專利名稱：胸腺素α1肽/聚合物結(jié)合物的制作方法
背景技術(shù)：
1、發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及胸腺素α1肽。
2、背景技術(shù)描述胸腺素α1(有時被稱之為TA1)是一個具有免疫調(diào)節(jié)功能的28個氨基酸的胸腺肽，與最初從小牛胸腺的胸腺素分部5分離的天然產(chǎn)物類似。其生物學(xué)功效包括增進(jìn)T淋巴細(xì)胞功能并包括調(diào)控白細(xì)胞介素-2(IL-2)、刺激干擾素呷產(chǎn)生、誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞活性，以及刺激胸腺生成作用。胸腺素α1還顯示出上調(diào)MHC族I表達(dá)的作用。
在本領(lǐng)域中一直需要改進(jìn)含有TA1和相關(guān)肽的組合物。
發(fā)明概述按照本發(fā)明的藥物組合物包括一有生理活性的結(jié)合物，該結(jié)合物含有與一物質(zhì)結(jié)合的胸腺素α1(TA1)肽，當(dāng)將所述結(jié)合物給藥于患者時，該物質(zhì)可增加TA1肽在患者血漿中的半衰期。該物質(zhì)可以是一基本上非抗原的聚合物。根據(jù)本發(fā)明的方法，將一基本上非抗原的聚合物與一TA1肽連接。將按照本發(fā)明的組合物給藥于需要免疫刺激的患者。
發(fā)明詳述本發(fā)明使用的TA1肽包括天然產(chǎn)生的TA1和合成TA1以及具有天然產(chǎn)生的TA1的氨基酸序列、與其實(shí)質(zhì)上相同的氨基酸序列、或其簡并的序列類型的重組TA1，以及具有取代的、缺失的、延長的、置換的、或甚至修飾的序列的類似物，這些類似物具有與TA1實(shí)質(zhì)上相同的生物活性，例如具有與TA1足夠的氨基酸同源性的TA肽，以至于其以與TA1具有實(shí)質(zhì)上相同活性的實(shí)質(zhì)上相同的方式發(fā)揮作用。
按照本發(fā)明的藥物組合物包括含有與一物質(zhì)結(jié)合的TA1肽的有生理活性的結(jié)合物，當(dāng)將所述結(jié)合物給藥于患者時，所述的物質(zhì)可增加TA1肽在患者血漿中的半衰期。該物質(zhì)可以是一基本上非抗原的聚合物。合適的聚合物具有范圍約為200～300,000的分子量，優(yōu)選為約在1,000～100,000范圍內(nèi)，更優(yōu)選為約在5,000～35,000范圍內(nèi)，而最優(yōu)選為約10,000～30,000范圍內(nèi)，分子量約為20,000是特別好的。
其中包括的聚合的物質(zhì)也最好是室溫下水溶性的。這種聚合物的一個非限制的實(shí)例包括例如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇的聚烷撐氧均聚物、聚氧乙烯基多元醇、其共聚物或其嵌段共聚物(維持該嵌段共聚物的水溶性的條件下)。在基本上非抗原的聚合物中，單一有活性的烷基封端的聚烷撐氧(PAO)，例如單甲基封端的聚乙二醇(mPEG)是預(yù)期可選用的。除了mPEG外，也可以使用C1-4烷基封端的聚合物。
作為基于PAO的聚合物的另一種選擇，也可以使用例如右旋糖酐、聚乙烯基砒絡(luò)烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、碳水化合物基的聚合物等等有效的非抗原材料。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到前述的列舉僅僅為了說明，具有這里描述的性質(zhì)的所有聚合物材料都是預(yù)期可選用的。用于本發(fā)明的目的，“有效的非抗原”意為在本領(lǐng)域中所理解的所有被認(rèn)為無毒性的并且不會在哺乳動物中引起明顯的致免疫反應(yīng)的材料。
該聚合物可以是直鏈的或分支的。聚乙二醇(PEG)是特別優(yōu)選的聚合物。
