專利名稱：男用避孕藥的制作方法
相關申請的交叉參考本申請要求2001年6月19日提交的美國臨時申請第60/299,313號的權益，其公開的內容本文引入作為參考。
政府支持本文描述的發(fā)明部分受到國家衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)健康基金編號U54-HD-13541-20S的支持。因此，政府可對本發(fā)明具有權利。
背景技術：
女性生殖系統(tǒng)已被廣泛研究了很多年，開發(fā)了許多女性避孕方法。相反，男性生殖系統(tǒng)的生理學沒有得到很好的了解。因此，目前可用于男子避孕的方法選擇非常少。
在過去幾十年中，新的男用避孕藥的開發(fā)主要集中于操縱下丘腦-垂體-睪丸軸以干擾精子發(fā)生(見Paulsen等，1994)。高劑量睪酮或合成黃體酮的給予都能抑制垂體促性腺激素的分泌，進而導致精子減少或精子活力缺乏(Frick等，1977)。盡管對精子發(fā)生的這種抑制作用是可逆的，外源性地給予類固醇或多肽激素往往會干擾激素平衡并誘導不良副作用。當雄激素水平受到影響，其它第二性征也受到影響。另外，雄激素，作為一種男性激素，在人體中具有多樣性作用。還有一些調節(jié)生理學終點的雄激素是未知的，同樣地，直到最近幾年才知道其潛在的副作用。
在精子發(fā)生過程中，發(fā)生了一系列的分子、生化和細胞活動。這些活動導致減數分裂過程中一個精原細胞通過連續(xù)兩次減數分裂產生四個精子細胞(關于綜述，見de Kretser和Kerr，1988；Byers等，1993)。另一方面，發(fā)育中的生殖細胞也必須逐漸地從基部轉位到生殖上皮的adluminal區(qū)室，如此在精子排放的過程中完全發(fā)育的精細胞(精子)可釋放到管腔中。另外，構成血-睪屏障(BTB)的足間(inter-足)的密封連接(TJ)必然遭受到破壞并定時地重新裝配以允許前細線期精母細胞適時地通過BTB，進入adluminal區(qū)室繼續(xù)它們的發(fā)育。這種發(fā)育中的精細胞通過BTB和上皮的及時運動對完成精子發(fā)生是必需的。
產生血-睪屏障的足(Sertoli)細胞間的TJ在睪丸中起重要作用。首先，它們在生精上皮和限制分子旁細胞(paracellular)轉運的基底層之間起著屏障作用。其次，它們構成了使精細胞發(fā)育與為精子發(fā)生創(chuàng)造良好環(huán)境的全身性循環(huán)相分離的血-睪屏障的主要部分(Dym等，1970)。第三，TJ產生和保持了細胞的極性。在睪丸中發(fā)現了一些與TJ相關的蛋白質，例如ZO-1(Byers等，1991；Pelletier等，1997)、cingulin(Byers等，1993)、occludin(Moroi等，1998)和claudin-1、-3、-5、-7、-8和-11(綜述見Fanning等，1999；Tsukita和Furuse，2000)。在這些蛋白質中，只有ZO-1，一種睪丸中得到了廣泛研究的胞漿蛋白(Byers等，1991；Pelletier等，1997，Chung等，1999；Wong等，2000)。
Occludin是一種位于TJ鏈上的65kDa整合性膜蛋白質(Furuse等，1993；Fujimoto等，1995；Saitou等，1997)。Occludin由四個跨膜結構域、一個長羧基末端胞質結構域、一個短氨基末端胞質功能域、兩個細胞外環(huán)和一個細胞內環(huán)組成。在這些結構域中，第一個胞外域富含酪氨酸(Tyr)和甘氨酸(Gly)(約60％)(Ando-Akatsuka等，1996)。這些特征在哺乳動物種類中是非常保守的(Ando-Akatsuka等，1996)。
如跨上皮電阻(TER)評估的那樣，檢測到當TJ裝配時誘導了occludin的表達。這表明TJ的形成需要occludin。當足細胞間的TJ進行裝配時誘導了ZO-1和occludin的表達，與觀察到的occludin的胞質結構域以1∶1的摩爾比與ZO-1締合相一致(Furuse等，1994)。這些結果還與這樣的看法相一致，即ZO-1在TJ生物發(fā)生過程中作用是跨接整合性膜TJ蛋白質例如occludin和肌動蛋白-為基礎的細胞骨架的接頭(Furuse等，1994；Fanning等，1998)。在TJ裝配過程中及時地誘導occludin的表達還與TJ裝配過程中觀察到磷酸化occludin水平提高的報道相一致(Sakakibara等，1997；Wong等，1997b)。
不同的上皮系統(tǒng)中occludin的功能分析顯示在TJ裝配中occludin起著關鍵性作用(綜述見Matter和Balda，1999；Mitic和Anderson，1998；Tsukita和Furuse，1999)。例如，用全長occludin的cDNA轉染后在MDCK細胞中檢測到TER的增加(Balda等，1996；McCarthy等，1996)。然而，還發(fā)現occludin缺陷的胚胎干細胞能夠分化成為攜帶TJ的極化上皮細胞(Saitou等，1998)。該結果表明claudin(在至少18種不同動物中發(fā)現的另一種TJ-整合性跨膜蛋白質)或其它有待鑒定的TJ-整合性蛋白質在TJ裝配中能夠代替occludin的作用，它也可與基礎的胞質TJ-蛋白ZO-1締合。其它研究顯示claudin-1、-3、-5、-7、-8和-11存在于睪丸中，表明上皮細胞可利用其它TJ蛋白質構建TJ(綜述見Mitic等，2000)。
研究了合成的occludin肽的體外作用。例如，一項研究采用了相應于occludin第一外環(huán)的合成肽，檢驗其在細胞-細胞粘附中的作用。當將occludin轉染的成纖維細胞與相應于occludin的第一外環(huán)的肽一起培養(yǎng)時，occludin誘導的細胞粘附受到抑制(Van Itlalie和Anderson，1997)。該觀察引起了該第一外環(huán)負現細胞-細胞粘附的推測。在另一項研究中，將雞occludin第一外環(huán)的同源肽加入非洲爪蟾(Xenopus)A6細胞培養(yǎng)物時阻止了TJ的重新密封。相反，相應于第二胞外域的10個氨基酸的肽沒有此作用(Lacaz-Viera等，1999)。然而，Wong和Gumbiner(1997)證明根據雞occludin的整個第一外環(huán)合成的44個氨基酸的肽，不能破壞培養(yǎng)的非洲爪蟾(Xenopus)腎上皮(A6)細胞中的TJ，然而，覆蓋整個第二外環(huán)的44個氨基酸的肽的確干擾了A6細胞中TJ的裝配。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個方面涉及一種男用避孕藥，該避孕藥含有氨基酸序列相應于哺乳動物occludin第二胞外域的肽，或該肽的類似物以及運載體。該肽或其類似物能干擾體內足細胞間的密封連接。在一些實施例中，該類似物對應于哺乳動物occludin第二胞外域的片段。該片段的序列就一個或多個氨基酸的取代、添加和/缺失而言實不同于天然的相應片段。
