專利名稱：微突出物陣列免疫貼劑和方法
對相關申請的交叉引用本發(fā)明要求2001年4月20日提交的美國專利申請流水號60/285572和2001年12月20日提交的美國專利申請流水號60/342552的優(yōu)先權。
背景技術：
可以通過各種施用途徑進行免疫，包括口服、鼻、肌內(IM)、皮下(SC)、和皮內(ID)途徑。已經(jīng)有大量文獻記載，施用途徑可以影響免疫應答的類型。參見LeClerc等，“對在重組細菌表面表達的外源表位的抗體應答免疫途徑的重要性”Vaccine，1989.7pp242-248。
大部分商業(yè)疫苗是通過IM或SC途徑施用的。盡管高速液體噴射注射器業(yè)已取得了某些成功，在幾乎所有場合下，這些疫苗都是用注射器和針頭，通過常規(guī)注射施用的。例如，參見Parent du Chatelet等，Vaccine，Vol.15，pp 449-458(1997)。
近年來，人們對開發(fā)無針頭疫苗遞送系統(tǒng)的興趣逐漸增加。不同的實驗室業(yè)已證實了對包括基于蛋白和DNA的抗原在內的大分子的無針頭免疫。Glenn等證實了將含有與佐劑、霍亂毒素混合的破傷風類毒素的溶液涂在未處理過皮膚上能夠誘導抗霍亂毒素抗體。Glenn等，Nature，Vol.391，pp 851(1998)。Tang等證實了表面施用編碼人癌胚抗原的腺病毒載體能誘導抗原特異性抗體。Tang等，Nature，Vol.388，pp 729-730(1997)。Fan等也證實了表面施用編碼乙型肝炎表面抗原的裸露DNA能夠誘導細胞和體液免疫應答。Fan等，Nature Biotechnology，Vol.17，pp 870-872(1999)。
皮膚是已知的免疫器官，例如，參見Fichtelius，等，Int.Arch.Allergy，1970，Vol.37，pp 607-620，和Sauder，J.InVest.Dermatol，1990，Vol.95，pp 105s-107s。進入皮膚的病原體要面對特化細胞的高度組織化的和多樣化的群體，這些細胞群能通過多種機制清除微生物。表皮朗氏細胞是有效的抗原呈遞細胞。淋巴細胞和真皮巨噬細胞能滲透通過皮膚。角質形成細胞或朗氏細胞表達或可以被誘導產(chǎn)生多種免疫活性化合物?？偠灾?，所述細胞協(xié)調一系列復雜的事件，這些事件最終控制了先天的和特異的免疫應答。實際上，業(yè)已探索過用該器官作為免疫途徑。例如，參見Tang等，Nature，1997，Vol.388，pp 729-730；Fan等，Nature Biotechnology，1999Vol.17，pp 870-872；和Bos，J.D.，ed.Skin Immune System(SIS)，Cutaneous Immunology and Clinical Immunodermatology，2ndEd.，1997，CRC Press，pp 43-146。一份最近的報導披露了用貼劑進行經(jīng)皮免疫。參見Glenn等，“經(jīng)皮免疫使用貼劑的人類疫苗遞送方法”Nature Medicine，Vol.6，No.12，December 2000，pp 1403-1406。不過，迄今為止，尚未開發(fā)出用于將抗原特異性地遞送到人類表皮和/或真皮中的可行的、可靠的、和傷害最小的方法。用常規(guī)針頭進行皮內注射的一個顯著制約是，需要很高水平的眼-手協(xié)調和手指靈活性。
皮膚的主要屏障——角質層，是親水性和高分子量藥物和諸如蛋白、裸露DNA和病毒載體的大分子不能滲透的。因此，經(jīng)皮遞送一直被局限于被動遞送具有有限親水性的低分子量化合物(＜500道爾頓)。
為了避開角質層屏障，業(yè)已評估了多種方法?；瘜W滲透增強劑、脫毛劑、包含體和水合技術，可以提高皮膚對大分子的滲透性。不過，所述方法在沒有很長的附著時間的情況下不能遞送治療劑量，并且，它們是效力較低的遞送方法。另外，在非刺激性濃度下，化學滲透增強劑的效果是有限的。業(yè)已評估了滲透增強的物理方法，包括砂紙摩擦，膠帶剝離，和分叉的針頭。盡管上述技術能提高滲透性，但是難于預測它們對藥物吸收影響的程度。另一種物理滲透增強劑，激光剝離，可以提供可再現(xiàn)性更高的效果，但是，目前該技術煩瑣并且昂貴。經(jīng)皮遞送的主動方法包括離子電滲、電穿孔、sonophoresis，和含有固體藥物的顆粒的轟擊遞送。使用主動運輸(例如sonophoresis)的遞送系統(tǒng)正在開發(fā)之中，并且用該系統(tǒng)可以遞送大分子。不過，在現(xiàn)階段，尚不了解所述系統(tǒng)是否能在人體內成功地和可再現(xiàn)地遞送大分子。
正在開發(fā)微突出物(microprojection)陣列貼劑技術，以便增加可以通過皮膚經(jīng)皮遞送的藥物的數(shù)量。在施用時，微突出物能產(chǎn)生穿過皮膚的運送障礙(角質層)的表面途徑，以便促進親水性和大分子遞送。
發(fā)明說明具有多個角質層穿刺微突出物的微突出物陣列被用于皮內遞送抗原性試劑和免疫應答增強佐劑，以便在哺乳動物體內，特別是在人體內誘導有效免疫應答。免疫應答增強佐劑是以能有效增強皮膚對抗原性試劑的免疫應答的量皮內遞送的。所述佐劑的使用，優(yōu)選可以遞送較少數(shù)量的抗原性試劑，但仍然能在患者體內獲得治療有效的抗原抗體滴度，即劑量節(jié)省效果。
所述抗原性試劑優(yōu)選包括疫苗抗原，所述抗原通常是蛋白、多糖、寡糖、脂蛋白和/或減毒或滅活病毒形式的。用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的抗原性試劑包括肝炎病毒、肺炎疫苗、流感疫苗、雞痘疫苗、天花疫苗、狂犬病疫苗和百日咳疫苗。