可以通過任何適當(dāng)?shù)姆绞綄⒕酆衔锱cTA1肽連接。用于連接聚合物與肽的典型的方法在美國專利No.4,179,337、4,766,106、4,917,888、5,122,614和6,177,074，以及PCT國際公開WO95/13090中公開，這里通過引用結(jié)合進(jìn)來。胸腺素α1具有5個用于聚合物的氨基結(jié)合的獨(dú)立的位點(diǎn)，并且聚合物(多個聚合物)可以在一個或多個位點(diǎn)結(jié)合。按照一個實(shí)施方案，將20,000分子量的PEG與TA1的N末端結(jié)合形成PEG-TA1。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，用適當(dāng)?shù)膫?cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，可以通過在不溶的聚合體支持珠(polymeric support beads)的TA1的固相肽合成形成PEG-TA1。在珠(beads)上完全合成TA1肽后，將被保護(hù)的TA1從珠上劈離留下具有自由氨基的N末端，再與20,000分子量的PEG反應(yīng)。然后除去側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，形成按照本發(fā)明實(shí)施方案的結(jié)合物。
按照本發(fā)明的組合物可以用于需要免疫刺激的患者的治療。這類患者可以包括癌癥病人、包括乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染的肝炎病人、HIV病人等。方法涉及給藥于患者免疫刺激有效量的有生理活性的本發(fā)明結(jié)合物。
TA1肽的分離、特性和用途已在例如美國專利No.4,079,127、美國專利No.4,353,821、美國專利No.4,148,788和美國專利No.4,116,951中描述。免疫刺激有效量的TA1肽可以通過常規(guī)劑量滴定實(shí)驗(yàn)來確定。已發(fā)現(xiàn)當(dāng)以高至16mg/kg體重/天的劑量給藥時，TA1對于人類是安全的。TA1肽的優(yōu)選劑量是在0.001mg/kg體重/天至10mg/kg體重/天的范圍內(nèi)，典型的劑量是大約0.02mg/kg體重/天。按照一個實(shí)施方案，免疫刺激有效量是包括TA1肽總計在大約0.1-10mg范圍內(nèi)的劑量。優(yōu)選的劑量包括TA1肽總計在大約1-5mg范圍內(nèi)。上述劑量僅反映存在于組合物中的TA1肽，不反映與其結(jié)合的聚合物的重量。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，TA1肽存在于藥學(xué)上可接受的液體載體中，例如注射用水、生理濃度的鹽水或類似的液體中。
皮下注射的TA1的血漿半衰期僅約2小時。然而，本發(fā)明聚合物與TA1肽的結(jié)合物實(shí)質(zhì)上增加了該肽的血漿半衰期。
通過以下的實(shí)施例進(jìn)一步說明但并無意限制本發(fā)明。
實(shí)施例1用5-氟尿嘧啶(5-FU)注射大鼠引起免疫抑制，然后用胸腺素α1(200μg/kg)或PEG基結(jié)合的(pegylated)胸腺素α1(20,000 MW PEG-胸腺素α1)(等量于摩爾基的200μg/kg的胸腺素分子)注射處理大鼠以確定在免疫參數(shù)上的效力。發(fā)現(xiàn)(1)與用胸腺素α1相比，用PEG-胸腺素α1注射在動物中NK活性的恢復(fù)(被5-FU降低后)更多；(2)與用胸腺素α1相比，用PEG-胸腺素α1注射在動物中有活性T細(xì)胞、CD25+的恢復(fù)(被5-FU降低后)更多。
在下面的實(shí)施例中，并不打算限制，在一個具有使用外科手術(shù)灌輸?shù)臐B透微型真空泵的癌癥治療模型中評價了TA1的連續(xù)注入，該模型以一恒定的流速輸送液體5天。給藥于大鼠5-氟尿嘧啶(5-FU)以引起免疫抑制，然后8天后(使用5-FU后白細(xì)胞計數(shù)的最低點(diǎn))用注射的或注入的TA1治療。每組8只大鼠，治療分組是對照(微型真空泵使用鹽水)；低劑量TA1(0.2mg/kgsc注射；空微型真空泵)；高劑量TA1(3.5mg/kg sc注射；空微型真空泵)；以及高劑量注入的TA1(3.5mg/kg用微型真空泵注入)。在基線和5-FU處理8天后(TA1治療的1天)，以及TA1治療的5天、12天、20天和27天后測定免疫參數(shù)。
