專利名稱：食管癌相關(guān)基因-2及其編碼蛋白質(zhì)的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食管癌相關(guān)基因領(lǐng)域，特別涉及食管癌相關(guān)基因-2(ECRG-2)的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及含有所述的多核苷酸序列的重組載體以及含有該載體的大腸桿菌。本發(fā)明進(jìn)一步涉及食管癌相關(guān)基因-2核苷酸序列編碼蛋白的用途。用該ECRG-2多核苷酸序列轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯下降，凋亡增加。
背景技術(shù)：
腫瘤是威脅人類健康的重要疾病之一。食管癌是其中常見的惡性腫瘤，全世界食管癌的50％是發(fā)生在中國(guó)。近年來(lái)，有許多關(guān)于食管癌的研究，但是在食管癌中的癌基因與抑癌基因中未發(fā)現(xiàn)與食管癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因(Shih Hsin Lu.Alterations of oncogenes and tumorsuppressor genes in esophageal cancer in China.MutationResearch 2000，467，343-353)。
其中我國(guó)的林縣是食管癌高發(fā)地區(qū)，有許多食管癌高發(fā)家族，據(jù)分析可能有很多因素，例如飲食習(xí)慣、特定地理?xiàng)l件等，但食管癌的發(fā)病是否與特定基因的表達(dá)有關(guān)，這一直是研究的熱點(diǎn)。本發(fā)明以食管癌高發(fā)家族作為基點(diǎn)，利用差異顯示聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Differencedisplay-polymer chain reaction，DD-PCR)方法，從高發(fā)家族食管癌組織中分離出四條差異表達(dá)序列標(biāo)記片斷(Expressed sequence tag，EST)，其中一條是食管癌相關(guān)基因-2。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供食管癌相關(guān)基因-2的多核苷酸序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供食管癌相關(guān)基因-2多核苷酸序列編碼蛋白質(zhì)在抑制腫瘤生長(zhǎng)中的用途。
為了完成上述目的，本發(fā)明涉及一種分離的多核苷酸，它選自
a)包含SEQ NO1的多核苷酸；b)一種在嚴(yán)緊條件下與SEQ NO1序列或其片斷雜交的多核苷酸序列；本發(fā)明涉及含有SEQ NO1的多核苷酸的重組質(zhì)粒。
所述的重組質(zhì)粒優(yōu)選為PGEX-4T-1-ECRG-2質(zhì)粒。
本發(fā)明涉及所述的重組載體的大腸桿菌。
所述的大腸桿菌優(yōu)選為BL21菌株。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述的多核苷酸序列在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)藥物中的用途。
所述的腫瘤優(yōu)選為食管癌。
所述的腫瘤細(xì)胞優(yōu)選為Bel7402細(xì)胞。


圖1為ECRG-2基因組結(jié)構(gòu)。
圖2顯示輻射染色體定位法的ECRG-2基因在染色體上的定位。
圖3顯示ECRG-2基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)。
圖4顯示ECRG-2基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)形式。
圖5顯示ECRG-2對(duì)Bel7402細(xì)胞增殖的影響。
圖6顯示ECRG-2對(duì)細(xì)胞周期的作用。
圖6A顯示未轉(zhuǎn)染的Bel7402細(xì)胞的流式細(xì)胞儀圖譜。
圖6B顯示轉(zhuǎn)染空載體的Bel7402細(xì)胞的流式細(xì)胞儀圖譜。
圖6C顯示轉(zhuǎn)染ECRG-2的Bel7402細(xì)胞的流式細(xì)胞儀圖譜。
圖7顯示ECRG-2對(duì)細(xì)胞凋亡的作用。
圖7A顯示對(duì)照細(xì)胞無(wú)凋亡小體。
圖7B顯示轉(zhuǎn)染ECRG-2后凋亡小體增多。