免疫應答增強佐劑優(yōu)選選自已知能增強哺乳動物對抗原的免疫應答，并且不會促進患者體內的不良皮膚反應的材料。最優(yōu)選的是Gerbu佐劑N-乙酰葡糖胺-(β1-4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺(GMDP)。
含有抗原性試劑和免疫應答增強佐劑的儲存器可以是凝膠材料，優(yōu)選是層壓在微突出物陣列上的薄膜形式，不過，更優(yōu)選是作為涂層直接涂在微突出物上的材料。最優(yōu)選的是將所述涂層僅涂在微突出物的皮膚穿刺尖端。
在使用時，將微突出物陣列施用在要免疫的動物皮膚上，并且將所述陣列壓在動物皮膚上，導致微突出物刺穿皮膚的最外層(即角質層)。最優(yōu)選的是，用施用器將微突出物陣列施用在要免疫的動物皮膚上，所述施用器能將微突出物陣列沖擊在皮膚上，導致微突出物刺穿皮膚。根據(jù)本發(fā)明，為了皮內遞送抗原性試劑和佐劑，微突出物應當刺穿角質層，并且進入下面的表皮和皮膚的真皮層。所述微突出物優(yōu)選不穿透皮膚達到導致明顯出血的深度。為了避免出血，微突出物穿刺皮膚的深度應當小于大約400微米，優(yōu)選小于大約200微米。微突出物產(chǎn)生通過角質層的表淺通路，以便有利于抗原性試劑和佐劑的滲透。抗原劑量和微突出物穿透的深度可方便地加以控制。這種皮內疫苗和免疫動物的方法可廣泛應用于多種治療性疫苗，以便提高效力，并且使用方便。
附圖簡述

圖1是本發(fā)明微突出物陣列的透視圖；圖2是在微突出物上具有含固體抗原的涂層的微突出物陣列的透視圖；圖3是在實施例1中使用的皮內抗原遞送裝置的側面剖視圖；圖4是表示在動物皮膚中微突出物的皮膚穿透深度的曲線圖；圖5是在實施例1中進行的研究的卵清蛋白遞送與時間的曲線圖；圖6是來自通過微突出物陣列遞送用OVA免疫的各個豚鼠的卵清蛋白-特異性抗體(IgG)滴度與時間的曲線圖，其中，箭頭表示初次免疫和加強免疫的時間；圖7是用OVA免疫的無毛豚鼠的卵清蛋白特異性抗體(IgG)的曲線圖，比較了微突出物遞送和皮內、皮下和肌內遞送；圖8是在加強免疫之后1周用單獨的OVA，以及同時用免疫應答增強佐劑免疫的豚鼠的抗體(IgG)滴度的曲線圖，比較了通過微突出物陣列的遞送和皮內注射；圖9是表示涂在微突出物陣列上的卵清蛋白量，以及在附著5秒鐘和1小時之后遞送到動物體內的卵清蛋白數(shù)量的曲線圖，如在實施例2中的詳細討論；圖10是表示用實施例2所述方法獲得的卵清蛋白遞送效力的曲線圖；圖11是比較卵清蛋白涂布的微突出物陣列和通過皮內注射施用的若干種劑量卵清蛋白的抗體滴度的曲線圖；和圖12是表示涂在微突出物陣列上的GMDP和卵清蛋白的數(shù)量，和隨各種附著時間遞送到動物體內的數(shù)量的曲線圖，如例2所述。
實施本發(fā)明的方式本發(fā)明提供了一種皮內疫苗，以及通過皮內遞送免疫原性試劑和免疫應答增強佐劑用于免疫動物的方法。術語“皮內(intradermal，intracutaneous，intradermally，intracutaneously)”在本文中被用于表示將抗原試劑(如疫苗抗原)和佐劑遞送到皮膚中，特別是遞送到皮膚的表皮層和/或下面的真皮層。
術語“微突出物”表示穿刺部件，它適合刺穿或切割活的動物，特別是人類皮膚的角質層，進入下面的表皮層、或表皮層和真皮層。所述穿刺部件應當不會將皮膚穿刺到會導致出血的深度。通常，所述穿刺部件具有小于500微米，并且優(yōu)選小于250微米的微突出物長度。所述微突出物的寬度通常為大約75-500微米，厚度為大約5-50微米?？梢詫⑽⑼怀鑫镏瞥刹煌臉嬓魏?或形狀，如針頭、空心針頭、刀片、釘、打孔器及其組合。
此處使用的術語“微突出物陣列”是指排列成陣列，用于刺穿角質層的多個微突出物。微突出物陣列可以通過用一種薄的片材蝕刻或穿刺多個微突出物，并且將所述微突出物折疊或彎曲離開所述片材的平面，形成如圖1所示以及在Trautman等的US 6,083,196中所披露的構形而制成。所述微突出物陣列還能夠以其他已知方式形成，如通過形成一個或多個條，沿每一個條的邊緣具有微突出物，如Zuck的美國專利6,050,988中所披露的。在以下專利中披露了其他微突出物陣列及其生產(chǎn)方法Godshall等，US 5,879,326和Kamen，US5,983,136。所述微突出物陣列還可以是多個空心針頭形式的，所述針頭裝有干燥抗原性試劑和佐劑。
本發(fā)明的皮內疫苗包括一種微突出物陣列，它具有多個由其延伸的角質層穿刺微突出物，并且具有一個裝有抗原性試劑(例如疫苗抗原)和免疫應答增強佐劑的儲存器。該儲存器相對于所述微突出物的位置是與由所述穿刺微突出物在角質層上切割的縫形成抗原性試劑和佐劑傳遞關系。在一種實施方案中，所述儲存器可以是層壓在微突出物陣列的皮膚近端或皮膚遠端側的聚合物薄膜形式的材料(例如凝膠材料)。這種類型的儲存器披露于Theeuwes等的WO 98/28037中，該專利的內容被收作本文參考。更優(yōu)選將抗原性試劑和佐劑在涂層中直接施用在微突出物上，最優(yōu)選施用在微突出物的穿刺尖端。用于施用這種涂層的合適的微突出物涂層和裝置，披露于以下美國專利申請流水號中2001年10月26日提交的10/045,842；2001年3月15日提交的10/099,604；以及從屬于2001年4月20日提交的美國臨時申請流水號60/285,576并且與之同時提交的另一份申請，以上申請的內容被收作本文參考。所述微突出物適合穿刺角質層，并且進入下面的表皮層或表皮層和真皮層，但是，優(yōu)選不會穿刺過深而到達毛細血管床，并導致明顯出血。通常，微突出物的長度可以穿透皮膚達到小于大約400微米的深度，并且優(yōu)選小于大約300微米。在穿刺皮膚的角質層時，容納在涂層中的抗原性試劑和佐劑被釋放到皮膚中，進行免疫治療。
