(yuǎn)端區(qū)段的參考區(qū)段(未展擴(kuò)的)Max＝在整個(gè)展擴(kuò)區(qū)段中最大腔直徑Min＝在整個(gè)展擴(kuò)區(qū)段中最小腔直徑腔增量＝損傷后的腔直徑減去損傷前的腔直徑腔損失＝損傷后的腔直徑減去28天隨訪時(shí)的腔直徑用未損傷區(qū)段作為參考對(duì)損傷區(qū)段的狹窄百分比進(jìn)行估計(jì)。用血管內(nèi)超聲(IVUS)測(cè)量了支架區(qū)域、腔區(qū)域、新內(nèi)膜區(qū)域、狹窄區(qū)域％參數(shù)。
根據(jù)囊損傷后立即測(cè)量的MLD和在28-29天隨訪時(shí)測(cè)量的MLD之間的差異來(lái)計(jì)算晚期腔損失，并且通過(guò)用晚期腔損失除以損傷后的MLD來(lái)計(jì)算改型指數(shù)。
在隨訪時(shí)冠狀動(dòng)脈的分析在28(n＝8)或29(n＝1)天后，為進(jìn)行隨后的血管造影術(shù)，將動(dòng)物禁食一整夜并如上進(jìn)行手術(shù)前處理。(在一個(gè)在第27天死亡的用生理鹽水處理的對(duì)照動(dòng)物中，僅進(jìn)行組織學(xué)分析)。此外，在隨后，對(duì)于各被展擴(kuò)動(dòng)脈的IVUS研究而言，將IVUS導(dǎo)管在被展擴(kuò)冠狀動(dòng)脈中展開(kāi)。然后在用IV戊巴比妥90mg/kg進(jìn)行麻醉的情況下將動(dòng)物安樂(lè)死，在血管切開(kāi)術(shù)后切除心臟。用鹽水對(duì)冠狀動(dòng)脈進(jìn)行灌注以清除血液，然后用2％低聚甲醛固定灌注15分鐘，然后用4％在磷酸緩沖液(pH7.4)中的低聚甲醛浸漬4小時(shí)，最后將其存儲(chǔ)于70％的乙醇中。為了保持外膜和血管周組織的完整性，小心地將冠狀動(dòng)脈同毗連的組織(脂肪組織和心肌)一起摘除下來(lái)。對(duì)于被展擴(kuò)區(qū)段而言，進(jìn)行特定的組織學(xué)處理以用金屬支柱在原位維持血管的體系結(jié)構(gòu)。將組織塊埋入到甲基丙烯酸甲酯中并用金剛石刃的刀對(duì)其進(jìn)行切割。切下三個(gè)包含12個(gè)支柱的放射狀的橫截面一個(gè)得自各支架的近端三分之一處、一個(gè)得自各支架的中間三分之一處和一個(gè)得自各支架的遠(yuǎn)端三分之一處。將這些部分研磨至約50μm的厚度，進(jìn)行光學(xué)拋光，并用甲苯胺藍(lán)(paragon染色劑)進(jìn)行染色。
組織形態(tài)學(xué)分析使用用電腦進(jìn)行處理的成像系統(tǒng)(Image Pro Plus 4.0)來(lái)進(jìn)行下面的組織形態(tài)學(xué)測(cè)量1.平均的橫截面面積和腔厚度(被內(nèi)膜/新內(nèi)膜-腔邊緣所圍繞著的區(qū)域)；新內(nèi)膜(腔和內(nèi)部彈性層之間的區(qū)域，IEL，并且當(dāng)IEL消失時(shí)，為腔和中膜或外部彈性層的殘余物之間的區(qū)域，EEL)；中膜(IEL和EEL之間的區(qū)域)；血管大小(被EEL所圍繞的區(qū)域但是不包括外膜區(qū)域)；和外膜(外膜周組織、脂肪組織和心肌、以及EEL間的區(qū)域)。
2.損傷得分。為了對(duì)血管損傷程度進(jìn)行定量，進(jìn)行以不同壁結(jié)構(gòu)破裂的數(shù)量和長(zhǎng)度為基礎(chǔ)的評(píng)分。損傷程度的計(jì)算如下0＝完整的IEL1＝暴露于淺中間層的破裂的IEL
2＝暴露于較深的中間層(中間解剖層)的破裂的IEL3＝暴露于外膜的破裂的EEL結(jié)果用五只用鹽水進(jìn)行了處理的家豬或五只用ETC-216進(jìn)行了處理的豬(每組四只雄性和一只雌性豬)來(lái)對(duì)治療后27-29天的再狹窄進(jìn)行評(píng)估。
在研究過(guò)程中，血液得自一些而不是所有的動(dòng)物，用其來(lái)對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量、血細(xì)胞比容％、血小板計(jì)數(shù)進(jìn)行測(cè)量。在對(duì)這些血變量進(jìn)行測(cè)量的所有情況中，與基準(zhǔn)值相比，治療后的值并沒(méi)有發(fā)生可觀的改變。即，其都在正常的范圍內(nèi)。
