專利名稱：玫瑰花提取物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然植物地提取，特別是玫瑰花提取物，該提取物具有天然抗氧化活性，可以制成抗氧化劑，用于防治疾病，提高機(jī)體免疫力，以及作為延年益壽的保健品。
背景技術(shù)：
從目前研究結(jié)果來看，氧自由基不僅與衰老有關(guān)，而且與人類大部分常見的主要疾病均有關(guān)，從人類死亡率最高的心腦血管疾病到人類最可怕的癌癥以及艾滋病，無一不和自由基有著密切的關(guān)系。通過防止自由基產(chǎn)生及清除已有自由基而達(dá)到防病治病的目的。目前人工合成的抗氧化劑，具有一定的毒性和誘變性，再使用上受到很大程度的限制，所以國內(nèi)外研究人員正在從植物中尋找安全，有效的天然抗氧化劑。如茶葉中茶多酚，甘草中三萜類，黃酮類；銀杏葉提取物主要為黃酮類，萜類等。但從玫瑰花中提取抗氧化活性物質(zhì)至今未見報(bào)導(dǎo)。
玫瑰花(Rosa rugosa Thunb)，又名徘徊花、筆頭花、湖花、刺玫花等，主要產(chǎn)于江蘇、浙江、福建、山東、四川和河北。玫瑰花目前應(yīng)用較多的方面只是用玫瑰花原料本身，常作為一種組合物的成分，用于美容護(hù)發(fā)等，如玫瑰花超級洗發(fā)寶，天然色素口紅及一種治療痤瘡和毛囊炎的藥物組合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種玫瑰花提取物及其應(yīng)用，該提取物包括多糖類，蛋白類和有機(jī)酸類，該提取物具有天然抗氧化活性，可以制成抗氧化劑，用于防治疾病，提高機(jī)體免疫力，以及作為延年益壽的保健品。并且可以用于天然保健品開發(fā)，該植物資源豐富，提取容易，安全無毒。
本發(fā)明總有效成分占提取物總量的30％，其中主要包括含多糖84.74％，蛋白8.57％，沒食子酸衍生物6.69％。
本發(fā)明具體提取方法包括如下步驟
1)干燥的玫瑰花切碎，水浸泡，回流煮沸2～4小時(shí)，提取物傾出，冷卻后離心，上清冷凍干燥，即得干粉。
2)取50mg干粉溶于適量醋酸銨緩沖液中(10mM，pH4.5)，上樣于陽離子交換纖維素層析柱(CM-32)，然后用分別為10mM pH4.5，200mM pH4.5，400mM pH8.0的醋酸銨緩沖液依次洗脫。
3)經(jīng)分離得到的活性物質(zhì)上樣于層析柱(Sephadex G-75)，用磷酸鹽緩沖液(50mM，pH7.0)洗脫收集，冷凍干燥。
本發(fā)明提取物(F21)包括多糖類，蛋白類，以及有機(jī)酸類，總有效成分占提取物總量的30％。其中小分子有機(jī)酸類抗氧化作用活性最強(qiáng)。
本發(fā)明玫瑰花提取物不僅對機(jī)體紅細(xì)胞溶血有顯著抑制作用和對組織脂質(zhì)過氧化有很強(qiáng)的抑制作用外，而且具有高效清除超氧陰離子的活性，是一種高效抗氧化劑。通過防止機(jī)體的自由基產(chǎn)生和凈化產(chǎn)生的自由基，提高機(jī)體抗病能力，預(yù)防與自由基有關(guān)的各種疾病的發(fā)生達(dá)到延緩衰老的作用。
本發(fā)明具有抗氧化活性的特點(diǎn)，可以制成抗氧化劑，用于防治疾病，提高機(jī)體免疫力，以及作為延年益壽的保健品。并且可以用于天然保健品開發(fā)，該植物資源豐富，提取容易，安全無毒。


圖1是F21經(jīng)CM-32陽離子交換纖維素柱層析的洗脫曲線。
圖2是F3純化產(chǎn)物經(jīng)HPLC純度鑒定。
圖3是F21及Vc抑制SAM鼠體外紅細(xì)胞溶血曲線。
圖4是F21及BHA體外抑制SAM鼠腦勻漿脂質(zhì)過氧化作用曲線。
圖5是F21及BHA體外抑制SAM鼠腎勻漿脂質(zhì)過氧化作用曲線。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