該避孕藥可口服或腸胃外給予(例如通過睪丸內注射方式)。在一些實施例中，使該肽與能特異性靶向睪丸細胞的配體連接(這樣形成偶聯物)。在其它較佳的實施例中，該配體是一種肽并通過肽鍵與occludin肽連接，這樣occludin肽和該配體以融合蛋白形式相連接。在更佳的實施例中，該配體含有促濾泡激素(FSH)的結合域的至少一部分。還提供了編碼occludin肽和融合蛋白的核酸以及含有相同成分的構建物(例如載體和宿主)。還進一步提供了制備此避孕藥和使用該肽或核酸在哺乳動物例如人中進行避孕以獲得避孕效果的方法。
在正常情況下，通過足細胞間(inter-Sertoli)的密封連接形成的血-睪屏障界定了使生殖細胞發(fā)育和成熟為具有完全功能的精細胞的所謂生精上皮的保護性環(huán)境。不受具體操作理論的束縛，申請人認為通過破壞足細胞和足細胞之間形成的密封連接，本發(fā)明的肽還可引起血-睪屏障(BTB)的破壞，導致人體免疫細胞流入生精上皮。免疫細胞可將精細胞識別為機體的“外來物”并破壞它們。結果，精細胞的數量減少到不育水平。
附圖的簡要描述

圖1說明體外足細胞間(inter-Sertoli)密封連接(TJ)通透性屏障的裝配圖。
圖2A和2C是凝膠，2B和2D說明體外足細胞間TJ裝配的過程中，穩(wěn)肽occludin的mRNA水平的變化圖。
圖3A和B是層析圖，說明用HPLC純化occludin肽并通過微量測序證實occludin的身份。
圖4A和B說明對應于大鼠occludin第二胞外環(huán)(殘基209-230)的22-氨基酸occludin肽對足細胞間TJ通透性屏障的作用圖。
圖5說明睪丸內注射一種occludin肽后睪丸重量的變化圖。
圖6A-L描述通過睪丸內注射給予成年大鼠22-氨基酸的合成occludin肽后，其抗精子生成作用的顯微鏡觀察照片。
圖7A和B是睪丸內注射合成的occludin或myotubularin肽后血-睪屏障(BTB)的可逆性破壞圖。
圖8是人occludin定向于細胞膜的示意圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明的肽(也稱作“occludin肽”)與哺乳動物occludin的第二胞外環(huán)相對應或是其類似物，它能破壞足細胞間的密封連接。人occludin的示意圖描述見圖8。如可以看到的，人occludin肽含有第一和第二胞內環(huán)/結構域。代表各種哺乳動物occludin第二胞外環(huán)序列的排列對比在表1中給出。該排列對比顯示哺乳動物occludin在這一結構域中具有基本上的同源性或序列相似性。
表1人 FTAQ-SSGSLYGSQIYALXNQFYTPAATGLYVDQYLYHYCVVDPQE-COOH(199-243)小鼠FTAQ-ASGSMYGSQIYMICNQFYTPGGTGLYVDQYLYHYCVVDPQE-COOH(197-241)大鼠FTAQ-ASGSMYGSQIYTICSQFYTPGGTGLYVDQYLYHYCVVDPQE-COOH(197-241)雞 PQAQM-SSGYYYSPLLAMCSQ-AYGST-YLNQYIYHYCTVDPQE-COOH(1987-227)狗 FIAQ-ASGSLYSSQIYAMCNQFYASTATGLYMDQYLYHYCVVDPQE-COOH(198-242)見Mitic等，Ann.Rev.Physiol.60121-142(1998)Genbank編號NP-112619(大鼠occludin)、NP-032782(小鼠occludin)、AAC50451(人occludin)和A49467(雞occludin)。另外，大鼠袋鼠在這一結構域中顯示顯著的同源性。其它種類哺乳動物occludin中的第二胞外環(huán)可根據標準技術鑒定，例如通過用與第二胞外環(huán)或其片段雜交的寡核苷酸探測基因文庫。為了便于序列信息的解釋，表2給出氨基酸的名稱及3-和1-字母符號。
表2氨基酸符號
通常，occludin肽的類似物是全長型式的(表1中給出3序列)，或它們的片段，可具有一個或多個天然發(fā)生或合成的(如修飾的)氨基酸取代、添加和/或缺失，只要該類似物能破壞體內足細胞之間形成的密封連接。在該類似物含有一個或多個氨基酸取代的情況下，保守性改變是優(yōu)選的。例如，親水性氨基酸如S、Q、G和T可用另一個親水性氨基酸殘基如D、N或G取代。同樣，疏水性氨基酸殘基例如Y可用另一個疏水性殘基，如R、I、K或L取代。在給定的運載體中從肽的溶解性觀點看疏水性取代是有利的。非保守性取代也是允許的，只要該類似物能保留破壞密封連接形成的能力。
優(yōu)選的類似物是與第二胞外環(huán)相對應的片段。通常，破壞密封連接形成的片段含有對應于哺乳動物occludin第二胞外環(huán)的約12個至全部的(例如43-45個)氨基酸殘基，例如含有12、13、14、、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、或45個氨基酸殘基的肽。優(yōu)選的片段是那些位于細胞膜最外部或最遠端的(見圖8)，并與參與形成密封連接的互鎖結構域的環(huán)部分相對應的片段。再參見表1中給出的大鼠occludin序列，優(yōu)選的類似物含有12個氨基酸的序列TICSQFYTPGGT(對應于氨基酸殘基214-225)。在人中，相應的12個氨基酸的序列是ALCNQFYTPAAT(也相應于氨基酸殘基214-255)。這樣，除了這12個氨基酸的肽本身外，其它含有該肽的類似物可通過簡單地在兩末端之一加入一個或多個側接該序列的天然發(fā)生的氨基酸殘基推斷。再參見表1，含有這12個氨基酸的序列的代表性類似物包括如下NH2-TICSQFYTPGGT-COOHNH2-YTICSQFYTPGGT-COOHNH2-TICSQFYTPGGTG-COOHNH2-YTICSQFYTPGGTG-COOHNH2-IYTICSQFYTPGGT-COOHNH2-TICSQFYTPGGTGL-COOHNH2-IYTICSQFYTPGGTG-COOHNH2-YTICSQFYTPGGTL-COOHNH2-QIYTICSQFYTPGGT-COOHNH2-QIYTICSQFYTPGGTG-COOHNH2-YTICSQFYTPGGTGLY-COOHNH2-YTICSQFYTPGGTGLYV-COOHNH2-YTICSQFYTPGGTGLYVD-COOHNH2-IYTICSQFYTPGGTGLYVD-COOHNH2-QIYTICSQFYTPGGTGLYVD-COOHNH2-SQIYTICSQFYTPGGTGLYVD-COOH