測(cè)量所有進(jìn)入研究時(shí)的動(dòng)物的心率和血壓作為基準(zhǔn)。在手術(shù)操作過(guò)程中和處死前也對(duì)大多數(shù)動(dòng)物的心率和血壓進(jìn)行了測(cè)量。對(duì)于進(jìn)入研究的動(dòng)物而言，這些變量與基準(zhǔn)值相比沒(méi)有由于進(jìn)行了手術(shù)操作或治療而發(fā)生可觀的改變。
在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行定量的冠狀動(dòng)脈血管造影術(shù)(QCA)的測(cè)量冠狀動(dòng)脈損傷前、緊接冠狀動(dòng)脈損傷后和支架展開(kāi)后、和處死前(圖1a和圖1b)。在接近支架的未展擴(kuò)區(qū)段(R1)、支架的近端部分(Prox)、支架整個(gè)長(zhǎng)度的平均區(qū)域(Aver)、支架的遠(yuǎn)端部分(Dist)和遠(yuǎn)離支架的未展擴(kuò)區(qū)段(R2)進(jìn)行直徑測(cè)量(mm)。此外，測(cè)量被展擴(kuò)區(qū)域的最大直徑(Max)和最小直徑(Min)。在被展擴(kuò)和毗連的未展擴(kuò)區(qū)段測(cè)量腔增量和腔損失的QCA評(píng)估。測(cè)定了被擴(kuò)展血管的最大(腔損失最大指數(shù))和最小(腔損失最小指數(shù))指數(shù)。圖1a和1b分別圖示了對(duì)于所有血管(即RCA和LAD聯(lián)合)或各種類(lèi)型的血管(即RCA或LAD)而言定量的冠狀血管造影術(shù)數(shù)據(jù)。
用血管內(nèi)超聲(IVUS)來(lái)測(cè)量處死前各擴(kuò)展的冠狀動(dòng)脈血管遠(yuǎn)端、中間和近端區(qū)域處的支架和腔面積。這些測(cè)量之間的差異是新內(nèi)膜面積。測(cè)量各動(dòng)物和區(qū)段的支架、腔和新內(nèi)膜區(qū)域的均值，并用其來(lái)測(cè)量匯集(LAD加RCA)的或各冠狀血管(LAD或RCA)治療組的均值。一只對(duì)照處理的豬在其預(yù)定操作前一天(即在第27天)死亡，因此，僅對(duì)其擴(kuò)展的冠狀血管進(jìn)行了組織形態(tài)學(xué)測(cè)量。圖2a和2b分別圖示了對(duì)于所有血管(即RCA和LAD聯(lián)合)和各種類(lèi)型的血管(即RCA或LAD)而言的血管內(nèi)超聲數(shù)據(jù)。
用被擴(kuò)展動(dòng)脈的組織形態(tài)學(xué)分析來(lái)測(cè)量外膜邊界層(ABL)、外部彈性層(EEL)、內(nèi)部彈性層(IEL)、腔(L)、外膜(A)、中膜(M)、內(nèi)膜(I)的平均橫截面區(qū)域、內(nèi)膜與中膜比(I/M)和損傷得分。損傷得分是在被展擴(kuò)血管膨脹部分的近端(a)、中間(b)和遠(yuǎn)端(c)區(qū)段各測(cè)量12次而獲得的36次損傷測(cè)定的均值。將損傷記為0、1、2或3分，0表示完整的IEL(即沒(méi)有損傷)，3表示暴露于外膜的破裂的EEL(即最嚴(yán)重的損傷)。
ETC-216治療顯著降低了冠狀血管內(nèi)膜與中膜(I/M)的比值，將其降低了32％(RCA和LAD聯(lián)合)。這種作用主要是由于LAD的I/M比例有38％的顯著降低和RCA有較小程度的22％的降低(不顯著)。應(yīng)當(dāng)注意的是，對(duì)于損傷而言，RCA(損傷得分＝1.87±0.54)比LAD(損傷得分＝2.57±0.34)的反彈更顯著。圖3a和3b分別圖示了所有血管(即，RCA和LAD聯(lián)合)和各種類(lèi)型的血管(即RCA或LAD)的組織形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)。圖4表示了組織形態(tài)學(xué)和IVUS變量之間的選擇相關(guān)性。
