專利名稱：白細(xì)胞介素－2及其基因在戒毒應(yīng)用中的測(cè)試方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及白細(xì)胞介素-2(IL-2)及其基因在戒毒應(yīng)用中的測(cè)試方法。
背景技術(shù)：
毒品，不僅嚴(yán)重危害人類健康，全世界吸毒者有1乙多人口，給社會(huì)帶來了一系列難以解決的問題。對(duì)危害世界人們身心健康的毒品，各國(guó)政府和科學(xué)家們正不遺余力地研究、開發(fā)解除毒品產(chǎn)生生理/心理反應(yīng)的藥物及方法，使吸毒者迅速達(dá)到脫毒、脫癮的目的。但由于毒品引發(fā)的特殊的生理及心理反應(yīng)，至今未能發(fā)現(xiàn)一種使吸毒者安全、有效、無依賴性地脫離毒品的“靈丹妙藥”?，F(xiàn)有的治療方法存在著難以接受的副作用，而且它的應(yīng)用也常常由于成癮性而受限。而整個(gè)對(duì)藥物依賴性研究的工作仍停留在“新的嗎啡類化合物取代舊的嗎啡類化合物”的怪圈中，“美沙酮遞減法”被發(fā)達(dá)國(guó)家作為“標(biāo)準(zhǔn)治療”，至今仍在使用。社會(huì)迫切需要一種本身無成癮性、有較好控制戒斷癥狀、且毒副作用小的藥物。
免疫系統(tǒng)中的一種重要的淋巴因子-白細(xì)胞介素-2的鎮(zhèn)痛作用和控制嗎啡戒斷癥狀作用的發(fā)現(xiàn)，可能為我們提供了一個(gè)重要的工具。我國(guó)劉新垣院士等首先發(fā)現(xiàn)IL-2具有鎮(zhèn)痛作用。實(shí)驗(yàn)表明IL-2既有中樞鎮(zhèn)痛作用又有外周鎮(zhèn)痛作用，臨床觀察發(fā)現(xiàn)對(duì)止痛效果不佳的晚期癌癥痛患者使用IL-2后具有很好的止痛作用。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)IL-2的鎮(zhèn)痛作用可能與阿片受體有關(guān)。在嗎啡耐受及對(duì)嗎啡不敏感的神經(jīng)病理痛模型上，IL-2較嗎啡具有更為顯著的鎮(zhèn)痛作用。由于吸毒者的免疫功能低下，IL-2有望一方面提高機(jī)體的免疫功能，一方面控制戒斷癥狀。然而IL-2在機(jī)體內(nèi)活性半衰期很短，必須大劑量連續(xù)用藥，醫(yī)藥費(fèi)用高及長(zhǎng)期注射的麻煩，從而影響了治療效果及這一藥物的廣泛應(yīng)用。基因治療為解決這一問題帶來了新的希望，它是一種通過基因轉(zhuǎn)移的方法，將具有表達(dá)目的基因的載體導(dǎo)入到相關(guān)的細(xì)胞和組織中，使轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物發(fā)揮治療作用的方法。目前用于基因治療的基因載體有病毒載體和非病毒載體。脂質(zhì)體屬于后者，它介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因安全性好，可用于在體(in vivo)基因治療；病毒載體穩(wěn)定性好，轉(zhuǎn)基因效率高，可轉(zhuǎn)染分裂或不分裂細(xì)胞；腺病毒進(jìn)入細(xì)胞核后，以附加體(episome)的形式存在，不發(fā)生整合，因此沒有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體潛在的致癌、致突變性，安全性較好，這些特點(diǎn)決定了腺病毒非常適合于神經(jīng)系統(tǒng)的在體基因治療。當(dāng)腺病毒載體注入蛛網(wǎng)膜下腔后，腺病毒進(jìn)入軟脊膜和蛛網(wǎng)膜內(nèi)增殖，基因表達(dá)產(chǎn)物以“旁分泌模式”作用于脊髓和感覺神經(jīng)根，可在脊髓水平對(duì)神經(jīng)進(jìn)行調(diào)控，這種基因治療方式通過腰穿即可完成，所以有希望應(yīng)用于門診患者的治療。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于設(shè)計(jì)IL-2基因在戒毒應(yīng)用中的測(cè)試方法，從而能采用IL-2蛋白、pcDNA3質(zhì)粒-脂質(zhì)體或腺病毒載體介導(dǎo)IL-2基因轉(zhuǎn)移至蛛網(wǎng)膜下腔，達(dá)到控制嗎啡戒斷癥狀，使IL-2的戒毒功能達(dá)到臨床應(yīng)用的目的。