實(shí)施例210周齡大鼠，重250-300g，給予100mg/kg 5-氟尿嘧啶(5-FU)進(jìn)行免疫抑制。
5-FU處理8天后，將大鼠隨機(jī)分入下面的組(n＝8)對照(微型真空泵使用鹽水)低劑量TA1，0.2mg/kg s.c.注射；(用空微型真空泵)高劑量TA1，3.5mg/kg s.c.注射；(用空微型真空泵)連續(xù)注入TA1，通過微型真空泵以3.5mg/k妙5天提供在基線和5-FU處理8天后(TA1治療的1天)，以及TA1治療的5天、12天、20天和27天后測定免疫參數(shù)。
評價包括NK活性(暴露于PBMC4小時后從YAC-1細(xì)胞中釋放的LDH)、總白細(xì)胞數(shù)(在通過單克隆抗體進(jìn)行特異性檢查后，通過身體的流式細(xì)胞計數(shù)參數(shù)來判斷)、總淋巴細(xì)胞數(shù)(流式細(xì)胞術(shù)測定CD3+)、以及有活性的淋巴細(xì)胞(流式細(xì)胞術(shù)測定CD25+CD3+)。
在基線的NK活性為42±5％，而5-FU處理后下降至9±2％。低劑量的TA1在12天后導(dǎo)致NK活性的明顯恢復(fù)，而高劑量的TA1使NK活性僅在5天中就獲得了明顯恢復(fù)。然而，連續(xù)注入TA1在5天時能雙倍該效應(yīng)，達(dá)到32±4％(相對于高劑量注射組的16±2％，低劑量注射組的12±3％和對照組的11±1％)。只有通過連續(xù)注入TA1治療的動物的NK活性恢復(fù)到基線水平。
由形態(tài)學(xué)測定的總白細(xì)胞計數(shù)，在用5-FU處理后從14,590±2,071細(xì)胞/mm3下降至2597±582細(xì)胞/mm3。與未治療的動物相比，采用注射的低或高劑量TA1治療組在恢復(fù)上傾向于較快的增加。而連續(xù)注入TA1的組僅在5天后就令人滿意地、明顯地并且完全地恢復(fù)至基線水平。
5-FU處理后有活性的淋巴細(xì)胞(CD3+CD25+)沒有明顯降低(從65±21細(xì)胞/mm3至37±10細(xì)胞/mm3)，然而，在高劑量TA1治療12和20天后，有活性的淋巴細(xì)胞明顯地增加(分別為297±136細(xì)胞/mm3和321±75對166±70和212±77細(xì)胞/mm3)。由連續(xù)注入提供的TA1導(dǎo)致有活性的淋巴細(xì)胞更多的增加，達(dá)到422±105和446±73細(xì)胞/mm3。
實(shí)施例310周齡大鼠，重250-300g，給予100μg/kg 5-氟尿嘧啶(5-FU)進(jìn)行免疫抑制。
5-FU處理8天后，將大鼠隨機(jī)分入下面的組(n＝15)對照(微型真空泵使用鹽水)高劑量TA1，3.5mg/kg s.c.注射；(用空微型真空泵)連續(xù)注入TA1，通過微型真空泵以3.5mg/kg/5天提供在基線和5-FU處理8天后(TA1治療的1天)，以及TA1治療的5天和14后測定免疫參數(shù)。
評價包括總白細(xì)胞數(shù)(在通過單克隆抗體進(jìn)行特異性檢查后，通過身體的流式細(xì)胞計數(shù)參數(shù)來判斷)、粒細(xì)胞(用FITC抗大鼠粒細(xì)胞HIS-48進(jìn)行流式細(xì)胞測定)、總淋巴細(xì)胞數(shù)(流式細(xì)胞術(shù)測定CD3+)、輔助性T淋巴細(xì)胞(流式細(xì)胞術(shù)測定CD4+)、有活性的淋巴細(xì)胞(流式細(xì)胞術(shù)測定CD25+CD3+)和血漿中的細(xì)胞因子表達(dá)(通過ELISA測定IL-2和IFN-γ)。
在實(shí)施例2中測定了與皮下注射相比通過連續(xù)注入提供的TA1對于白細(xì)胞總數(shù)有明顯影響后，人們對于測定哪種類型的白細(xì)胞帶來了這種增長感興趣。顯示出通過連續(xù)注入提供的TA1影響最明顯的白細(xì)胞種類是粒細(xì)胞。在5-FU作用后，粒細(xì)胞數(shù)從4,485±1,116降至1,249±432。用TA1治療后導(dǎo)致5天內(nèi)粒細(xì)胞數(shù)增至14,652±2,463(與注射TA1的9,924±3,218和無TA1的6,954±1,519比較)，并且這個數(shù)目在14天后仍然是最高的。