實(shí)施例2INFILTRATOR壁內(nèi)傳遞ETC-216——一種包含由ApoA-IM和棕櫚酰基-油?；?磷脂酰膽堿(POPC)所組成的復(fù)合體的制劑對(duì)豬冠狀動(dòng)脈中伴有支架展開(kāi)的過(guò)度牽張的經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀血管成形術(shù)(PTCA)中再狹窄的作用。
材料和方法用體重為25-30kg的成年家豬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。給動(dòng)物喂食常規(guī)飼料并將其在動(dòng)物飼養(yǎng)室中進(jìn)行喂養(yǎng)。在手術(shù)前將豬禁食一整夜并于術(shù)前3天對(duì)其進(jìn)行口服阿司匹林(325mg)的預(yù)處理并且其后每天對(duì)其進(jìn)行該處理直至安樂(lè)死。在手術(shù)開(kāi)始前3天給動(dòng)物使用噻氯匹定(250mg)并在手術(shù)后每天給藥，給藥14天。在手術(shù)后2天每天給動(dòng)物使用鹽酸地爾硫(120mg)。
在禁食一整夜16小時(shí)后，將動(dòng)物固定并給其肌內(nèi)(IM)注射乙酰丙嗪(0.5mg/kg)、氯胺酮(20mg/kg)、和阿托品(0.05mg/kg)；通過(guò)靜脈內(nèi)(IV)給予硫噴妥(5-8mg/kg)來(lái)誘導(dǎo)麻醉；并在氣管插管后通過(guò)1-2％異氟烷來(lái)進(jìn)行維持。在操作期間進(jìn)行機(jī)械換氣、動(dòng)脈血壓(BP)和連續(xù)的心電圖(ECG)監(jiān)測(cè)。
手術(shù)操作包括暴露頸動(dòng)脈，然后將一個(gè)8F鞘插入到該頸動(dòng)脈中。在進(jìn)行動(dòng)脈器械操作干預(yù)前給動(dòng)物使用托西溴芐銨(250mg IV)、鹽酸普萘洛爾(1mg)和肝素(8,000U IV)。在熒光鏡的引導(dǎo)下，使一根8F AL-0.75引導(dǎo)導(dǎo)管前進(jìn)到頸動(dòng)脈口。在冠狀動(dòng)脈內(nèi)給予硝酸甘油(200mcg)后，對(duì)三個(gè)冠狀動(dòng)脈都進(jìn)行定量的冠狀動(dòng)脈血管造影術(shù)以對(duì)血管的大小進(jìn)行評(píng)估。選擇兩個(gè)最大的血管來(lái)進(jìn)行該操作。在用支架展開(kāi)的PTCA前在該手術(shù)操作中通過(guò)INFILTRATOR壁內(nèi)給予ETC-216或蔗糖-甘露醇介質(zhì)。引入INFILTRATOR導(dǎo)管來(lái)以十分低的劑量向冠狀動(dòng)脈血管壁傳遞ETC-216或蔗糖-甘露醇介質(zhì)以將進(jìn)入到循環(huán)中的藥劑的損失降到最低。用4-6mg ETC216或蔗糖-甘露醇介質(zhì)各自以0.3-0.4ml的給藥體積對(duì)各動(dòng)物的兩個(gè)動(dòng)脈進(jìn)行滲透。因此，各動(dòng)物在位于兩個(gè)動(dòng)脈區(qū)段處一共接受總劑量為約8-12mg的ETC-216。在伴有支架展開(kāi)的囊過(guò)度膨脹前在傳遞ETC-216或蔗糖-甘露醇介質(zhì)過(guò)程中通過(guò)將所連接的囊膨脹一次至1.5-2個(gè)大氣壓的壓力來(lái)使各動(dòng)脈進(jìn)行滲透操作。在滲透操作后，用斜的或間隔的支作為解剖學(xué)參考，將支架在LAD、RCA、和LCX進(jìn)行了滲透的部分中精確展開(kāi)。所有的支架都是用一種囊來(lái)展開(kāi)的，所說(shuō)的囊在30秒內(nèi)膨脹1至3次至6-8個(gè)大氣壓以達(dá)到最終支架動(dòng)脈的比例約為1.3∶1。開(kāi)始進(jìn)行血管造影術(shù)以對(duì)準(zhǔn)支架位置并進(jìn)行重復(fù)以確認(rèn)在支架擴(kuò)展部位跡象為損傷部位明顯“遞升”或“遞降”的損傷。將該導(dǎo)管撤回，將進(jìn)行了結(jié)扎的頸動(dòng)脈和皮膚切口閉合。為了預(yù)防感染，在該操作結(jié)束時(shí)給所有的動(dòng)物都使用抗生素。動(dòng)物從麻醉中恢復(fù)過(guò)來(lái)，回到動(dòng)物飼養(yǎng)室中，喂食添加有如上所述的藥物的常規(guī)飼料。