具體實(shí)施例方式
以下將結(jié)合附圖和實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。但是實(shí)施例并非限制本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，僅僅是對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行說(shuō)明，以便于本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明。
本發(fā)明人用試驗(yàn)結(jié)果展示了本發(fā)明ECRG-2基因的分離、鑒定、表達(dá)及其抑制腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)的用途。
ECRG-2基因來(lái)源1.ECRG-2基因的克隆我們選取林縣食管癌高發(fā)家族的三例食管癌組織與正常食管上皮組織，提取RNA，進(jìn)行差異顯示(Difference Display，DD)-PCR(DD-PCR)，分離出4條差異EST片段，其中ECRG-2片段長(zhǎng)度為183bp.以183bp的ECRG-2 EST序列為基礎(chǔ)，利用RACE技術(shù)(采用Clontech公司的SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit并按手冊(cè)操作)從正常的食管組織中克隆了ECRG-2基因的全長(zhǎng)cDNA。
2.ECRG-2基因的鑒定1).經(jīng)測(cè)序鑒定ECRG-2基因的cDNA全長(zhǎng)為569bp，含有258bp的閱讀框架，編碼85個(gè)氨基酸。其序列如SEQ NO1所示。5’-端cDNA翻譯起始密碼的上游有同框終止密碼子。3’-端有典型加尾信號(hào)AATAAA序列和poly A尾。
2).Northern blot檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致。
ECRG-2基因在各種腫瘤中的分布我們將ECRG-2在食管、肝臟、結(jié)腸和肺的腫瘤組織及其鄰近組織中的表達(dá)作了比較，結(jié)果如表1所示。
表1表達(dá)組織樣品數(shù) 陽(yáng)性表達(dá)(％)陰性表達(dá)(％)食管正常上皮7 7(100％)0鄰近組織33 17(65％)16(35％)腫瘤組織51 14(21％)12(55％)肝臟鄰近組織22 11(50％)11(50％)腫瘤組織22 10(45％)10(45％)結(jié)腸鄰近組織17 4(24％) 13(76％)
腫瘤組織184(22％) 13(78％)肺鄰近組織9 5(55％) 4(45％)腫瘤組織9 4(44％) 5(55)ECRG-2基因組的研究1).ECRG-2基因組的結(jié)構(gòu)ECRG-2基因組的全長(zhǎng)為3540bp，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成(圖1)。
2).ECRG-2基因組突變的研究(A).在第四外顯子中發(fā)現(xiàn)(TCA)3和(TCA)4兩種基因型多態(tài)，其中(TCA)3基因型在食管癌及癌旁組織中明顯增多，(TCA)3基因型的人群可能易患食管癌。
STR的TCA基因型在腫瘤醫(yī)院病人中的分布頻率正常對(duì)照(％)病例(％)比值比(95％可信度)TCA4/TCA433(15.2)19(12.6)1.00(referent)TCA3/TCA4118(54.1) 66(44.0)1.03(0.52-2.04)TCA3/TCA367(30.7)65(43.4)0.59(0.29-1.21)Total 218(100)150(100)STR的TCA基因型在林縣病人中的分布頻率正常對(duì)照(％)病例(％)比值比(95％可信度)TCA4/TCA421(17.9)2(5.6) 1.00(referent)TCA3/TCA457(48.8)17(44.8)3.13(0.61-29.98)TCA3/TCA339(33.3)19(50.0)5.12(0.99-48.7)Total 117(100)38(100)(B).在第二外顯子發(fā)現(xiàn)一例SNP。
(C).在第一外顯子發(fā)現(xiàn)一例突變。
ECRG-2基因cDNA的研究(1)ECRG-2基因的cDNA全長(zhǎng)已克隆為569bp。開放閱讀框258bp。編碼蛋白質(zhì)含有85氨基酸，分子量約9.32KD。在GenBank/protein和dbEST檢索，未發(fā)現(xiàn)與ECRG-1基因序列相似的基因，因此，ECRG-2基因是新基因。(序列見前)(2)用輻射染色體定位法，將ECRG-2基因定位在染色體5q32-33(圖2)。