NH2-TICSQFYTPGGTGLY-COOHNH2-TICSQFYTPGGTGLYV-COOHNH2-TICSQFYTPGGTGLYVD-COOHNH2-GSQIYTICSQFYTPGGTGLYV-COOHNH2-GSQIYTICSQFYTPGGTGLY-COOHNH2-GSQIYTICSQFYTPGGTGL-COOHNH2-GSQIYTICSQFYTPGGTG-COOH以編號的方式進行描述(例如TICSGFYTPGGT表示為(214-225)，某些含有該序列的其它類似物包括氨基酸殘基(213-225)、(212-225)、(211-225)、(210-225)、(209-225)、(208-225)、(207-225)、(206-225)、(205-225)、(204-225)、(203-225)、(202-225)、(201-225)、(200-225)、(199-225)、(214-226)、(214-227)、(214-228)、(214-229)、(214-230)、(214-231)、(214-232)、(214-233)、(214-234)、(214-235)、(214-236)、(214-237)、(214-238)、(214-239)、(214-240)、(214-241)、(214-242)、(214-243)、(213-226)、(212-227)、(211-228)、(210-229)和(209-230)。使用相同的方案，可不難產生其它哺乳動物包括人occludin衍生的適當的類似物列表。
采用文獻中描述的標準方法可檢驗其它的類似物以確定它們是否能破壞睪丸中足細胞之間的密封連接。見，Lui WY，Lee WM和Cheng CY(2001)轉化生長因子-b3可能通過其對occludin、zonula occludins-l和claudin-ll的作用體外介導足細胞間密封連接通透性屏障的干擾，Endocrinology 1421867-1877；Chung NPY和ChengCY(2001)氯化鎘誘導的足細胞間密封連接通透性屏障的破壞是研究大鼠睪丸中精子發(fā)生過程中連接分解現象的適當體外模型嗎？Endocrinology 1421878-1888；和GrimaJ，Wong CSC，Zhu LJ，Zong SD和Cheng CY(1998)由足細胞分泌的睪丸素與細胞表面聯合，并且其表達與足生殖細胞連接的破壞相關而與足細胞間密封連接無關，J.Biol.Chem.27321040-21053。制備足細胞的單層懸浮液(例如將足細胞以約1×106細胞/cm2的密度在Matrigel包被的二房室的裝置上培養(yǎng))。然后，在兩個電極(例如銀-氯化銀)之間施加電流脈沖(約20uA)通過足細胞上皮短時間(例如約2秒)，并定量測定電阻(例如使用Millicell電阻系統(tǒng)(Millipore Corp))。用濾波器的表面積(約0.6cm2)乘以電阻得到歐姆×cm2的電阻。然后將類似物加入懸浮液中。如果類似物干擾密封連接屏障，通過足細胞上皮的電阻將降低(例如從約100歐姆×cm2降到約40-80歐姆×cm2或更少)。
本發(fā)明的肽和類似物可根據標準技術制備，例如固相肽合成或通過基因工程，例如在重組宿主(例如細胞)中表達編碼該肽的DNA。已知的適當宿主可包括細菌、酵母、真菌、哺乳動物和植物細胞。參數例如密碼子偏愛、調節(jié)序列的選擇和宿主等可根據已知的方法優(yōu)化。
本發(fā)明的肽可用作雄性避孕藥。因此，可配制它們給予任何雄性哺乳動物，尤其是人。給予的肽的量將取決于例如體重、男性的整體健康狀況和給予的方式等一些因素。然而通常劑量將在約0.1-10mg/睪丸的范圍內。男性通常在給藥后的大約2-4周內將會不育。該肽的作用是暫時的。男性將保持不育約6個星期直到作用逐漸消失和生育能力恢復。這些時間將因個體與體而不同。
給予避孕藥的適當方式包括口服和腸胃外給予，例如通過皮下或睪丸內注射方式。另外，可以定向將此肽傳遞給睪丸，例如通過將此肽與一配體偶聯，配體是例如活性已降低(與野生型蛋白質相比)或優(yōu)選完全缺乏激素活性的促濾泡激素(FSH)或其衍生物來選擇性地與睪丸細胞結合。配體性質上可以是肽或非肽。因此，依照標準技術和試劑，例如通過化學交聯的方式，可將配體與occludin肽偶聯形成偶聯物。在配體是肽的實施例中，occludin肽和配體可通過肽鍵連接以產生融合蛋白。選擇的配體應能靶向于大量存在或專門存在于睪丸細胞，優(yōu)選足細胞上的受體。因此，這些偶聯物或融合蛋白能優(yōu)先地或選擇性地與這種細胞結合，而不與少量或根本不表達此類受體的細胞結合。
FSH是一個由兩個非共價連接的α和β亞基組成的異質二聚體糖蛋白(綜述見Pierce等，1981)。FSH通過其受體結合位點與存在于足細胞上的FSH受體結合(綜述見Fritz等，1978)，該受體結合位點存在于β亞基C-末端區(qū)域的氨基酸殘基93-99(Lindau Shepard等，1994)，和α亞基的His90和Lys91中(Zeng等，1995)。FSH受體是否存在于其它細胞類型中尚不知道。α亞基上的氨基酸殘基Asn52和Asn78以及β亞基上的殘基Asn7和Asn24使其具有激素活性(綜述見Rose等，2000)。已報道α亞基的兩個Asn殘基的去糖基化導致野生型的生物效能明顯下降約41％(Bishop等，1994)。因此，在這四個位點進行定點誘變將產生具有很少或可忽略不計的(功能上無意義的)激素活性同時保留與足細胞結合親合力的FSH。然后可將這種突變的FSH編碼序列插入表達載體并轉染宿主(例如CHO細胞)用于生產重組蛋白質(FSH與肽融合)或FSH與肽連接的偶聯物(例如通過化學交聯劑)(Keene等，1989；VanWezenbeek等，1990)。在這種情況下，皮下給予(例如肌肉內)將特別適合。其它適當配體的選擇，及其能保留所需結合親合力但有效地除去其它天然改能的修飾，是細胞特異性輸送系統(tǒng)領域技術人員水平范圍內的事。
同樣，對于任何給定的給予藥式可進行運載體的選擇和優(yōu)化，這是藥物領域技術人員水平范圍內的事。用于配制任何給藥方式的肽的其它成分，例如佐劑、稀釋劑、賦形劑和/或穩(wěn)定劑的選擇是本領域已知的，并可依據行業(yè)中的標準操作進行選擇(Remington，藥劑科學與實踐(The Science and Practice of Pharmacy(2000))。