圖1表示用于本發(fā)明的角質層穿刺微突出物部件10的一種實施方案。圖1表示具有多個微突出物12的部件10的一部分。微突出物12以大體上90度的角度從具有開口16的片材14上延伸?？梢詫⒉考?0整合在試劑遞送或取樣系統(tǒng)20(如圖3所示)上，包括一個背襯22，和用于將系統(tǒng)粘在皮膚上的粘合劑24。在圖1、2和3所示的微突出物部件10的實施方案中，微突出物12是通過以下方法制成的用一個薄的金屬片材14蝕刻或穿刺多個微突出物12，并且使微突出物12彎曲偏離開所述片材的平面，諸如不銹鋼和鈦的金屬是優(yōu)選的。金屬微突出物部件及其生產(chǎn)方法披露于以下專利中Trautman等，美國專利6,083,196；Zuck美國專利6,050,988；和Daddona等，美國專利6,091,975，以上專利的內容被收作本文參考?？捎糜诒景l(fā)明中的其他微突出物部件是通過以下方式生產(chǎn)的通過硅芯片蝕刻技術蝕刻硅，或通過用蝕刻的微型模具模制塑料。Godsha11等在美國專利5,879,326中披露了硅和塑料微突出物部件，該專利的內容被收作本文參考。
圖2表示具有微突出物12的微突出物部件10，它具有一種含有抗原的涂層18。涂層18可以部分或完全覆蓋微突出物12?？梢酝ㄟ^將微突出物浸入蛋白抗原以及任選含有任何免疫應答增強佐劑的揮發(fā)性液體溶液或懸浮液中，將所述涂層施用在微突出物12上。所述液體溶液或懸浮液的抗原性試劑的濃度應當為大約1-20wt％。所述揮發(fā)性液體可以是水、二甲亞砜、二甲基甲酰胺、乙醇、異丙醇及其混合物。其中，最優(yōu)選的是水。
可用于本發(fā)明的合適的抗原性試劑包括蛋白、多糖、寡糖、脂蛋白、減毒或滅活病毒形式的抗原，所述病毒如巨細胞病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類乳頭瘤病毒、風疹病毒、和水痘-帶狀皰疹病毒；減毒或滅活細菌，如百日咳桿菌、破傷風梭菌、白喉棒桿菌、A族鏈球菌、侵肺軍團菌、腦膜炎萘氏球菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、蒼白密螺旋體、和霍亂弧菌及其混合物。多種含有抗原性試劑的現(xiàn)已商業(yè)化的疫苗也可用于本發(fā)明中，并且包括流感疫苗、萊姆病疫苗、狂犬病疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、雞痘疫苗、天花疫苗、肝炎疫苗、百日咳疫苗和白喉疫苗。
可以與抗原性試劑一起用于本發(fā)明的合適的免疫應答增強佐劑包括磷酸鋁凝膠、氫氧化鋁；藻類葡聚糖、β-葡聚糖；霍亂毒素B亞基、熱激蛋白(HSPs)；γ菊粉，GMDP(N-乙酰葡糖胺-(β1-4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺)；GTP-GDP；Imiquimod；ImmTherTM(DTP-GDP)；Loxoribine，MPL；MTP-PE；Murametide；Pleuran(β-葡聚糖)；Murapalmitine；QS-21；S-28463(4-氨基-α，α-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇)；Scalvo肽(IL-1β[β163-171肽]；和TheramideTM。
本發(fā)明的微突出物陣列皮內疫苗優(yōu)選在沖擊條件下施用在患者皮膚上。例如，可以用由Trautman等在2001年10月12日提交的美國專利流水號09/976,798中所披露類型的偏壓(例如彈簧驅動)沖擊性施用器施用本發(fā)明的涂布過的微突出物陣列。最優(yōu)選的是，所述涂布過的微突出物陣列是以在10毫秒或更短時間內每平方厘米的微突出物陣列至少0.05焦耳的沖擊力施用的。
用于本發(fā)明的優(yōu)選的含有抗原性試劑和含有佐劑的儲存器是直接施用在微突出物表面上的固體涂層形式的。所述涂層優(yōu)選以液態(tài)施用，然后干燥?？梢酝ㄟ^浸泡、噴霧和/或其他已知微流化分散技術將含有抗原性試劑和佐劑的所述揮發(fā)性液體溶液或懸浮液施用在所述微突出物陣列上。然后讓所述涂層干燥，以便形成含有抗原和佐劑的固體涂層。優(yōu)選僅在微突出物陣列的刺穿皮膚組織的部分涂布抗原性試劑。Trautman等在2002年3月15日提交的美國專利申請流水號10/099,604中披露了合適的微突出物涂布方法和裝置，該專利申請的內容被收作本文參考。使用該專利所披露的涂布方法和該專利所披露的涂布組合物，我們能夠精確地并且均勻地僅對典型的金屬(即鈦)的微突出物陣列上的皮膚穿刺微突出物的尖端進行涂布，所述微突出物陣列的微突出物長度小于500微米。
盡管按照本發(fā)明通過皮內遞送的佐劑和抗原性試劑的相對量可以根據(jù)被遞送的具體抗原性試劑和佐劑而改變，通常，被遞送的佐劑和被遞送的抗原的重量比例為大約0∶5-50∶1，更優(yōu)選為大約1∶1-10∶1。為了獲得上述佐劑抗原性試劑的遞送比例，所述儲存器優(yōu)選裝有與上文所述相同重量比的抗原性試劑和免疫應答增強佐劑。
