專利名稱：用于調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的釉質(zhì)基質(zhì)蛋白組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及諸如牙釉蛋白的活性釉質(zhì)基質(zhì)物質(zhì)的制劑在制備用于調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的藥物組合物中的用途?？梢詫⑺鼋M合物用于預(yù)防和/或治療哺乳動物的狀況或疾病，所述狀況或疾病的特征是，所述哺乳動物在它的天然免疫反應(yīng)中表現(xiàn)出對內(nèi)部和/或外部刺激的不平衡，即，其中，所述哺乳動物免疫系統(tǒng)的至少一部分是無區(qū)別地受到刺激的，對所述免疫原產(chǎn)生過敏反應(yīng)，或不能對所述刺激產(chǎn)生產(chǎn)應(yīng)。所述狀況通?？赡苁窍到y(tǒng)性的或局部性的，如系統(tǒng)性和/或創(chuàng)傷后全身炎癥或自身免疫疾病。
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)的正常功能，是保護(hù)身體免受諸如細(xì)菌和病毒的外源微生物的攻擊和破壞。在正常情況下，這些微生物被認(rèn)為是入侵者，并因此使它們無害。
負(fù)責(zé)個體免疫反應(yīng)的是淋巴系統(tǒng)；表示淋巴細(xì)胞，它的前體和衍生物，以及所有支持細(xì)胞的組合。在異常狀況下，或在免疫系統(tǒng)失衡時，它不能對外源微生物作出反應(yīng)，并且破壞所述外源微生物，將自身的細(xì)胞和組織誤認(rèn)為外源組織并且加以攻擊，或者以過度敏感的方式不適當(dāng)?shù)丶せ睢?br> 對抗原制劑(外源抗原或自身抗原)的免疫反應(yīng)通常以由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，并且通過T淋巴細(xì)胞或天然殺傷(NK)破壞所有具有所述抗原的細(xì)胞為特征。不過，B或T淋巴細(xì)胞的缺陷，可能導(dǎo)致免疫缺陷疾病的發(fā)生或免疫反應(yīng)功能的破壞。所述免疫缺陷或不足可能是先天性的，即通過基因突變引起的，或者它可以是獲得性的，例如通過病毒感染而獲得，或者是衰老過程的結(jié)果。由此產(chǎn)生的缺陷可能是或不是致命性的，這取決于出現(xiàn)這種缺陷時干細(xì)胞或淋巴細(xì)胞分化所處的階段。
除了抗原之外，淋巴細(xì)胞需要淋巴因子進(jìn)行全面激活。例如，T-輔助細(xì)胞不能增殖，除非它們接收到來自巨噬細(xì)胞的信號，而T-細(xì)胞毒性細(xì)胞和B-細(xì)胞取決于來自T-輔助細(xì)胞，以及有可能還來自巨噬細(xì)胞的信號進(jìn)行它們的全面發(fā)育。充分的免疫反應(yīng)需要若干種細(xì)胞類型的協(xié)同活性，這意味著調(diào)節(jié)淋巴因子的表達(dá)或活性，有可能對不利的免疫反應(yīng)產(chǎn)生有益影響。
在休克，燒傷，廣泛的手術(shù)過程或創(chuàng)傷之后，免疫系統(tǒng)的功能可能在系統(tǒng)性、無分別的、過度的全身炎癥中受到過度刺激，而其他功能則急劇癱瘓。當(dāng)免疫學(xué)宿主反應(yīng)因此而失控時，所觀察到的細(xì)胞激活的失衡狀態(tài)會導(dǎo)致一連串臨床狀況。所述狀況可能是急性期反應(yīng)，全身炎癥，過敏，敗血癥，感染或器官衰竭，并且可能最終導(dǎo)致多器官衰竭。多器官衰竭或功能障礙是加強(qiáng)監(jiān)護(hù)單元中死亡的最常見原因。當(dāng)今，針對預(yù)防或改善失控免疫反應(yīng)的治療方法業(yè)已能夠顯著改變這一結(jié)果。
失衡狀態(tài)的其他例子是免疫系統(tǒng)攻擊它自身的身體。這些狀態(tài)在引起所述攻擊的抗原的起源和攻擊的機(jī)制和表現(xiàn)方面有所不同。這種反應(yīng)通常分別被稱為過敏，延遲型過敏反應(yīng)，同種異體移植反應(yīng)和自身免疫反應(yīng)。
缺乏免疫性是另一種失衡的狀況，其中，身體不能對注射的過敏原或抗原作出反應(yīng)。缺乏免疫反應(yīng)被認(rèn)為是在缺乏“共刺激”信號的情況下，T-細(xì)胞受體(TCR)和肽-呈遞主要組織相容性復(fù)合物(MHC)抗原之間相互作用之后，細(xì)胞間信號傳導(dǎo)的結(jié)果。這種共刺激信號正常情況下是呈遞在抗原-呈遞細(xì)胞(APCs)的細(xì)胞表面上的。
免疫系統(tǒng)能局部和系統(tǒng)地調(diào)節(jié)它的功能。例如，延遲型過敏反應(yīng)可以在特征性皮膚反應(yīng)中以局部形式表現(xiàn)，或在系統(tǒng)反應(yīng)中表現(xiàn)，其中，大量的抗原進(jìn)入血液，并且以發(fā)燒，不適，關(guān)節(jié)疼痛和循環(huán)的淋巴細(xì)胞數(shù)量減少為特征。炎癥通常被定義為對細(xì)胞損傷的局部反應(yīng)，而全身炎癥或多器官衰竭是系統(tǒng)性炎癥。
在創(chuàng)傷之后，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞馬上被過度激活，以便大量釋放促炎細(xì)胞因子，這種過度的釋放導(dǎo)致了全身炎癥的發(fā)生，隨后在大部分患者體內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞功能的基本癱瘓。在3-5天之后，這種狀態(tài)被新募集的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞克服，不過，這些細(xì)胞有可能缺乏完整的活性譜，因?yàn)樗鼈兪遣怀墒斓募?xì)胞。另外，患者還可能經(jīng)歷一個抗炎期(補(bǔ)償性抗炎反應(yīng)綜合征)，并且有時會觀察到促炎和抗炎的混合反應(yīng)(混合型拮抗反應(yīng)綜合征)。
因此，對細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)控平衡的創(chuàng)傷后影響，主要是通過同時攻擊單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系和T細(xì)胞引起的，導(dǎo)致完整細(xì)胞相互作用的崩解。創(chuàng)傷應(yīng)激不僅影響每一種細(xì)胞類型的適度和特異性性能的能力；它還影響單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系和T細(xì)胞正常情況下所具有的在多個調(diào)控循環(huán)中的控制能力和調(diào)節(jié)監(jiān)督。這種調(diào)控功能的喪失是在損傷發(fā)生時臨時出現(xiàn)的。
例如，能導(dǎo)致上述最初的系統(tǒng)性超炎反應(yīng)的已知炎性細(xì)胞因子包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，白介素-1(IL-1)，IL-6，和干擾素γ，它有可能與TNF-α協(xié)同作用。為了下調(diào)所述介質(zhì)，利用諸如抗內(nèi)毒素，TNF-α，IL-1的拮抗劑或血小板激活因子的抗體進(jìn)行的臨床試驗(yàn)迄今為止一直是令人失望的。這些制劑不僅被證實(shí)沒有調(diào)節(jié)作用，它們甚至?xí)岣咧滤缆省?br> 另外，在應(yīng)激條件下，容易誘導(dǎo)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系產(chǎn)生并且釋放前列腺素E2(PGE2)，它有可能是最有效的內(nèi)源免疫抑制劑。PGE2是T細(xì)胞有絲分裂，IL-2受體表達(dá)和B細(xì)胞的IgM抗體合成的抑制劑。通過cAMP含量的細(xì)胞內(nèi)提高，PGE2還能對單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系的TNF-α和IL-1的合成產(chǎn)生負(fù)面控制作用。PGE2可以抑制TH1細(xì)胞因子(IL-2，IFNγ)的合成，但不能抑制TH2細(xì)胞的IL-4合成。因此，PGE2分泌能破壞所述平衡，有利于TH2型反應(yīng)，在B細(xì)胞生產(chǎn)中導(dǎo)致從IgM到IgG1和IgE的轉(zhuǎn)換。因此，破壞所述平衡能影響TH1或TH2-優(yōu)勢反應(yīng)的形成。
用于調(diào)節(jié)患者免疫反應(yīng)的傳統(tǒng)試劑和方法通常會導(dǎo)致不需要的副作用。例如，諸如環(huán)孢菌素A，硫唑嘌呤和強(qiáng)的松的免疫抑制劑，被用于抑制患有自身免疫病的患者或接受移植物的患者的免疫系統(tǒng)。不過，所述制劑會抑制患者的整體免疫反應(yīng)，因此，破壞了患者對與原有疾病無關(guān)的感染劑產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力。由于這種有害的副作用以及免疫調(diào)節(jié)的醫(yī)學(xué)重要性，多年以來用于調(diào)控免疫系統(tǒng)的特定部分的試劑和方法一直是研究的主題。
存在于釉質(zhì)基質(zhì)中的釉質(zhì)基質(zhì)蛋白是最常見的釉質(zhì)前體。在牙骨質(zhì)形成之前，釉質(zhì)基質(zhì)蛋白沉積在發(fā)育中的牙根的頂端根面上。沉積的釉質(zhì)基質(zhì)是形成牙骨質(zhì)的起始因子。同樣，牙骨質(zhì)的形成本身與牙周韌帶和牙槽骨骼的發(fā)育相關(guān)。正如本發(fā)明人在本發(fā)明之前所證實(shí)的，釉質(zhì)基質(zhì)蛋白因此可能通過模擬牙齒中的天然連接的形成，促進(jìn)牙周再生(Gestrelius S，Lyngstadaas SP，Hammarstrm L.Emdogain-基于仿生學(xué)的牙周再生。Clin Oral Invest 4120-125(2000))。
釉質(zhì)基質(zhì)包括多種蛋白，如牙釉蛋白，琺瑯蛋白，簇蛋白(tuftprotein)，蛋白酶，和白蛋白。釉質(zhì)基質(zhì)的主要成分牙釉蛋白是通過可變剪接和受控制的分泌后加工由單個基因產(chǎn)生的一個疏水性蛋白家族。在脊椎動物進(jìn)化過程中，它們是高度保守的，并且在所有檢查過的高等脊椎動物中，表現(xiàn)出很高的總體序列同源性水平(大于80％)。實(shí)際上，豬和人牙釉蛋白基因轉(zhuǎn)錄物的序列只具有4％的堿基差別，因此，盡管是來源于豬的釉質(zhì)基質(zhì)蛋白，在人體中也會被認(rèn)為是“自身的”，并且可以在人體中促進(jìn)牙齒再生，而不會誘導(dǎo)過敏反應(yīng)或其他不希望的反應(yīng)。
在以前的專利文獻(xiàn)中業(yè)已披露了釉質(zhì)基質(zhì)蛋白和釉質(zhì)基質(zhì)衍生物(EMD)能誘導(dǎo)硬組織形成(即牙釉形成，美國專利4,672,032(Slavkin))，硬組織之間的結(jié)合(EP-B-0 337 967和EP-B-0 263 086)和傷口愈合，如皮膚和粘膜的愈合(WO 99/43344)。
發(fā)明概述本發(fā)明基于這樣的驚人發(fā)現(xiàn)，活性釉質(zhì)物質(zhì)具有調(diào)節(jié)哺乳動物的免疫機(jī)制的能力。免疫調(diào)節(jié)在本文中被定義為通過各種特異性和非特異性方式引起的免疫反應(yīng)水平的增強(qiáng)或減弱。
因此，本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案包括活性釉質(zhì)物質(zhì)在制備用于預(yù)防和/或治療哺乳動物的狀況的藥物組合物的用途，其中，所述狀況以所述哺乳動物對諸如外部或內(nèi)部刺激因子的免疫原的免疫反應(yīng)失衡為特征。
“免疫反應(yīng)失衡”可能在休克，燒傷，過度手術(shù)過程和/或創(chuàng)傷損傷之后出現(xiàn)，該術(shù)語表示一種狀態(tài)/狀況，其中，免疫系統(tǒng)的一種或多種功能可能在系統(tǒng)性、無區(qū)別的、過度全身炎癥中被過度刺激，而其他功能可能同時或分別刺激不足。術(shù)語“免疫反應(yīng)失衡”表示一種狀態(tài)/狀況，其中，所述免疫學(xué)宿主反應(yīng)是不受控制的，并且，所觀察到的細(xì)胞激活的失衡狀態(tài)會導(dǎo)致一連串臨床狀態(tài)。所述狀態(tài)可能是急性期反應(yīng)，全體炎癥，過敏，休克，敗血癥，感染和/或器官衰竭，并有可能最終導(dǎo)致多器官衰竭。
術(shù)語“免疫反應(yīng)失衡”的其他例子是這樣的狀態(tài)/狀況，其中，所述對象的惰性免疫系統(tǒng)攻擊它自身的身體。這些狀態(tài)在引起所述攻擊的抗原來源和所述攻擊的機(jī)制和表現(xiàn)方面有所不同。這些反應(yīng)通常分別被稱為過敏，延遲型過敏反應(yīng)，同種異體排斥，和自身免疫反應(yīng)。
術(shù)語“免疫反應(yīng)失衡”可以表示局部和系統(tǒng)狀態(tài)，正如上文所述。例如，炎癥通常被定義為對細(xì)胞損傷的局部反應(yīng)，而全身炎癥或多器官衰竭是系統(tǒng)性炎癥的例子。
在本文中，術(shù)語“免疫原”被用于表示能夠引起免疫反應(yīng)的任何因子。例如，它可以是毒素，真菌，寄生蟲，病毒，細(xì)菌，花粉，粉塵，污染顆粒，細(xì)胞因子，激素，應(yīng)激，手術(shù)，燒傷，移植器官或血液，組織移植物，休克，創(chuàng)傷，或非自身或自身抗原。
免疫學(xué)過敏反應(yīng)是能導(dǎo)致組織損傷或破壞身體功能的免疫反應(yīng)?？梢愿鶕?jù)組織損傷的機(jī)制將它們劃分成五種類型(I-V)，它們與很多重要的人類疾病和失調(diào)相關(guān)，如過敏反應(yīng)，哮喘，食物過敏，重癥肌無力和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，將一種活性釉質(zhì)物質(zhì)用于制備用來預(yù)防和/或治療哺乳動物狀況的藥物組合物，其中，它的免疫系統(tǒng)的至少一部分對所述免疫原過敏反應(yīng)。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述哺乳動物的免疫系統(tǒng)的至少一部分，因此以無區(qū)別的形式受到刺激。