血管造影術(shù)和IVUS測(cè)量用定量的冠狀動(dòng)脈血管造影術(shù)(QCA)來(lái)在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)平均和最小的腔直徑進(jìn)行評(píng)估，即，在損傷前、緊接損傷后和安樂(lè)死前在28天隨訪時(shí)進(jìn)行評(píng)估。根據(jù)囊損傷后立即測(cè)量的MLD和在28天隨訪時(shí)測(cè)量的MLD之間的差異來(lái)計(jì)算晚期腔損失，并且通過(guò)用晚期腔損失除以損傷后的MLD來(lái)計(jì)算改型指數(shù)。
在定量期間所用術(shù)語(yǔ)的定義冠狀血管造影術(shù)R1＝近端區(qū)段的參考區(qū)段(未展擴(kuò)的)P＝被展擴(kuò)動(dòng)脈的近端區(qū)段
M＝被展擴(kuò)動(dòng)脈的中間區(qū)段D＝被展擴(kuò)動(dòng)脈的遠(yuǎn)端區(qū)段R2＝遠(yuǎn)端區(qū)段的參考區(qū)段(未展擴(kuò)的)Max＝在整個(gè)展擴(kuò)區(qū)段中最大的腔直徑Min＝在整個(gè)展擴(kuò)區(qū)段中最小的腔直徑腔增量＝損傷后的腔直徑減去損傷前的腔直徑腔損失＝損傷后的腔直徑減去28天隨訪時(shí)的腔直徑用未被損傷部分作為參考對(duì)損傷部分的狹窄百分比進(jìn)行估計(jì)。測(cè)量支架區(qū)域、腔區(qū)域、新內(nèi)膜區(qū)域、狹窄區(qū)域(都是用IVUS進(jìn)行的)。
在隨訪時(shí)冠狀動(dòng)脈的分析在28天后，為進(jìn)行隨后的血管造影術(shù)，將動(dòng)物禁食一整夜并如上進(jìn)行手術(shù)前處理。此外，在隨后，對(duì)于各被展擴(kuò)動(dòng)脈的IVUS研究而言，將IVUS導(dǎo)管在被展擴(kuò)冠狀動(dòng)脈中展開(kāi)。然后在用IV戊巴比妥90mg/kg進(jìn)行麻醉的情況下將動(dòng)物安樂(lè)死，在血管切開(kāi)術(shù)后切除心臟。用鹽水對(duì)冠狀動(dòng)脈進(jìn)行灌注以清除血液，然后用2％低聚甲醛固定灌注15分鐘，然后用4％在磷酸緩沖液(pH7.4)中的低聚甲醛浸漬4小時(shí)，最后將其存儲(chǔ)于70％的乙醇中。為了保持外膜和血管周組織的完整性，小心地將冠狀動(dòng)脈同毗連的組織(脂肪組織和心肌)一起摘除下來(lái)。對(duì)于被展擴(kuò)區(qū)段而言，進(jìn)行特定的組織學(xué)處理以用金屬支柱在原位維持血管的體系結(jié)構(gòu)。將組織塊埋入到甲基丙烯酸甲酯中并用金剛石刃的刀對(duì)其進(jìn)行切割。切下三個(gè)包含12個(gè)支柱的放射狀的橫截面一個(gè)得自各支架的近端三分之一處、一個(gè)得自各支架的中間三分之一處和一個(gè)得自各支架的遠(yuǎn)端三分之一處。將這些部分研磨至約50μm的厚度，進(jìn)行光學(xué)拋光，并用甲苯胺藍(lán)(paragon染色劑)進(jìn)行染色。
組織形態(tài)學(xué)分析使用用電腦進(jìn)行處理的成像系統(tǒng)(Image Pro Plus 4.0)來(lái)進(jìn)行下面的組織形態(tài)學(xué)測(cè)量1.平均的橫截面面積和腔厚度(被內(nèi)膜/新內(nèi)膜-腔邊緣所圍繞著的區(qū)域)；新內(nèi)膜(腔和內(nèi)部彈性層之間的區(qū)域，IEL，并且當(dāng)IEL消失時(shí)，為腔和中膜或外部彈性層的殘余物之間的區(qū)域，EEL)；中膜(IEL和EEL之間的區(qū)域)；血管大小(被EEL所圍繞的區(qū)域但是不包括外膜區(qū)域)；和外膜(外膜周組織、脂肪組織和心肌、以及EEL間的區(qū)域)。