玫瑰花提取物(F21)制備與純化
采集于福建產(chǎn)的植物玫瑰花，將干燥的植物花切碎，水浸泡，回流煮沸2小時(shí)，提取物傾出，冷卻后離心，上清冷凍干燥，即得干粉(使用LGJ0.5冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠制造)。
取50mg干粉溶于適量醋酸銨緩沖液中(10mM，pH4.5)，上樣于CM-32陽離子交換纖維素層析柱，然后用分別為10mM pH4.5，200mM pH4.5，400mM pH8.0的醋酸銨緩沖液依次洗脫，自動分步收集，測定各管抗氧化活性。
經(jīng)分離得到的活性物質(zhì)上樣于Sephadex G-75層析柱，用磷酸鹽緩沖液(50mM，pH7.0)洗脫收集，冷凍干燥。
提取物成分確定
F21經(jīng)過上述CM-32陽離子交換纖維素柱分離出3種活性成份F1、F2、F3，經(jīng)Sephdex G-75層析柱將F1純化出F1-a和F1-b兩種成份，其中F1-a為活性成份。F21中活性成份F1-a，F(xiàn)2和F3洗脫曲線見附圖1，三種活性成份的得率見表1。
表1F21活性成份純化結(jié)果
組分性狀 得率(％)
F1-a 乳白色，粉狀 5.0
F2 黃色，粘狀 20.0
F3 乳白色，粉狀 4.0
經(jīng)多糖含量測定(蒽酮比色法)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2主要成分為多糖，糖含量高達(dá)84.74％，F(xiàn)1-a含有少量多糖。對活性成份進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定(改良Lowry法)，使用上海分析儀器總廠生產(chǎn)的752紫外光柵分光光度計(jì)。測定結(jié)果表明F1-a含有少量蛋白，占8.57％，F(xiàn)2及F3中皆不含蛋白。結(jié)果見表2。
表2F21，F(xiàn)1-a，F(xiàn)2，F(xiàn)3中多糖及蛋白含量測定
組分蛋白含量(干重)(％)糖含量(干重)(％)
F2112.51 32.79
F1-a 8.57 23.12
F2 0 84.74
F3 0 0
經(jīng)高效液相色譜法(HPLC)鑒定純度。使用島津LC-A4 HPLC儀，采用C18反相液-液相色譜法，測得結(jié)果F1-a為糖蛋白復(fù)合物，不是單一成份，F(xiàn)2以多糖為主，也含有少量其他成份。F3為單一峰，是單一成份，見附圖2，而且在三種抗氧化活性成分中，活性最高。對F3進(jìn)一步用核磁共振技術(shù)(UNITY plus-400型超導(dǎo)NMR譜儀，美國Varian公司)，付里葉變換紅外光譜測定技術(shù)(FTIR)進(jìn)行分析(Magna-560型付里葉變換紅外光譜儀，美國)，而且結(jié)合紫外吸收光譜法(儀器DU-7紫外分光光度計(jì)，美國Beckman)和元素分析技術(shù)(元素分析儀，美國)進(jìn)行綜合解析，確定F3抗氧化活性成份為沒食子酸衍生物。
3.玫瑰花提取物抗氧化活性測定結(jié)果見附圖3，4，5。
4.為了更好的理解本發(fā)明，下面用動物實(shí)驗(yàn)來說明玫瑰花提取物活性成份在小鼠體內(nèi)的抗氧化效果及對小鼠延緩衰老的作用，來說明本發(fā)明的特點(diǎn)。