也可將occludin肽與蛋白質轉導域(PTD)(具有大量帶陽電荷的賴氨酸(K)和精氨酸(R)殘基的約10-16個殘基的小肽)偶聯用于輸送。較佳地，PTD應具有1-5個這樣的殘基。研究顯示如β-半乳糖苷酶(約120kDa)一樣大的功能性蛋白質當與帶有NH2-RKKRRQRRR序列的Tat-PTD(Tat代表慢病毒的反式激活蛋白)偶聯時，可通過腹膜間注射從細胞內傳遞給細胞(Schwarze等，1999；Schwarze和Dowdy，2000)。與PTD偶聯可通過改善occludin肽向睪丸足細胞的輸送提高避孕藥的功效。
還可經適當的輸送系統(tǒng)給予雄性編碼occludin肽(或融合蛋白)的核酸實現避孕。例如，腺病毒/逆轉錄病毒介導的基因轉移系統(tǒng)也可用于輸送此肽。見，Blanchard和Boekelheide，1997；Nagano等，2000。例如，可將編碼對應于與報道基因如β-半乳糖苷酶連接的occludin肽的肽的DNA分子插入復制-缺陷型病毒表達載體例如人腺病毒血清5型(Stratford-Perricaudet等，1990；Lee等，1993；Blanchard等，1997)。在一個較佳的實施例中，構建了含有E1和E3缺失的復制機能不全的人腺病毒血清5型，其中插入了occludin肽的編碼序列和報道基因并由腺病毒啟動子驅動。進行體外病毒包裝以產生高效價的病毒原液。病毒原液的濃度采用噬斑形成單位檢驗以293人胚腎細胞進行定量測定(Hitt等，1995)。然后用含有CaCl2和MgCl2的PBS將病毒原液稀釋到適當的濃度并通過睪丸內注射輸入睪丸。
應理解盡管本發(fā)明結合優(yōu)選具體實施例進行了描述，上文所描述的以及以下實施例旨在說明而不是限制本發(fā)明的范圍。在本發(fā)明范圍內的其它方面、優(yōu)點以及修飾是本發(fā)明所屬領域熟練技術人員所明白的。
下文實施例描述使用本發(fā)明的肽進行的實驗，該肽是與大鼠occludin第二胞外域相對應的22個氨基酸的肽。通過測定跨越足細胞上皮的跨上皮電阻體外檢驗了該肽。該肽能可逆地破壞足細胞間的密封連接。還通過雄性大鼠睪丸注射體內評估了該肽，其結果顯示生精上皮的生殖細胞可逆性缺失和血-睪屏障的破壞。
動物。從Charles River實驗室(Kingston，MA)獲得成年(體重250和300g之間)和20日齡Sprague-Dawley大鼠。所有大鼠在Rockefeller大學實驗動物研究中心(Rockefeller University Laboratory Animal Research Center(LARC)中飼養(yǎng)。每籠兩只成年大鼠。在控溫(22℃)和恒定的光照12小時黑暗12小時周期中，所有的動物可自由接近標準的大鼠食物并隨意取水。這些動物依據動物福利法案(Animal Welfare Act)部分和衛(wèi)生和公共事業(yè)部(Department of Health and Human Services)的出版物“管理和使用實驗動物指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animal)”中的準則進行飼養(yǎng)。本申請中描述的動物的使用經Rockefeller大學動物管理和使用委員會(Rockefeller University Animal Care and Use Committee)批準，方案編號97117，95129R和00111。
足細胞培養(yǎng)物的制備。如前所述(Cheng等，1986)從20日齡Sprague-Dawley大鼠分離得到原代足細胞。將足細胞以5×104細胞/cm2的密度接種在100-mm的培養(yǎng)皿中[約4.5×106細胞/100-mm培養(yǎng)皿/9ml的Ham氏F12營養(yǎng)混合物/Dulbecco修飾的Eagle氏培養(yǎng)基(F12/DMEM，1∶1，v/v，Life Technologies，Inc.)；F12/DMEM中添加有15mM的HEPES、1.2g/L的碳酸氫鈉、10μg/ml的牛胰島素、5μg/ml的人轉鐵蛋白、2.5ng/ml的EGF、20mg/L的慶大霉素和10μg/ml的桿菌肽(bacitrain)。當用TER測定監(jiān)測(Grima等，1998)時低細胞密度培養(yǎng)的足細胞形成了沒有足細胞間TJ裝配的單層上皮。但是形成了粘附連接(AJ)和空隙連接(GJ)(Chung等，1999)。對于高細胞密度的培養(yǎng)物，如前所述(Grima等，1998)足細胞接種在包被MatrigelTMCollaborative Biochemical Products)，Belford，MA)(用F12/DMEM，作1∶7(v/v)稀釋)的24孔培養(yǎng)皿上(有效表面積約1.88cm2，每孔2ml F12/DMEM)以0.6-3×106/cm2的密度接種以形成TJ、AJ和GJ，當用各種標準評估時，模擬了體內發(fā)現足細胞(Grima等，1992)。細胞培養(yǎng)物35℃培養(yǎng)在含有95％的空氣和5％的CO2(v/v)的濕潤氣體中，24小時后記錄TER讀數且取名為第一天培養(yǎng)物。當用顯微鏡觀察檢驗時這些足細胞培養(yǎng)物顯示95％以上的純度(Wong等，2000；Grima等，1992；Grima等，2000)。
用半定量RT-PCR檢測occludin的穩(wěn)態(tài)mRNA水平?；旧先缜八鲞M行半定量RT-PCR(Grima等，1998；Chung等，1998a、b；1999；Monk和Cheng，1999)。RNA STAT-60TM(Tel Test“B”Inc.，Friendswood，TX)在特定的時間點提取培養(yǎng)細胞的RNA。在25μl最終反應體積中，用1μg寡-dT15和MMLV逆轉錄試劑盒(Promega，Madison，WI)將大約3μg的總RNA逆轉錄為cDNA。為了定量測定和比較不同樣品的occludin mRNA水平，用S16共擴增occludin，這樣occludin的相對表達可相對于S16標準化。在初步實驗中，采用不同濃度的模板和引物對進行PCR，檢測了經20-28輪擴增的PCR產物以確保靶基因和S16的線性化。在大多數實驗中，通過將3μl的RT產物與0.4μg的各個occludin引物(有義引物5’-CTGTCTATGCTCGTCATCG-3’，核苷酸770-788和反義引物5’-CATTCCCGATCTAATGACGC-3’，核苷酸1044-1063)(Genebank編號AB016425)、80ng各個大鼠核糖體S16引物(有義引物5’-TCCGCTGCAGTCCGTTCAAGTCTT-3’，核苷酸15-38和反義引物5’-GCCTTTCTTCTTGGATTCGCAGCG-3’，核苷酸376-399)(Chan等，1990)、5μl的10XPCR緩沖液、3μl的MgCl2(25mM)、8μl的dNTP(200μM的各個dATP、dGTP、dCTP和dTTP)、2.5單位的Taq DNA聚合酶(Promega)相混合，并用無菌雙蒸水稀釋到50μl的最終體積進行PCR。