本發(fā)明提供了一種白細(xì)胞介素-2及其基因在戒毒應(yīng)用中的測(cè)試方法，該方法包括下列步驟(1)真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-IL-2的構(gòu)建人IL-2基因經(jīng)EcoR I和Xho I酶切得到有EcoR I和Xho I接頭的全長(zhǎng)含信號(hào)肽的人IL-2 cDNA(462bp)克隆入經(jīng)相同酶切的pcDNA3載體(Invitrogen)。IL-2基因在CMV啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109擴(kuò)增，堿裂解法制備質(zhì)粒，聚乙二醇沉淀法純化。通過測(cè)定260nm的光吸收來確定質(zhì)粒濃度，注射時(shí)質(zhì)粒稀釋于含5％葡萄糖的磷酸緩沖液(PB)中；(2)重組腺病毒Ad5-IL-2的構(gòu)建人IL-2基因經(jīng)EcoR I和Xho I酶切得到有EcoR I和Xho I接頭的全長(zhǎng)含信號(hào)肽的人IL-2 cDNA(462bp)克隆入經(jīng)相同酶切的pCA13載體(Microbix)。得到pCA13-IL-2，此時(shí)IL-2基因在CMV啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，pCA13-IL-2與腺病毒基因組質(zhì)粒pBHG10(Microbix)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，進(jìn)行同源重組，篩選重組腺病毒，擴(kuò)增純化腺病毒，注射時(shí)病毒稀釋于含5％蔗糖的PBS中；(3)嗎啡依賴(成癮)小鼠模型的建立以劑量遞增法形成嗎啡依賴小鼠模型(此組小鼠為嗎啡依賴組)。嗎啡依賴小鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1可激發(fā)戒斷癥狀，此組小鼠為嗎啡戒斷組；(4)嗎啡依賴大鼠模型的建立以劑量遞增法形成嗎啡依賴大鼠模型(此組大鼠為嗎啡依賴組)。嗎啡依賴大鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1可激發(fā)戒斷癥狀，此組大鼠為嗎啡戒斷組；(5)IL-2蛋白及pcDNA3質(zhì)粒介導(dǎo)IL-2基因抑制小鼠嗎啡戒斷癥狀測(cè)試方法的建立用劑量遞增法建立的嗎啡成癮小鼠模型，在末次給嗎啡3小時(shí)后將成癮的小鼠隨機(jī)分為8組，每組10只。蛋白治療組經(jīng)第5與第6腰椎之間(蛛網(wǎng)膜下腔)分別注射5×103，1×104，2×104，4×104，8×104IU IL-2蛋白，對(duì)照組為含5％葡萄糖的0.01M磷酸緩沖液(PB)。IL-2基因治療組8μg pcDNA3/8μg lipofectamine(對(duì)照組，提前24小時(shí)注射)，8μg pcDNA3-IL-2/8μg lipofectamine(基因治療組，提前24小時(shí)注射)。注射總體積為10μl。注射后5分鐘，各組小鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)戒斷癥狀，觀察小鼠開始跳躍的潛伏期、15分鐘內(nèi)小鼠出現(xiàn)的跳躍次數(shù)及30分鐘內(nèi)小鼠的體重變化；(6)IL-2蛋白抑制大鼠嗎啡戒斷癥狀測(cè)試方法的建立用劑量遞增法建立的嗎啡成癮大鼠模型，在末次給嗎啡3小時(shí)后，將成癮的大鼠隨機(jī)分為4組，每組5-11只，經(jīng)第5與第6腰椎之間插入導(dǎo)管鞘內(nèi)(蛛網(wǎng)膜下腔)分別注射2×104，4×104，1.4×105IU IL-2蛋白，對(duì)照組為含5％葡萄糖的PB，注射總體積為30μl。