2.損傷得分。為了對(duì)血管損傷程度進(jìn)行定量，進(jìn)行以不同壁結(jié)構(gòu)破裂的數(shù)量和長(zhǎng)度為基礎(chǔ)的評(píng)分。損傷程度的計(jì)算如下0＝完整的IEL1＝暴露于淺中間層的破裂的IEL2＝暴露于較深的中間層(中間解剖層)的破裂的IEL3＝暴露于外膜的破裂的EEL結(jié)果將分別來(lái)自十四頭家豬的兩個(gè)冠狀動(dòng)脈用蔗糖-甘露醇介質(zhì)(對(duì)照)或4-6mg ETC-216(每組n＝7)進(jìn)行處理。進(jìn)行左前下行(LAD)、左旋血管(LCX)和右側(cè)冠狀動(dòng)脈(RCA)的定量的冠狀動(dòng)脈血管造影術(shù)(QCA)以對(duì)各血管的大小進(jìn)行評(píng)估；對(duì)于該操作而言選擇兩根最大的動(dòng)脈。在各動(dòng)脈中，通過(guò)INFILTRATOR來(lái)將藥物進(jìn)行壁內(nèi)傳遞，然后在藥物傳遞部位用支架進(jìn)行過(guò)度牽張的經(jīng)皮經(jīng)腔的冠狀血管成形術(shù)(PTCA)。這種手術(shù)操作誘導(dǎo)了一種其中形成炎癥、新內(nèi)膜增生和再狹窄的血管損傷。在擴(kuò)展之前、擴(kuò)展后立即、以及在第28天時(shí)就在處死前將得自所有動(dòng)脈的用支架進(jìn)行了處理的動(dòng)脈進(jìn)行QCA。此外，用IVUS來(lái)測(cè)定支架和腔面積以對(duì)就在處死前的新內(nèi)膜面積進(jìn)行估計(jì)。在處死后，得到用于組織形態(tài)學(xué)測(cè)量的被展擴(kuò)動(dòng)脈區(qū)段，對(duì)過(guò)度牽張損傷的程度、新內(nèi)膜增生的數(shù)量、以及再狹窄進(jìn)行評(píng)估。僅用組織學(xué)方法對(duì)得自在其預(yù)定的QCA和IVUS操作前9天死亡的一只用介質(zhì)進(jìn)行處理的豬的冠狀動(dòng)脈血管進(jìn)行分析。在預(yù)定的28天操作后6天，由于錯(cuò)誤的處理安排而將一只用ETC-216-處理的豬安樂(lè)死。為了進(jìn)行公平的比較，將得自這兩只豬的數(shù)據(jù)排除在分析之外。
此外，將兩只動(dòng)物用使用INFILTRATOR傳遞的約3倍濃度的ETC-216制劑進(jìn)行處理。發(fā)現(xiàn)該制劑太粘，不能有效地通過(guò)該裝置來(lái)傳遞藥物并發(fā)現(xiàn)其對(duì)該裝置的囊造成損害，從而增加了動(dòng)脈損傷的量，這限制了該裝置對(duì)粘性溶液的應(yīng)用。
在研究過(guò)程中，血液得自所有的動(dòng)物，用其來(lái)對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量、血細(xì)胞比容％、血小板計(jì)數(shù)進(jìn)行測(cè)量。在對(duì)這些血變量進(jìn)行測(cè)量的所有情況中，與基準(zhǔn)值相比，治療后的值并沒(méi)有發(fā)生可觀的改變。即，其都在正常的范圍內(nèi)。測(cè)量所有進(jìn)入研究時(shí)的動(dòng)物的的心率和血壓作為基準(zhǔn)。在手術(shù)操作過(guò)程中和處死前也對(duì)大多數(shù)動(dòng)物的心率和血壓進(jìn)行了測(cè)量。對(duì)于進(jìn)入研究的動(dòng)物而言，這些變量與基準(zhǔn)值相比沒(méi)有由于進(jìn)行手術(shù)操作或治療而發(fā)生可觀的改變。
在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行定量的冠狀動(dòng)脈血管造影術(shù)(QCA)的測(cè)量冠狀動(dòng)脈損傷前、緊接冠狀動(dòng)脈損傷和支架展開(kāi)后、和處死前。在接近支架的未展擴(kuò)區(qū)段(R1)、支架的近端部分(Prox)、支架整個(gè)長(zhǎng)度的平均區(qū)域(Aver)、支架的遠(yuǎn)端部分(Dist)和遠(yuǎn)離支架的未展擴(kuò)區(qū)段(R2)進(jìn)行直徑測(cè)量(mm)。用血管內(nèi)超聲(IVUS)來(lái)測(cè)量處死前各擴(kuò)展的冠狀動(dòng)脈血管遠(yuǎn)端、中間和近端區(qū)域處的支架和腔面積。這些測(cè)量之間的差異是新內(nèi)膜面積。