另外，通過微突出物尖端涂層，可以方便地獲得每平方厘米微突出物陣列至少0.2微克的抗原性試劑和佐劑加載量，優(yōu)選每平方厘米微突出物陣列至少2微克。對于典型的5平方厘米的陣列來說，可以換算出至少1微克的抗原性試劑和佐劑加載量，并且優(yōu)選至少10微克，對于大部分免疫來說，這是非常合適的。使用通過抗原性試劑和佐劑涂布的微突出物尖端，大大提高了遞送效率(Edel)。Edel被定義為在每一個預定時間段內從所述涂層中釋放出的抗原性試劑和佐劑的重量百分比。通過含有抗原性試劑和佐劑的溶液或懸浮液的尖端涂層，可以在1小時內獲得至少30％的Edel，優(yōu)選在15分鐘內獲得至少50％的Edel。因此，本發(fā)明與現(xiàn)有技術中所采用的常規(guī)macrotine皮膚穿刺裝置相比具有顯著的成本優(yōu)勢。
在以下實施例中，將用豚鼠評估微突出物皮膚穿透深度、模型抗原(即OVA)遞送，和皮內遞送模型抗原以便刺激免疫應答的能力。在以下實驗中，微突出物穿透皮膚的平均深度為大約100微米。通過改變涂布溶液濃度、附著時間、和系統(tǒng)尺寸，獲得了不同的OVA劑量。通過2平方厘米的微突出物陣列，遞送了1-80微克的OVA，并且獲得了在5秒時間內的高達20微克的遞送速度。誘導了劑量依賴型一級和二級抗原特異性抗體應答。在1和5微克的劑量下，抗體應答與皮內施用所出現(xiàn)的抗體應答相同，而比在皮下或肌內施用之后出現(xiàn)的抗體應答高50倍。佐劑GMDP與OVA的固體涂層導致了增強的抗體應答。因此，微突出物陣列貼劑技術可以經(jīng)皮施用干燥抗原。
用微突出物陣列控制皮內OVA遞送，是通過改變涂層溶液的濃度、附著時間、和系統(tǒng)尺寸而實現(xiàn)的，并且以上變量的組合使得在劑量方面可以有更大的靈活性。以上結果還可應用于其他蛋白抗原。另外，由于大部分化合物在干燥狀態(tài)下更穩(wěn)定，微突出物陣列技術具有消除冷凍鏈儲存的潛力。
豚鼠對微突出物陣列系統(tǒng)具有相當好的耐受力。在初次免疫之后，輕微的和臨時施用部位紅斑與微突出物很淺地穿透皮膚是一致的。在用微突出物陣列或ID注射進行加強施用之后，中等程度的紅斑和水腫表明出現(xiàn)了混合的免疫應答。
實施例1免疫研究具有兩個目的測定用微突出物陣列在無毛豚鼠(HGPs)體內遞送各種量的OVA所導致的免疫應答，并且比較使用低含量OVA和GMDP佐劑一起用微突出物陣列進行免疫的結果。遠交的雄性和雌性有胸腺HGP是從Biological Research Labs(Switzerland，ibmGOHI-hr株)和Charles River Labs(Michigan，IAFHA-HO-hr株)獲得的。動物重量為250-1000克。對動物進行檢疫，單獨圈養(yǎng)，并且在得到Association for Assessment and Accreditation ofLaboratory Animal Care認可的設施中保持。本研究遵守Principlesof Laboratory Animal Care(NIH publication #85-23，1985年修訂)的規(guī)定。
用于這些研究的微突出物陣列在1或2平方厘米的面積上具有密度為190個微突出物/平方厘米的330微米的突出物。所述微突出物陣列是使用受控制的生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的，該生產(chǎn)工藝采用了自動CAD-產(chǎn)生的微突出物陣列設計，光化學蝕刻和成型。首先，在大約30微米厚的鈦片材上施加一薄層抗蝕膜。用一種具有理想樣式的掩模對所述抗蝕膜進行接觸-暴露。并且通過一種非常類似于用于生產(chǎn)印刷電路板的方法進行顯影。然后對顯影的片材進行酸蝕刻，并且使用成型工具使微突出物相對所述片材的平面彎大約90度的角。所形成的微突出物陣列是具有圖1所示精密微突出物的篩。
用卵清蛋白(OVA)和葡糖胺胞壁酰二肽(GMDP)涂布微突出物陣列，或僅使用OVA作為對照。對于用GMDP(Pharmitra，UnitedKingdom)進行的研究來說，將微突出物陣列浸泡在含有OVA(1％)和GMDP(10％)的溶液中。對于僅周OVA進行的對照研究來說，通過浸泡在含有1％，5％或20％OVA(Grade V，SIGMA Chemical Co，St Louis，MO)的無菌水中，用OVA對所述陣列進行涂布。通過強制通風除去多余的溶液，并且在室溫下將所述陣列風干1小時或1小時以上。對于使用熒光素異硫氰酸酯(FITC)-標記的OVA(Molecular Probes，Portland，OR)進行的研究來說，將單獨的熒光化合物用于含有5％OVA或更低含量的任何涂布溶液。對于濃度為20％的OVA涂布溶液來說，將未標記過的OVA(15％)與FITC-OVA(5％)混合。
用FITC-OVA測定涂布在微突出物陣列上的OVA的量。涂在所述裝置上的干燥OVA，是通過將該裝置在室溫下在玻璃閃爍小瓶中的10毫升硼酸(0.1M，pH9)中浸泡1小時進行萃取的。用硼酸對萃取材料的等份試樣進行進一步稀釋，以便通過發(fā)光光譜相對已知標準物進行定量(激發(fā)波長494nm，發(fā)射波長520nm)。還通過熒光顯微技術，檢查了用FITC-OVA涂布的微突出物陣列。
在涂布和干燥之后，用聚異丁烯粘合劑將微突出物陣列固定在低密度聚乙烯背襯上。最終的系統(tǒng)具有圖3所示的結構，總面積為8平方厘米，并且所述陣列的皮膚接觸面積為1平方厘米或2平方厘米。