注射后5分鐘，各組大鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)戒斷癥狀，觀察大鼠的各種戒斷癥狀，如濕狗樣抖動(dòng)、異常姿勢(shì)、激惹、咬牙、腹瀉、流涎、體重減少，并計(jì)算戒斷癥狀總評(píng)分值；(7)腺病毒載體介導(dǎo)IL-2基因抑制小鼠嗎啡戒斷癥狀測(cè)試方法的建立大鼠經(jīng)第5與第6腰椎之間插入導(dǎo)管鞘內(nèi)(蛛網(wǎng)膜下腔)分別注射含5％蔗糖的PBS，1×107pfu腺病毒5型(Ad5)，1×107pfuAd5-IL-2。注射總體積為10μl。注射后一周測(cè)定腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)的戒斷癥狀，觀察小鼠開始跳躍的潛伏期、15分鐘內(nèi)小鼠出現(xiàn)的跳躍次數(shù)及30分鐘內(nèi)小鼠的體重變化；(8)成癮性試驗(yàn)a.小鼠豎尾試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為六組，每組10只，分別腹腔注射嗎啡20mg.kg-1(陽(yáng)性對(duì)照)，腹腔注射含5％葡萄糖的PB(陰性對(duì)照)，腹腔注射IL-2蛋白1×105IU或1×106IU，及蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2蛋白1×104IU或1×105IU。觀察給藥后2小時(shí)內(nèi)小鼠有無出現(xiàn)S形豎尾反應(yīng)；b.小鼠跳躍反應(yīng)試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為三組，每組10只，分別皮下注射含5％葡萄糖的PB(陰性對(duì)照組)或嗎啡(陽(yáng)性對(duì)照組)，腹腔注射IL-2蛋白，第一天注射5次(9:00、10:00、11:00、13:00、15:00)，第二天注射2次(9:00、11:00)。嗎啡組小鼠起始劑量為2.5mg.kg-1，此后按5，10，20，30，40，50mg.kg-1劑量遞增；IL-2蛋白組劑量為1×104，2×104，4×104，8×104，1.6×105，3.2×105and6.4×105IU。于最后一次給藥后2小時(shí)，腹腔注射納洛酮10mg.kg-1，觀察10分鐘內(nèi)小鼠跳躍反應(yīng)次數(shù)；(9)統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析。
本發(fā)明的方法研究結(jié)果(1)蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2蛋白抑制小鼠嗎啡戒斷癥狀蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2蛋白(1×104IU)可明顯延長(zhǎng)小鼠開始跳躍的潛伏期(p＜0.01)，并明顯抑制小鼠出現(xiàn)的跳躍次數(shù)(p＜0.01)，其效果呈劑量依賴性；IL-2蛋白(2×104IU)可明顯抑制小鼠的體重減少(p＜0.05)(圖1，A、B、C)。
(2)蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2基因(pcDNA3-IL-2)抑制小鼠嗎啡戒斷癥狀8μgpcDNA3-IL-2/8μglipofectamine可明顯抑制小鼠的體重變化(p＜0.05)，并可延長(zhǎng)小鼠開始跳躍的潛伏期(p＜0.01)和抑制小鼠出現(xiàn)的跳躍次數(shù)(p＜0.01)(圖1，A、B、C)。
(3)蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2蛋白抑制大鼠嗎啡戒斷癥狀蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2蛋白可明顯抑制大鼠的戒斷癥狀總分值(p＜0.05)，包括異常姿勢(shì)、激惹、腹瀉、流涎、體重減少；對(duì)濕狗樣抖動(dòng)、咬牙的評(píng)分值有減少的傾向，但無統(tǒng)計(jì)意義?？偟慕Y(jié)果表明，IL-2蛋白也可明顯抑制大鼠大部分的嗎啡戒斷癥狀。