(3)ECRG-2基因在正常食管上皮表達(dá)，而在食管癌組織中表達(dá)明顯下降?？赡転橐灰职┗颉?br> (4)ECRG-2基因在原核細(xì)胞中表達(dá)(圖3)。
(5)ECRG-2基因和其編碼蛋白質(zhì)能抑制食管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖4)。
(6)用流式細(xì)胞儀研究ECRG-2基因?qū)?xì)胞周期的作用，結(jié)果表明ECRG-2基因有促進(jìn)食管癌細(xì)胞的凋亡(圖5、6)。
實(shí)施例1ECRG-2基因的來(lái)源與提取純化一mRNA差異顯示法(一)組織標(biāo)本細(xì)胞總RNA(TotalRNA)的提取1.參考“異硫氰酸胍一步提取法”(《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》盧圣棟主編中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，139-141)，具體步驟有修改。
取0.3g凍存組織標(biāo)本，在液氮存在條件下于研缽中研成粉末，轉(zhuǎn)入含3ml溶液D(4M異硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉pH7.0，0.5％十二烷基肌氨酸鈉，100mM 2-巰基乙醇)的勻漿器中勻漿(冰浴中操作)，勻漿液轉(zhuǎn)入10ml離心管，按順序加入0.3ml 2M乙酸鈉pH4.0；3ml水飽和酚；0.6ml氦仿-異戊醇(49∶1)，加蓋后立即強(qiáng)烈振蕩10秒鐘，置冰浴中15分鐘，再以4℃，10000g離心20分鐘，回收水相，加入等體積的酚-氯仿，振蕩10秒鐘，置冰浴中10分鐘。4℃，10000g離心20分鐘，回收水相，加入等體積的氯仿，振蕩10秒鐘，置冰浴中5分鐘，4℃，10000g離心20分鐘?；厥账?，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，放入-20℃沉淀1小時(shí)。4℃，10000g離心20分鐘，棄上清，用75％乙醇洗沉淀和管壁，4℃，10000g離心10分鐘。重復(fù)一次，抽真空干燥沉淀后，溶于適量的DEPC處理水中。
2.RNA的定量及電泳鑒定取10ulRNA溶液加590ul水，混勻后用UV-240型紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定OD260、OD280和OD230，OD260/OD280比值約為1.8。
RNA樣本用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定。
(二)mRNA差異顯示1.逆轉(zhuǎn)錄分別將5例標(biāo)本的總RNA與三種3’錨定引物組合，逆轉(zhuǎn)錄出cDNA首鏈，共15管，分為3組，每支0.5ml離心管中分別加入5ul正常A、正常B、癌旁、癌A和癌B總RNA(ug/ul)及5ul的10uM的錨定引物A。于70℃變性10分鐘，立即置于冰水浴中，加入5ul逆轉(zhuǎn)錄體系(終濃度為1U/ul的RNasin(Promega，美國(guó))、10mM DTT、1×Buffer、200uM的dNTP和200U的SuperScript II(BRL)。于42℃溫浴1小時(shí)，90℃變性5分鐘，置冰水浴中3分鐘，每管加去離子水至終體積為100ul，防于-20℃冰箱儲(chǔ)存。
2.PCR擴(kuò)增取5支0.5ml離心管，按順序(正常A，正常B，癌旁，癌A，癌B)分別加入以錨定引物A起始的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μl，以此為一組，可另設(shè)一組為平行對(duì)照。分別加入18μl至終濃度為1×Taq酶Buffer、1.25mM MgCl2、20uM的dNTP、0.5uM的錨定引物A、0.5uM的隨機(jī)引物溶液、0.1U的Taq酶和0.25M的[α-32P]-dCTP，使最終PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為每管20μl。加入一滴石蠟油，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃ 2分鐘、42℃ 5分鐘和72℃ 5分鐘，共一個(gè)循環(huán)。然后94℃ 30秒、56℃ 40秒，72℃ 40秒，共40個(gè)循環(huán)。最后，72℃延伸5分鐘。