用異丙醇拭子(70％)清潔麻醉HGPs的治療部位(胸側面)，并使其干燥。在用沖擊性施用器施用所述系統(tǒng)時，用手略微拉伸所述皮膚部位。在施用之后，解除所述拉伸張力，并且讓該系統(tǒng)留在皮膚上規(guī)定的時間。對于在皮膚上保持5秒鐘以上的裝置來說，用Vetwrap(3M，St Paul，MN)包裹HGPs，并且單獨圈養(yǎng)。
為了評估微突出物的穿透深度，在施用之后馬上去掉該系統(tǒng)，并且用蘸有印度墨水的棉簽對所述皮膚部位進行染色。所述染料以圓形運動的方式沿兩個相反的方向施用大約15秒時間。然后用紗布擦掉多余的染料，并且用異丙醇拭子除去皮膚上的所有染料，直到僅僅可以看到由微突出物陣列所產(chǎn)生的通道。然后，對HGPs實施安樂死，除去所述皮膚部位，并且冷凍。用一個8毫米的活檢打孔器對每一個冷凍的皮膚部位進行活檢。平行于皮膚表面對活檢組織進行切片，第一個切片為20微米，而其余的為50微米。然后將各個皮膚切片封固在顯微鏡載玻片上，并且統(tǒng)計每一切片上染色孔的數(shù)量。根據(jù)所述統(tǒng)計數(shù)據(jù)和微突出物的已知密度，計算出在特定皮膚切片上染色的通道的百分比，并且作為深度的函數(shù)進行作圖。在某些研究中，用攝像顯微鏡系統(tǒng)(Hi-Scope KH2200，Hirox Co，Japan)對皮膚進行照相。
每一只HGP接受一個干燥涂布的FITC-OVA微突出物陣列，該陣列是按上述方法施用的。在除去系統(tǒng)之后，用70％的異丙醇充分洗滌處理過的皮膚部位，以便除去皮膚表面上任何殘留的OVA。對HGPs實施安樂死，并且采集8毫米的皮膚活組織。將每一個組織樣品放入裝有0.1毫升去離子水的閃爍小瓶中。然后添加氫氧化季銨鹽(0.9mL，1M，溶解在甲醇中，JT Baker，Phillipsburg，NJ)，并且在60℃下溫育該樣品過夜。然后，用2毫升氫氧化季銨鹽/水(9∶1)進一步稀釋溶解的材料，并且通過熒光測定對熒光進行定量，并且與已知標準物進行比較。本底對照樣品包括未處理過的皮膚。將最少三個重復用于每一種實驗條件。
在免疫當天之前，從每一只動物體內獲得基線血液樣品。在免疫當天對HGPs進行麻醉，并且用70％的異丙醇清潔處理部位，并使其干燥。對于通過針頭注射進行的免疫來說，將OVA溶解在無菌水中。使用具有25號針頭的無菌1毫升注射器(Becton Dickinson，F(xiàn)ranklinLakes，NJ)。ID和SC注射是在HGPs的后背側面進行的。將后腿的四頭肌用于IM注射。按上述方法施用包括干燥涂布的OVA的微突出物陣列。
每只HGP進行一次初次免疫(第0天)，4周之后進行第2次(即加強)免疫，使用相同的工具。在初次免疫之后，對HGPs進行麻醉，并且從前腔靜脈中采集血液。通過免疫測定評估血清樣品中抗OVA抗體的存在。
通過酶聯(lián)免疫測定(ELISA)檢測來自未免疫過的和免疫過的HGPs的血清中抗OVA抗體的存在。簡單地講，用0.1毫升/孔的OVA(10μg/mL，溶解在0.2M的碳酸氫鈉/碳酸鈉緩沖液中，pH9.6)涂布96孔聚丙乙烯平板(Maxisorp，NUNC，Rochester，NY)，并且在4℃下溫育過夜。用PBS-Tween緩沖液洗滌平板，然后用200微升的PBS/酪蛋白(0.5％)/Tween-20(0.05％)緩沖液在室溫下封閉1小時。然后再次洗滌所述平板，并且添加測試血清(100微升/孔，2-5倍的系列稀釋比例，3次重復，在室溫下溫育1小時)。在洗滌之后，添加100微升過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗豚鼠IgG抗體(JacksonImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)，并且在室溫下溫育1小時。在溫育之后洗滌平板，添加100微升底物(ABTS，BectonDickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)，并且在室溫下溫育35分鐘。用SpectraMAX 250(Molecular Devices Corporation，Sunnyvale，CA)測定吸光度(405/490nm)。結果以相對未免疫對照血清樣品的終點抗體滴度形式表達。
結果是以平均值以及平均值的相關標準誤形式提供的。通過方差分析(ANOVA)，進行各組結果之間的比較。
將微突出物陣列貼劑施用在HGP上，并且肉眼評估皮膚紅斑、浮腫和出血的跡象。與未處理過的皮膚相比，在施用過程之后，通常觀察到了檢測不到的紅斑至輕度反應。所形成的所有紅斑都是暫時的，通常會在24小時或更短時間內消除。沒有出現(xiàn)水腫或出血的現(xiàn)象。用印度墨水技術評估微突出物穿透力，表明95％以上的微突出物穿透了角質層屏障。另外，觀察到了相對均勻的穿透形式。從處理過的部位采集的皮膚活檢樣品表明大約50％的微突出物穿透了大約100微米的深度(圖4)。沒有微突出物能穿透300微米以上的深度。
提高涂布溶液中OVA的濃度，會導致OVA在微突出物陣列上的加載量增加。采用1％OVA涂布溶液，OVA的涂布量大約為7微克/平方厘米。用5％OVA涂布溶液涂布的微突出物陣列含有大約40微克/平方厘米的干燥涂布OVA，而用含有20％OVA的涂布溶液涂布的微突出物陣列，含有大約240微克/平方厘米的干燥涂布OVA(表1)。通過熒光顯微術觀察發(fā)現(xiàn)，所述涂層是作為薄的無定形玻璃形式存在的。在最大濃度下，平均計算厚度為大約3微米，這一結果與顯微鏡觀察結果吻合。通過施用在HGP皮膚上的系統(tǒng)，用5秒鐘時間評估通過2平方厘米的涂有三種OVA濃度的微突出物陣列遞送的OVA。所述研究證實，1％、5％和20％的OVA涂布溶液分別導致了平均為大約1、6和10微克/平方厘米的蛋白遞送量(表1)。