PCR的循環(huán)參數如下94℃變性1分鐘，62℃退火2分鐘和72℃延伸3分鐘，總共進行23輪，隨后72℃延伸15分鐘。為了在對獲得的放射自顯影圖進行光密度掃描后提高檢測限度和產生半定量分析的數據，在[γ-32P]-標記的引物存在下進行PCR。簡言之，occludin和S16的有義引物在5’-末端用T4多核苷酸激酶(Promega，Madison，WI)以[γ-32P]-dATP(比活性，6000Ci/mmol，AmershamPharmacia Biotech)標記。[γ-32P]-S16(有義引物，～10,000cpm/PCR管)[γ-32P]-occludin(有義引物)的相對比率與未標記的相應有義引物相同，因此獲得的放射自顯影圖是溴化乙錠染色凝膠的復制品。將約10μl的PCR產物等分用0.5x TBE(45mM的Tris-硼酸鹽，1mM的EDTA，pH 8.0)作為電泳緩沖液在5％的T聚丙烯酰胺凝膠上分辨。通過溴化乙錠染色觀察PCR產物。然后干燥凝膠并用Kodak X-OMAT AR感光膠片(Eastman Kodak，Rochester，NY)放射自顯影。得到的放射自顯影圖用UltroScan XL激光增強密度計(Pharmacia Amersham Biotech)在600nm處進行光密度掃描，將數據相對于S16標準化以產生半定量的數據。
22個氨基酸的occludin合成肽的合成、純化和特征分析。從SynPep公司(Dublin，CA)獲得對應于大鼠occludin第二胞外域的22個氨基酸的肽(NH2-GSQIYTICSQFYTPGGTGLYVD-COOH，氨基酸殘基209-230)(Genebank編號AB016425)和22個氨基酸的myotubularin(NH2-TKVNERYELCDTYPALLAVPAN-COOH，殘基156-177)(Li等，2000a)。用BLAST搜索軟件在Genbank現存的序列中這些肽序列沒有同源物。然而，大鼠occludin序列的一小段在不同種類動物分離的occludin中，具有90％的同源性。為了純化該合成肽，將500μg粗肽溶解于溶劑A(含有0.1％三氟乙酸的5％乙腈、95％水，v/v)中并以1ml/分鐘的流速加載到VydacTM(Separations Group，Hesperia，CA)C18反相HPLC柱上(4.6×250mm)。然后從其它雜質中分離occludin肽并如所描述的(Li等，2000；Monk和Cheng，1999)用15-65％線性梯度的溶劑B(含有0.1％三氟乙酸的95％乙腈、5％水，v/v)洗脫30分鐘以上。以220nmUV吸光率監(jiān)測洗脫液，并收集每份0.5ml。合并含有occludin肽的組分、冷凍和凍干。然以后，微量測序約50pmol的純化occludin肽以驗證其身份，如前所述(Monk和Cheng，1999；Cheng等，1998；和Cheng等，1989)。重復產量約為96％。
通過測定跨足細胞上皮的跨上皮電阻(TER)評估足細胞間TJ-通透性屏障的完整性。為了評估occludin肽對足細胞間TJ裝配的影響，分離了20日齡大鼠睪丸中的足細胞以1.2×106個細胞/cm2的密度培養(yǎng)以使足細胞間TJ進行裝配，并且如前所述定量測定了(Wong等，2000；Grima等，1998)橫跨足細胞上皮的、定量衡量TJ完整性的TER。將細胞接種在頂室(Millipore，Bedford，MA)(25，28)中的MatrigelTM(1∶7)包被的HA濾膜上。非常小心去做，不要在足細胞聚集物之間形成氣泡，由于氣泡能在相鄰的足細胞之間產生物理孔隙，所以是獲得跨越足細胞上皮的穩(wěn)定TER的主要障礙。在特定的時間點如所描述通過Millicell電阻系統(tǒng)測定跨越足細胞上皮的TER(Grima等，1998；Cheng和Chung，2001)。電阻歐姆乘以兩室裝置(bicameral unit)的有效表面積(約0.6cm2)以產生面積電阻(ohm.cm2)。然后通過從足細胞接種室的值減去本底(在Matrigel包被的無細胞室上測定)值。為了在TER測定過程中將溫度-引起的波動減到最小，在記錄跨越足細胞上皮的TER前，將培養(yǎng)物穩(wěn)定在室溫20-30分鐘。剛剛分離的足細胞接種在Martigel包被的小室上24小時后，將0.2-4μM合成occludin肽加入兩室裝置的基底室(含0.03％DMSO的0.5ml F12/DMEM，v/v，DMSO用于溶解肽于培養(yǎng)液中)和頂室中(含0.03％DMSO的0.5ml的F12/DME，v/v)(第一天)。每天更換培養(yǎng)液時，將肽加入含0.03％DMSO(v/v)的F12/DMEM中。在選擇試驗中，用不含肽的F12/DMEM和隨后用也不含肽的培養(yǎng)液兩次連續(xù)洗滌沖洗細胞，從足細胞上皮除去合成occludin肽。對照實驗包括(i)單獨培養(yǎng)的足細胞，(ii)僅用運載體(含0.03％DMSO的培養(yǎng)液，v/v)培養(yǎng)的足細胞，和(iii)如上文所述在存在4μM的22-氨基酸合成myotubularin肽條件下培養(yǎng)的足細胞。各個時間點包括一式三份培養(yǎng)物，而各次實驗用不同批足細胞重復2-3次。我們選擇不同于其它方法的TER測定以定量測定Sertoli間TJ的裝配和維持，該方法包括(i)限制[3H]-菊糖、[125I]-BSA或熒光素異硫氰酸鹽標記的葡聚糖跨越足細胞上皮的擴散，(ii)維持兩室裝置的頂室和基底室中培養(yǎng)液的非平衡狀態(tài)，和(iii)為了如下原因，如所描述的(Grima等，1992；Grima等，2000)，極化足細胞產物，例如轉鐵蛋白、rABP、睪丸素、簇集素、和α2-巨球蛋白的分泌。首先，這是本領域細胞生物學家廣泛采納的一項技術(Wong等，1997；Balda等，1996)。其次，它可對足細胞間TJ的裝配和維持產生定量測定。第三，也是最重要的，TER測定獲得的結果與上文所述其它繁瑣方法獲得的結果一致，例如用[3H]-菊糖和熒光素異硫氰酸鹽標記的葡聚糖的擴散性限制(用Tecan GENios細胞熒光計監(jiān)測)與TER同時評估該密封連接和通透性屏障。