加入終止反應(yīng)緩沖液(95％甲酰胺，20mMEDTA，0.05％溴酚蘭，0.05％二甲苯蘭)10μl/管以終止反應(yīng)3.6％聚丙烯酰胺凝膠電泳及曝光參照《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》(盧圣棟主編 中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，85-88)介紹的方法操作，凝膠濃度為6％(丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺為19∶1，尿素濃度為7M)，用1×TBE電泳緩沖液預(yù)電泳2小時(shí)。PCR產(chǎn)物于94變性后取3μl上樣，恒定功率80W，電泳約7小時(shí)，使二甲苯蘭行至凝膠底部。電泳后用濾紙平貼于凝膠上并揭下凝膠，覆蓋保鮮膜后放入壓片盒中，加X光片，于-70℃冰箱曝光16-20小時(shí)，無(wú)需固定凝膠或加增感屏。注意壓片時(shí)應(yīng)把凝膠與X光片的相對(duì)位置固定，否則會(huì)在回收差異片段時(shí)引起偏差。
4.回收及擴(kuò)增差異片段洗片前用針、錐等物在凝膠和X光片上打孔，洗片后在X光片上找出差異條帶，把x光片和凝膠上的針孔對(duì)齊，在差異片段的相對(duì)位置切下凝膠條，放入0.5ml離心管中，加入50μl的PCR反應(yīng)液，PCR反應(yīng)條件為94℃ 5分鐘、然后，94℃ 40秒、56℃ 60秒和72℃ 60秒，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。
(三)PCR產(chǎn)物的克隆1.純化PCR產(chǎn)物按照WizardTMPCR DNA Purification System試劑盒(Promega公司，美國(guó))說(shuō)明書操作，純化完畢后用1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定純化效果。
2.連接反應(yīng)按照Promega公司的pGEM-T Vector System試劑盒說(shuō)明書操作，具體步驟有所改動(dòng)取T4DNA連接酶的10×緩沖液1μl，pGEM-T(50ng/μl)載體0.2μl，去離子水0.8μl，PCR純化產(chǎn)物7μl(對(duì)照加水)，T4DNA連接酶1μl(1WeissU/μl)，輕輕混勻，于15℃連接3小時(shí)。
3.制備感受態(tài)細(xì)菌按照《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》(盧圣棟主編 中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，292-293)介紹的氯化鈣方法操作。
4.轉(zhuǎn)化將10μl連接產(chǎn)物加入200μl感受態(tài)細(xì)菌中，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，置冰浴1小時(shí)。將管放到42℃水浴中熱休克90秒，然后迅速放回冰浴中，使細(xì)菌冷卻2分鐘。加1ml LB液體培養(yǎng)基，37℃，200rpm培養(yǎng)1小時(shí)。離心濃縮細(xì)菌，用適量的LB液體培養(yǎng)基重懸后，涂布到含有氨芐青霉素(Amp，100μg/ml)的LB瓊脂平板上，于37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。5.含重組質(zhì)粒的細(xì)菌的鑒定用常規(guī)PCR方法進(jìn)行鑒定。用無(wú)菌牙簽挑少許細(xì)菌接種到配好的20μl PCR反應(yīng)液中，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照(不加模板)及陽(yáng)性對(duì)照(加純化的PCR產(chǎn)物為模板)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件同上。
PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
(四)測(cè)序1.重組質(zhì)粒DNA的小量提取采用Promega公司的Wizard Plus Minipreps DNA PurificationSystem并按操作手冊(cè)提取質(zhì)粒DNA。用1％瓊脂糖電泳鑒定并測(cè)定OD260、OD280和OD230。