表1涂在微突出物陣列上并且遞送到無毛豚鼠皮膚中的卵清蛋白量a

用熒光素異硫氰酸酯(FITC)-標記的卵清蛋白對微突出物貼劑陣列(2平方厘米)進行涂布。將該陣列施用在無毛豚鼠(n＝3)上5秒鐘時間。
使用用20％OVA溶液涂布的2平方厘米的裝置，蛋白向皮膚的遞送隨著施用時間的延長而增加(圖5)。5秒鐘的施用時間能將大約20微克的OVA遞送到皮膚中。30分鐘的施用時間能遞送大約50微克的OVA，1小時的施用時間能遞送大約80微克。以上結果表明了遞送量受時間影響的線性關系。
進行了免疫研究，以便確定通過微突出物陣列遞送OVA是否能在HGPs體內誘導免疫應答。將動物分成四個處理組(n＝3-5/組)，接受1，5，20或80微克的OVA/組。按照遞送研究所確立的方案進行。表2歸納了OVA涂層濃度，貼劑附著時間，以及用于遞送大致劑量抗原的裝置表面積。
表2從卵清蛋白涂布的微突出物陣列向無毛豚鼠皮膚中遞送卵清蛋白

每一只HGP接受初次免疫。4周之后在相同的激發(fā)條件下進行加強免疫。為了通過ELISA測定OVA-特異性抗體(IgG)的含量，每隔一周從每只動物體內采集血清。
在圖6中示出了每一只HGP對通過微突出物遞送的1，5，20和80微克OVA的免疫應答。在初次免疫之后2周，觀察到了相對低含量的OVA特異性抗體。在隨后的四周時間，觀察到了抗體滴度的普遍提高。隨著抗原劑量的加大，以及隨著時間的延長，血清轉變速度加快。在初次免疫之后2周，所有接受20或80微克劑量OVA的動物都發(fā)生了血清轉變。在加強免疫之后，在所有測試過的劑量下，所有動物都發(fā)生了血清轉變。在加強免疫之后1周，觀察到了抗體的顯著增加。一般，在加強免疫之后1周，觀察到峰抗體滴度。然后，抗體滴度降低，直到進行下一次加強治療。
為了比較用微突出物陣列進行的免疫和常規(guī)ID，SC和IM注射進行的免疫，進行了其他研究。測試過的OVA劑量為1，5，20和80微克。在初次免疫之后采集的血清樣品表明，對用針頭施用OVA的抗體應答的動力學類似于用微突出物陣列觀察的結果。在所有處理組中，OVA劑量的提高，導致了OVA-特異性抗體滴度的提高。在初次免疫之后，較高的抗體劑量與較高的血清轉變速度相關(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。除了少數(shù)幾只用低劑量OVA免疫的動物(即SC，1微克，IM，1微克和5微克)之外，所有其他的HGPs在加強免疫之后2周，都具有可檢測的抗OVA抗體。
進行ANOVA，以便評估在各個處理組之間的可能的差異，在加強免疫之后1周分析抗體滴度(圖7)。所有抗原遞送方法都出現(xiàn)了明顯的劑量反應作用。通過微突出物陣列用20或80微克OVA免疫的動物所具有的抗體滴度與通過常規(guī)ID，SC或IM注射免疫的動物的抗體滴度相當。通過微突出物陣列接受5微克OVA的動物所具有的抗體滴度明顯高于(24倍)通過IM針頭施用所觀察到的滴度。通過微突出物陣列遞送1微克劑量的OVA導致了比SC(10倍)或IM(50倍)注射途徑更高的抗體水平。
為了測定與佐劑共同配制并且干燥涂布在微突出物陣列上的OVA是否能增強抗體應答，進行了有關研究。用由OVA和GMDP干燥涂布的微突出物進行的免疫研究，遞送了大約1微克的OVA，同時遞送了大約15微克GMDP，并且導致了與無佐劑對照相比抗體滴度的明顯提高。在ID施用之后，抗體滴度的提高為250％。在微突出物陣列施用之后，抗體滴度的提高為1300％(圖8)。
通過共同遞送佐劑GMDP，可以增強遞送低劑量(1微克)抗原的抗體應答。用OVA和GMDP干燥涂布的陣列進行的遞送研究表明，佐劑的存在不會明顯影響所遞送的OVA量(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。盡管不能直接定量用微突出物陣列遞送到皮膚中的GMDP的量，根據(jù)質量傳遞計算估計有大約15微克的GMDP被遞送到皮膚中。在該劑量下，GMDP在ID和微突出物施用途徑中加強了抗體應答，但是在通過微突出物陣列共同施用GMDP和OVA之后的作用明顯更大。另外，通過微突出物陣列遞送的GMDP和OVA所產(chǎn)生的抗體滴度接近在沒有GMDP的條件下用20微克或更高劑量的OVA所獲得的抗體滴度水平，這證實了顯著的劑量節(jié)省效應。在這種情況下，所觀察到的微突出物陣列遞送和ID之間的增強作用的差異是無法理解的，不過，可能是在ID或微突出物陣列施用之后抗原和佐劑在皮膚的不同層中定位的微小差異所導致的。事實上，實驗業(yè)已證實，在微突出物陣列遞送之后，OVA主要定位于表皮層中(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。這種優(yōu)選的定位，可能導致諸如朗氏細胞的相關的表皮細胞暴露于所述佐劑增加，這有可能引發(fā)增強的激活作用。
HGP能很好地耐受微突出物陣列。在初次免疫之后，在施用部位出現(xiàn)的紅斑很輕微，并且在24小時內消失。另外，在任何動物上都沒有出現(xiàn)感染的跡象。在通過微突出物陣列或ID注射進行加強施用之后，觀察到了中度皮膚紅斑和水腫。這種皮膚反應迅速出現(xiàn)，并且持續(xù)數(shù)天時間，這表明出現(xiàn)了混合的免疫應答。