用被擴(kuò)展動(dòng)脈的組織形態(tài)學(xué)分析來(lái)測(cè)量外膜邊界層(ABL)、外部彈性層(EEL)、內(nèi)部彈性層(IEL)、腔(L)、外膜(A)、中膜(M)、內(nèi)膜(I)的平均橫截面區(qū)域、內(nèi)膜與中膜比(I/M)和損傷得分。損傷得分是在被擴(kuò)張血管膨脹部分的近端(a)、中間(b)和遠(yuǎn)端(c)區(qū)段各測(cè)量12次而獲得的36次損傷測(cè)定的均值。將損傷記為0、1、2或3分，0表示完整的IEL(即沒(méi)有損傷)，3表示暴露于外膜的破裂的EEL(即最嚴(yán)重的損傷)。
壁內(nèi)INFILTRATOR傳遞的ETC-216治療顯著降低了冠狀血管內(nèi)膜與中膜的比值，將其降低了35％(LAD、LCX、和RCA聯(lián)合)。這種作用主要是由于RCA(-42％，p＝0.002)、LCX(-38％)、和LAD(-29％)的I/M比例的顯著降低。圖5a和5b分別圖示了所有血管(即RCA、LCX和LAD聯(lián)合)和各種類(lèi)型的血管(即RCA或LAD)的組織形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種在對(duì)病態(tài)冠狀動(dòng)脈、外周動(dòng)脈和腦動(dòng)脈進(jìn)行旁路手術(shù)、植入移植物或移植器官的手術(shù)、或血管成形術(shù)之前或期間用于治療或預(yù)防的方法，其包括在損傷部位給血管局部使用有效量的脂質(zhì)調(diào)節(jié)藥以防止或減少狹窄或再狹窄或?qū)Π邏K進(jìn)行穩(wěn)定。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所說(shuō)的抗增生藥是α螺旋狀載脂蛋白或HDL關(guān)聯(lián)蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所說(shuō)的載脂蛋白或HDL關(guān)聯(lián)蛋白選自載脂蛋白A-I、載脂蛋白A-I Milano、載脂蛋白A-I Paris、載脂蛋白E、載脂蛋白原A-I、載脂蛋白A-II、載脂蛋白原A-II、載脂蛋白A-IV、被改性從而包括一個(gè)或多個(gè)巰基的載脂蛋白、載脂蛋白C-I、載脂蛋白C-II、和載脂蛋白C-III、這些載脂蛋白中的α-螺旋狀序列、對(duì)氧磷酶、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白、LCAT和磷脂轉(zhuǎn)移蛋白。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所說(shuō)的載脂蛋白是載脂蛋白A-I Milano。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其包括將載脂蛋白或HDL關(guān)聯(lián)蛋白與脂質(zhì)聯(lián)合進(jìn)行給藥。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所說(shuō)的載脂蛋白是與脂質(zhì)和HDL關(guān)聯(lián)蛋白聯(lián)合進(jìn)行給藥的。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中載脂蛋白與脂質(zhì)的重量比為約1∶0.5至1∶3。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所說(shuō)的脂質(zhì)調(diào)節(jié)劑是通過(guò)壁內(nèi)的滲入裝置來(lái)進(jìn)行給藥的。
9.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所說(shuō)的載脂蛋白或HDL關(guān)聯(lián)蛋白是用導(dǎo)管來(lái)進(jìn)行給藥的。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所說(shuō)的載脂蛋白是在凝膠中被進(jìn)行給藥的。