(4)IL-2蛋白無成癮性a.小鼠豎尾試驗(yàn)嗎啡組小鼠均出現(xiàn)S形豎尾反應(yīng)，興奮跑動(dòng)，而IL-2蛋白組小鼠無豎尾反應(yīng)，活動(dòng)正常。
b.小鼠跳躍反應(yīng)試驗(yàn)IL-2蛋白組(0.9±0.5)與對(duì)照組(0.4±0.3)比較相近，與嗎啡組(14.1±1.6)比較則有非常顯著的差異(p＜0.01)。
表1.蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2蛋白對(duì)大鼠嗎啡戒斷癥狀的影響形成嗎啡依賴大鼠模型后，經(jīng)第5與第6腰椎之間插入導(dǎo)管鞘內(nèi)(蛛網(wǎng)膜下腔)分別注射2×104，4×104，1.4×105IU IL-2蛋白，對(duì)照組(vehicle)為含5％葡萄糖的PB，注射總體積為30μl。注射后5分鐘，各組大鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)戒斷癥狀，觀察大鼠的各種戒斷癥狀，如濕狗樣抖動(dòng)、異常姿勢(shì)、激惹、咬牙、腹瀉、流涎、體重減少，并計(jì)算戒斷癥狀總評(píng)分值。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義定為*P＜0.05(與vehicle比較)。
表1IL-2劑量 2.0×104IU4.0×104IU 1.4×105IUvehicle動(dòng)物數(shù)5 5 5 11運(yùn)動(dòng)性癥候分值濕狗樣抖動(dòng) 1.60±0.75 0.80±0.49 0±0 1.27±0.49異常姿勢(shì)6.40±1.60 6.80±0.49 5.6±0.75*8.00±0流涎1.20±0.49 0±0*0.4±0.4*1.82±0.12咬牙0.20±0.20 0.10±0.10 0.0±0 0.27±0.10非運(yùn)動(dòng)性癥候分值腹瀉5.60±0.98 3.20±1.50*2.4±1.6*7.27±0.49激惹1.60±1.60 0.8±0.49*0.4±0.4*3.54±0.68體重減少10.00±1.58 6.00±1.00*7.00±1.22*11.82±1.02總評(píng)分值26.60±3.01*17.70±1.74*15.8±3.43*33.95±1.06表2.小鼠注射7次IL-2蛋白(腹腔)或嗎啡(皮下)后，腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)的小鼠跳躍小鼠分別皮下注射含5％葡萄糖的PB(陰性對(duì)照組)或嗎啡(陽(yáng)性對(duì)照組)，腹腔注射IL-2蛋白，第一天注射5次(9:00、10:00、11:00、13:00、15:00)，第二天注射2次(9:00、11:00)。嗎啡組小鼠起始劑量為2.5mg.kg-1，此后按5，10，20，30，40，50mg.kg-1劑量遞增；IL-2蛋白組劑量為1×104，2×104，4×104，8×104，1.6×105，3.2×105及6.4×105IU。于最后一次給藥后2小時(shí)，腹腔注射納洛酮10mg.kg-1，觀察10分鐘內(nèi)小鼠跳躍反應(yīng)次數(shù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義定為*P＜0.05(與嗎啡組比較)。
表2藥物及給藥途徑 跳躍次數(shù)(跳躍的小鼠/總數(shù))
含5％葡萄糖的PB(皮下注射)0.4±0.3*(2/10)嗎啡(皮下注射) 14.1±1.6(10/10)IL-2蛋白(腹腔注射) 0.9±0.5*(3/10)
圖1(A、B、C)蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2蛋白及pcDNA3-IL-2基因?qū)π∈髥岱冉鋽喟Y狀的影響形成嗎啡依賴小鼠模型后，經(jīng)第5與第6腰椎之間(蛛網(wǎng)膜下腔)分別注射5×103、1×104，2×104、4×104、8×104IU IL-2蛋白，對(duì)照組(vehicle)為含5％葡萄糖的PB，n＝9-18；基因治療組為8μg pcDNA3-IL-2/8μg lipofectamine(提前24小時(shí)注射)，其對(duì)照組為8μg pcDNA3/8μg lipofectamine(提前24小時(shí)注射)，n＝10。