2.[γ-32P]-ATP末端標(biāo)記引物按照Pharmacia公司的Cycle Sequencing Kit使用說(shuō)明操作。3.測(cè)序反應(yīng)以“A”“C”“G”“T”分別標(biāo)記4套0.5ml離心管，并分別加入2μl對(duì)應(yīng)的反應(yīng)終止混合物(Termination Mix)；另取一0.5ml管加入下列試劑平均每管(μl) 終濃度H2O 9.85×Sequencing Buffer 5 1×dNTP Mix 5 16uM稀釋的重組質(zhì)粒模板 2 1μgTaq酶(5U/μl) 0.21U末端標(biāo)記的引物T7或SP6 3 3pmol總計(jì) 25μl輕輕混勻，稍離心后分別取5μl加至A、C、G、T管中，加1滴石蠟油，放于PCR儀(PE公司480型)中，94℃ 2分鐘，然后，94℃ 30秒、58℃ 40秒、72℃ 60秒，共35個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸5分鐘。反應(yīng)完成后加入反應(yīng)終止液(Stop Solution)3μl/管，混勻。4.測(cè)序凝膠電泳及放射自顯影凝膠濃度為6％(丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺為19∶1，尿素濃度為7M)，用1×TBE電泳緩沖液預(yù)電泳2小時(shí)，PCR測(cè)序產(chǎn)物于94℃變性后取3μl上樣，恒定功率80W，電泳約5小時(shí)，使溴酚蘭行至凝膠底部，電泳后用濾紙平貼于凝膠上并揭下凝膠，覆蓋保鮮膜后放入壓片盒中，加X光片，于-70℃冰箱曝光16-20小時(shí)，無(wú)需固定凝膠或加增感屏，顯影后讀序。
(五)同源性比較把測(cè)序結(jié)果輸入計(jì)算機(jī)，通過(guò)Internet電腦網(wǎng)絡(luò)與美國(guó)國(guó)立醫(yī)學(xué)圖書館的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較(http∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)。
二、差異片段的鑒定(一)逆轉(zhuǎn)錄PCR鑒定1.設(shè)計(jì)引物根據(jù)測(cè)序結(jié)果，在cDNA片段兩端設(shè)計(jì)一對(duì)引物。
2.總RNA的逆轉(zhuǎn)錄取5份凍存的、根據(jù)方法一提取的組織標(biāo)本(正常A、正常B、癌旁、癌A和癌B)總RNA，逆轉(zhuǎn)錄方法同方法一。
3.PCR分別加入18μl至終濃度為1×Taq酶Buffer、1.5mM MgCl2、40uM的dNTP、0.5μM的β-actin F和β-actin R、ECRG2 AF和ECRG2 AR以及0.1U/μl的Taq酶，使最終PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為每管20μl。加入一滴石蠟油，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃ 2分鐘、94℃30秒、56℃ 40秒，72℃ 40秒，共30個(gè)循環(huán)。最后，72℃延伸5分鐘。
PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其中β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物作為內(nèi)對(duì)照。
(二)Northern Blot鑒定1.RNA的1％甲醛凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜稱取2g瓊脂糖，加入170mlDEPC處理的水，加熱溶解.待瓊脂糖冷卻到55-60℃時(shí)加入20血預(yù)熱的10×MOPS緩沖液(0.2M MOPS pH7.0，80mM乙酸鈉，10mMEDTA pH8.0)及11ml預(yù)熱的甲醛(終濃度為0.66M)，混勻后在通風(fēng)櫥內(nèi)鋪膠(0.5-0.75cm厚)。取0.5ml DEPC處理的離心管加入下列試劑20μg總RNA、2μl 5×MOPS緩沖液3.5μl甲醛、10μl去離子甲酰胺，加水至20μl?；靹蚝笥?5℃變性15分鐘，迅速放入冰浴，加2μl 10×載樣緩沖液(50％甘油，1mMEDTApH8.0，0.4％溴酚蘭，0.4％二甲苯蘭)，混勻。甲醛凝膠預(yù)電泳(以1×MOPS為電泳緩沖液，5V/cm)5分鐘后加樣。4V/cm電壓條件下電泳約4小時(shí)，溴酚蘭泳至凝膠的80％處停止。