11.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所說(shuō)的載脂蛋白是與磷脂以約1∶0.5至1∶3的重量比聯(lián)合給藥的載脂蛋白A-I Milano，劑量為0.05至0.3mg載脂蛋白A-I Milano/kg或4至6mg載脂蛋白A-IMilano/被治療的血管區(qū)段。
12.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所說(shuō)的載脂蛋白或HDL關(guān)聯(lián)蛋白是以0.01mg載脂蛋白/kg至受粘度或裝置體積/冠狀血管區(qū)段限制的劑量之間的劑量來(lái)進(jìn)行給藥的。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所說(shuō)的載脂蛋白是以0.3mg載脂蛋白/kg至受粘度或裝置體積/冠狀血管部分限制的劑量之間的劑量來(lái)進(jìn)行給藥的。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中核酸分子是通過(guò)壁內(nèi)滲入來(lái)進(jìn)行給藥的。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所說(shuō)的核酸分子編碼α螺旋狀載脂蛋白或HDL關(guān)聯(lián)蛋白。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所說(shuō)的核酸分子是寡核苷酸。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所說(shuō)的脂質(zhì)調(diào)節(jié)藥是以單一的有效劑量來(lái)進(jìn)行給藥的。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所說(shuō)的脂質(zhì)調(diào)節(jié)藥是以多劑量來(lái)進(jìn)行給藥的。
19.如權(quán)利要求1所述的方法，其還進(jìn)一步包括全身給藥選自抗增生化合物、抗炎化合物、抗高血壓化合物、抗凝劑、和脂質(zhì)調(diào)節(jié)劑的藥物。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所說(shuō)的全身治療是在所述局部治療之前開(kāi)始的。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所說(shuō)的脂質(zhì)調(diào)節(jié)劑選自煙酸、他汀類(lèi)物質(zhì)、和貝特類(lèi)物質(zhì)。
22.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所說(shuō)的抗增生劑選自紫杉醇、雷帕霉素、AP-17替羅非班、和阿昔單抗。
23.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所說(shuō)的用于預(yù)防或延遲凝血或血小板聚集的物質(zhì)選自阿司匹林、IIb/IIIa抑制劑、氯吡格雷、肝素和肝素片斷。
24.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所說(shuō)的局部傳遞是通過(guò)從導(dǎo)管釋放到心包空間中來(lái)進(jìn)行的。
25.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所說(shuō)的釋放是通過(guò)使用進(jìn)行了涂布的支架來(lái)獲得的。
26.如權(quán)利要求1所述的方法，用于預(yù)防或治療再狹窄。
27.如權(quán)利要求1所述的方法，用于穩(wěn)定斑塊。
28.如權(quán)利要求27所述的用于降低斑塊破裂后果的方法，所說(shuō)的斑塊破裂后果包括血栓形成和局部缺血。