注射總體積為10μl。注射后5分鐘，各組小鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)戒斷癥狀，分別統(tǒng)計(jì)各組小鼠開始跳躍的潛伏期(秒)(圖1A)及15分鐘內(nèi)小鼠出現(xiàn)的跳躍次數(shù)(圖1B)及30分鐘內(nèi)小鼠體重變化(克)(圖1C)，圖中橫坐標(biāo)為蛛網(wǎng)膜下腔注射的IL-2濃度，縱坐標(biāo)分別為潛伏期(秒)(圖1A)、跳躍次數(shù)(圖1B)和體重變化(克)(圖1C)，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義定為*P＜0.05，**P＜0.01(與vehicle比較)；#P＜0.05，##P＜0.01(與8μg pcDNA3/8μg lipofectamine比較)。
注1.對(duì)照組(vehicle)2.5×103IU IL-2蛋白3.1×104IU IL-2蛋白4.2×104IU IL-2蛋白5.4×104IU IL-2蛋白6.8×104IU IL-2蛋白7.8μg pcDNA3-IL-2/8μg lipofectamine8.8μg pcDNA3/8μg lipofectamine通過本發(fā)明的測(cè)試方法結(jié)果表明蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2蛋白具有較好的戒毒作用，其效果呈劑量依賴性。其特點(diǎn)是本身沒有成癮性，且能同時(shí)增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，這對(duì)免疫力低下的吸毒者來說是很有益的，不成癮，又能增強(qiáng)免疫功能，乃目前任何治療方法所無法做到的。pcDNA3-IL-2基因也有一定的戒毒作用，其效果比高劑量IL-2蛋白差，可能是由于IL-2蛋白的瞬時(shí)分泌量較低。但另一方面，由于pcDNA3-IL-2表達(dá)IL-2蛋白可持續(xù)6天(比注射的IL-2蛋白的半衰期延長(zhǎng)約300倍)，對(duì)整個(gè)戒毒過程來說是很方便、經(jīng)濟(jì)的。通過對(duì)pcDNA3-IL-2基因?qū)霔l件的進(jìn)一步優(yōu)化，其戒毒效果可望更好，更適合實(shí)際應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式(1)真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-IL-2的構(gòu)建人IL-2基因經(jīng)EcoR I和Xho I酶切得到有EcoR I和Xho I接頭的全長(zhǎng)含信號(hào)肽的人IL-2 cDNA(462bp)克隆入經(jīng)相同酶切的pcDNA3載體(Invitrogen)。IL-2基因在CMV啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109擴(kuò)增，堿裂解法制備質(zhì)粒，聚乙二醇沉淀法純化。通過測(cè)定260nm的光吸收來確定質(zhì)粒濃度。注射時(shí)質(zhì)粒稀釋于含5％葡萄糖的磷酸緩沖液(PB)中。
(2)重組腺病毒Ad5-IL-2的構(gòu)建人IL-2基因經(jīng)EcoR I和Xho I酶切得到有EcoR I和Xho I接頭的全長(zhǎng)含信號(hào)肽的人IL-2 cDNA(462bp)克隆入經(jīng)相同酶切的pCA13載體(Microbix)。得到pCA13-IL-2，此時(shí)IL-2基因在CMV啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，pCA13-IL-2與腺病毒基因組質(zhì)粒pBHG10(Microbix)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，進(jìn)行同源重組，篩選重組腺病毒。擴(kuò)增純化腺病毒，注射時(shí)病毒稀釋于含5％蔗糖的PBS中。