2.堿轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜按照Z(yǔ)eta-ProbeGT尼龍膜使用說(shuō)明書操作在水平容器中以濾紙搭橋，用玻璃棒趕凈氣泡。RNA凝膠用去離子水漂洗后放在濾紙中央，用玻璃棒趕凈氣泡。將去離子水浸透的Zeta-ProbeGT尼龍膜(膜四周邊緣均比凝膠寬2mm)平鋪于凝膠上，趕凈氣泡.鋪上兩張用50mM NaOH浸透的濾紙(比凝膠稍小)，趕凈氣泡。再在其上放置10cm厚的濾紙并壓以重約500g的重物。轉(zhuǎn)膜3-8小時(shí)，期間可更換濾紙一次，在剛轉(zhuǎn)好的膜上可以肉眼觀察到28s、18srRNA的位置，并做記錄.尼龍膜用2×SSC緩沖液漂洗2次，于空氣干燥后夾在兩層濾紙之間放入80℃烤箱內(nèi)烤干30分鐘備用。
3.不對(duì)稱PCR標(biāo)記探針在0.5ml離心管中加入下列試劑(以ECRG1為例)分別加入20μl至終濃度為1×Taq酶Buffer、1.5mM MgCl2、20uM的dNTP、0.5uM的引物T7、0.005uM的引物SP6、0.1U/μl的Taq酶和0.25M的[α-32P]-dCTP。加入一滴石蠟油，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃ 3分鐘、94℃ 30秒、56℃ 40秒，72℃ 40秒，共40個(gè)循環(huán)。最后，72℃延伸5分鐘。存于4℃。
4.預(yù)雜交及雜交反應(yīng)將轉(zhuǎn)有RNA的尼龍膜放入雜交盒，加20ml雜交液(0.25M Na2HPO4pH7.2，7％SDS，1mM EDTA)，于65℃預(yù)雜交3小時(shí)。倒出預(yù)雜交液，重新加入15ml雜交液并加入變性的探針，于65℃雜交20小時(shí)。倒掉雜交液，迅速加入100ml洗膜緩沖液I(40mM Na2HPO4pH7.2，5％SDS，1mM EDTA)，65℃振蕩洗膜60分鐘，重復(fù)一次。換洗膜緩沖液II(40mMNa2HPO4pH7.2，1％SDS，1mM EDTA)于65℃洗2次，每次60分鐘。最后用室溫的洗膜緩沖液II漂洗一次，使雜交膜溫度恢復(fù)到室溫，用保鮮膜包裹后放入壓片盒中加X光片及增感屏，-70℃放射自顯影。注意在每一步操作時(shí)都要使雜交膜保持濕潤(rùn)。
三、cDNA末端迅速擴(kuò)增(5’RACE，Rapid Amplification of cDNA Ends)按照BRL公司的5’RACE試劑盒說(shuō)明書操作。
實(shí)施例2ECRG2基因編碼的融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)PCR法獲得ECRG-2基因獲取編碼85個(gè)氨基酸的ECRG-2基因片段。PCR反應(yīng)管中加入下列試劑。
試劑 每管(ul)TAKARALATaq 0.25ul10×LA BUFFER(Mg2+Plus) 2.5uldNTP(2.5mM) 4ulDNA 1ulECRG-25’引物(10mM) 1ulECRG-23’引物(10mM) 1ulddH2O14.75ul計(jì)25ul放于PCR儀(PE公司2400型)中94℃變性4分種后，94℃變性30秒、59℃退火45秒、72℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 7分鐘，4℃保溫。
1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。
PCR產(chǎn)物的克隆與純化1.PCR產(chǎn)物、載體的限制性內(nèi)切酶酶切PCR產(chǎn)物經(jīng)酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，70％乙醇洗滌后干燥，溶于ddH2O中。先用EcolRI酶切3小時(shí)，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀。再用SalI酶切。pGEX-4T-1同樣用EcoRI，SalI酶切。
2.酶切產(chǎn)物的純化酶切產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠(TAE緩沖液配制)電泳分離后，在長(zhǎng)波紫外燈下用干凈的刀片快速切下目的條帶，置于1.5mlEP管中。用博大公司的DNA純化回收試劑盒純化加入適量的溶膠液(100ul凝膠加300ul溶膠液)，顛倒混勻至凝膠完全溶解。再加10ul玻璃奶，置于冰上10分鐘，期間輕輕混勻3-4次。12000轉(zhuǎn)離心20秒，棄上清。沉淀用洗滌液洗兩次。用洗脫緩沖液重懸沉淀，于65℃放置5分鐘。12000轉(zhuǎn)離心20秒回收純化的DNA片段，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定純化效果并定量。