可以從本發(fā)明中受益的狀況包括這樣的狀況其中，所述哺乳動物免疫反應(yīng)的失衡是局部性的和/或系統(tǒng)性的。在本文中，系統(tǒng)性被定義為與一個系統(tǒng)相關(guān)或一個系統(tǒng)所常見的，即與局部反應(yīng)不同，前者從總體上影響所述身體。例如，所述狀況可以是選自下組的自身免疫病類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，皮膚病，過敏，硬化，動脈硬化，多發(fā)性硬化，哮喘，牛皮癬，狼瘡，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，糖尿病，重癥肌無力，慢性疲勞綜合征，纖維肌痛，慢性疲勞綜合征，克隆氏病，橋本氏甲狀腺炎，格雷夫斯病，阿狄森氏病，格-巴綜合征和硬皮病。
在本文中，術(shù)語“自身免疫病”表示超過80種不同的嚴(yán)重慢性疾病。在美國，自身免疫病是緊隨癌癥和心臟病之后的第三大疾病。75-90％的自身免疫病發(fā)生在女性身上，并且通常在生育年齡期間發(fā)生。除了身體器官之外，自身免疫病還影響神經(jīng)，肌肉，血液，結(jié)締組織，胃腸系統(tǒng)和所有身體系統(tǒng)。
自身免疫病的原因尚不完全了解或理解，不過，據(jù)推測激素，遺傳和環(huán)境因素在這種病的誘導(dǎo)和發(fā)作中發(fā)揮著重要作用。這種病的大部分的過程是個體化的，并且是高度不可預(yù)測的。自身免疫病不表示耐受機(jī)制的普遍衰竭，相反，它們體現(xiàn)了對特定自身抗原的特異性反應(yīng)的出現(xiàn)。
本發(fā)明同樣涉及的其他狀況是以系統(tǒng)性炎癥和/或感染為特征的，并且與創(chuàng)傷，燒傷，手術(shù)，透析，休克，和/或細(xì)菌或病毒感染相關(guān)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)狀況與選自下組的疾病相關(guān)體外膜氧合作用(ECMO)，休克，系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，敗血癥，多器官衰竭，諸如器官和/或假體的移植物排斥，心臟和肺旁路手術(shù)，慢性炎癥，哮喘和/或與應(yīng)激相關(guān)的肺病，細(xì)菌感染，壞疽，軟組織感染，和傷口感染。
若干種嚴(yán)重創(chuàng)傷，如大手術(shù)，系統(tǒng)性炎癥，燒傷，或休克可能導(dǎo)致患者免疫學(xué)反應(yīng)的重大損傷，這種損傷的臨床后果是，創(chuàng)傷個體很容易發(fā)生嚴(yán)重系統(tǒng)感染，這種感染可能導(dǎo)致嚴(yán)重組織破壞和器官衰竭。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，活性釉質(zhì)物質(zhì)因此被用于生產(chǎn)用于預(yù)防和/或治療哺乳動物狀況的藥物組合物，其中，所述哺乳動物免疫系統(tǒng)的至少一部分攻擊產(chǎn)生它們的生物體的分子，細(xì)胞或組織?；钚杂再|(zhì)物質(zhì)在本文中被用于生產(chǎn)用來預(yù)防和/或治療哺乳動物狀況的藥物組合物，其中，所述狀況的特征是系統(tǒng)性炎癥和/或感染。
在系統(tǒng)性、無區(qū)別的、過度全身炎癥中，部分免疫系統(tǒng)受到刺激，而在復(fù)雜的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性(CMI)中的其他功能則顯著癱瘓。在創(chuàng)傷之后發(fā)生的一系列細(xì)胞激活狀態(tài)和復(fù)雜的事件順序中，出現(xiàn)了免疫異常，對這種異常尚不十分了解。一種已知的事實(shí)是創(chuàng)傷應(yīng)激誘導(dǎo)的完整單核細(xì)胞-T細(xì)胞相互作用的分解，它與單核細(xì)胞調(diào)控和T細(xì)胞功能的顯著抑制的顯著改變相關(guān)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，活性釉質(zhì)物質(zhì)因此被用于生產(chǎn)用于恢復(fù)患者的單核細(xì)胞-T細(xì)胞相互作用平衡的藥物組合物，即用于恢復(fù)健康的單核細(xì)胞調(diào)控和T細(xì)胞功能。
在本文中，炎癥被定義為對細(xì)胞損傷的局部反應(yīng)，其標(biāo)志為毛細(xì)管擴(kuò)張，白細(xì)胞浸潤，發(fā)紅，發(fā)熱，疼痛，腫脹，和/或功能喪失，并且在正常情況下起到被用作啟動消除有毒制劑和受損組織的機(jī)制的作用。
在本發(fā)明中，活性釉質(zhì)物質(zhì)被用于生產(chǎn)用來調(diào)節(jié)哺乳動物體內(nèi)T-輔助細(xì)胞激活方式(conception)的藥物組合物。在所述藥物組合物中所包含的所述活性釉質(zhì)物質(zhì)在這里可以調(diào)節(jié)細(xì)胞間和/或細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)物質(zhì)的表達(dá)的水平，釋放和/或功能。在所述藥物組合物中所包含的活性釉質(zhì)物質(zhì)還可以調(diào)節(jié)與所述哺乳動物的免疫機(jī)制相關(guān)的至少一種細(xì)胞因子的表達(dá)水平，釋放和/或功能，或調(diào)節(jié)與所述哺乳動物的免疫機(jī)制相關(guān)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)。
很多常見的和臨床上重要的疾病狀態(tài)，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，哮喘，結(jié)核，麻風(fēng)，血吸蟲病，慢性肝炎，甲狀腺炎和多發(fā)性硬化都是慢性炎癥及其后果的例子。慢性炎癥可能由未能消除急性炎性刺激，由對自身抗原的自身免疫反應(yīng)所導(dǎo)致，或可能是由持續(xù)存在的低強(qiáng)度先天性慢性刺激劑所導(dǎo)致。其特征是同時發(fā)炎和修復(fù)，通過細(xì)胞因子和生長因子的協(xié)同作用，引起巨噬細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和其他細(xì)胞的募集和激活。本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案，包括利用活性釉質(zhì)物質(zhì)生產(chǎn)用于治療和/或預(yù)防慢性炎癥的藥物組合物。
慢性炎癥最好是以過程的形式定義的，其中，持續(xù)的炎癥和試圖通過修復(fù)治愈組織是同時進(jìn)行的。盡管它通常是簡單地以時間進(jìn)程的形式定義的，具有持續(xù)超過6周時間的損傷，傳統(tǒng)上通常被稱為是慢性的，上述定義中的任意一種完全是隨意的。在顯微水平上，慢性炎癥有時是以細(xì)胞反應(yīng)的模式定義的，盡管這種定義是可變的，并且并不總是可靠的。
該過程的獨(dú)特特征最好通過將它與急性炎癥反應(yīng)加以比較來理解。在急性炎癥中，宿主反應(yīng)導(dǎo)致所述刺激劑的消除，隨后是恢復(fù)相關(guān)的組織再生或修復(fù)，與急性炎癥相反，慢性炎癥的特征是發(fā)炎和修復(fù)是同時進(jìn)行的，而不是連續(xù)進(jìn)行的。修復(fù)一直是慢性炎癥的特征，因?yàn)樗c導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)破壞的刺激劑相關(guān)。修復(fù)通常是通過顆?；M織的向內(nèi)生長實(shí)現(xiàn)的，所述組織包括巨噬細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和新的血管。
急性炎癥和慢性炎癥的其他重要區(qū)別，與滲出和細(xì)胞募集之間的相對平衡，以及炎癥反應(yīng)中占優(yōu)勢的細(xì)胞類型相關(guān)。在慢性炎癥中，通常具有不太顯著的滲出反應(yīng)和較強(qiáng)的炎性細(xì)胞募集，它可能伴隨著局部細(xì)胞增殖。與急性炎癥相反，它的特征通常是募集大量的中性粒細(xì)胞，在所有形式的慢性炎癥中主要的浸潤細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。根據(jù)刺激劑的性質(zhì)，炎性介質(zhì)和生長因子(統(tǒng)稱為細(xì)胞因子)的不同特征通常是局部的，產(chǎn)生慢性炎癥的不同的形態(tài)學(xué)特征。
炎癥的系統(tǒng)作用在慢性炎癥疾病中更為顯著，并且可能造成嚴(yán)重的臨床后果。這種系統(tǒng)性作用在很大程度上是由細(xì)胞因子介導(dǎo)的。急性炎癥的最顯著的系統(tǒng)性作用是發(fā)燒和白細(xì)胞增多，而慢性炎癥通常與疲勞，嗜睡，體重減輕和消瘦相關(guān)。
當(dāng)與本發(fā)明相關(guān)的狀況和/或疾病是感染時，所述狀況可能是通過選自，但不局限于下組的格蘭氏陰性微生物和格蘭氏陽性微生物的細(xì)菌污染引起的1)G+例如，葡萄球菌屬和鏈球菌屬，它們能夠釋放內(nèi)毒素肽聚糖(PepG)，它是G+微生物的特異性細(xì)胞壁成分。2)G-例如，在感染期間從它們的外層細(xì)胞被膜中釋放脂多糖(LPS)的大腸菌類和其他微生物。所述免疫學(xué)狀況，在這里是通過由所述感染微生物產(chǎn)生的內(nèi)毒素和/或外毒素引起的。
在本發(fā)明中，在人類血液中由來自金黃色葡萄球菌(PepG)和大腸桿菌(LPS)的內(nèi)毒素引起的細(xì)胞反應(yīng)可以通過施用實(shí)施例1所述的牙釉蛋白有效調(diào)控。這些結(jié)果清楚地表明了活性釉質(zhì)物質(zhì)對哺乳動物免疫機(jī)制的有效調(diào)節(jié)作用。
在由本發(fā)明人進(jìn)行的，并且披露于本申請的實(shí)施例2中的另一種實(shí)驗(yàn)中，用豬作為敗血癥模型，在體內(nèi)檢驗(yàn)釉質(zhì)基質(zhì)衍生物的治療效力。
在實(shí)施例2中，EMD，甚至是通過大的藥團(tuán)注射輸送的EMD，被證實(shí)在以大劑量系統(tǒng)施用時是安全的。另外，在本發(fā)明中證實(shí)了系統(tǒng)性注射釉質(zhì)基質(zhì)衍生物，能對抗豬體內(nèi)的內(nèi)毒素(LPS)作用。一般，可以歸結(jié)為與假操作的豬相比，在處理過的豬體內(nèi)的膿毒性休克的發(fā)作延遲。這種延遲取決于劑量，1mg/kg體重的劑量只能提供短時間的延遲(大約30分鐘)，而5mg/kg的劑量似乎能預(yù)防或者至少顯著延遲(＞5小時)膿毒性休克和相關(guān)的多器官衰竭的發(fā)作。
可以解釋釉質(zhì)基質(zhì)衍生物對LPS誘導(dǎo)的休克的有利作用的一種可能的機(jī)制是，釉質(zhì)基質(zhì)衍生物能結(jié)合LPS，并因此使所述毒性作用失活。另一種同樣可預(yù)見的可能性是釉質(zhì)基質(zhì)衍生物與LPS競爭相同的受體，例如，存在于白細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，破骨細(xì)胞，和/或肥大細(xì)胞上的受體。因此，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涉及活性釉質(zhì)物質(zhì)在制備藥物組合物中的用途，其中，所述活性釉質(zhì)物質(zhì)通過直接與內(nèi)毒素和/或外毒素結(jié)合，和/或通過與所述內(nèi)毒素和/或外毒素的細(xì)胞受體結(jié)合，使得由微生物產(chǎn)生的所述內(nèi)毒素和/或外毒素的毒性作用失活。
第三種高度可能的可能機(jī)制是，釉質(zhì)基質(zhì)衍生物通過以有利形式調(diào)控細(xì)胞因子和信號分子的表達(dá)級聯(lián)反應(yīng)，直接調(diào)節(jié)所述免疫反應(yīng)，所述分子在LPS誘導(dǎo)的膿毒性休克中起主要作用。根據(jù)在本申請中沒有披露的以前的離體實(shí)驗(yàn)，將至少一部分釉質(zhì)基質(zhì)衍生物的作用歸咎于后一種機(jī)制似乎是合理的。另外，所進(jìn)行的血液分析還表明了釉質(zhì)基質(zhì)衍生物對在白細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)胞因子具有直接作用。所述作用似乎是特異性的，對TNF和IL-6有顯著影響，但對IL-1β沒有影響。最后，很可能的是上面所提出的所有機(jī)制都有關(guān)系，并且正是由于這些作用的組合，提供了釉質(zhì)基質(zhì)衍生物在該模型中的有利作用。
在實(shí)施例2中所披露的膿毒性休克發(fā)作的延遲具有重要的臨床價值。在本發(fā)明的一種設(shè)想的實(shí)施方案中，所述延遲直接與血液中“游離”LPS的數(shù)量相關(guān)，并且釉質(zhì)基質(zhì)衍生物因此被作為抗生素的佐劑，用于治療諸如嚴(yán)重菌血癥和感染，用于延遲和/或減輕毒素的作用。在抗生素治療開始之后，所述治療對于處在關(guān)鍵時間的患者的存活來說是重要的。
在另一種同樣優(yōu)選的實(shí)施方案中，釉質(zhì)基質(zhì)衍生物的作用，是通過炎性反應(yīng)的直接調(diào)控引起的，因此，可以將釉質(zhì)基質(zhì)衍生物用于多種臨床狀況，其中，休克是一種可能的并發(fā)癥。所述狀況包括所有大手術(shù)，移植，創(chuàng)傷，ECMO，急性透析，嚴(yán)重感染，嚴(yán)重過敏和很多其他狀況。