(3)嗎啡依賴小鼠模型的建立以劑量遞增法形成嗎啡依賴小鼠模型(此組小鼠為嗎啡依賴組)。嗎啡依賴小鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1可激發(fā)戒斷癥狀，此組小鼠為嗎啡戒斷組。
(4)嗎啡依賴大鼠模型的建立以劑量遞增法形成嗎啡依賴大鼠模型(此組大鼠為嗎啡依賴組)。嗎啡依賴大鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1可激發(fā)戒斷癥狀，此組大鼠為嗎啡戒斷組。
(5)IL-2蛋白及pcDNA3質(zhì)粒介導(dǎo)IL-2基因抑制小鼠嗎啡戒斷癥狀測(cè)試方法的建立用劑量遞增法建立的嗎啡成癮小鼠模型，在末次給嗎啡3小時(shí)后，將成癮的小鼠隨機(jī)分為8組，每組10只。蛋白治療組經(jīng)第5與第6腰椎之間(蛛網(wǎng)膜下腔)分別注射5×103，1×104，2×104，4×104，8×104IU IL-2蛋白，對(duì)照組為含5％葡萄糖的0.01M磷酸緩沖液(PB)。IL-2基因治療組8μg pcDNA3/8μg lipofectamine(對(duì)照組，提前24小時(shí)注射)，8μgpcDNA3-IL-2/8μg lipofectamine(基因治療組，提前24小時(shí)注射)。注射總體積為10μl。注射后5分鐘，各組小鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)戒斷癥狀，觀察小鼠開始跳躍的潛伏期、15分鐘內(nèi)小鼠出現(xiàn)的跳躍次數(shù)及30分鐘內(nèi)小鼠的體重變化。
(6)IL-2蛋白抑制大鼠嗎啡戒斷癥狀測(cè)試方法的建立用劑量遞增法建立的嗎啡成癮大鼠模型，在末次給嗎啡3小時(shí)后，將成癮的大鼠隨機(jī)分為4組，每組5-11只，經(jīng)第5與第6腰椎之間插入導(dǎo)管鞘內(nèi)(蛛網(wǎng)膜下腔)分別注射2×104，4×104，1.4×105IU IL-2蛋白，對(duì)照組為含5％葡萄糖的PB，注射總體積為30μl。注射后5分鐘，各組大鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)戒斷癥狀，觀察大鼠的各種戒斷癥狀，如濕狗樣抖動(dòng)、異常姿勢(shì)、激惹、咬牙、腹瀉、流涎、體重減少，并計(jì)算戒斷癥狀總評(píng)分值。
(7)腺病毒載體介導(dǎo)IL-2基因抑制小鼠嗎啡戒斷癥狀測(cè)試方法的建立大鼠經(jīng)第5與第6腰椎之間插入導(dǎo)管鞘內(nèi)(蛛網(wǎng)膜下腔)分別注射含5％蔗糖的PBS，1×107pfu腺病毒5型(Ad5)，1×107pfuAd5-IL-2。注射總體積為10μl.注射后一周測(cè)定腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)的戒斷癥狀，觀察小鼠開始跳躍的潛伏期、15分鐘內(nèi)小鼠出現(xiàn)的跳躍次數(shù)及30分鐘內(nèi)小鼠的體重變化。
(8)成癮性試驗(yàn)a.小鼠豎尾試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為六組，每組10只，分別腹腔注射嗎啡20mg.kg-1(陽(yáng)性對(duì)照)，腹腔注射含5％葡萄糖的PB(陰性對(duì)照)，腹腔注射IL-2蛋白1×105IU或1×106IU，及蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2蛋白1×104IU或1×105IU。觀察給藥后2小時(shí)內(nèi)小鼠有無出現(xiàn)S形豎尾反應(yīng)。
b.小鼠跳躍反應(yīng)試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為三組，每組10只，分別皮下注射含5％葡萄糖的PB(陰性對(duì)照組)或嗎啡(陽(yáng)性對(duì)照組)，腹腔注射IL-2蛋白，第一天注射5次(9:00、10:00、11:00、13:00、15:00)，第二天注射2次(9:00、11:00)。嗎啡組小鼠起始劑量為2.5mg.kg-1，此后按5，10，20，30，40，50mg.kg-1劑量遞增；IL-2蛋白組劑量為1×104，2×104，4×104，8×104，1.6×105，3.2×105and6.4×105IU。于最后一次給藥后2小時(shí)，腹腔注射納洛酮10mg.kg-1，觀察10分鐘內(nèi)小鼠跳躍反應(yīng)次數(shù)。