Occludin肽的睪丸內注射和睪丸的組織學分析。為了評價occludin肽對精子發(fā)生的體內作用，如下通過直接睪丸內注射將肽給予成年大鼠的睪丸。將肽懸浮于0.9％無菌鹽水中，通過暴露UV進行5分鐘滅菌。應注意在肽使用前短暫UV處理滅菌肽懸浮液不會改變肽的結構，并以兩種方法驗證。首先，當與UV處理前的肽比較時，UV處理的肽在采用Vydac C18層析柱(4.6×250mm，i.d.)(Cheng等，1998，Cheng等，1989)的反相HPLC上保持相同的滯留時間。其次，當如所描述的(Mruk和Cheng，1990；Cheng等，1998；Cheng等，1989)進行定向蛋白質微測序時，UV處理的肽的初級序列保持不變。處理前，體重250g和300g之間的成年大鼠用Metofane麻醉。大鼠通過睪丸內注射接受300μl的0.9％無菌鹽水(運載體對照)，不處理(對照)，或者懸浮于300μl 0.9％無菌鹽水中的1.5-10mg occludin肽。動物的右側睪丸接受肽或運載體而同一動物的左側睪丸不做處理用做對照。如前所述，基本上以約100ul樣品/每點在每一睪丸上3個點給予肽或運載體(Grima等，1998；Eng等，1994)。在另一對照組中，大鼠用基于已知的足細胞蛋白質、大鼠myotubularin(rMTM)的合成性22個氨基酸的NH2-TKVNERYELCDTYPALLAVPAN-COOH肽注射(Li等，2000；Li等，2001)，該肽與occludin沒有序列同源性。在各處理組中使用3個大鼠，并在特定時間點通過CO2窒息殺死大鼠。立即取出睪丸并固定于10％中性緩沖福爾馬林中。用石蠟包埋睪丸，并以分級乙醇脫水。為了進行形態(tài)學分析，切成5μm的切片并用蘇木精和曙紅染色。采用帶有Olympus PM-30曝光控制組件的Olympus BX40顯微鏡(Tokyo，Japan)檢測睪丸各不同點的約50張切片，(Exposure Control Unit)。
使用顯微穿刺術評估occludin-肽誘導的血-睪屏障(BTB)的破壞。
牛血清白蛋白(BSA)的放射性碘化簡言之，如所描述的(Cheng等，1983)，將5μg的BSA(Sigrna，RIA級，Mr 68kDa)用1mCi的[125I]-碘化鈉(Amersham Pharmacia Biotech)通過Iodogen(Fraker等，1978)進行放射性碘化。
檢測生精小管液體(STF)和睪丸網液體(RTF)中的[125I]-BSA。如上文所述(在三個點給予右側睪丸)，睪丸內給予1.5mg occludin或者myotubularin肽/睪丸后2、4、6和12周，其中同一動物的左側睪丸用作對照。用鹽酸開他敏(ketamine HCl)(Fort DodgeLaboratories，Inc.，Fort Dodge IA)以60mg/kg體重的濃度麻醉大鼠(n＝每個時間點4-6個大鼠，在肽處理時體重約為250克)。基本上如描述的(Turner等，1984；Stahler等，1991)進行顯微穿刺術。簡言之，通過剖腹術暴露睪丸，并用手術絲線結扎輸出管。然后將睪丸放回陰囊，用70％乙醇洗凈傷口，外科縫合使動物恢復。輸出管結扎后24小時，用鹽酸開他敏麻醉大鼠，進行兩側的腎切除以防止腎排泄[125I]-BSA，將大約6×106cpm的[125I]-BSA通過頸靜脈注入大鼠。注入后2小時，取出睪丸，如所描述收集RTF和STF(Turner等，1984；Stahler等，1991)在γ-計數器中進行放射性測定。沒有接受occludin或者myotubularin肽的同一動物左側睪丸用作對照，也收集STF和RTF作放射性測定以評估BTB的完整性。
統(tǒng)計分析。用Student’s t-檢驗將處理的樣品與它們相應的對照進行比較，或者通過采用GB-STAT統(tǒng)計分析包(Statistical Analysis Package)(7.0版，DynamicMicrosystems Inc.，Silver Spring，MD)的ANOVA分析結果的統(tǒng)計學顯著性。對ANOVA用Tukey’s可靠的顯著性差異(HSD)檢驗，將各個樣品的結果與對照相比較以及與同一組中經受相同處理的樣品比較。在研究細胞基因表達或TER測定以評估足細胞間TJ通透屏障的所有培養(yǎng)實驗中，各個時間點有重復培養(yǎng)物并且各個實驗使用不同批足細胞重復2-3次。
足細胞的occludin表達與足細胞間TJ-通透性屏障的體外裝配相關。
當在Matrigel包被的二室裝置上以2×104和3×106個細胞/cm2之間的不同細胞密度培養(yǎng)足細胞時，注意到跨越足細胞上皮的TER穩(wěn)定增加(圖1)。如跨越足細胞上皮的穩(wěn)定TER(圖1)所表明的那樣，足細胞間TJ的裝配在第4天完成。這些結果與用于評估足細胞間TJ通透性屏障的其它技術所得的結果一致，例如跨越足細胞上皮的[3H]-菊糖的限制性擴散，足細胞分泌產物，例如rABP、轉鐵蛋白的極化分泌和檢驗(Grima等，1992；Byers等，1986；和Janecki等，1986)。由于TER測定對足細胞間TJ裝配可產生定量性評估，它不需要用放射性同位素；該方法具有高度可重復性并且建立和維持相對容易。另外，它為本領域的細胞生物學家廣泛使用(Wong等，1997；Balda等，1996)。因此，選擇了這一方法而不是其它方法。
以不同的細胞密度在Matrigel包被的兩室裝置上培養(yǎng)的足細胞，在TJ裝配期間培養(yǎng)時間里顯示相似的TER模式圖，但足細胞間TJ的“密封度”與細胞密度呈正相關。當足細胞以3×106細胞/cm2密度培養(yǎng)時，4天后在三個不同的試驗中TER輕度下降。這可能是細胞過密和死亡、代謝廢物的聚集和營養(yǎng)液不足的結果。形態(tài)學研究顯示以這種高密度培養(yǎng)的細胞伴有降解足細胞產生的DNA碎片的增加(Wong等，2000)。以低的細胞密度(2×104細胞/cm2)培養(yǎng)，沒有檢測到可測量的TJ通透性，可能是由于細胞數量不足而缺乏使TJ能夠裝配的鄰近細胞(圖1)。以高細胞密度培養(yǎng)(1.2×104細胞/cm2)，當Stertolil比較圖2)，在第2和4.5天之間occludin穩(wěn)態(tài)mRNA水平明顯而短暫地提高(圖2A，B)，說明TJ裝配需要重新合成TJ的結構單元之一的occludin。第五天后，穩(wěn)態(tài)occludin的mRNA恢復到與第1天相似的基礎水平(圖2A，B)。這種occludin表達的瞬時誘導在2×104細胞/cm2的低細胞密度培養(yǎng)物中沒有檢測到(圖2C比較圖2A、B)。這些結果與先前顯示ZO-1誘導、以及TJ-締合蛋白、和足細胞間TJ裝配之間的相關性觀察相一致(Chung等，1999；Wong等，2000)。