其意圖不是要限制本發(fā)明的范圍，對本文所披露的活性釉質(zhì)物質(zhì)能夠調(diào)節(jié)哺乳動物免疫系統(tǒng)的機(jī)制的一種理論上的解釋是，它與選自下組的細(xì)胞表面受體和/或細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的相互作用ICAM，HLA抗原，白介素1受體，白介素2受體，白介素3受體，白介素4受體，白介素5受體，白介素6受體，白介素7受體，白介素8受體，白介素9受體，白介素10受體，白介素11受體，白介素12受體，白介素13受體，白介素14受體，白介素15受體，白介素16受體，白介素17受體，白介素18受體，IFNα受體，IFNβ受體，IFNΔ受體，IFNγ受體，IFNΩ受體，PDGF受體，TGF受體，TNF受體，EGF受體，CD44受體和整聯(lián)蛋白受體家族。
細(xì)胞表面受體是當(dāng)通過它們相應(yīng)的信號傳導(dǎo)分子，激活配體時，細(xì)胞聯(lián)通的眾所周知的介質(zhì)。細(xì)胞表面受體以高的或低的親和力結(jié)合所述配體，并且將這種細(xì)胞外事件轉(zhuǎn)化成一種或多種細(xì)胞內(nèi)信號，該信號能改變靶細(xì)胞的行為。因此，活性釉質(zhì)物質(zhì)能夠通過類似的方式，通過改變靶細(xì)胞的行為調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。因此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，活性釉質(zhì)物質(zhì)能激活細(xì)胞表面受體，以便誘導(dǎo)受體特異性細(xì)胞間信號傳導(dǎo)級聯(lián)發(fā)應(yīng)，并且改變一種或多種基因的表達(dá)，導(dǎo)致所述細(xì)胞行為的改變。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，活性釉質(zhì)物質(zhì)能夠激活細(xì)胞表面受體，該受體可以作為一種酶直接操縱所謂的催化受體，一種例子是，具有起著酪氨酸激酶作用的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白。
在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，活性釉質(zhì)物質(zhì)能激活G-蛋白-連接的表面受體，它能間接地使獨(dú)立的質(zhì)膜結(jié)合酶或離子通道激活或失活。受體和酶和/或離子通道之間的相互作用，通常是由諸如G-蛋白(GTP-結(jié)合調(diào)控蛋白)的第三種蛋白介導(dǎo)的，它能激活細(xì)胞內(nèi)介質(zhì)，例如，但不局限于環(huán)化AMP，InsP3和Ca2+。
諸如白介素，IFNγ和TNFα的細(xì)胞因子，都在免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。特別感興趣的是作為T細(xì)胞分化成TH1和TH2亞型的一部分的細(xì)胞因子基因調(diào)控。例如，細(xì)胞因子的作用可能通過它的特異性受體介導(dǎo)，所述受體能啟動一種信號傳導(dǎo)途徑，該途徑本身能導(dǎo)致細(xì)胞因子通過反饋機(jī)制釋放。
正如在實(shí)施例1中所證實(shí)的，針對細(xì)菌細(xì)胞壁產(chǎn)物，牙釉蛋白對細(xì)胞因子釋放和炎性表面受體的調(diào)控具有調(diào)節(jié)作用。因此，本發(fā)明的一種實(shí)施方案涉及活性釉質(zhì)物質(zhì)在制備藥物組合物中的用途，該組合物用于通過介導(dǎo)一種信號調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，所述信號是通過諸如IL-2R，IL-4R，IL-10R，IFNγR和TNFαR的細(xì)胞因子受體介導(dǎo)的。另外，由于細(xì)胞因子的釋放是通過它們的表達(dá)水平調(diào)控的，活性釉質(zhì)物質(zhì)還可以通過啟動一種或多種細(xì)胞因子在哺乳動物中的表達(dá)水平的上調(diào)和/或下調(diào)，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)一種或多種細(xì)胞因子的釋放和/或功能。
在本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，一種活性釉質(zhì)物質(zhì)通過TNFαR介導(dǎo)免疫反應(yīng)的調(diào)控。TNFα受體是在除了紅細(xì)胞以外的所有類型的體細(xì)胞上表達(dá)的。業(yè)已披露了兩種受體，55kDa的受體(TNF-R1；又被命名為CD120a，還被稱為TNF受體超家族成員1A(TNF-RSF1A))和75kDa的受體(TNF-R2；又被命名為CD120b，還被稱為TNF受體超家族成員1B(TNF-RSF1B))。TNFαR與NGF的低親和力受體相關(guān)，并且與人類細(xì)胞表面抗原CD40相關(guān)，并且能在刺激過的T-細(xì)胞和B-淋巴細(xì)胞上強(qiáng)表達(dá)。第三種受體亞型是在正常人肝臟中表達(dá)的。它能結(jié)合TNFα但不能結(jié)合TNFβ。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)了兩種受體亞型的不同作用。似乎是p55受體的結(jié)合，特異性導(dǎo)致了細(xì)胞粘附分子ICAM-1，E-選擇蛋白，V-CAM-1，和CD44的誘導(dǎo)，而p55和p75受體的結(jié)合，誘導(dǎo)了α-2整聯(lián)蛋白的表達(dá)。除了膜結(jié)合受體之外，業(yè)已披露了若干種能結(jié)合TNF的可溶性蛋白。這種分子量大約為30kDa的蛋白被稱為T-BP-1和T-BP-2(腫瘤壞死因子結(jié)合蛋白)，它來自所述膜受體的TNF-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。它們有可能通過抑制TNF與它的受體的結(jié)合，起著TNF活性的生理學(xué)調(diào)節(jié)劑的作用。
IL-2的生物學(xué)活性是通過幾乎只能在激活的T-細(xì)胞，而不能在靜息T-細(xì)胞上表達(dá)的膜受體介導(dǎo)的。IL-5和IL-6能調(diào)節(jié)IL-2受體的表達(dá)。在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，披露了一種能通過IL-2R調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的活性釉質(zhì)物質(zhì)。
存在三種不同類型的IL-2受體，它們是以不同方式，獨(dú)立地表達(dá)的。高親和力IL-2受體占由細(xì)胞表達(dá)的所有IL-2受體的大約10％。該受體是由兩種亞基組成的膜受體復(fù)合物IL-2R-α(TAC抗原＝T-細(xì)胞激活抗原；p55)和IL-2R-β(p75；新的名稱為CD122)。p75是以組成形式在靜息T-淋巴細(xì)胞，NK-細(xì)胞，和多種其他細(xì)胞類型上組成型表達(dá)的，而p55的表達(dá)通常只能在細(xì)胞激活之后出現(xiàn)。p75與IL-2介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)相關(guān)。另外，IL-2受體與多種其他蛋白(p22，p40，p100)相關(guān)，這些蛋白被認(rèn)為與調(diào)節(jié)受體鏈的構(gòu)象改變，受體介導(dǎo)的細(xì)胞吞噬作用，以及其他信號傳導(dǎo)過程相關(guān)。鑒定的蛋白之一是95kDa的細(xì)胞粘附分子ICAM-1，它有可能將IL-2受體集中在細(xì)胞與細(xì)胞接觸的部位，并由此可能介導(dǎo)旁分泌活性，例如，在IL-2-介導(dǎo)的T-細(xì)胞刺激期間。與p75相關(guān)的另一種蛋白是被稱為Ick的酪氨酸特異性蛋白激酶。其他激酶可能同樣與IL-2受體相關(guān)。業(yè)已鑒定了兩種這樣的激酶，它們被稱為fyn和1yn。另外，IL-2受體信號傳導(dǎo)還可以通過vav介導(dǎo)。最近，業(yè)已披露了第三種64kDa的IL-2受體亞基，它被命名為γ。該亞基是產(chǎn)生高親和力和中等親和力IL-2受體所必需的，但是不能通過它本身結(jié)合IL-2。最近業(yè)已證實(shí)了IL-2受體的γ亞基是IL-4和IL-7受體的成分。它還有可能是IL-13受體的成分。
激活的淋巴細(xì)胞能連續(xù)分泌TAC抗原的42kDa的片段。該片段能在血清和血漿中循環(huán)，并且起著可溶性IL-2受體的作用(sIL-2R)。該可溶性受體的濃度在不同的病理學(xué)狀態(tài)下具有很大差別。
在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，一種活性釉質(zhì)物質(zhì)能激活I(lǐng)FNγR。業(yè)已披露了分子量在70-160kDa之間的多種IFNγR的結(jié)合蛋白。這種蛋白能在除了成熟的紅細(xì)胞以外的所有類型的人類細(xì)胞上表達(dá)。在單核細(xì)胞和其他造血細(xì)胞中表達(dá)的所述受體的分子量為140kDa。在其他細(xì)胞類型中觀察到54kDa的蛋白。
IL-4的生物學(xué)活性是通過IL-4受體(IL-4R)介導(dǎo)的。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，活性釉質(zhì)物質(zhì)能激活I(lǐng)L-4R。IL-4受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與Epo，IL-6的受體和IL-2受體的β鏈相關(guān)，將其命名為CD124。業(yè)已披露了兩種形式的所述受體，其中之一是分泌型的。分泌型受體僅包括細(xì)胞外IL-4結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且能夠阻斷IL-4活性。業(yè)已證實(shí)能以與IL-4受體相同的親和力結(jié)合IL-4的IL-4結(jié)合蛋白(IL-4-BP)，是一種可溶性IL-4受體變體?？扇苄允荏w可能通過抑制受體結(jié)合或通過發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用，起著細(xì)胞因子活性的生理學(xué)調(diào)節(jié)劑的作用。IL-4-介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的機(jī)制在很大程度上尚屬未知。IL-4能影響細(xì)胞內(nèi)鈣含量，并且還可能影響肌醇磷脂和蛋白激酶C的代謝。
在人體中，IL10是通過激活的CD8+外周血T-細(xì)胞，通過抗原特異性和多克隆激活之后的Th0，Th1，和Th2-樣CD4+T細(xì)胞克隆，通過B-細(xì)胞淋巴瘤，以及通過LPS-激活的單核細(xì)胞和肥大細(xì)胞產(chǎn)生的。IL-4和IL10能抑制單核細(xì)胞的IL10的合成。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，一種活性釉質(zhì)物質(zhì)能激活I(lǐng)L10受體(IL-10R)。業(yè)已克隆了鼠IL-10受體。該受體是一種大約為110kDa的蛋白，它能特異性地結(jié)合鼠IL-10。該受體在結(jié)構(gòu)上與IFN的受體相關(guān)。
釉質(zhì)基質(zhì)衍生物對外周淋巴細(xì)胞的作用表明，豬牙釉蛋白衍生物Emdogain能誘導(dǎo)CD25/CD4陽性淋巴細(xì)胞體外增殖的略微增強(qiáng)，同時伴隨著CD19陽性B-淋巴細(xì)胞的減少(Petinaki，E.，S.Nikolopoulos，和E.Castanas.1998。在體外使用Emdogain之后，外周淋巴細(xì)胞的低刺激。J Clin Periodontol.25715-20)。不過，該文獻(xiàn)的作者不能證實(shí)對免疫球蛋白和/或細(xì)胞因子(IL-2和IL-6)生產(chǎn)了任何顯著影響。
有趣的是，本發(fā)明人業(yè)已發(fā)現(xiàn)多種成纖維細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物(來自牙周韌帶，魚鰭或禽皮膚的胚胎，真皮細(xì)胞)，與未刺激過的培養(yǎng)物相比，在用EMDOGAIN(BIORA AB，SWEDEN)刺激時，能產(chǎn)生兩倍的轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)。上述發(fā)現(xiàn)支持了活性釉質(zhì)物質(zhì)對失衡的免疫反應(yīng)的潛在調(diào)節(jié)影響的觀點(diǎn)。
釉質(zhì)基質(zhì)是釉質(zhì)的前體，并且可以從任何相關(guān)的天然來源獲得，即牙齒處在發(fā)育中的哺乳動物。一種合適的來源是來自宰殺的動物，例如牛、豬或羊的發(fā)育中的牙齒，例如，另一種來源是魚皮。
正如以前所披露的(EP-B-0 337 967和EP-B-0 263 086)，釉質(zhì)基質(zhì)可以用發(fā)育中的牙齒制備。剝離釉質(zhì)基質(zhì)，并且制備釉質(zhì)基質(zhì)衍生物(EMD)，例如，通過用諸如緩沖液，稀酸或堿或水/溶劑混合物的水溶液提取，然后進(jìn)行大小排阻，脫鹽或其他純化步驟，或者隨后進(jìn)行冷凍干燥。還可以通過加熱或溶劑處理使酶失活，在這種情況下，所述衍生物能夠以液體形式保存，而不進(jìn)行冷凍干燥。
作為釉質(zhì)基質(zhì)衍生物或蛋白的另一種來源，人們還可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的普遍采用的合成方法，或使用培養(yǎng)過的真核細(xì)胞和/或原核細(xì)胞，或者通過DNA技術(shù)進(jìn)行修飾。因此，釉質(zhì)基質(zhì)蛋白可以是重組產(chǎn)生的，并且還可以是遺傳學(xué)修飾的(例如，參見Sambrook，J.等Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。