有趣的是，在該研究中有一只動物既通過注射(3.5mg/kg)又通過連續(xù)注入(另外的3.5mg/kg)提供TA1。這只動物不僅健康和精力旺盛，沒有明顯的不利的反應(yīng)，而且TA1對測定的免疫參數(shù)的影響甚至比其他的那些動物更大。對于粒細(xì)胞，與其他采用注入方式治療的動物的平均14,652±2,463相比，這只研究的動物在5天后具有非常高的19,376細(xì)胞/mm3的水平。
5-FU處理后，總淋巴細(xì)胞數(shù)(CD3+)顯著下降(從10,904±1,973細(xì)胞/mm3降至1,740±560)。用TA1治療使得總淋巴細(xì)胞數(shù)恢復(fù)至基線水平，這發(fā)生在用連續(xù)注入方式提供TA1后僅5天，而用注射方式提供TA1則直至14天都未見這種恢復(fù)。
通過注射和注入二種方式提供TA1的那只動物具有與其他動物差不多的淋巴細(xì)胞水平(與平均的9,644±961細(xì)胞/mm3相比，其為9,765細(xì)胞/mm3)，但是在這些淋巴細(xì)胞中有活性的淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)大大增多(從通過注入方式提供TA1的動物中有活性的淋巴細(xì)胞數(shù)428±89，或淋巴細(xì)胞的4％，增至通過以高劑量注射接著注入TA1的動物中有活性的淋巴細(xì)胞數(shù)為976，或淋巴細(xì)胞的10％)。
用5-FU處理后輔助性T淋巴細(xì)胞(CD3+CD4+)也降低，從5,411±1,084細(xì)胞/mm3降至1,710±449細(xì)胞/mm3。不用TA1治療的實(shí)驗(yàn)這個降低的T細(xì)胞水平14天中沒有增加。在粒細(xì)胞測定中，對于細(xì)胞數(shù)目恢復(fù)的效果，以連續(xù)注入方式提供TA1優(yōu)于注射方式，與粒細(xì)胞測定中所見到的結(jié)果相反，用這兩種輸送方式提供TA1都足以將輔助性T細(xì)胞的水平恢復(fù)至基線。
由于通過注射或通過連續(xù)注入提供TA1都可導(dǎo)致CD4+輔助性T淋巴細(xì)胞增多，人們對于測定這種增多是歸于輔助性T細(xì)胞的Th1還是Th2種類影響感興趣。先前在體外和體內(nèi)的數(shù)據(jù)已證明TA1增加T細(xì)胞的Th1種類，并且在本研究中也觀察到相同的結(jié)果。通過連續(xù)注入的方式提供TA1比通過皮下注射方式提供TA1導(dǎo)致在血漿水平的Th1細(xì)胞因子IL-2更多增加(在連續(xù)注入后14天為42±7pg/ml，與之相比，對于采用注射的TA1為21±16pg/ml，而對照動物為10±16pg/ml)。
用TA1治療導(dǎo)致Th1細(xì)胞因子IL-2的增加，并且TA1可使另一Th1細(xì)胞因子IFN-γ增加。雖然其水平較低，治療后5天，皮下注射TA1導(dǎo)致較高的血漿水平的IFN-γ。在用連續(xù)注入提供TA1治療動物14天時，具有最高的血漿水平的IFN-γ(14±5 pg/ml，與之相比，對于采用注射的TA1組為10±1pg/ml，而對照組為8±8pg/ml)。
接受注射和連續(xù)注入TA1的動物具有更高的2種測定的Th1細(xì)胞因子，特別是IFN-γ，治療14天后為45pg/ml，與之相比，其他動物為14±5pg/ml。
結(jié)論●在循環(huán)系統(tǒng)中維持恒定水平的TA1數(shù)天可增加測定的免疫效應(yīng)。
●這種劑量制度在粒細(xì)胞數(shù)上導(dǎo)致未預(yù)料到的正效果，并且在注射TA1中在單核細(xì)胞中觀察到正效果。