3.連接反應(yīng)將純化的ECRG-2片段分別與pGEX-4T-1連接。連接體系如下pGEX-4T-1 1ulECRG-26ulT4DNA ligase 1ul5×Buffer 2ul總計(jì) 10ul12-14℃連接12小時(shí)以上。
4.感受態(tài)細(xì)菌按照<精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南>介紹的TSS Buffer一步法操作。挑取凍存的DH5α菌種接種于LB培養(yǎng)基平板，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑單個(gè)菌落，接種在5mlLB培養(yǎng)基中，于37℃，250RPM振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)接1ml過(guò)夜培養(yǎng)物入100mlLB液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)3小時(shí)使之進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600約為0.4-0.6)。4℃，4000rpm離心10分鐘回收細(xì)菌。去盡培養(yǎng)基，加入10ml預(yù)冷的1×TSS Buffer，重懸細(xì)菌。分裝成200ul/份，凍于-70℃?zhèn)溆谩?br> 5.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞取感受態(tài)細(xì)菌200ul，置冰上融化。將步驟2中的各種連接產(chǎn)物加入其中，輕輕混勻，冰浴30分鐘。再于42℃水浴中熱休克90秒，然后迅速放回冰浴中。加0.8mlLB液體培養(yǎng)基，37℃，200rpm培養(yǎng)1小時(shí)。離心濃縮細(xì)菌，用適量的LB液體培養(yǎng)基重懸后，涂布到含有氨芐青霉素(Amp，100ug/ml)的LB瓊脂平板上，于37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。
6.質(zhì)粒的提取與純化挑取步驟4平板上的單菌落接種于5mlLB培養(yǎng)基中(含100ug/mlAmp)，37℃，200rpm培養(yǎng)過(guò)夜。4℃，12000rpm，離心10秒收集菌體。棄上清，倒置于濾紙上使殘液流凈。加入200ul懸浮液完全重懸細(xì)菌，再加入200ul細(xì)胞裂解液，輕輕顛倒混勻，直至溶液變清。再加200ul中和液，顛倒混勻數(shù)次。12000rpm離心10分鐘，取上清加入1ml Resin中。將Wizard柱安裝在一次性注射器頭部，用針芯將Resin/DNA混合物推入Wizard柱。再用2ml洗液洗柱。將Wizard柱轉(zhuǎn)移到1.5mlEP管上，12000rpm離心2分鐘去盡殘余的洗液。再將Wizard柱轉(zhuǎn)移到一支新的EP管上，加50ul滅菌水，放置1分鐘。12000rpm離心20秒回收純化的質(zhì)粒。1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定純化效果。
7.重組質(zhì)粒的細(xì)菌的鑒定(1)PCR鑒定法取少許步驟5所得的純化質(zhì)粒作為模板，用特異性引物做PCR擴(kuò)增ECRG-2片段。產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳分析。
(2)酶切鑒定法取純化的質(zhì)粒10ul順序用EcoRI，SalI于37℃酶切，產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
序列測(cè)定含有經(jīng)鑒定為陽(yáng)性重組質(zhì)粒的細(xì)菌送公司自動(dòng)測(cè)序。
陽(yáng)性重組體轉(zhuǎn)化BL21菌株測(cè)序證實(shí)序列、讀碼框無(wú)誤的重組質(zhì)粒按前述的方法轉(zhuǎn)化BL21。重組ECRG-2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化1.表達(dá)GST-ECRG-2融合蛋白菌株的篩選。