在本發(fā)明中，釉質(zhì)基質(zhì)衍生物或釉質(zhì)基質(zhì)蛋白衍生物(EMD)是釉質(zhì)基質(zhì)的衍生物，它包括一種或若干種釉質(zhì)基質(zhì)蛋白或所述蛋白的部分，它們是通過可變剪接或加工天然產(chǎn)生的，或通過對天然長度的蛋白進(jìn)行酶促或化學(xué)裂解產(chǎn)生的，或通過在體外或體內(nèi)合成多肽產(chǎn)生的(重組DNA方法，或培養(yǎng)植物或動物細(xì)胞的二倍體細(xì)胞)。釉質(zhì)基質(zhì)衍生物還包括與多肽或蛋白相關(guān)的釉質(zhì)基質(zhì)。所述多肽或蛋白可以與合適的可生物降解的載體分子結(jié)合，如多胺酸或多糖，或它們的組合。另外，術(shù)語釉質(zhì)基質(zhì)衍生物還包括合成的類似物質(zhì)。
蛋白是由通過肽鍵連接在一起的氨基酸殘基組成的生物學(xué)大分子。線性氨基酸聚合物形式的蛋白又被稱為多肽。通常，蛋白具有50-800個氨基酸殘基，因此，其分子量在大約6000-大約數(shù)十萬道爾頓或更高的范圍內(nèi)。小蛋白被稱為肽或寡肽。
釉質(zhì)基質(zhì)蛋白是正常情況下存在于釉質(zhì)基質(zhì)中的蛋白，即釉質(zhì)前體(Ten CateOral Histology，1994；RobinsonEur.J.OralScience，Jan.1998，106 Suppl.1282-91)，或可以通過裂解所述蛋白獲得的蛋白。一般，所述蛋白的分子量低于120,000道爾頓，并且包括牙釉蛋白，非-牙釉蛋白，富脯氨酸非-牙釉蛋白和tuftelins。
用于本發(fā)明的蛋白的例子是牙釉蛋白，富脯氨酸非牙釉蛋白，tuftelins，簇蛋白，血清蛋白，唾液蛋白，ameloblastin，sheathlin，和它們的衍生物，以及它們的混合物。含有活性釉質(zhì)物質(zhì)的用于本發(fā)明中的制劑，還可以包括至少兩種上述蛋白類物質(zhì)。另外，用于本發(fā)明中的其他蛋白出現(xiàn)在市售產(chǎn)品EMDOGAIN(BIORA AB，Sweden)中。
EMDOGAIN(BIORA AB，S-205 12 Malmo，Sweden)包括30mg釉質(zhì)基質(zhì)蛋白，在大約80℃下加熱3小時，以便使殘余的蛋白酶失活，以及1ml載體溶液(丙二醇藻酸酯)，在使用之前對它們進(jìn)行混合，除非所述蛋白和載體是分別測試的。分別位于20，14和5kDa的主要蛋白峰之間的重量比例大約為80/8/12。
一般，釉質(zhì)基質(zhì)的主要蛋白被稱為牙釉蛋白。它們占基質(zhì)蛋白的大約90％w/w。其余10％w/w包括富脯氨酸非牙釉蛋白，tuftelins，簇蛋白，血清蛋白和至少一種唾液蛋白。不過，還可能存在其他蛋白，如琺瑯蛋白(ameloblastin，sheathlin)，業(yè)已證實(shí)了它與釉質(zhì)基質(zhì)相關(guān)。另外，各種蛋白能夠以若干種不同的大小(即不同的分子量)合成和/或加工。因此，業(yè)已發(fā)現(xiàn)釉質(zhì)基質(zhì)中的主要蛋白牙釉蛋白是以幾種不同的大小存在的，它們共同構(gòu)成了超分子聚集物。它們主要是疏水性物質(zhì)，能在生理學(xué)條件下形成聚集物。它們可以攜帶其他蛋白或肽或者是其他蛋白或肽的載體。
發(fā)育中的牙釉的牙釉蛋白是組織特異性蛋白，富含脯氨酸，亮氨酸，組氨酸和谷氨酰殘基，并且是通過內(nèi)層牙釉上皮細(xì)胞的成釉質(zhì)細(xì)胞合成的。所述蛋白構(gòu)成了大量的細(xì)胞外基質(zhì)，該基質(zhì)通過羥基磷灰石相礦物化，成為成熟的牙釉。檢查來自多種哺乳動物的牙釉蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)了高度進(jìn)化序列保守性，暗示了特殊的功能。最近，業(yè)已證實(shí)在釉質(zhì)基質(zhì)中的多種牙釉蛋白成分，是通過一系列分泌后蛋白水解加工和通過由牙釉蛋白基因產(chǎn)生的可變剪接的mRNAs的表達(dá)產(chǎn)生的，所述基因位于性染色體上。對重組牙釉蛋白的物理化學(xué)研究業(yè)已證實(shí)，它們在體外經(jīng)歷了自我組裝過程，產(chǎn)生了超分子‘納米球’結(jié)構(gòu)，并且最近的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，揭示了所述納米球在分泌性釉質(zhì)基質(zhì)的超結(jié)構(gòu)組構(gòu)中的功能作用。這種組構(gòu)作用能導(dǎo)致最早的礦物晶體的組織化發(fā)育。
對牙釉蛋白表達(dá)的最新研究業(yè)已證實(shí)了小鼠牙釉蛋白RNA的可變剪接，產(chǎn)生了7種不同的mRNAs，這些mRNA編碼長度為194-44個氨基酸殘基的牙釉蛋白。
其他蛋白物質(zhì)也適用于本發(fā)明中。其例子包括諸如富含脯氨酸的蛋白和聚脯氨酸蛋白。適用于本發(fā)明的物質(zhì)的其他例子包括所述蛋白的聚集物，釉質(zhì)基質(zhì)衍生物和/或釉質(zhì)基質(zhì)蛋白以及釉質(zhì)基質(zhì)，釉質(zhì)基質(zhì)衍生物和釉質(zhì)基質(zhì)蛋白的代謝物。所述代謝物可以具有任何大小，從蛋白的大小到短肽的大小。
如上文所述，用于本發(fā)明的蛋白，多肽或肽，通常具有最多為大約120kDa的分子量，通過SDS PAGE電泳測定，例如，最多為100kDa，90kDa，80kDa，70kDa或60kDa。
用于本發(fā)明中的蛋白通常是以制劑形式存在的，其中，所述活性釉質(zhì)物質(zhì)在所述制劑中的蛋白含量為大約0.005％w/w-100％w/w，如，大約0.5-99％w/w，大約1-95％w/w，大約10-95％w/w，大約10-90％w/w，大約15-90％w/w，大約20-90％w/w，大約30-90％w/w，大約40-85％w/w，大約50-80％w/w，大約60-70％w/w，大約70-90％w/w，或大約80-90％w/w。
一種用于本發(fā)明中的活性釉質(zhì)物質(zhì)的制劑，還可以包括具有不同分子量的活性釉質(zhì)物質(zhì)的混合物。
釉質(zhì)基質(zhì)蛋白可以劃分成高分子量部分和低分子量部分，并且，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，確定的釉質(zhì)基質(zhì)蛋白級份對牙周缺陷(即牙周創(chuàng)傷)的治療具有有價值的特性。該級份包括乙酸可提取的蛋白，通常被稱為牙釉蛋白，并且構(gòu)成了釉質(zhì)基質(zhì)的低分子量部分(參見EP-B-0 337 967和EP-B-0 263 086)。
在本發(fā)明中，所述活性蛋白不局限于釉質(zhì)基質(zhì)的低分子量部分。目前，優(yōu)選的蛋白包括釉質(zhì)基質(zhì)蛋白，如分子量(在體外通過SDS-PAGE測定)低于大約60,000道爾頓的牙釉蛋白，不過，分子量超過60,000道爾頓的蛋白同樣具有作為促進(jìn)結(jié)締組織生長候選物的有希望的特征。
因此，用于本發(fā)明中的活性釉質(zhì)物質(zhì)的分子量最高為大約40,000Da，例如，分子量為大約5,000Da至大約25,000Da。
通過分離所述蛋白，例如，通過沉淀，離子交換層析，制備電泳，凝膠滲透層析，反相層析或親和層析分離，可以純化不同分子量的牙釉蛋白。
牙釉蛋白分子量的組合可以改變，從主要為20kDa的化合物到具有40至5kDa的多種不同分子量的牙釉蛋白的聚集物，以至主要為5kDa的化合物。正常情況下存在于釉質(zhì)基質(zhì)中的其他釉質(zhì)基質(zhì)蛋白，如tuftelin或蛋白水解酶可以添加到所述牙釉蛋白聚集物中并且由所述聚集物攜帶。
在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于制備用來預(yù)防和/或治療哺乳動物的以所述哺乳動物對一種免疫原的免疫反應(yīng)失衡為特征的狀況的所述活性釉質(zhì)物質(zhì)，選自氨基酸長度為大約2-13kDa的任何可溶性牙釉蛋白型肽，包括氨基酸長度為2-4.5kDa，3-5.5kDa，4-6.5kDa，5-7.5kDa或5-13kDa的可溶性基于牙釉蛋白的肽，所述肽包含在如圖2所示出的通過對加工過的牙釉蛋白進(jìn)行HPLC分析的第三和/或第四個峰代表的洗脫液中。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述加工過的牙釉蛋白產(chǎn)物是5kDa的多肽。
根據(jù)本發(fā)明，活性釉質(zhì)物質(zhì)可以與其他活性藥物一起使用，如抗細(xì)菌，抗炎，抗病毒，抗真菌物質(zhì)，或與局部化療，細(xì)胞程序死亡誘導(dǎo)劑，諸如TGFβ，PDGF，IGF，F(xiàn)GF，EGF的生長因子，角質(zhì)細(xì)胞生長因子或它們的肽類似物組合。酶-本身存在于釉質(zhì)基質(zhì)或它的制劑中或是添加的-還可以與釉質(zhì)基質(zhì)，釉質(zhì)基質(zhì)衍生物和/或釉質(zhì)基質(zhì)蛋白，特別是蛋白酶組合使用。
為了給個體(動物或人類)施用，優(yōu)選將活性釉質(zhì)物質(zhì)和/或它的制劑制備成含有所述活性釉質(zhì)物質(zhì)，并且任選含有一種或多種可以藥用的賦形劑的藥物組合物。
要施用的含有所述活性釉質(zhì)物質(zhì)的組合物可能適合通過任何合適的途徑施用，例如，通過軟管，注射器，噴霧或輸液裝置給患者系統(tǒng)施用。另外，組合物可能適合與手術(shù)結(jié)合使用，例如，通過輸液進(jìn)入血液，淋巴，腹水，或腦脊液全身施用，或通過吸入施用。
在下面提供了含有活性釉質(zhì)物質(zhì)的合適組合物的例子。
為了給個體(動物或人類)施用，優(yōu)選將所述物質(zhì)制備成含有所述物質(zhì)，并且任選含有一種或多種可以藥用的賦形劑的藥物組合物。
例如，所述組合物可以是液體，半固體或固體組合物形式的，例如，但不局限于溶解的輸液液體，如消毒鹽水，Ringer′s溶液，葡萄糖溶液，磷酸緩沖鹽溶液，血液，血漿或水，粉末，微膠囊，微球體，納米顆粒，噴霧劑，氣溶膠，吸入裝置，溶液，分散液，懸浮液，乳液，混合物。
所述組合物可以按照常規(guī)藥物學(xué)方法制備，例如，參見“RemingtonThe science and practice of pharmacy”20th ed.Mack Publishing，Easton PA，2000 ISBN 0-912734-04-3和“Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology”，edited bySwarbrick，J.&J.C.Boylan，Marcel Dekker，Inc.，New York，1988 ISBN 0-8247-2800-9。
含有活性物質(zhì)的藥物組合物可以作為藥物輸送系統(tǒng)。在本文中，術(shù)語“藥物輸送系統(tǒng)”表示藥物組合物(藥用制劑或劑型)，該組合物在施用時給人或動物的身體提供所述活性物質(zhì)。因此，術(shù)語“藥物輸送系統(tǒng)”包括多種藥物組合物，如液體，粉末和噴霧劑。
用于本發(fā)明的組合物中的可以藥用的賦形劑的選擇以及它的最佳濃度一般無法預(yù)測，并且，必須根據(jù)它們的實(shí)驗(yàn)測定確定。另外，一種可以藥用的賦形劑是否適用于藥物組合物中一般取決于選擇哪一種類型的劑型。不過，藥物制劑化領(lǐng)域的技術(shù)人員可以從文獻(xiàn)中找到有關(guān)指南，例如，″RemingtonThe science and practice ofpharmacy″20th ed.Mack Publishing，Easton PA，2000 ISBN 0-912734-04-3。
可以藥用的賦形劑是一種物質(zhì)，它對施用該組合物的個體基本上是無害的。這種賦形劑通常滿足由國家藥物管理機(jī)構(gòu)規(guī)定的要求。官方藥典，如英國藥典，美國藥典和歐洲藥典，規(guī)定了眾所周知的可以藥用的賦形劑的標(biāo)準(zhǔn)。
下面提供了用于本發(fā)明的相關(guān)藥物組合物的概述。該概述基于特定施用途徑。不過，可以理解的是，在這種情況下，可以藥用的賦形劑能夠以不同的劑型或組合物使用，特定可以藥用的賦形劑的使用，不局限于所述賦形劑的特定劑型或特定功能。
腸胃外組合物為了全身使用，本發(fā)明的組合物可以包括傳統(tǒng)上無毒性的可以藥用的載體和賦形劑，包括微球體和脂質(zhì)體。
用于本發(fā)明的組合物包括所有類型的固體，半固體和液體組合物。例如，特別相關(guān)的組合物是溶液，懸浮液，乳液。
可以藥用的賦形劑可以包括溶劑，緩沖劑，防腐劑，螯合劑，抗氧化劑，穩(wěn)定劑，乳化劑，懸浮劑，稀釋劑。所述不同制劑的例子參見下文。
在一種最優(yōu)選的實(shí)施方案中，將Emdogain(BIORA AB，Malmo，Sweden)的冷凍干燥粉末以30mg/ml的最終濃度溶解在磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中。
其他同樣優(yōu)選的實(shí)施方案的例子是以如下終濃度溶解在磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)中的冷凍干燥的Emdogain(BIORA AB，Malmo，Sweden)粉末0.01-50mg/ml，如0.01-10mg/ml，0.1-10mg/ml，0.01-5mg/ml，0.1-5mg/ml，0.01-1mg/ml，0.1-1mg/ml，或0.01-0.05mg/ml，包括大約0.01mg/ml，0.02mg/ml，0.03mg/ml，0.04mg/ml 0.05mg/ml，0.06mg/ml，0.07mg/ml，0.08mg/ml，0.09mg/ml，0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.3mg/ml，0.4mg/ml，0.5mg/ml，1mg/ml，10mg/ml，20mg/ml，30mg/ml，35mg/ml，40mg/ml，45mg/ml，或50mg/ml的濃度。