機(jī)體在正常的生理?xiàng)l件下，自由基的產(chǎn)生與消除處于動態(tài)平衡，這是因?yàn)榇嬖谥宄杂苫拿复俜磻?yīng)和非酶促反應(yīng)的防御系統(tǒng)。如果防御系統(tǒng)功能下降，體內(nèi)產(chǎn)生自由基的水平會隨之增高，很容易與其他物質(zhì)生成新的自由基，而且往往以連鎖方式進(jìn)行下去，對組織造成嚴(yán)重?fù)p傷，破壞細(xì)胞內(nèi)各種生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本發(fā)明將F21提取物作用于小鼠體內(nèi)第一，通過提高內(nèi)源性抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px等)的活性，消除并防止自由基的產(chǎn)生；第二，該提取物本身所含有的抗氧化成份直接清除體內(nèi)已有自由基代謝產(chǎn)物(過氧化脂質(zhì)LPO或丙二醛MDA)，減少自由基對各種抗氧化酶的滅活作用，維持機(jī)體生理平衡，使機(jī)體免受損害，起到防病和延緩衰老的效果。
本發(fā)明玫瑰花提取物抗氧化活性的測定方法如下
1.細(xì)胞水平測定采用紅細(xì)胞溶血測定法。
給藥小鼠摘眼球取血，制備10％紅細(xì)胞懸液，加入等體積自由基引發(fā)劑2，2-偶氮-雙-(2-脒基丙烷)氯化二氫(AAPH)，引起紅細(xì)胞膜磷脂發(fā)生過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，釋放出血紅蛋白，于540nm測定上清液的吸光值，按下式計(jì)算抑制率
抑制率(％)＝(1-A/B)×100％
APBS(磷酸鹽緩沖液)反應(yīng)管吸光值B完全溶血吸光值
2.組織水平測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法。
將小鼠的肝組織勻漿后加入TBA，100℃加熱15分鐘，不飽和脂肪酸過氧化產(chǎn)物之一丙二醛產(chǎn)生，丙二醛與TBA反應(yīng)產(chǎn)生紅色物質(zhì)，在535nm處測定光吸收，抗氧化活性按下式計(jì)算
抑制率(％)＝(A-A1)/A×100％
A對照吸光值，A1試樣體系吸光值
3.組織中SOD酶(超氧化物岐化酶)活性測定采用亞硝酸鹽法
黃嘌呤氧化酶(XO)與其底物次黃嘌呤或黃嘌呤反應(yīng)產(chǎn)生O2-·，與羥胺反應(yīng)生成NO2-·，在酸性條件下繼而與對氧基苯磺酸和N-萘二氨基乙烯發(fā)生顯色反應(yīng)生成紅色產(chǎn)物，SOD酶抑制該反應(yīng)。由抑制的程度確定SOD酶活力。通過波長550nm處比色，計(jì)算酶活力。
4.全血CAT酶(過氧化氫酶)活性測定采用紫外速率直接法
CAT酶可分解H2O2生成H2O和O2，H2O2在240nm處有吸收峰，測定反應(yīng)中H2O2在一定時(shí)間內(nèi)吸光度降低來表示CAT活性。取小鼠新鮮血20μl與5ml蒸餾水中，制成1∶250溶血液，即為待測樣品。將溶血液與H2O2混合后在240nm處測定吸光值的變化。
計(jì)算公式
a250×15 b全血Hb濃度(g/L)
5.谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性測定采用DTNB直接法
GSH-Px可特異性地催化GSH與過氧化物的氧化還原反應(yīng)，以單位時(shí)間內(nèi)GSH減少的量來表示GSH-Px的活力。在一定條件下GSH與DTNB(5，5’-二硫代對硝基苯甲酸)反應(yīng)生成淺黃色5’-硫代-2-硝基苯甲酸陰離子，在423nm處有最大吸收。
取小鼠全血10μl加入1ml雙蒸水中，制成1∶100溶血液，即為待測樣品，將樣品與GSH混合后加入H2O2，反應(yīng)3分鐘，然后加入NaOH調(diào)pH6.5，再加入DTNB顯色劑，通過測定各管吸光度來測定酶活性。
計(jì)算公式全血＝[GSH]非酶管-[GSH]樣品管+[GSH]試劑空白管/3×4μl
通過以上方法對三批給藥和對照組小鼠進(jìn)行抗氧化活性測定。測定結(jié)果見表3
表38月齡小鼠給藥后抗氧化活性測定結(jié)果
通過以上結(jié)果表明，玫瑰花提取物對機(jī)體具有提高各種抗氧化酶的活性，是一種有效的抗氧化劑。
實(shí)施例2.