(9)統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析。
權(quán)利要求
1.白細(xì)胞介素-2 IL-2及其基因在戒毒應(yīng)用中的測(cè)試方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-IL-2的構(gòu)建人IL-2基因經(jīng)EcoR I和Xho I酶切得到有EcoR I和Xho I接頭的全長(zhǎng)含信號(hào)肽的人IL-2 cDNA 462bp克隆入經(jīng)相同酶切的pcDNA3載體Invitrogen，IL-2基因在CMV啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109擴(kuò)增，堿裂解法制備質(zhì)粒，聚乙二醇沉淀法純化，通過測(cè)定260nm的光吸收來確定質(zhì)粒濃度，注射時(shí)質(zhì)粒稀釋于含5％葡萄糖的磷酸緩沖液中；(2)重組腺病毒Ad5-IL-2的構(gòu)建人IL-2基因經(jīng)EcoR I和Xho I酶切得到有EcoR I和Xho I接頭的全長(zhǎng)含信號(hào)肽的人IL-2 cDNA 462bp克隆入經(jīng)相同酶切的pCA13載體Microbix，得到pCA13-IL-2，此時(shí)IL-2基因在CMV啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，pCA13-IL-2與腺病毒基因組質(zhì)粒pBHG10 Microbix共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，進(jìn)行同源重組，篩選重組腺病毒，擴(kuò)增純化腺病毒，注射時(shí)病毒稀釋于含5％蔗糖的PBS中；(3)嗎啡依賴小鼠模型的建立以劑量遞增法形成嗎啡依賴小鼠模型，此組小鼠為嗎啡依賴組，嗎啡依賴小鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1可激發(fā)戒斷癥狀，此組小鼠為嗎啡戒斷組；(4)嗎啡依賴大鼠模型的建立以劑量遞增法形成嗎啡依賴大鼠模型，此組大鼠為嗎啡依賴組，嗎啡依賴大鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1可激發(fā)戒斷癥狀，此組大鼠為嗎啡戒斷組；(5)IL-2蛋白及pcDNA3質(zhì)粒介導(dǎo)IL-2基因抑制小鼠嗎啡戒斷癥狀測(cè)試方法的建立用劑量遞增法建立的嗎啡成癮小鼠模型，在末次給嗎啡3小時(shí)后，將成癮的小鼠隨機(jī)分為8組，每組10只，蛋白治療組經(jīng)第5與第6腰椎之間，蛛網(wǎng)膜下腔， 分別注射5×103，1×104，2×104，4×104，8×104IU IL-2蛋白，對(duì)照組為含5％葡萄糖的0.01M磷酸緩沖液，IL-2基因治療組8μg pcDNA3/8μg lipofectamine，對(duì)照組，提前24小時(shí)注射，8μg pcDNA3-IL-2/8μg lipofectamine，基因治療組，提前24小時(shí)注射，注射總體積為10μl，注射后5分鐘，各組小鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)戒斷癥狀，觀察小鼠開始跳躍的潛伏期、15分鐘內(nèi)小鼠出現(xiàn)的跳躍次數(shù)及30分鐘內(nèi)小鼠的體重變化；(6)IL-2蛋白抑制大鼠嗎啡戒斷癥狀測(cè)試方法的建立用劑量遞增法建立的嗎啡成癮大鼠模型，在末次給嗎啡3小時(shí)后，將成癮的大鼠隨機(jī)分為4組，每組5-11只，經(jīng)第5與第6腰椎之間插入導(dǎo)管鞘內(nèi)，蛛網(wǎng)膜下腔，分別注射2×104，4×104，1.4×105IU