另外，正如在實(shí)施例2中所披露的，給需要的哺乳動物施用的釉質(zhì)基質(zhì)衍生物制劑的重量應(yīng)當(dāng)根據(jù)要治療的哺乳動物的個體體重和需要的EMD效果進(jìn)行調(diào)整，并且最優(yōu)選為大約0.01-100mgEMD/kg體重，如大約0.01-50mgEMD/kg，0.05-10mgEMD/kg，0.01-1mgEMD/kg，0.1-50mgEMD/kg，0.1-25mgEMD/kg，0.1-15mgEMD/kg，或0.1-10mgEMD/kg，或0.1-1mgEMD/kg體重，還取決于釉質(zhì)基質(zhì)衍生物是以高劑量或低劑量使用。
因此，典型的低劑量包括至多0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.1，0.12，0.15，0.17，0.2，0.5，1，1.2，1.5，1.6，1.8，2.2，5.5，6，7，8，9，或9.9mgEMD/kg體重，而典型的高劑量包括至少10，15，18，20，25，50，75，或100mgEMD/kg體重。
上述藥劑可以每周使用至少一次，如至少1，2，3，4，5，6，7，或更多次/周，使用1-30天，或者使用10-90天，或更長。
各種制劑的例子溶劑的例子包括，但不局限于水，醇，血液，血漿，腦脊液，腹水和淋巴液。
緩沖劑的例子包括，但不局限于檸檬酸，乙酸，酒石酸，乳酸，氫磷酸，碳酸氫鹽，磷酸鹽，二乙胺等。
螯合劑的例子包括，但不局限于EDTA鈉和檸檬酸。
抗氧化劑的例子包括，但不局限于丁基化羥基苯甲醚(BHA)，抗壞血酸及其衍生物，生育酚及其衍生物，半胱氨酸及其衍生物。
粉末成分的例子包括，但不局限于藻酸，膠原，乳糖，在涂到傷口上之后能形成凝膠的粉末(吸收液體/傷口滲出液)。
稀釋劑和崩解劑的例子包括，但不局限于乳糖，蔗糖，emdex，磷酸鈣，碳酸鈣，硫酸鈣，甘露糖醇，淀粉和微晶纖維素。
結(jié)合劑的例子包括，但不局限于蔗糖，山梨糖醇，合歡膠，藻酸鈉，明膠，淀粉，纖維素，羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素，羥丙基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇。


圖1用10微升FITC或PE偶聯(lián)的單克隆抗體溫育用LPS，PepG和基質(zhì)蛋白組合物處理過的全血樣品。通過流式細(xì)胞術(shù)分析抗原表達(dá)，使用10微升抗-CD14，抗-CD44，抗-ICAM-1，以及同種型陰性對照抗-IgGl和抗-IgG2。所有樣品都是在FACScan上使用CellQuest軟件進(jìn)行分析的。
圖2按照Gestrelius等于1997年披露的方法，從不成熟的豬釉質(zhì)中提取牙釉蛋白。在溶解于30％的乙腈中之后，使用大小排阻柱在JascoHPLC上分離所述樣品。四個不同的峰表示復(fù)合物，完整長度的蛋白和可溶性、加工過的牙釉蛋白肽。
圖3釉質(zhì)基質(zhì)衍生物導(dǎo)致了促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)生產(chǎn)的減少，同時伴隨著抗炎細(xì)胞因子IL-10釋放的增加。
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實(shí)驗(yàn)部分實(shí)驗(yàn)1本研究的目的是研究牙釉蛋白對人類全血的先天免疫機(jī)制的潛在調(diào)控作用。特別感興趣的是針對細(xì)菌細(xì)胞壁產(chǎn)物的細(xì)胞因子釋放和炎性表面受體的調(diào)控。
材料和試劑外周靜脈血是從健康的職員體內(nèi)獲得的，并且收集在裝有0.129M檸檬酸鈉的真空容器中(Becton Dickinson Vacutainer System Eur，Meylan Cedex，F(xiàn)rance)。以30微克/毫升的終濃度將冷凍干燥的Emdogain粉末(BIORA AB，Malmo，Sweden)溶解在磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中。將大腸桿菌026B6脂多糖(LPS；Difco Laboratories，Detroit，MI，USA)懸浮在無熱源無菌鹽水中，并且將10納克/毫升的LPS直接添加到微量離心管中的血液樣品中。脂磷壁酸(LTA)是從Sigma化學(xué)品公司(St.Louis，Miss.，USA)購買的。肽聚糖(PepG)是按照以前披露的方法從金黃色葡萄球菌中分離的(Foster，S.J.1992J Bacteriol.174464-70)。對營養(yǎng)生長和分化期間枯草芽孢桿菌168中的自溶酶的分析是通過使用復(fù)性聚丙烯凝膠酰胺電泳進(jìn)行的，以10微克/毫升的濃度將所述自溶酶直接添加到血液樣品中。
全血實(shí)驗(yàn)外周靜脈血是從健康的職員體內(nèi)獲得的，并且收集到裝有0.129M檸檬酸鈉的真空容器中(Becton Dickinson Vacutainer System Eur，Meylan Cedex，F(xiàn)rance)。將全血樣品分裝到1.5ml的微量離心管中(Sorenson，BioScience Inc.，Salt Lake City，Utah，USA)。用LPS，PepG或LTA刺激之前，在37℃下，用以0，45，150，300，450，600或750克/毫升的終濃度溶解的Emdogain預(yù)溫育所述血液樣品2小時。
然后用10納克/毫升LPS，10克/毫升PepG或100克/毫升LTA刺激所述血液樣品4或6小時。然后在冰上冷卻所述血液，并且離心(14000g，1分鐘)，并且將血漿移出，進(jìn)行細(xì)胞因子蛋白檢測。作為對照，添加等體積的0.9％的氯化鈉，以取代所述細(xì)菌產(chǎn)物。在抽血之后馬上分析基礎(chǔ)細(xì)胞因子的含量。
初步研究業(yè)已證實(shí)，與用LPS刺激的4小時相比，PepG和LTA在刺激之后6小時產(chǎn)生TNF-α峰值。因此，選擇4小時的LPS刺激和6小時的PepG和LTA刺激。
ELISA技術(shù)。按照生產(chǎn)商的說明，用通過商業(yè)渠道獲得的固相夾心酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(PeliKline Compact，CLB Labs，Amsterdam，The Netherlands)測定TNF-α，IL-6和IL-10的血漿濃度。TNF-α，IL-6和IL-10 ELISA的檢測限分別為3，0.4和3pg/ml。在450nm波長下用ELISA讀數(shù)器對所述平板進(jìn)行讀數(shù)(Thermo maxmicroplate reader，Molecular Devices，Menlo Park，CA.，USA)。
抗體標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)。在刺激之后，以100微升的體積馬上將全血樣品分裝到Falcon聚苯乙烯試管(Becton Dickinson，LincolnPark，New Jersey，USA)中，并且在室溫下與10微升FITC或PE偶聯(lián)的單克隆抗體一起遮光溫育30分鐘。在洗滌和固定之前，用FACS裂解溶液(Becton Dickinson，San JoSe，CA.，USA)裂解紅細(xì)胞。用CellWash(Becton Dickinson)洗滌樣品3次，然后用1％甲醛(Cell FIX，Becton Dickinson，Erembodegem，Belgium)固定。通過流式細(xì)胞術(shù)分析抗原表達(dá)，使用10微升抗-CD14(18D11，DiatecAS，Oslo，Norway)，抗-CD44(Diatec AS，Oslo，Norway)，抗-ICAM-1(Diatec AS，Oslo，Norway)，以及同種型陰性對照抗-IgG1(1B9)和抗-IgG2(5A7)(均為Diatec AS)。所有樣品都是在FACScan(Becton Dickinson)上用CellQuest軟件進(jìn)行分析的。結(jié)果如圖1所示。
在每一個實(shí)驗(yàn)中，通過在分布圖上的特有位置，將所述單核細(xì)胞群確定為CD14陽性細(xì)胞。在按照上述特征進(jìn)行適當(dāng)?shù)拈T控之后，測定所述單核細(xì)胞群中的熒光強(qiáng)度(FI)，并且記錄每一次測定的平均FI(幾何平均值)。
統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)是以平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)形式提供的。通過單向方差分析(ANOVA)，分析所述數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行Tukey測驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為是顯著的。
如圖3所示，釉質(zhì)基質(zhì)衍生物導(dǎo)致了促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)生產(chǎn)的減少，這種減少伴隨著抗炎細(xì)胞因子IL-10釋放的增加。以上結(jié)果表明釉質(zhì)基質(zhì)衍生物具有有效的免疫調(diào)節(jié)作用。它還表明，釉質(zhì)基質(zhì)衍生物可能對伴隨多器官衰竭的敗血癥具有治療作用。另外，釉質(zhì)基質(zhì)衍生物可能對與急性或慢性炎癥相關(guān)的其他疾病具有治療作用，如炎性胃腸疾病，移植器官或整形移植物排斥，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，動脈硬化和若干種其他疾病。
實(shí)驗(yàn)2在本研究中，使用豬膿毒癥模型，在體內(nèi)檢驗(yàn)了釉質(zhì)基質(zhì)衍生物的治療作用。該模型根據(jù)連續(xù)輸液大腸桿菌LPS，產(chǎn)生了急性炎性反應(yīng)。經(jīng)過一段時間之后(通常在注射LPS半小時-1小時之后)，所述動物出現(xiàn)了膿毒性休克，體現(xiàn)了嚴(yán)重膿毒癥的病理生理學(xué)特征。該模型是經(jīng)體外發(fā)現(xiàn)與可能的臨床實(shí)驗(yàn)聯(lián)系在一起的有效工具。
在膿毒癥發(fā)作之前30分鐘，通過靜脈內(nèi)藥團(tuán)注射(＝注射LPS，1.7微克/千克體重/小時)，給豬施用釉質(zhì)基質(zhì)衍生物(最大劑量為5毫克/千克體重，即計算的血清濃度為大約100毫克/升)。據(jù)報導(dǎo)，釉質(zhì)基質(zhì)衍生物在血液中的半衰期為240分鐘。因此，為了保持EMD的治療性血清水平，利用一種靜脈內(nèi)輸液裝置每小時輸送50毫克包含在100毫升Ringer’s溶液(pH＝6)中的釉質(zhì)基質(zhì)衍生物。對于對照來說，用相同方法處理3只‘假處理’豬，所不同的是不施用EMD，而是代之以用血清白蛋白(“安慰劑”)進(jìn)行注射和輸液。
連續(xù)記錄血液動力學(xué)參數(shù)，每小時記錄1次，直到在輸注細(xì)菌毒素(LPS)之后5小時該實(shí)驗(yàn)結(jié)束時為止。在該實(shí)驗(yàn)開始之前(0時間)，在開始注射釉質(zhì)基質(zhì)衍生物或安慰劑之后馬上(0-a時間)，在開始注射LPS之后馬上(1時間)以及在膿毒癥發(fā)作之后每1個小時，從肝靜脈和門靜脈，腹動脈，和肺動脈中采集血樣，并且記錄臨床參數(shù)，并且分析血液平衡參數(shù)，器官功能標(biāo)記物(如血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ASAT)，血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALAT)，和作為肝臟功能標(biāo)記物的血清堿性磷酸酶活性，和作為腎功能標(biāo)記物的γ-轉(zhuǎn)谷氨酰酶(γ-GT)和肌酐酸，和炎性介質(zhì)(TNF-α，IL-1β和IL-6)。在所述實(shí)驗(yàn)期間，在預(yù)定的時間點(diǎn)上分析每小時從所述豬體內(nèi)采集的血液樣品的所述器官功能標(biāo)記物。所述血液樣品是采用挪威國立醫(yī)院血液學(xué)實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)院方法分析的。通過ELISA，使用購自R&D Systems Inc.(Minneapolis，MN，USA)的豬TNF-α/TNSF2 Quantikine P ELISA試劑盒(#PTA00)，豬IL-6 Quantikine P免疫分析試劑盒(P6000)，和豬IL-1β/IL-1F2Quantikine P ELISA試劑盒(#PTA00)分析相同血液樣品中的炎性標(biāo)記物。采用生產(chǎn)商提供的標(biāo)準(zhǔn)方法，不進(jìn)行省略或改進(jìn)。
在該實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后(所述動物死亡，或在連續(xù)注射釉質(zhì)基質(zhì)衍生物或安慰劑和LPS 5小時之后)，對所述動物實(shí)施安樂死，并且進(jìn)行尸體解剖。對內(nèi)部循環(huán)器官進(jìn)行肉眼檢查，并且對組織進(jìn)行取樣，以便按照研究計劃進(jìn)行組織學(xué)評估。
結(jié)果1號豬物理學(xué)數(shù)據(jù)雌性；總體重23.5kg；健康手術(shù)無并發(fā)癥治療安慰劑(包含在50毫升PBS藥團(tuán)注射液中的25毫克血清白蛋白，每小時輸液的100毫升Ringer’s溶液中的10毫克SA，總的SA劑量＝75毫克)，LPS(溶解在4.5毫升PBS中的40微克/小時，連續(xù)注射5小時；總的PBS劑量＝200微克)。
血液動力學(xué)觀察所述動物沒有表現(xiàn)出對注射安慰劑的反應(yīng)。出現(xiàn)了對LPS注射的強(qiáng)的初步反應(yīng)，隨后出現(xiàn)的是膿毒性休克狀況，該狀況在整個實(shí)驗(yàn)中持續(xù)出現(xiàn)。休克的發(fā)作是在LPS注射開始之后1小時內(nèi)出現(xiàn)的。