選擇SAM鼠(天津防病中心提供)雄性、8月齡為實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行分組，給藥組6只，對照組6只，玫瑰花提取物(F21)加水配成適當(dāng)水溶液，通過灌胃的方式給藥30天，給藥劑量80mg/kg·bw，對照組給以相等劑量的生理鹽水，每日一次，第31天各組小鼠同時(shí)取肝組織制備10％肝組織勻漿液(w/v)，冷凍離心后取上層清液待用。將此上清液進(jìn)行100倍體積稀釋，獲得0.1％的組織液。總SOD活力測定的方法如下
試劑測定管(ml) 對照管(ml)
PBS1.01.0
組織勻漿上清液 0.03
蒸餾水 0.50.5+0.03
次黃嘌呤(HX) 0.10.1
羥胺(HA) 0.10.1
黃嘌呤氧化酶 0.10.1
(XO)
用漩渦混勻器充分混勻，置37℃恒溫水浴40分鐘
顯色劑 2 2
混勻，10分鐘后倒入1cm光徑比色杯中，蒸餾水調(diào)零，波長550nm處比色。
定義每毫克組織蛋白在1ml反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50％時(shí)所對應(yīng)的SOD量為一個(gè)亞硝酸鹽單位(NU/mg.prot)。經(jīng)計(jì)算，給藥組6只鼠的SOD酶活力平均值為739.69NU/mg.prot。對照組6只鼠的SOD酶活力平均值為624.89 NU/mg.prot，給藥后平均提高114.80 NU/mg.prot。
實(shí)施例3
小鼠的選擇、分組、給藥及給藥時(shí)間與實(shí)施例2中相同。給藥30天之后的實(shí)驗(yàn)小鼠，斷頸處死，取肝組織，制成10％肝勻漿液，離心后取上清液1ml，加入無水乙醇10μl，冰浴30分鐘，加入10％TritonX-100 110μl，冰浴5分鐘。將樣品稀釋200倍加入反應(yīng)體系，測定管加入酶液2ml，10mM的PBS 1ml混勻，在240nm處測定30秒吸光值的變化，計(jì)算CAT酶活力。
給藥組6只鼠的CAT酶活力平均為491.01K/g.Hb，對照組6只鼠的CAT酶活力平均為361.20K/g.Hb，給藥組比對照組CAT平均酶活力高129.81K/g.Hb。
實(shí)施例4
小鼠壽命實(shí)驗(yàn)
選擇SAM鼠10只，均為雄性，有關(guān)資料記載SAM鼠平均壽命為333天，將試驗(yàn)鼠分為兩組，為給藥組5只，對照組5只，給藥濃度80mg/kg·bw，每日一次以口服形式。給藥時(shí)間從小鼠10月齡開始(270天之后)一直到小鼠自然死亡為止。見表4。
表4小鼠壽命時(shí)間(天)
組別 1號2號3號4號5號平均
對照組324326334382340341
給藥組352406405397410394
以上結(jié)果表明，選用SAM鼠作動物實(shí)驗(yàn)，在小鼠9個(gè)月之后通過口服玫瑰花提取物，可使小鼠壽命由對照組平均341天延長到平均壽命為394天，給藥組比對照組平均壽命增加53天。
權(quán)利要求
1、一種玫瑰花提取物，其特征在于該提取物總有效成分占提取物總量的30％，其中主要包括含多糖84.74％，蛋白8.57％，沒食子酸衍生物6.69％。
2、權(quán)利要求1所述的玫瑰花提取物的提取方法，其特征在于包括下述步驟
1)干燥的玫瑰花切碎，水浸泡，回流煮沸2～4小時(shí)，提取物傾出，冷卻后離心，上清冷凍干燥，即得干粉；
2)取干粉溶于10mM，pH4.5的醋酸銨緩沖液中，上樣于陽離子交換纖維素層析柱，然后用分別為10mM pH4.5，200mM pH4.5，400mM pH8.0的醋酸銨緩沖液依次洗脫；
3)經(jīng)分離得到的活性物質(zhì)上樣于層析柱，用50mM，pH7.0的磷酸鹽緩沖液洗脫收集，冷凍干燥。
3、權(quán)利要求1所述的玫瑰花提取物用于抗氧化劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及天然植物的提取，特別是玫瑰花提取物。天然植物玫瑰花(Rosa rugosaThunb)提取物總有效成分占提取物總量的30％，其中主要包括含多糖84.74％，蛋白8.57％，沒食子酸衍生物6.69％。該提取物可以抑制紅細(xì)胞溶血100％，20μg/ml抑制組織脂質(zhì)過氧化90％以上，而且還具有提高各種抗氧化酶活性作用。本發(fā)明的植物資源豐富，提取容易，安全無毒，可制成抗氧化劑，用于防治疾病，提高機(jī)體免疫力，以及作為延年益壽的保健品。
文檔編號A61P39/06GK1410111SQ0214610
公開日2003年4月16日 申請日期2002年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月31日
發(fā)明者劉方, 牛淑敏, 吳子斌 申請人:南開大學(xué)