IL-2蛋白，對(duì)照組為含5％葡萄糖的PB，注射總體積為30μl，注射后5分鐘，各組大鼠腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)戒斷癥狀，觀察大鼠的各種戒斷癥狀，如濕狗樣抖動(dòng)、異常姿勢(shì)、激惹、咬牙、腹瀉、流涎、體重減少，并計(jì)算戒斷癥狀總評(píng)分值；(7)腺病毒載體介導(dǎo)IL-2基因抑制小鼠嗎啡戒斷癥狀測(cè)試方法的建立大鼠經(jīng)第5與第6腰椎之間插入導(dǎo)管鞘內(nèi)，蛛網(wǎng)膜下腔，分別注射含5％蔗糖的PBS，1×107pfu腺病毒5型Ad5，1×107pfuAd5-IL-2。注射總體積為10μl。注射后一周測(cè)定腹腔注射納洛酮4mg.kg-1激發(fā)的戒斷癥狀，觀察小鼠開始跳躍的潛伏期、15分鐘內(nèi)小鼠出現(xiàn)的跳躍次數(shù)及30分鐘內(nèi)小鼠的體重變化；(8)成癮性試驗(yàn)a.小鼠豎尾試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為六組，每組10只，分別腹腔注射嗎啡20mg.kg-1陽(yáng)性對(duì)照，腹腔注射含5％葡萄糖的PB陰性對(duì)照，腹腔注射IL-2蛋白1×105IU或1×106IU，及蛛網(wǎng)膜下腔注射IL-2蛋白1×104IU或1×105IU，觀察給藥后2小時(shí)內(nèi)小鼠有無出現(xiàn)S形豎尾反應(yīng)；b.小鼠跳躍反應(yīng)試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為三組，每組10只，分別皮下注射含5％葡萄糖的PB陰性對(duì)照組或嗎啡陽(yáng)性對(duì)照組，腹腔注射IL-2蛋白，第一天注射5次，9:00、10:00、11:00、13:00、15:00，第二天注射2次9:00、11:00，嗎啡組小鼠起始劑量為2.5mg.kg-1，此后按5，10，20，30，40，50mg.kg-1劑量遞增；IL-2蛋白組劑量為1×104，2×104，4×104，8×104，1.6×105，3.2×105and 6.4×105IU，于最后一次給藥后2小時(shí)，腹腔注射納洛酮10mg.kg-1，觀察10分鐘內(nèi)小鼠跳躍反應(yīng)次數(shù)；(9)統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白細(xì)胞介素-2及其基因在戒毒應(yīng)用中的測(cè)試方法，其特征在于其中采用的給藥途徑為蛛網(wǎng)膜下腔給藥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白細(xì)胞介素-2及其基因在戒毒應(yīng)用中的測(cè)試方法，其特征在于IL-2及pcDNA3-IL-2或Ad5-IL-2在蛛網(wǎng)膜下腔表達(dá)的IL-2蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白細(xì)胞介素-2及其基因在戒毒應(yīng)用中的測(cè)試方法，其特征在于其中所述的成癮類型為阿片類物質(zhì)成癮。
全文摘要
本發(fā)明屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了一種白細(xì)胞介素－2(IL－2)及其基因在戒毒應(yīng)用中的測(cè)試方法。通過本發(fā)明的方法表明蛛網(wǎng)膜下腔注射IL－2蛋白有較好的戒毒作用，其效果呈劑量依賴性。pcDNA3－IL－2基因也有一定的戒毒作用，通過對(duì)該基因?qū)霔l件的進(jìn)一步優(yōu)化，其戒毒效果可望更好，更適合實(shí)際實(shí)用。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1508265SQ02155058
公開日2004年6月30日 申請(qǐng)日期2002年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月20日
發(fā)明者劉新恒, 顧錦法, 王晉慧, 姚明忠 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院