死亡時循環(huán)器官的解剖學(xué)和肉眼外觀所有循環(huán)器官具有正常的解剖學(xué)。病理學(xué)指征出現(xiàn)在肝臟中，肝臟中出現(xiàn)了充血和止血的指征。
血液學(xué)所述動物最初表現(xiàn)出正常的血液學(xué)參數(shù)值。在該實(shí)驗(yàn)中，大部分參數(shù)值處在正常值范圍內(nèi)。唯一的例外出現(xiàn)在LPS注射之后4小時和5小時，此時出現(xiàn)了B-中性粒細(xì)胞的增加和B-淋巴細(xì)胞的減少。
生物化學(xué)在整個實(shí)驗(yàn)中，所有的酶活性和肌酐酸處在正常值范圍內(nèi)。觀察到了肌酐酸的緩慢但是穩(wěn)定的減少，不過，它的值從來沒有降低到低于正常值。所述豬最初表現(xiàn)出ALP的略微的增加，不過，在施用LPS之前，這種增加恢復(fù)正常。在整個實(shí)驗(yàn)中，ASAT值同樣偏高，不過，沒有表現(xiàn)出因?yàn)長PS注射而產(chǎn)生的顯著變化。
細(xì)胞因子在施用LPS之后，所述豬表現(xiàn)出TNF值的迅速增加。在開始注射LPS之后的1小時之前，所述值超過了檢測限(1500微克/升)，并且在整個實(shí)驗(yàn)中保持在該水平。在注射LPS之后，IL-6也迅速增加。在本實(shí)驗(yàn)中，IL-6水平一直穩(wěn)定地增加，最后停留在3500微克/升的水平上。IL-1β表現(xiàn)出由LPS注射導(dǎo)致的緩慢增加，這種增加在5小時之后停留在大約700微克/升的水平。
評價在該實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，血液動力學(xué)參數(shù)表明了肝臟和肺衰竭。弱的和下降的排尿，表明了腎功能衰弱。器官衰竭的第一個指征是在LPS注射開始之后2小時出現(xiàn)的，在施用LPS之后30分鐘觀察到了戰(zhàn)栗。血液學(xué)和生物化學(xué)參數(shù)值表明，其生命支持系統(tǒng)正常工作，并且，所觀察到的作用是通過毒素注射引起的，而不是因?yàn)槭中g(shù)的創(chuàng)傷引起的。所述炎性狀態(tài)表明，所述豬患有膿毒性休克。沒有細(xì)胞因子值恢復(fù)的跡象。這頭豬極有可能不能在實(shí)驗(yàn)中存活。
2號豬物理學(xué)數(shù)據(jù)雌性；總體重21.5kg；健康手術(shù)無并發(fā)癥治療釉質(zhì)基質(zhì)衍生物(包含在50毫升PBS藥團(tuán)注射液中的21.5毫克釉質(zhì)基質(zhì)衍生物，每小時輸液的100毫升Ringer’s溶液中的10毫克釉質(zhì)基質(zhì)衍生物，總的釉質(zhì)基質(zhì)衍生物劑量＝71.5毫克)，LPS(37微克/小時，包含在4.5毫升PBS中，連續(xù)注射5小時；總的LPS劑量＝185微克)。
血液動力學(xué)觀察所述動物沒有表現(xiàn)出對EMD藥團(tuán)注射的反應(yīng)。出現(xiàn)了對LPS注射的非常迅速而且顯著的初步反應(yīng)(心動過速和加快的動脈流)，隨后在LPS注射開始之后大約1小時出現(xiàn)膿毒性休克狀況。在這一階段，觀察到了多器官衰竭的早期指征。不過，在隨后的時間，所述血液動力學(xué)值穩(wěn)定化，并且恢復(fù)了器官功能。
死亡時循環(huán)器官的解剖學(xué)和肉眼外觀所有循環(huán)器官具有正常的解剖學(xué)，在檢查過的器官中沒有發(fā)現(xiàn)肉眼可見的病理學(xué)指征。
血液學(xué)所述動物最初表現(xiàn)出正常的血液學(xué)參數(shù)值。在該實(shí)驗(yàn)中，所有參數(shù)值處在正常值范圍內(nèi)。
生物化學(xué)在整個實(shí)驗(yàn)中，所有的酶活性和肌酐酸處在正常值范圍內(nèi)。所述豬最初表現(xiàn)出ALP的略微增加，不過，通過注射釉質(zhì)基質(zhì)衍生物或LPS時，該值保持不變。在該實(shí)驗(yàn)即將結(jié)束時ASAT值略微提高，不過，沒有表現(xiàn)出由釉質(zhì)基質(zhì)衍生物或LPS注射而產(chǎn)生的任何顯著變化。
細(xì)胞因子注射釉質(zhì)基質(zhì)衍生物，不會引起分析的循環(huán)細(xì)胞因子的任何增加。不過，在施用LPS之后，所述豬表現(xiàn)出TNF值的快速增加。在開始注射LPS之后的1小時之前，所述值提高到超過檢測限(1500微克/升)，并且在該水平保持大約4小時。4小時之后，TNF值降低，并且表現(xiàn)出正?；嫩E象。在注射LPS之后，IL-6同樣快速增加。在正常實(shí)驗(yàn)中，IL-6水平一直穩(wěn)定地增加，在1小時之后提高到4800微克/升的峰值。在5小時之后，IL-6值似乎下降，不過，由于該實(shí)驗(yàn)(計劃)的結(jié)束，這種趨勢沒有得到證實(shí)。IL-1β表現(xiàn)出由LPS注射所導(dǎo)致的緩慢的增加，在5小時之后停留在大約1000微克/升的水平。
評價所述動物似乎從明顯的膿毒性休克和器官衰竭發(fā)生中恢復(fù)過來，表現(xiàn)在血液動力學(xué)參數(shù)以及腎功能(排尿)恢復(fù)和腹水減少方面。從施用LPS之后1小時開始出現(xiàn)了戰(zhàn)栗。上述發(fā)現(xiàn)是不尋常的，特別是在緊隨所述強(qiáng)的對內(nèi)毒素(LPS)的初步反應(yīng)之后。血液學(xué)和生物化學(xué)參數(shù)值表明，它的生命支持系統(tǒng)正常工作，并且，所觀察到的作用是由毒素注射引起的，而不是由手術(shù)的創(chuàng)傷引起的。所述炎性狀態(tài)表明，所述豬最初患有膿毒性休克。不過，存在IL-6和TNF值緩慢恢復(fù)的跡象。IL-1β值似乎不受施用釉質(zhì)基質(zhì)衍生物影響。在特定時間內(nèi)，所述炎性細(xì)胞因子水平持續(xù)降低，這頭豬極有可能在本實(shí)驗(yàn)中存活下來。
3號豬物理學(xué)數(shù)據(jù)雌性；總體重25.0kg；健康手術(shù)無并發(fā)癥治療安慰劑(包含在100毫升PBS藥團(tuán)注射液中的125毫克SA，每小時輸液的100毫升Ringer’s溶液中的50毫克SA，總的SA劑量＝350毫克)，LPS(43微克/小時，包含在4.5毫升PBS中，連續(xù)注射5小時；總的LPS劑量＝215微克)。
血液動力學(xué)觀察所述動物沒有表現(xiàn)出對安慰劑注射的反應(yīng)。在出現(xiàn)膿毒性休克狀況之后，觀察到了對LPS注射的低至中等的初步反應(yīng)，該狀況在整個實(shí)驗(yàn)中一直持續(xù)。休克的發(fā)作是在開始注射LPS之后大約1小時出現(xiàn)的。
死亡時循環(huán)器官的解剖學(xué)和肉眼外觀所有循環(huán)器官具有正常的解剖學(xué)。僅在肝臟中觀察到病理學(xué)指征，它表現(xiàn)出充血(腫脹和發(fā)紅)和止血的跡象。
血液學(xué)所述動物最初表現(xiàn)出正常的血液學(xué)參數(shù)值。在該實(shí)驗(yàn)中，大部分參數(shù)值處在正常值范圍內(nèi)。唯一的例外出現(xiàn)在LPS注射4和5小時之后，此時，觀察到B-中性粒細(xì)胞的增加和B淋巴細(xì)胞的減少。
生物化學(xué)在整個實(shí)驗(yàn)中，大部分酶活性處在正常值范圍內(nèi)。觀察到了肌酐酸的緩慢而又穩(wěn)定的減少，并且，在LPS注射之后2小時，肌酐酸含量降低到低于正常值范圍，并且在該實(shí)驗(yàn)的其余時間保持在該低水平上。所述豬最初表現(xiàn)出增加的ALP活性，不過，該值是穩(wěn)定的，并且不受LPS注射的影響。炎性狀態(tài)表明，所述豬患有膿毒性休克。沒有出現(xiàn)細(xì)胞因子值恢復(fù)的跡象。這頭豬很有可能不能在本實(shí)驗(yàn)中存活。
細(xì)胞因子在施用LPS之后，所述豬表現(xiàn)出TNF值的迅速增加。在開始注射LPS之后的1小時之前，所述值提高到超過檢測限(1500微克/升)，并且在整個實(shí)驗(yàn)中都保持在該水平。在LPS注射開始之后，IL-6同樣迅速增加。在該實(shí)驗(yàn)中，IL-6含量一直穩(wěn)定地增加，并且在LPS注射之后3小時提到到5000微克/升的峰值，最后停留在3900微克/升的水平上。IL-1β表現(xiàn)出由LPS注射所導(dǎo)致的緩慢增加，在5小時之后停留在大約700微克/升的水平。
評價在本實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，血液動力學(xué)參數(shù)表明了肝臟衰竭。低排尿表現(xiàn)出腎衰竭。從開始注射LPS之后3小時開始出現(xiàn)了器官衰竭的跡象。在施用LPS之后30分鐘出現(xiàn)了戰(zhàn)栗。血液學(xué)和生物化學(xué)參數(shù)值表明，它的生命支持系統(tǒng)正常工作，并且，所觀察到的作用是由毒素注射引起的，而不是由手術(shù)的創(chuàng)傷引起的。所述炎性狀態(tài)表明了所述豬患有膿毒性休克。不存在細(xì)胞因子值恢復(fù)的跡象。所述豬很有可能不能在本實(shí)驗(yàn)中存活下來。
4號豬物理學(xué)數(shù)據(jù)雌性；總體重24.5kg；健康手術(shù)無并發(fā)癥治療釉質(zhì)基質(zhì)衍生物(包含在100毫升PBS藥團(tuán)注射液中的125毫克釉質(zhì)基質(zhì)衍生物，每小時輸液的100毫升Ringer’s溶液中的50毫克釉質(zhì)基質(zhì)衍生物，總的釉質(zhì)基質(zhì)衍生物劑量＝375毫克)，LPS(42微克/小時，包含在4.5毫升PBS中，連續(xù)注射5小時；總的LPS劑量＝210微克)。
血液動力學(xué)觀察所述動物沒有表現(xiàn)出對EMD藥團(tuán)注射的反應(yīng)。在開始LPS注射之后大約3小時出現(xiàn)了針對LPS注射的很強(qiáng)的初步反應(yīng)，隨后是弱的膿毒性休克狀況。在此階段。觀察到了肺衰竭的早期狀況。不過，在隨后的時間點(diǎn)上，所述血液動力學(xué)值穩(wěn)定化，并且恢復(fù)了所有器官功能。
死亡時循環(huán)器官的解剖學(xué)和內(nèi)眼外觀所有循環(huán)器官具有正常的解剖學(xué)。在檢查過的器官中沒有發(fā)現(xiàn)肉眼可見的病理學(xué)指征。
血液學(xué)所述動物最初表現(xiàn)出正常的血液學(xué)參數(shù)值。在正常實(shí)驗(yàn)中，所有參數(shù)值處在正常值范圍內(nèi)。
生物化學(xué)在整個實(shí)驗(yàn)中，所有的酶活性和肌酐酸處在正常值范圍內(nèi)。所述豬最初表現(xiàn)出略微增強(qiáng)的ALP活性，不過，在注射釉質(zhì)基質(zhì)衍生物或LPS時，該活性保持不變。在該實(shí)驗(yàn)即將結(jié)束時ASAT值略微提高，不過，沒有表現(xiàn)出直接與注射釉質(zhì)基質(zhì)衍生物或LPS相關(guān)的任何顯著改變。
細(xì)胞因子注射釉質(zhì)基質(zhì)衍生物沒有引起分析的循環(huán)細(xì)胞因子的任何增加。不過，在開始LPS注射之后的1小時之前，所述值提高到超過檢測限(1500微克/升)，并且在正常實(shí)驗(yàn)保持在該水平。在開始LPS注射之后，IL-6同樣快速增加。IL-6含量在實(shí)驗(yàn)中一直穩(wěn)定地增加，在3小時之后提高到超過檢測限(＞5000微克/升)。在4小時之后，IL-6值似乎下降，并且在5小時時同樣證實(shí)了這種趨勢。IL-1β表現(xiàn)出由LPS注射所導(dǎo)致的緩慢的穩(wěn)定增加，在5小時之后停留在大約700微克/升的水平。
評價正如通過臨床和血液動力學(xué)參數(shù)所發(fā)現(xiàn)的，所述動物似乎在嚴(yán)重膿毒性休克和器官衰竭方面受到保護(hù)。沒有觀察到器官衰竭，不過，在整個實(shí)驗(yàn)中排尿是低的。產(chǎn)生的腹水很少，并且沒有出現(xiàn)戰(zhàn)栗。這一發(fā)現(xiàn)是不尋常的，特別是在對內(nèi)毒素(LPS)做出強(qiáng)的初步反應(yīng)之后更是如此。血液學(xué)和生物化學(xué)參數(shù)值表明，它的生命支持系統(tǒng)能正常工作，并且，所觀察到的作用是由毒素注射引起的，而不是由手術(shù)的創(chuàng)傷引起的。所述炎性狀態(tài)表明，所述豬最初有膿毒性休克的發(fā)作。不過，存在IL-6和TNF值緩慢恢復(fù)的跡象。IL-1β值似乎不受施用釉質(zhì)基質(zhì)衍生物影響。由于時間和炎性細(xì)胞因子含量的持續(xù)降低，以及良好的血液動力學(xué)狀態(tài)，有理由認(rèn)為這頭豬能夠在本實(shí)驗(yàn)中存活下來。
5號豬物理學(xué)數(shù)據(jù)雌性；總體重25.0kg；健康手術(shù)無并發(fā)癥治療釉質(zhì)基質(zhì)衍生物(包含在100毫升PBS藥團(tuán)注射液中的125毫克釉質(zhì)基質(zhì)衍生物，每小時輸液的100毫升Ringer’s溶液中的50毫克釉質(zhì)基質(zhì)衍生物，總的釉質(zhì)基質(zhì)衍生物劑量＝375毫克)，LPS(43微克/小時，包含在4.5毫升PBS中，連續(xù)注射5小時；總的LPS劑量＝215微克)。
血液動力學(xué)觀察作為對EMD藥團(tuán)注射的最初反應(yīng)，所述動物表現(xiàn)出初步的肺血壓提高。這種作用是非常短暫的(數(shù)分鐘)，并且不取決于劑量。這表明了釉質(zhì)基質(zhì)衍生物溶液對肺毛細(xì)管具有短時間的血管收縮作用。在所述藥團(tuán)注射結(jié)束之前，所出現(xiàn)的作用已正?；]有發(fā)現(xiàn)通過釉質(zhì)基質(zhì)衍生物注射產(chǎn)生的其他作用。該動物根本沒有出現(xiàn)對LPS注射的任何顯著反應(yīng)。在整個實(shí)驗(yàn)中，沒有出現(xiàn)膿毒性休克狀況的跡象，并且器官循環(huán)是穩(wěn)定的。在實(shí)驗(yàn)期間，對LPS流量和LPS插管的位置進(jìn)行若干次控制，以便確保LPS是按照實(shí)驗(yàn)計劃輸送的。