體外用對應于occludin第二外環(huán)一片段的22個氨基酸合成肽可逆性擾亂足細胞間TJ-通透性屏障評估了對應于大鼠occludin第二外環(huán)最遠區(qū)域的22-個氨基酸的合成肽(表1中的殘基209-230)影響足細胞間TJ裝配的能力。該肽合成后，通過反相HPLC純化合成的occludin肽(圖3A，B)，并且通過定向蛋白微測序證實其身份。以1.2×106細胞/cm2的密度分離后24小時將occludin肽加入足細胞上皮誘導了TER的劑量依賴性下降(圖4A)。這種肽誘導的旁細胞(paracellular)通透性屏障的破壞可在肽從培養(yǎng)物中除去后回復(圖4B)。當與未處理的對照比較時，在第4-5天，用4μM occludin肽培養(yǎng)的足細胞引起TER的明顯下降大約50％。在選擇實驗中，當第五天用F12/DMEM連續(xù)洗滌兩次，從兩室裝置中除去occludin肽時，足細胞間TJ通透性屏障可重新裝配，使TER讀數在3-4天內與對照沒有區(qū)別(圖4B)。令人感興趣的是，重新裝配因occludin肽誘導所破壞的足細胞間TJ所用的時間與用剛剛體外分離的足細胞進行足細胞間TJ裝配所用的時間大約相同，這與[Ca2+]缺失的誘導的TJ滲漏不同，因為它僅花費90分鐘使足細胞重新密封受破壞的TJ(Grima等，1998)。由于occludin肽擾亂足細胞間TJ通透性屏障的作用在肽除去后是可逆的，可確定occludin肽對足細胞是無毒的。當使用4μM的22個氨基酸rMTM肽替代occludin肽時，對擾亂足細胞間TJ屏障沒有明顯作用(數據未顯示)。而且，當在選擇試驗中用臺盼藍染料排斥試驗評估occludin肽處理的培養(yǎng)物與對照培養(yǎng)物的細胞成活力時，沒有檢測到明顯的差別(數據未顯示)。從occludin(或其類似物)第二胞外環(huán)獲得的其它多肽可通過進行前述試驗容易地評估效能。
Occludin肽對體內精子發(fā)生的可逆作用HPLC純化后，將occludin或myotubularin肽懸浮于0.9％無菌鹽水中并在UV下無菌5分鐘。實驗組各大鼠接受含0.15mg或者1.5mg的相應純化肽的300μl的鹽水睪丸內注射。如材料和方法以及其它文獻中詳細描述的(Grima等，1992；Eng等，1994)那樣，肽懸浮液分布于各睪丸的3個點(每個位點約100ml)。當與沒有接受處理、僅用運載體處理(0.9％無菌鹽水)或myotubularin肽處理的對照大鼠比較時，該純化occludin肽睪丸內注射在2周內引起睪丸重量減少(圖5)。雖然occludin肽誘導了睪丸重量和睪丸大小的下降(圖5)，但睪丸的外觀和附睪看來正常。圖6A-C顯示沒有接受處理(圖6A)、僅睪丸內注射運載體后14天(圖6B)或者睪丸內注射鹽水后14天(圖6C)的對照大鼠的睪丸。圖6D-F是睪丸的另一對照組，其中大鼠接受myotubularin肽睪丸內注射處理后10天(圖6D)、23天(圖6E)和40天(圖6F)。處理睪丸的形態(tài)學分析顯示更晚期的生殖細胞，例如延長的精子細胞，在occludin肽處理后8天(圖6G)和16天之間開始從上皮中缺失。occludin肽睪丸內注射后27天，觀察到生殖細胞基本上從所有測定的精細管上皮中大量地缺失(圖6I和6J)。另外，當與僅接受運載體或myotubularin肽的對照大鼠或睪丸相比較時，occludin處理的睪丸生精小管明顯縮小，小管直徑減少了20-30％之多(圖6I和6J比較6A-C)。occludin肽處理后27天上皮中的生殖細胞開始恢復。到第47天，在所有檢測的生精小管中可清楚地看到精母細胞(圖6K)，到occludin肽處理后的68天，生精上皮的形態(tài)學看來與對照大鼠沒有區(qū)別(圖6L)，顯示從occludin肽誘導的睪丸破壞中完全恢復(圖6L)。睪丸在40天內幾乎完全恢復的事實(處理后68天的圖6L對比處理后27天的圖6I、J)說明大多數精母細胞沒有被occludin肽的處理所破壞。
Occludin肽對血-睪屏障(BTB)的作用為了確定肽-誘導的生殖細胞損失是否由于BTB的破壞(它進而誘導宿主免疫系統(tǒng)提高了攻擊從而引起生殖細胞的吸收，如圖6中所顯示)，在每個睪丸的三個點睪丸內注射合成肽(occludin肽或myotubularin肽)后評估了BTB的完整性，而同一動物(成年Sprague-Dawley大鼠，體重270-300gm)的其它睪丸用做對照(n＝每一時間點4-6個大鼠)。圖7顯示的結果清楚地表明以1.5mg/睪丸的occludin肽睪丸內注射后BTB遭到破壞。與通過頸靜脈注入[125I]-BSA后的同一大鼠的未處理睪丸比較，處理后2-6周之間在occludin肽注射的睪丸中，[125I]-BSA在STF(圖7A)和RTF(圖7B)中累積。該肽-誘導的BTB損傷看來是可逆的，因為當用類似于圖6顯示的那些組織學分析檢測時(數據未顯示)，到處理后12周，STF和RTF中[125I]-BSA的累積急劇下降(圖7A，B)，與生精上皮的恢復相一致。而從肽處理的大鼠收集的STF和RTF中的放射性水平變成與未接觸occludin肽的對照睪丸沒有區(qū)別(圖7)。由于22個氨基酸的大鼠myotubularin肽不能誘導BTB的破壞，該occludin肽-誘導的BTB損傷似乎是特異性的，因為在myotubularin肽處理的大鼠STF或RTF中檢測到的放射活性與未接受肽處理的對照大鼠沒有區(qū)別(圖7A，B)。
通過PCR制備編碼野生型FSH亞基和相應突變體的cDNA表3顯示編碼野生型促濾泡激素(“FSH”)的α和β亞基、FSH-α的兩個突變體和FSH-β的一個突變體的全長cDNA。表4顯示可用Sorrentino等，1998所描述的桿狀病毒系統(tǒng)制備的三個重組FSH突變體。為了獲得這些cDNA，可如McPherson，1991所描述的采用PCR進行定點誘變。簡言之，從大鼠腦垂體分離得到總RNA，用于采用寡(dT)15的RT反應。這些cDNA用做隨后PCR的模板。合成含有突變位點的適當的引物對，如所描述的(McPherson，1991；Sorrentino等，1998)該引物對用于采用上述RT產物作為模板的PCR。制備缺乏推定的糖基化位點(見表3和4)的重組FSH蛋白(已知該糖基化位點提供了FSH的全部激素活性(Rose等，2001))，方法是將N-末端起第56和82位的Asn(N)轉變?yōu)锳sp(D)(見表3和表4中的突變體1)。另外，用Lys-Lys-Lys和Ala-Ala-Ala分別取代Thr-Met-Leu(殘基50-52)和Met-Gly-Asn(殘基75-77)制備突變體(見表3和表2中的突變體4)。目的是改變靠近推定的糖基化位點部位的疏水性和構象。第三個突變體僅由缺失推定的糖基化位點的FSH-β組成(見表3和表2中的突變體4)。表3和4顯示編碼三個不同的FSH-α和兩個FSH-β亞基的定點誘變實驗后的PCR產物，將它們亞克隆入pGEM-T載體(Promega)中用于定向核苷酸序列分析以驗證序列在所需突變位點上。然后可將含有所需突變位點的cDNA與一質粒連接，例如，pAcGzt，它可用于轉染入桿狀病毒生產重組蛋白質。