所述皮膚富含抗原呈遞細胞和皮膚相關的淋巴組織，這使得它成為理想的免疫靶位。實際上，有很多研究業(yè)已證實，ID或表皮施用抗原，能導致有效的免疫應答，并且與其他施用途徑相比具有劑量節(jié)省效果。不過，常規(guī)ID施用的明顯限制是，難以精確控制穿透的深度，需要熟練的技術人員。我們的結果表明，涂布在微突出物陣列上的OVA能夠以可再現(xiàn)的方式遞送到皮膚內。另外，通過微突出物陣列遞送OVA，誘導了特異性免疫應答。用涂在微突出物陣列上的干燥抗原產(chǎn)生了一級和二級抗原特異性抗體應答。所述應答是劑量依賴型的。針對通過微突出物陣列系統(tǒng)施用的OVA的抗體應答動力學，類似于用常規(guī)注射方式觀察到的結果。1和5微克劑量的微突出物施用所產(chǎn)生的免疫應答，比用相同的劑量皮下或肌內注射所產(chǎn)生的免疫應答強50倍。將佐劑、葡糖胺胞壁酰二肽、和OVA干燥涂布在微突出物上，導致了增強的抗體應答。
實施例2制備了含有20wt％卵清蛋白的水溶液。為了進行隨后的分析，用FITC標記卵清蛋白。微突出物陣列(微突出物長度為250微米，每個陣列有595個微突出物)的面積為2平方厘米。使用2002年3月15日提交的共同未決的美國專利申請流水號10/099,604中所披露的裝置和方法，通過讓微突出物陣列通過攜帶有OVA溶液的轉筒，用該溶液涂布微突出物的尖端。在某些陣列上，進行了多次涂布。熒光顯微術發(fā)現(xiàn)，在所有情況下，所述涂層都局限于微突出物尖端的前100微米。通過熒光測定進行定量，證實了在1次、2次和4次涂布之后，分別將1.8微克，3.7微克和4.3微克的量涂在所述陣列上。
將一些所述微突出物陣列施用在無毛豚鼠上(每組3只動物)，以便評估遞送到皮膚中的卵清蛋白。在施用所述系統(tǒng)時，用手將動物脅腹皮膚雙向拉伸(向左向右和向上向下)。用沖擊性施用器進行施用(總能量等于0.4焦耳，用少于10毫秒的時間遞送)，使用披露于2001年10月12日提交的美國專利申請流水號09/976,798中所披露的彈簧驅動的沖擊性施用器。所采用的系統(tǒng)包括一個卵清蛋白涂布的微突出物陣列，該陣列用丙烯酸粘合劑(7平方厘米的圓片)粘接在低密度聚乙烯薄膜背襯的中央。在施用之后，解除拉伸張力，并且在與皮膚接觸5秒鐘或1小時之后除去該系統(tǒng)。在除去該系統(tǒng)之后，將殘余的藥物從皮膚上徹底洗凈，并且在施用的部位采集8毫米的皮膚活檢樣品。通過將所述皮膚活檢樣品溶解在氫氧化季銨鹽(1M，溶于甲醇中)中測定遞送到皮膚中的卵清蛋白的總量。通過熒光測定進行定量。圖9和10中所示的結果表明，可以將高達4.5微克的OVA遞送到無毛豚鼠皮膚中，在5秒鐘和1小時附著時間之后，遞送效率分別高于55％和85％。還發(fā)現(xiàn)遞送效率相對獨立于涂層的厚度。
使用類似方法用未標記過的卵清蛋白涂布相同的微突出物陣列。通過總蛋白測定評估涂布在該陣列上的蛋白量。使用20wt％OVA的涂布溶液以可接受的可再現(xiàn)性(4.6±0.5微克)涂布5微克卵清蛋白(OVA)的目標劑量。用6只一組的無毛豚鼠，通過所述陣列進行免疫研究。系統(tǒng)以及在動物上的系統(tǒng)施用與上文所述相同，所不同的是，在所有豚鼠上的附著時間為5秒鐘。其余3組動物接受皮內注射0.1，1.0和10微克的卵清蛋白。以不同的時間間隔采集血液樣品，并且通過ELISA評估抗卵清蛋白的抗體(IgG)滴度。在初次免疫2-3周之后，用微突出物陣列貼劑進行免疫的所有動物都產(chǎn)生了抗卵清蛋白IgG抗體，這表明抗原尖端涂布的微突出物陣列能有效誘導免疫應答(參見圖11)。隨著皮內施用的卵清蛋白劑量的提高，出現(xiàn)了劑量反應。來自這種劑量反應的外推表明，用微突出物陣列獲得的抗體應答與皮內遞送大約1.4-4微克卵清蛋白的抗體應答一致。
用含有2wt％卵清蛋白和10wt％GMDP的含水涂布溶液進行與上文所述類似的實驗。每個陣列進行8次涂布。根據(jù)涂布的和遞送的卵清蛋白的量，以及在涂層制劑中GMDP與卵清蛋白的比例估算所涂布的GMDP和遞送到皮膚內的GMDP。分析表明，每一個微突出物陣列涂布了11微克GMDP和2.2微克卵清蛋白。掃描電子顯微術檢查表明，所述涂層是以玻璃狀無定形基質形式存在的，在不同的微突出物之間具有良好的涂層均勻性。所述涂層局限于微突出物的前150微米。在無毛豚鼠上進行的遞送研究表明，GMDP是以類似于卵清蛋白的遞送效率遞送的(圖12)。
本發(fā)明的微突出物陣列貼劑可廣泛應用于皮內遞送多種治療性疫苗，以便提高效力，并且提供方便性。
權利要求
1.一種皮內疫苗遞送裝置，包括一個微突出物陣列，該陣列具有多個角質層穿刺微突出物，所述微突出物具有適合通過穿刺皮膚至小于大約500微米的深度在角質層上切割小孔的尺寸；一個裝有抗原性試劑和免疫應答增強佐劑的儲存器，該儲存器相對于所述微突出物的位置是與所述孔形成試劑和佐劑傳遞關系。
2.如權利要求1的皮內疫苗遞送裝置，其中，所述免疫應答增強佐劑選自磷酸鋁凝膠、氫氧化鋁、藻類葡聚糖、β-葡聚糖、霍亂毒素B亞基、熱激蛋白(HSPs)、γ菊粉、GMDP(N-乙酰葡糖胺-(β1-4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺)、GTP-GDP、Imiquimod、ImmTherTM(DTP-GDP)、Loxoribine，MPL、MTP-PE、Murametide、Pleuran(β-葡聚糖)、Murapalmitine、QS-21、S-28463(4-氨基-α，α-二甲基1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇)、Scalvo肽(IL-1β[β163-171肽]、和TheramideTM。