死亡時循環(huán)器官的解剖學(xué)和肉眼外觀所有循環(huán)器官具有正常的解剖學(xué)。在檢查過的器官中沒有出現(xiàn)肉眼可見的病理學(xué)指征。
血液學(xué)所述動物最初表現(xiàn)出正常的血液學(xué)參數(shù)值，只有白細(xì)胞的數(shù)量除外。白細(xì)胞的數(shù)量從手術(shù)開始(0-樣品)起顯著增加(為正常值的2倍)。不過，不同白細(xì)胞的相對含量似乎正常，并且，在本實(shí)驗(yàn)中保持穩(wěn)定。在整個實(shí)驗(yàn)過程中，所有其他參數(shù)值處在正常值范圍內(nèi)。
生物化學(xué)在整個實(shí)驗(yàn)中，所有酶活性和肌酐酸處在正常值范圍內(nèi)。ALP除外，它的含量從該實(shí)驗(yàn)開始起提高，不過，在整個觀察階段保持穩(wěn)定。在注射釉質(zhì)基質(zhì)衍生物或LPS時，ALP含量保持不變。從注射LPS開始到該實(shí)驗(yàn)結(jié)束，ALAT值略微提高。不過，這種提高是非常小的，并且很少上升到高于正常限。
細(xì)胞因子注射釉質(zhì)基質(zhì)衍生物，沒有引起分析中的循環(huán)細(xì)胞因子的任何增加。不過，所述豬甚至在實(shí)驗(yàn)開始之前就表現(xiàn)出TNF值的顯著增加(＞1500微克/升)，直到施用LPS之后2小時，該值都保持在高于檢測范圍。不過，從此時開始，觀察到了TNF值的迅速降低，并且在本實(shí)驗(yàn)結(jié)束之前，TNF含量接近正?；?。在LPS注射開始之后，IL-6迅速增加。IL-6含量穩(wěn)定地增加，直到開始注射LPS之后2小時，達(dá)到2500微克/升的峰值。然后，IL-6含量逐漸降低，在注射LPS之后5小時達(dá)到正常含量。IL-1β表現(xiàn)出由注射LPS引起的緩慢的穩(wěn)定的增加，在5小時之后停留在大約900微克/升的水平。
評價正如通過臨床和血液動力學(xué)參數(shù)所觀察到的，所述動物似乎完全避免了LPS誘導(dǎo)的膿毒性休克和器官衰竭。在整個實(shí)驗(yàn)中，沒有出現(xiàn)器官衰竭，并且排尿良好而且穩(wěn)定。產(chǎn)生的腹水很少，并且沒有出現(xiàn)戰(zhàn)栗。極不尋常的是，所述動物沒有以這種方式對中樞內(nèi)毒素(LPS)注射作出反應(yīng)。血液學(xué)和生物化學(xué)參數(shù)值表明，其生命支持系統(tǒng)能正常工作，并且，所出現(xiàn)的作用是由所述毒素注射引起的，而不是由手術(shù)造成的創(chuàng)傷引起的。所述炎性狀態(tài)表明了所述豬最初患有弱的膿毒性休克發(fā)作，不過，存在IL-6和TNF參數(shù)值迅速恢復(fù)的明確跡象。IL-1β值似乎沒有受到施用釉質(zhì)基質(zhì)衍生物的影響。如果允許的話，該動物在本實(shí)驗(yàn)中存活下來是沒有疑問的。
6號豬物理學(xué)數(shù)據(jù)雌性；總體重23.0kg；健康手術(shù)無并發(fā)癥治療釉質(zhì)基質(zhì)衍生物(包含在100毫升PBS藥團(tuán)注射液中的115毫克釉質(zhì)基質(zhì)衍生物，每小時輸液的100毫升Ringer’s溶液中的50毫克釉質(zhì)基質(zhì)衍生物，總的釉質(zhì)基質(zhì)衍生物劑量＝365毫克)，LPS(39微克/小時，包含在4.5毫升PBS中，連續(xù)注射5小時；總的LPS劑量＝195微克)。
血液動力學(xué)觀察作為對EMD藥團(tuán)注射的反應(yīng)，所述動物表現(xiàn)出肺血壓的最初的升高。該反應(yīng)是臨時和短暫的(數(shù)分鐘)，并且不取決于劑量，這表明注射釉質(zhì)基質(zhì)衍生物對肺毛細(xì)管具有短時間的血管收縮作用。在所述藥團(tuán)注射結(jié)束之前，這種作用正常化。
出現(xiàn)了對注射LPS的很強(qiáng)的最初反應(yīng)(心跳速度和動脈血流的快速而又短暫的增加)，隨后在整個實(shí)驗(yàn)過程中持續(xù)中等程度高血壓狀態(tài)。沒有出現(xiàn)膿毒性休克的跡象，也沒有出現(xiàn)任何器官衰竭的跡象。
死亡時循環(huán)器官的解剖學(xué)和肉眼外觀所有循環(huán)器官具有正常的解剖學(xué)。在檢查過的器官中沒有出現(xiàn)肉眼可見的病理學(xué)指征。
血液學(xué)所述動物最初表現(xiàn)出正常的血液學(xué)參數(shù)值。在整個實(shí)驗(yàn)中，所有參數(shù)值保持在正常范圍內(nèi)。
生物化學(xué)在整個實(shí)驗(yàn)中，所有酶活性和肌酐酸處在正常值范圍內(nèi)，ALP和ASAT除外，它們的含量從該實(shí)驗(yàn)開始起略微增加，不過，在整個觀察階段保持穩(wěn)定。ALP和ASAT含量沒有因?yàn)樽⑸溆再|(zhì)基質(zhì)衍生物或LPS而改變。
細(xì)胞因子注射釉質(zhì)基質(zhì)衍生物沒有引起分析的循環(huán)細(xì)胞因子的任何增加。不過，所述豬在施用LPS之后，表現(xiàn)出TNF值的迅速增加。在開始注射LPS之后1小時之前所述值上升到高于檢測限(1500微克/升)，并且在該水平保持大約3小時。在3小時之后，TNF值迅速降低，并且在觀察期結(jié)束時正?；Ｔ陂_始注射LPS之后，IL-6同樣迅速增加。在注射LPS之后2小時，IL-6含量上升到2700微克/升的峰值。不過，在該實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，IL-6的值已經(jīng)降低到接近正常值(350微克/升)。IL-1β表現(xiàn)出由LPS注射引起的緩慢的穩(wěn)定的增加，在4小時之后上升到大約1200微克/升的峰值。
評價正如通過血液動力學(xué)和臨床參數(shù)所發(fā)現(xiàn)的，所述動物似乎沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的膿毒性休克和器官衰竭。在整個實(shí)驗(yàn)期間，沒有出現(xiàn)器官衰竭，并且排尿多而且穩(wěn)定。產(chǎn)生的腹水很少，并且僅僅在LPS輸液之后大約4小時觀察到了戰(zhàn)栗。上述發(fā)現(xiàn)是不尋常的，特別是在本實(shí)驗(yàn)中所觀察到的對內(nèi)毒素(LPS)的強(qiáng)的初步反應(yīng)之后更是如此。血液學(xué)和生物化學(xué)參數(shù)值表明，其生命支持系統(tǒng)能正常工作，并且，所出現(xiàn)的作用是由所述毒素注射引起的，而不是由手術(shù)造成的創(chuàng)傷引起的。所述炎性狀態(tài)表明，所述豬最初患有強(qiáng)的膿毒性休克發(fā)作(TNF和IL-6的快速而又明顯的增加)。不過，存在IL-6和TNF值全面恢復(fù)的明確跡象。IL-1β值似乎沒有受到施用釉質(zhì)基質(zhì)衍生物的影響。如果允許的話，該動物在本實(shí)驗(yàn)中在本實(shí)驗(yàn)中存活下來是沒有疑問的。
總結(jié)對照(1和3號豬)這兩種對照都表現(xiàn)正常，即在開始注射LPS之后大約30分鐘，它們都進(jìn)入了膿毒性休克狀態(tài)。這兩頭豬在注射LPS之后存活了5小時，不過，它們表現(xiàn)出嚴(yán)重的不受控制的膿毒性休克的明確臨床體征，出現(xiàn)較高的體溫，多器官衰竭，腎衰，低血壓和降低的心輸出。另外，對血液的分析發(fā)現(xiàn)了膿毒性休克的明確跡象。所述炎性狀態(tài)還與伴隨TNF-α和白介素-6強(qiáng)表達(dá)的急性毒素誘導(dǎo)的膿毒性休克吻合。在所述實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，所述豬的狀況是如此嚴(yán)重，以至于判斷它們不適合繼續(xù)生活。
低的釉質(zhì)基質(zhì)衍生物劑量(2號豬)施用低的釉質(zhì)基質(zhì)衍生物劑量的豬也進(jìn)入了膿毒性休克狀態(tài)。不過，與假操作動物相比，對LPS的急性炎性反應(yīng)的發(fā)作延遲了大約30-60分鐘。在敗血癥發(fā)作之后，所述豬穩(wěn)定化，然后緩慢地從休克中恢復(fù)過來。這頭豬表現(xiàn)出稍好一些的臨床參數(shù)，并且沒有出現(xiàn)腎衰的跡象(通過排尿衡量)。在開始注射LPS之后5小時，按計劃對這頭豬實(shí)施安樂死。所述藥團(tuán)注射，以及緊隨其后的用“低”劑量的釉質(zhì)基質(zhì)衍生物輸液沒有在這頭豬體內(nèi)引起不良反應(yīng)的任何臨床體征，也沒有出現(xiàn)針對釉質(zhì)基質(zhì)衍生物注射的任何監(jiān)測的參數(shù)。這頭豬還表現(xiàn)出TNF和IL-6值降低的傾向。這一發(fā)現(xiàn)與所述臨床觀察一起暗示了該動物已經(jīng)從休克中恢復(fù)過來。
高釉質(zhì)基質(zhì)衍生物劑量(4號豬，5號和6號豬)三只施用高劑量釉質(zhì)基質(zhì)衍生物的動物無一出現(xiàn)由注射LPS引起的嚴(yán)重的膿毒性休克狀況。兩只動物(4號豬和6號豬)經(jīng)歷了初步的，但是短暫的內(nèi)毒素反應(yīng)，不過，該狀況很快穩(wěn)定，并且所述動物很快恢復(fù)，并且在整個實(shí)驗(yàn)中保持“受控制”狀態(tài)。第三只動物(5號豬)對注射LPS根本沒有反應(yīng)。這些動物中沒有一只出現(xiàn)多器官衰竭或腎衰的跡象。只有一頭豬(6號豬)出現(xiàn)了由注射LPS誘導(dǎo)的典型的戰(zhàn)栗。與對照相比，所述戰(zhàn)栗的發(fā)作被明顯延遲了(4小時)。在開始注射LPS之后5小時，按計劃對這些豬實(shí)施安樂死。
在這些豬中，藥團(tuán)注射和隨后的用“高”劑量的釉質(zhì)基質(zhì)衍生物輸液沒有引起任何持久的臨床體征或不良反應(yīng)。在這些豬中有兩頭(5號豬和6號豬)觀察到了對藥團(tuán)注射的初步反應(yīng)。這種反應(yīng)是以肺動脈壓力的快速而短暫的提高形式出現(xiàn)的，表明了高濃度釉質(zhì)基質(zhì)衍生物溶液(大約1.25mg/m1)的中樞藥團(tuán)注射，誘導(dǎo)了肺小動脈和/或毛細(xì)管的自發(fā)的收縮。這種作用是即時的，并且與劑量無關(guān)。所觀察到的作用在數(shù)分鐘內(nèi)恢復(fù)正常，并且所述豬是穩(wěn)定的，在藥團(tuán)注射結(jié)束之前表現(xiàn)出正常的血液動力學(xué)參數(shù)和臨床狀態(tài)。
在初步的LPS反應(yīng)之后，TNF和IL-6值還表現(xiàn)出下降的趨勢。實(shí)際上，在這三只動物中有兩只(5號豬和6號豬)的TNF和IL-6在所述觀察期結(jié)束之前接近正常化。這一發(fā)現(xiàn)與所述臨床觀察一起暗示了這些動物沒有出現(xiàn)LPS誘導(dǎo)的休克和隨后的多器官衰竭。在這些豬上施用的釉質(zhì)基質(zhì)衍生物注射液，能保護(hù)這些動物免受注射毒素的嚴(yán)重?fù)p傷，并因此防止所述動物出現(xiàn)膿毒性休克。所有三只動物都能在實(shí)驗(yàn)中存活下來。
權(quán)利要求
1.活性釉質(zhì)物質(zhì)和/或活性釉質(zhì)物質(zhì)制劑在制備用于預(yù)防和/或治療哺乳動物中的狀況的藥物組合物中的用途，其中，所述狀況以所述哺乳動物對免疫原的免疫反應(yīng)失衡為特征。
2.如權(quán)利要求1的用途，其中，所述活性釉質(zhì)物質(zhì)能調(diào)節(jié)所述哺乳動物免疫機(jī)制的功能。
3.如權(quán)利要求1或2的用途，其中，所述免疫系統(tǒng)的至少一部分能對所述免疫原過敏反應(yīng)。
4.如權(quán)利要求1-3中任意一項的用途，其中，所述免疫系統(tǒng)的至少一部分是無區(qū)別地受到刺激的。
5.如權(quán)利要求1-4中任意一項的用途，其中，所述免疫系統(tǒng)的至少一部分不能對所述刺激作出反應(yīng)。
6.如權(quán)利要求1-5中任意一項的用途，其中，所述免疫反應(yīng)的失衡是局部性的。
7.如權(quán)利要求1-5中任意一項的用途，其中，所述免疫反應(yīng)的失衡是系統(tǒng)性的。
8.如權(quán)利要求1-7中任意一項的用途，其中，所述狀況以自身免疫病為特征。
9.如權(quán)利要求8的用途，其中，所述自身免疫病選自下組類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，皮膚病，過敏，硬化，動脈硬化，多發(fā)性硬化，哮喘，牛皮癬，狼瘡，糖尿病，重癥肌無力，慢性疲勞綜合征，纖維肌痛，克隆氏病，橋本氏甲狀腺炎，格雷夫斯病，阿狄森氏病，格-巴綜合征和硬皮病。
10.如權(quán)利要求7的用途，其中，所述狀況以系統(tǒng)性炎癥和/或感染為特征。
11.如權(quán)利要求10的用途，其中，所述系統(tǒng)性狀況與創(chuàng)傷、燒傷、手術(shù)、透析、休克和/或細(xì)菌或病毒感染相關(guān)。
12.如權(quán)利要求10的用途，其中，所述系統(tǒng)性狀況與選自下組的疾病相關(guān)體外膜氧合作用(ECMO)，休克，系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，敗血癥，多器官衰竭，諸如器官和/或假體的移植物排斥，心臟和肺旁路手術(shù)，慢性炎癥，哮喘和/或與應(yīng)激相關(guān)的肺病，細(xì)菌感染，壞疽，軟組織感染，和傷口感染。
13.如權(quán)利要求11或12的用途，其中，所述感染是由選自格蘭氏陰性微生物和格蘭氏陽性微生物的細(xì)菌污染引起的。
14.如權(quán)利要求13的用途，其中，所述感染是由所述微生物產(chǎn)生的內(nèi)毒素和/或外毒素引起的。
15.如權(quán)利要求14的用途，其中，所述感染是由來自金黃色葡萄糖球菌的PepG引起的。
16.如權(quán)利要求14的用途，其中，所述感染是由來自大腸桿菌的LPS引起的。