29.一種在對(duì)病態(tài)冠狀動(dòng)脈、外周動(dòng)脈和腦動(dòng)脈進(jìn)行旁路手術(shù)、植入移植物或移植器官的手術(shù)、血管成形術(shù)或斑塊穩(wěn)定之前或期間用于預(yù)防或治療的試劑盒，其包括用于長(zhǎng)時(shí)間局部釋放有效量脂質(zhì)調(diào)節(jié)藥以防止或減少狹窄或再狹窄或穩(wěn)定斑塊的手段。
30.如權(quán)利要求29所述的試劑盒，其包含一種壁內(nèi)滲入裝置。
31.如權(quán)利要求29所述的試劑盒，其包括與用于載脂蛋白和/或脂質(zhì)的儲(chǔ)庫(kù)聯(lián)用的導(dǎo)管。
32.如權(quán)利要求29所述的試劑盒，其包含用于將核酸分子進(jìn)行給藥的手段。
33.如權(quán)利要求29所述的試劑盒，其中所說(shuō)的膽固醇降低藥選自載脂蛋白A-I、載脂蛋白A-I Milano、載脂蛋白A-I Paris、載脂蛋白E、載脂蛋白原A-I、載脂蛋白A-II、載脂蛋白原A-II、載脂蛋白A-IV、被改性從而包括一個(gè)或多個(gè)巰基的載脂蛋白、載脂蛋白C-I、載脂蛋白C-II、和載脂蛋白C-III、這些載脂蛋白中的α-螺旋狀序列、對(duì)氧磷酶、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白、LCAT和磷脂轉(zhuǎn)移蛋白。
34.一種用將在被治療部位釋放的物質(zhì)進(jìn)行了涂布的支架，所說(shuō)的將在被治療部位釋放的物質(zhì)選自單獨(dú)的或與磷脂一起被配制的α螺旋狀載脂蛋白或HDL關(guān)聯(lián)蛋白、表達(dá)編碼α螺旋狀載脂蛋白或HDL關(guān)聯(lián)蛋白的基因的細(xì)胞、和編碼用于局部傳遞到損傷部位的α螺旋狀載脂蛋白或HDL關(guān)聯(lián)蛋白的裸DNA。
全文摘要
可在對(duì)病態(tài)冠狀動(dòng)脈、外周動(dòng)脈和腦動(dòng)脈進(jìn)行旁路手術(shù)、植入移植物或移植器官的手術(shù)、血管成形術(shù)、或?qū)Σ环€(wěn)定斑塊進(jìn)行穩(wěn)定之前或期間將載脂蛋白A－I(ApoA－I)進(jìn)行局部給藥，所說(shuō)的載脂蛋白A－I優(yōu)選地是變體形式如載脂蛋白A－I Milano(ApoA－IM)，載脂蛋白可以單獨(dú)給藥或更優(yōu)選地是與脂質(zhì)載體如磷脂或其他藥物聯(lián)合進(jìn)行給藥。在供選擇的實(shí)施方案中，并不直接提供載脂蛋白，而是提供編碼該載脂蛋白的基因。將基因以與引入蛋白所用方法相似的方法引入到血管內(nèi)，然后在血管內(nèi)表達(dá)蛋白。該技術(shù)還可用于傳遞用于治療或預(yù)防再狹窄或其它心血管疾病的基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將支架僅用載脂蛋白進(jìn)行涂布、用與脂質(zhì)一起進(jìn)行配制的載脂蛋白進(jìn)行涂布、用表達(dá)載脂蛋白的遺傳學(xué)工程細(xì)胞進(jìn)行涂布、用編碼載脂蛋白的裸DNA或其他局部傳遞到損傷部位的藥物如抗增生劑進(jìn)行涂布。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該系統(tǒng)與組合治療一起使用，以將載脂蛋白等藥劑的局部傳遞與全身抗血壓治療、抗炎治療、脂質(zhì)調(diào)節(jié)和/或抗凝治療聯(lián)用。這些治療可以在局部傳遞之前、與局部傳遞一起或在局部傳遞之后進(jìn)行。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1596121SQ02823781
公開(kāi)日2005年3月16日 申請(qǐng)日期2002年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月28日
發(fā)明者C·L·比斯蓋爾 申請(qǐng)人:埃斯佩里安醫(yī)療公司, 塞達(dá)斯-西奈醫(yī)療中心