●未觀察到不利事件，甚至在比常規(guī)用量高15倍的TA1劑量下使用也未觀察到不利事件(并且在一只動物中以超過常規(guī)用量的30倍劑量使用)。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，包括一有生理活性的結(jié)合物，該結(jié)合物含有與一物質(zhì)結(jié)合的胸腺素α1(TA1)肽，所述物質(zhì)在將所述結(jié)合物給藥于患者時可增加TA1肽在患者血漿中的半衰期。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述物質(zhì)基本上是一非抗原的聚合物。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述聚合物為PEG。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述PEG具有約200-3000,000范圍內(nèi)的分子量。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述分子量為約5,000-35,000。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述分子量為約20,000。
7.權(quán)利要求2的組合物，其中所述聚合物連接于TA1肽的N-末端部分。
8.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述胸腺素α1肽為TA1。
9.形成權(quán)利要求2的組合物的方法，包括將一基本上為非抗原的聚合物與一胸腺素α1肽結(jié)合。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述聚合物結(jié)合于胸腺素α1的N-末端部分。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述聚合物為PEG。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述PEG具有約200-300,000范圍的分子量。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述分子量為約5,000-35,000。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述分子量為約20,000。
15.權(quán)利要求9的方法，其中所述胸腺素α1肽為TA1。
16.權(quán)利要求1組合物的給藥方法，包括通過給予患者免疫刺激有效量的藥物組合物治療需要免疫刺激的患者，所述藥物組合物包括一有生理活性的結(jié)合物，該結(jié)合物含有與一物質(zhì)結(jié)合的胸腺素α1(TA1)肽，所述物質(zhì)在將所述結(jié)合物給藥于患者時可增加TA1肽在患者血漿中的半衰期。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述物質(zhì)基本上是-非抗原的聚合物。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述聚合物為PEG。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述PEG具有約200-3000,000范圍內(nèi)的分子量。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述分子量為約5,000-35,000。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述分子量為約20,000。
22.權(quán)利要求17的方法，其中所述聚合物連接于TA1肽的N-末端部分。
23.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述胸腺素α1肽為TA1。
全文摘要
一種藥物組合物，包括一有生理活性的結(jié)合物，該結(jié)合物含有與一材料結(jié)合的胸腺素α1(TA1)肽，當(dāng)將所述結(jié)合物給藥于患者時，該材料增加TA1肽在患者血漿中的半衰期。該材料可以是一基本上非抗原的聚合物。在本發(fā)明的方法中，將基本上非抗原的聚合物與一TA1肽連接。將本發(fā)明的組合物給藥于需要免疫刺激的患者。
文檔編號A61P37/04GK1582162SQ02821872
公開日2005年2月16日 申請日期2002年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月1日
發(fā)明者阿爾佛雷德·R·魯?shù)婪? 辛西婭·W·塔特希爾 申請人:賽克隆制藥公司