表3.野生型FSH和FSH突變體的α和β亞基的氨基酸序列α-亞基rFSHαWTNH2-MDCYRRVAAVILVMLSMVLHILHSLPDGDLIIQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKNITSQATCCVAKSFTKATVMGNARVENHTDCHCSTCYYHKS-COOHΔrFSHα-(56/82) NH2-MDCYRRVAAVILVMLSMVLHILHSLPDGDLIIQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTMLVPKDITSQATCCVAKSFTKATVMGNARVEDHTDCHCSTCYYHKS-COOHΔrFSHα- NH2-MDCYRRVAAVILVMLSMVLHILHSLPDGDLIIQ(50-52/75-77) GCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKKKKVPKNITSQATCCVAKSFTKATVAAAARVENHTDCHCSTCYYHKS-COOHβ-亞基rFSHβWTNH2-MMKSIQLCILLWCLRAVCCHSCELTNITISVEKEECRFCISINTTWCEGYCYTRDLVYKDPARPNTQKVCTFKELVYETIRLPGCARHSDSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE-COOHΔrFSHβ-(22-24) NH2-KSIQLCILLWCLRAVCCHSCELTNITISVEKEECRFCIS---TWCEGYCYTRDLVYKDPARPNTQKVCTFKELVYETIRLPGCARHSDSLYTYPVATECHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE-COOH*顯示了編碼大鼠FSH相應的α和β亞基的全長核苷酸序列及其突變體。以粗體表示的氨基酸殘基代表信號肽。帶下劃線形式的氨基酸殘基代表已知賦予FSH激素活性的推定的糖基化位點。以粗斜體表示的殘基代表建議的突變。虛線代表缺失。
表4.推薦的重組的FSH突變體和野生型FSH(對照)FSHα-亞基FSHβ-亞基對照rFSHαWTrFSHβWT突變體1 ΔrFSHα-(56/82) ΔrFSHβ-(22-24)突變體2 ΔrFSH α-(50-52/75-77) ΔrFSHβ-(22-24)突變體3 無α亞基 ΔrFSHβ-(22-24)
行業(yè)適用性本發(fā)明涉及醫(yī)療、獸醫(yī)和制藥行業(yè)，具體涉及避孕領域。
本說明書中提及的所有的出版物表明了本發(fā)明所屬領域技術人員的水平。所有這些出版物本文以相同的程度引入作為參考。
前面描述的具體的實施例全面揭示了本發(fā)明的總體特征，這樣其它人為了各種運用，可通過應用現有的知識不難地修改和/或改寫這種具體的實施例而不背離本發(fā)明總的特征。因此，這種修改和改變旨在理解與本發(fā)明公開的實施例相同的意義和范圍。另外，本文所用的術語是為了描述目的而無限制性。
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權利要求
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2.如權利要求1所述的避孕藥，其特征在于，所述避孕藥還含有特異性地靶睪丸足細胞的配體，其中所述配體與所述的肽連接。
3.如權利要求2所述的避孕藥，其特征在于，所述肽和所述配體通過肽鍵連接。
4.如權利要求2所述的避孕藥，其特征在于，所述配體含有促濾泡激素(FSH)。
5.如權利要求1所述的避孕藥，其特征在于，所述避孕藥為適合于睪丸內注射的形式。
6.如權利要求1所述的避孕藥，其特征在于，所述避孕藥為適合于腸胃外給予的形式。
7.一種避孕的方法，其特征在于，所述方法包括給予雄性哺乳動物一種組合物，所述組合物包含具有與哺乳動物occludin第二胞外域相應的氨基酸序列的肽，或所述肽的類似物，和運載體，其中所述的肽能破壞體內足細胞間的密封連接。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述雄性哺乳動物是人。
9.一種生產男用避孕藥的方法，所述方法包括(a)制備具有與哺乳動物occludin第二胞外域相應的氨基酸序列的肽，或所述肽的類似物，其中所述的肽能破壞體內足細胞間的密封連接；和(b)使所述肽與運載體結合。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法還包括(a)制備特異地靶向睪丸足細胞的配體；和(b)將所述肽與所述配體連接。
11.一種哺乳動物occludin第二胞外域的肽片段，所述片段可含有一個或多個取代、添加和/或缺失，并且其中所述片段能破壞體內細胞間的密封連接。
12.如權利要求11所述的肽片段，其特征在于，所述片段含有肽序列ALCNQFYTPAAT。
13.如權利要求11所述的肽片段，其特征在于，所述片段含有肽序列GSQIYTICSQFYTPGGTGLYVD。
14.一種編碼具有與哺乳動物occludin第二胞外域相應的氨基酸序列的肽，或其類似物的DNA分子，其中所述肽或其類似物能破壞體內足細胞間的密封連接。
15.如權利要求14所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的第一部分編碼所述的肽，其第二部分編碼能選擇性靶向睪丸足細胞的配體，并且其中所述DNA分子的表達產生含有所述肽和所述配體的融合蛋白。
16.如權利要求15所述的DNA分子，其特征在于，其中所述第二部分編碼促濾泡激素結合域的至少一部分，該部分足以使所述融合蛋白選擇性靶向睪丸足細胞。
17.如權利要求14所述的DNA分子，其特征在于，所述類似物具有對應于哺乳動物occludin第二胞外域一片段的氨基酸序列，并且就其具有至少一個氨基酸取代、添加或缺失而言，它可能不同于所述片段的天然序列。
18.一種含有如權利要求14所述的DNA分子的載體。
19.一種用如權利要求14所述的DNA分子轉化的非人宿主。
20.如權利要求19所述的非人宿主是大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明公開的是含有與哺乳動物occludin第二胞外域相應的氨基酸序列的肽及其類似物的男用避孕藥。所述的肽可與靶向睪丸細胞的運載體連接，較佳地與修飾的促濾泡激素連接。還公開了生產這種避孕藥的方法和使用方法。
文檔編號A61K38/00GK1518592SQ02812282
公開日2004年8月4日 申請日期2002年6月19日 優(yōu)先權日2001年6月19日
發(fā)明者C·Y·程, C Y 程 申請人:人口委員會股份有限公司