17.如權(quán)利要求11-16中任意一項的用途，其中，包含在所述藥物組合物中的所述活性釉質(zhì)物質(zhì)和/或所述制劑通過與由所述微生物產(chǎn)生的內(nèi)毒素和/或外毒素結(jié)合，使由所述微生物產(chǎn)生的內(nèi)毒素和/或外毒素的毒性作用失活。
18.如權(quán)利要求11-16中任意一項的用途，其中，包含在所述藥物組合物中的所述活性釉質(zhì)物質(zhì)和/或所述制劑通過與由所述微生物產(chǎn)生的內(nèi)毒素和/或外毒素的細(xì)胞受體結(jié)合，使由所述微生物產(chǎn)生的內(nèi)毒素和/或外毒素的毒性作用失活。
19.如上述權(quán)利要求中任意一項的用途，其中，包含在所述藥物組合物中的所述活性釉質(zhì)物質(zhì)和/或所述制劑能調(diào)節(jié)所述哺乳動物體內(nèi)T-輔助細(xì)胞激活的方式。
20.如上述權(quán)利要求中任意一項的用途，其中，包含在所述藥物組合物中的所述活性釉質(zhì)物質(zhì)和/或所述制劑能調(diào)節(jié)細(xì)胞間和/或細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)物質(zhì)。
21.如權(quán)利要求20的用途，其中，包含在所述藥物組合物中的所述活性釉質(zhì)物質(zhì)和/或所述制劑能調(diào)節(jié)與所述哺乳動物的免疫機(jī)制相關(guān)的至少一種細(xì)胞因子的表達(dá)水平，釋放和/或功能。
22.如上述權(quán)利要求中任意一項的用途，其中，包含在所述藥物組合物中的所述活性釉質(zhì)物質(zhì)和/或所述制劑能調(diào)節(jié)與所述哺乳動物的所述免疫機(jī)制相關(guān)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)。
23.如權(quán)利要求22的用途，其中，包含在所述藥物組合物中的所述活性釉質(zhì)物質(zhì)和/或所述制劑能與選自下組中任意一個的細(xì)胞表面受體和/或細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)相互作用ICAM，HLA抗原，白介素受體，PDGF受體，TGF受體，TNF受體，EGF受體，CD44或整聯(lián)蛋白。
24.如上述權(quán)利要求中任意一項的用途，其中，所述藥物組合物是系統(tǒng)施用的。
25.如上述權(quán)利要求中任意一項的用途，其中，所述活性釉質(zhì)物質(zhì)是釉質(zhì)基質(zhì)，釉質(zhì)基質(zhì)衍生物和/或釉質(zhì)基質(zhì)蛋白。
26.如上述權(quán)利要求中任意一項的用途，其中，所述活性釉質(zhì)物質(zhì)選自下組琺瑯蛋白，牙釉蛋白，非-牙釉蛋白，富脯氨酸非牙釉蛋白，tuftelins，它們的衍生物和混合物。
27.如上述權(quán)利要求中任意一項的用途，其中，所述活性釉質(zhì)物質(zhì)選自牙釉蛋白和/或肽，它們的衍生物和混合物。
28.如上述權(quán)利要求中任意一項的用途，其中，所述活性釉質(zhì)物質(zhì)的分子量最多為大約120kDa，如最多為100kDa，90kDa，80kDa，70kDa或60kDa，該分子量是通過SDS PAGE電泳測定。
29.如上述權(quán)利要求中任意一項的用途，其中，所述活性釉質(zhì)物質(zhì)和/或所述制劑包括不超過13kDa的牙釉蛋白加工產(chǎn)物。
30.如權(quán)利要求29的用途，其中，所述加工過的牙釉蛋白產(chǎn)物選自氨基酸長度為大約2-13kDa的基于可溶性牙釉蛋白的肽，包括氨基酸長度為2-4.5kDa，3-5.5kDa，4-6.5kDa，5-7.5kDa，或5-13kDa的基于可溶性牙釉蛋白的肽。
31.如上述權(quán)利要求中任意一項的用途，其中，所述加工過的牙釉蛋白產(chǎn)物包含在通過如圖2所示的降解的牙釉蛋白的HPLC分析的第三和/或第四個峰表示的洗脫液。
32.如上述權(quán)利要求中任意一項的用途，其中，所述加工過的牙釉蛋白產(chǎn)物是5kDa的多肽。
33.如上述權(quán)利要求中任意一項的用途，其中，所述活性釉質(zhì)物質(zhì)的分子量最高為大約40,000。
34.如上述權(quán)利要求中任意一項的用途，其中，所述活性釉質(zhì)物質(zhì)的分子量為大約5,000至大約25,000。
35.如上述權(quán)利要求中任意一項的用途，其中，所述活性釉質(zhì)物質(zhì)的主要部分的分子量為大約20kDa。
36.如上述權(quán)利要求中任意一項的用途，其中，所述活性釉質(zhì)物質(zhì)制劑包括具有不同分子量的活性釉質(zhì)物質(zhì)的混合物。
37.如上述權(quán)利要求中任意一項的用途，其中，所述活性釉質(zhì)物質(zhì)制劑包括至少兩種選自下組的物質(zhì)牙釉蛋白，富脯氨酸非牙釉蛋白，tuftelins，簇蛋白，血清蛋白，唾液蛋白，ameloblastin，sheathlin，和它們的衍生物。
38.如上述權(quán)利要求中任意一項的用途，其中，在所述制劑中，所述活性釉質(zhì)物質(zhì)的蛋白含量為大約0.005％w/w-100％w/w，如大約5-99％w/w，大約10-95％w/w，大約15-90％w/w，大約20-90％w/w，大約30-90％w/w，大約40-85％w/w，大約50-80％w/w，大約60-70％w/w，大約70-90％w/w，或大約80-90％w/w。
39.如上述權(quán)利要求中任意一項的用途，其中，所述藥物組合物還包括可以藥用的賦形劑。
40.如權(quán)利要求39的用途，其中，所述可以藥用的賦形劑是磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。
41.一種用于治療和/或預(yù)防有需要的哺乳動物中的狀況的方法，包括施用有效量的含有活性釉質(zhì)物質(zhì)和/或活性釉質(zhì)物質(zhì)制劑的藥物組合物，所述狀況的特征是由外部和/或內(nèi)部刺激造成的所述哺乳動物的免疫反應(yīng)失衡。
42.如權(quán)利要求41的方法，其中，所述活性釉質(zhì)物質(zhì)能調(diào)節(jié)有需要的哺乳動物體內(nèi)的免疫機(jī)制的功能。
43.如權(quán)利要求41或42的方法，其中，所述免疫反應(yīng)的失衡是對所述刺激的過敏性反應(yīng)。
44.如權(quán)利要求41-43中任意一項的方法，其中，所述免疫反應(yīng)的失衡以不能對所述刺激反應(yīng)為特征。
45.如權(quán)利要求41-43中任意一項的方法，其中，所述免疫反應(yīng)的失衡以所述免疫系統(tǒng)的無區(qū)別的刺激為特征。
46.如權(quán)利要求41-45中任意一項的方法，其中，所述哺乳動物的免疫反應(yīng)失衡是局部性的。
47.如權(quán)利要求41-46中任意一項的方法，其中，所述哺乳動物的免疫反應(yīng)失衡是系統(tǒng)性的。
48.如權(quán)利要求47的方法，其中，所述狀況以系統(tǒng)性炎癥和/或感染為特征。
49.如權(quán)利要求47或48的方法，其中，所述系統(tǒng)性狀況與創(chuàng)傷，燒傷，手術(shù)，透析，休克和/或細(xì)菌或病毒感染相關(guān)。
50.如權(quán)利要求47-49中任意一項的方法，其中，所述系統(tǒng)性狀況與體外膜氧合作用(ECMO)，休克，系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，敗血癥，多器官衰竭，諸如器官和/或假體的移植物排斥，心臟和肺旁路手術(shù)，慢性炎癥，哮喘和與應(yīng)激相關(guān)的肺病，細(xì)菌感染，壞疽，軟組織感染，和/或傷口感染相關(guān)。
51.如權(quán)利要求47-50中任意一項的方法，其中，所述感染是由選自格蘭氏陰性微生物和格蘭氏陽性微生物的細(xì)菌污染引起的。
52.如權(quán)利要求47-51中任意一項的方法，其中，所述感染是由所述微生物產(chǎn)生的內(nèi)毒素和/或外毒素引起的。
53.如權(quán)利要求41-46的方法，其中，所述免疫反應(yīng)失衡是自身免疫病。
54.如權(quán)利要求53的方法，其中，所述自身免疫病選自，但不局限于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，皮膚病，過敏，硬化，動脈硬化，多發(fā)性硬化，哮喘，牛皮癬，狼瘡，糖尿病，重癥肌無力，慢性疲勞綜合征，纖維肌痛，慢性疲勞綜合征，克隆氏病，橋本氏甲狀腺炎，格雷夫斯病，阿狄森氏病，格-巴綜合征和硬皮病。
55.如權(quán)利要求41-54中任意一項的方法，其中，所述藥物組合物中的活性釉質(zhì)物質(zhì)能調(diào)節(jié)所述哺乳動物體內(nèi)T-輔助細(xì)胞激活的方式。
56.如權(quán)利要求41-55中任意一項的方法，其中，所述藥物組合物中的活性釉質(zhì)物質(zhì)能調(diào)節(jié)細(xì)胞間信號傳導(dǎo)物質(zhì)。
57.如權(quán)利要求56的方法，其中，所述藥物組合物中的活性釉質(zhì)物質(zhì)能調(diào)節(jié)與所述哺乳動物免疫機(jī)制相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)水平，釋放和/或功能。
58.如權(quán)利要求41-57的方法，其中，所述藥物組合物中的活性釉質(zhì)物質(zhì)能調(diào)節(jié)與所述哺乳動物免疫機(jī)制相關(guān)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)。
59.如權(quán)利要求58的方法，其中，包含在所述藥物組合物中的活性釉質(zhì)物質(zhì)能與選自下組中任意一種的細(xì)胞表面受體和/或細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)相互作用ICAM，HLA抗原，白介素受體，PDGF受體，TGF受體，TNF-受體，EGF受體，CD44或整聯(lián)蛋白。
60.如權(quán)利要求41-58中任意一項的方法，其中，所述含有活性釉質(zhì)物質(zhì)的藥物組合物是系統(tǒng)性施用的。
61.如權(quán)利要求41-60中任意一項的方法，其中，所述活性釉質(zhì)物質(zhì)是釉質(zhì)基質(zhì)，釉質(zhì)基質(zhì)衍生物和/或釉質(zhì)基質(zhì)蛋白。
62.如權(quán)利要求41-61中任意一項的方法，其中，所述活性釉質(zhì)物質(zhì)選自下組琺瑯蛋白，牙釉蛋白，非-牙釉蛋白，富脯氨酸非牙釉蛋白，tuftelins，它們的衍生物和它們的混合物。
63.如權(quán)利要求41-62中任意一項的方法，其中，所述活性釉質(zhì)物質(zhì)的分子量最多為大約120kDa，如，最多為100kDa，90kDa，80kDa，70kDa或60kDa，該分子量是通過SDS PAGE電泳測定的。
64.如權(quán)利要求41-63中任意一項的方法，其中，所述活性釉質(zhì)物質(zhì)制劑包括具有不同分子量的活性釉質(zhì)物質(zhì)的混合物。
65.如權(quán)利要求41-64中任意一項的方法，其中，所述活性釉質(zhì)物質(zhì)制劑包括至少兩種選自下組的物質(zhì)牙釉蛋白，富脯氨酸非牙釉蛋白，tuftelins，簇蛋白，血清蛋白，唾液蛋白，ameloblastin，sheathlin，和它們的衍生物。
66.如權(quán)利要求41-65中任意一項的方法，其中，所述活性釉質(zhì)物質(zhì)的分子量最高為大約40,000。
67.如權(quán)利要求41-66中任意一項的方法，其中，所述活性釉質(zhì)物質(zhì)的分子量為大約5,000至大約25,000。
68.如權(quán)利要求41-67中任意一項的方法，其中，所述活性釉質(zhì)物質(zhì)的主要部分的分子量為大約20kDa。
69.如權(quán)利要求41-68中任意一項的方法，其中，所述制劑中所述活性釉質(zhì)物質(zhì)的蛋白含量為大約0.005％w/w-100％w/w，如大約5-99％w/w，大約10-95％w/w，大約15-90％w/w，大約20-90％w/w，大約30-90％w/w，大約40-85％w/w，大約50-80％w/w，大約60-70％w/w，大約70-90％w/w，或大約80-90％w/w。
70.如權(quán)利要求41-69中任意一項的方法，其中，所述藥物組合物還包括一種可以藥用的賦形劑。
71.如權(quán)利要求70的方法，其中，所述可以藥用的賦形劑是磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。
72.如權(quán)利要求71的方法，其中，所述藥物組合物包括30微克釉質(zhì)基質(zhì)蛋白，和1ml的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。
全文摘要
本發(fā)明涉及諸如牙釉蛋白的活性釉質(zhì)基質(zhì)物質(zhì)的制劑在制備用于調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的藥物組合物中的用途?？梢詫⑺鼋M合物用于預(yù)防和/或治療哺乳動物的狀況或疾病，所述狀況或疾病的特征是，所述哺乳動物在它的天然免疫反應(yīng)中表現(xiàn)出對內(nèi)部和/或外部刺激的不平衡，即，其中，所述哺乳動物免疫系統(tǒng)的至少一部分是無區(qū)別地受到刺激的，對所述免疫原產(chǎn)生過敏反應(yīng)，或不能對所述刺激產(chǎn)生產(chǎn)應(yīng)。所述狀況通?？赡苁窍到y(tǒng)性的或局部性的，如系統(tǒng)性和/或創(chuàng)傷后全身炎癥或自身免疫疾病。
文檔編號A61P17/02GK1585648SQ02822669
公開日2005年2月23日 申請日期2002年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月14日
發(fā)明者S·P·林斯塔多斯, S·格斯特雷利烏斯 申請人:比奧拉比奧?？怂构?br>