3.如權利要求1的皮內疫苗遞送裝置，其中，所述佐劑包括葡糖胺酰胞壁酰二肽。
4.如權利要求1的皮內疫苗遞送裝置，其中，所述陣列具有一個皮膚接觸面積，并且所述儲存器具有每平方厘米的所述陣列的皮膚接觸面積至少大約0.2微克的抗原性試劑加載量。
5.如權利要求1的皮內疫苗遞送裝置，其中，所述陣列具有一個皮膚接觸面積，并且所述儲存器具有每平方厘米的所述陣列的皮膚接觸面積至少大約2微克的抗原性試劑含量。
6.如權利要求1的皮內疫苗遞送裝置，其中，所述抗原性試劑選自蛋白、多糖、寡糖、脂蛋白、減毒或滅活病毒，減毒或滅活細菌及其混合物。
7.如權利要求1的皮內疫苗遞送裝置，其中，所述抗原性試劑包括疫苗。
8.如權利要求7的皮內疫苗遞送裝置，其中，所述疫苗選自流感疫苗、萊姆病疫苗、狂犬病疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、雞痘疫苗、天花疫苗、肝炎疫苗和白喉疫苗。
9.如權利要求1的皮內疫苗遞送裝置，其中，所述陣列是由金屬構成的，并且包括一個粘性背襯。
10.如權利要求1的皮內疫苗遞送裝置，其中，所述陣列具有高達大約5平方厘米的皮膚接觸面積。
11.如權利要求1的皮內疫苗遞送裝置，其中，所述儲存器中佐劑加載量與抗原性試劑加載量的重量比為大約0.5∶1-50∶1。
12.如權利要求1的皮內疫苗遞送裝置，其中，所述儲存器中佐劑加載量與抗原性試劑加載量的重量比為大約1∶1-10∶1。
13.如權利要求1的皮內疫苗遞送裝置，其中，所述儲存器包括涂布在微突出物上的干燥固體。
14.如權利要求1的皮內疫苗遞送裝置，其中，所述儲存器包括層壓在所述陣列上的薄膜。
15.一種用于免疫哺乳動物的方法，包括將一個微突出物陣列施用在哺乳動物的皮膚部位上，所述陣列具有多個皮膚穿刺微突出物，所述微突出物具有適合穿刺皮膚至小于大約500微米的深度的尺寸，以及一個裝有抗原性試劑和免疫應答增強佐劑的儲存器，該儲存器相對于所述微突出物的位置是與通過穿刺用的微突出物在角質層上形成的切口形成試劑和佐劑傳遞關系；導致所述微突出物穿刺皮膚；和皮內將所述抗原性試劑和所述佐劑從所述儲存器中遞送到哺乳動物。
16.如權利要求15的方法，其中，所述免疫應答增強佐劑選自磷酸鋁凝膠、氫氧化鋁、藻類葡聚糖、β-葡聚糖、霍亂毒素B亞基、熱激蛋白(HSPs)、γ菊粉、GMDP(N-乙酰葡糖胺-(β1-4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺)、GTP-GDP、Imiquimod、ImmTherTM(DTP-GDP)、Loxoribine，MPL、MTP-PE、Murametide、Pleuran(β-葡聚糖)、Murapalmitine、QS-21、S-28463(4-氨基-α，α-二甲基1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇)、Scalvo肽(IL-1β[β163-171肽]、和TheramideTM。
17.如權利要求15的方法，其中，所述佐劑包括葡糖胺酰胞壁酰二肽。
18.如權利要求15的方法，其中，所述陣列具有一個皮膚接觸面積，并且所述儲存器具有每平方厘米的所述陣列的皮膚接觸面積至少大約0.2微克的抗原性試劑加載量。
19.如權利要求15的方法，其中，所述陣列具有一個皮膚接觸面積，并且所述儲存器具有每平方厘米的所述陣列的皮膚接觸面積至少大約2微克的抗原性試劑含量。
20.如權利要求15的方法，其中，所述抗原性試劑選自蛋白、多糖、寡糖、脂蛋白、減毒或滅活病毒，減毒或滅活細菌及其混合物。
21.如權利要求15的方法，其中，所述抗原性試劑包括疫苗。
22.如權利要求21的方法，其中，所述疫苗選自流感疫苗、萊姆病疫苗、狂犬病疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、雞痘疫苗、天花疫苗、肝炎疫苗和白喉疫苗。
23.如權利要求15的方法，其中，所述陣列是由金屬構成的，并且包括一個粘性背襯。
24.如權利要求15的方法，其中，所述陣列具有高達大約5平方厘米的皮膚接觸面積。
25.如權利要求15的方法，其中，所述儲存器中佐劑加載量與抗原性試劑加載量的重量比為大約0.5∶1-50∶1。
26.如權利要求15的方法，其中，所述儲存器中佐劑加載量與抗原性試劑加載量的重量比為大約1∶1-10∶1。
27.如權利要求15的方法，其中，所述儲存器包括涂布在微突出物上的干燥固體。
28.如權利要求15的方法，其中，所述儲存器包括層壓在所述陣列上的薄膜。
全文摘要
披露了一個具有微突出物陣列(10)、裝有免疫原性試劑和免疫應答增強佐劑的儲存器(18)的皮膚貼劑(20)，以及使用所述貼劑對動物(例如人類)進行免疫的方法。在一種優(yōu)選實施方案中，微突出物陣列(10)由光蝕刻的和顯微穿孔的鈦箔(14)構成。用含有疫苗抗原和諸如葡糖胺胞壁酰二肽的佐劑的液體制劑涂布微突出物(12)，干燥，并且使用沖擊性施用器將其施用在要免疫的動物皮膚上。微突出物(12)產(chǎn)生通過角質層的表面途徑，以便有利于抗原性試劑和佐劑的滲透?？梢钥刂瓶乖瓌┝亢蜐B透深度。該方法可廣泛應用于多種治療性疫苗，以便提高效力，并且使用方便。
文檔編號A61K9/70GK1602216SQ02812374
公開日2005年3月30日 申請日期2002年4月22日 優(yōu)先權日2001年4月20日
發(fā)明者W·J·科爾米爾, P·E·達多納, J·A·約翰森, W·A·楊, J·A·馬特里爾諾, R·L·基南, J·C·特勞特曼 申請人:阿爾扎公司