挑取含PGEX-4T-1-ECRG-2質(zhì)粒的單菌落，接種入5ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。過(guò)夜培養(yǎng)物50ul轉(zhuǎn)入5ml新鮮的LB/Amp培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6。加IPTG至終濃度為1mM，繼續(xù)于37℃培養(yǎng)，分別于2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)留樣。以BL21空菌，pGEX-4T-1空載體以及未加IPTG誘導(dǎo)的pGEX-4T-1-ECRG2培養(yǎng)物作為陰性對(duì)照，12％的SDS-PAGE膠分析蛋白表達(dá)情況。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，有明顯的GST-ECRG2融合蛋白的表達(dá)，結(jié)果見圖3。
2.表達(dá)蛋白在細(xì)菌中存在形式的確定。
已鑒定可表達(dá)目的蛋白的菌株于37℃過(guò)夜培養(yǎng)，培養(yǎng)物按1∶100的比例接種入300ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6。加IPTG至終濃度為1mM。繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。收集菌體，重懸于1×PBS中，超聲波破碎(工作3秒，間歇3秒，共180次。功率為200W)。裂解物經(jīng)12000RPM離心10分鐘。上清與沉淀分別經(jīng)SDS-PAGE分析。
GST-ECRG2融合蛋白以包涵體形式表達(dá)。
3.親和層析法純化GST-ECRG-2谷胱甘肽瓊脂珠的準(zhǔn)備按所需的柱床體積的1.33倍取原液，裝入一層析柱中。以10倍體積的PBS洗滌備用。
誘導(dǎo)表達(dá)GST-ECRG-2菌液400ml，12000rpm，10分鐘離心收集菌體。PBS重懸后加PMSF至終濃度為1mM，超聲破碎后，1000rpm，10分鐘離心，上清過(guò)谷胱甘肽瓊脂珠柱。共過(guò)三次。再以10倍體積的PBS充分洗柱，再加與柱床體積相同的10mM還原性谷胱甘肽入柱中，保留10分鐘，收集流出液，共三次。洗脫物經(jīng)SDS-PAGE膠分析蛋白純化的情況。
實(shí)施例3ECRG2基因?qū)el7402細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞周期的影響重組體的構(gòu)建用特異性引物(ECRG-25’-引物TGG G GAT CCC ATG AAG ATC ACTGGG GGT CTC；3’-引物TCG AAT TCC TTA GCA ACT TCC ATC GTG AAG)做PCR擴(kuò)增ECRG-2基因，用ECORI、BamHI酶切后插入載體pcDNA3.1(+)。重組體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，酶切鑒定為陽(yáng)性重組體后送公司測(cè)序。
細(xì)胞培養(yǎng)Bel7402細(xì)胞株于含10％的新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5％的CO2，37℃的環(huán)境中培養(yǎng)。
轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)1.接種適量的Bel7402細(xì)胞于35mm皿中，待其長(zhǎng)到80％滿。稀釋2ug的pcDNA3.1(+)-ECRG2入100ul的無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基(A液)，再稀釋5ul的LIPOFECTAMINETM入100ul的無(wú)血清培養(yǎng)基(B液)，混合A、B液，室溫放置30分鐘。用無(wú)血清培養(yǎng)基洗Bel7402細(xì)胞三遍，加入2ml的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，再將混合好的A、B液加入其中。37℃，5％的CO2環(huán)境下放置8小時(shí)后換兩倍血清培養(yǎng)基，18-24小時(shí)后換正常培養(yǎng)基，72小時(shí)后按1∶10傳代于含G418的選擇性培養(yǎng)基內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2周以篩選陽(yáng)性克隆。
陽(yáng)性克隆的RT-PCR鑒定陽(yáng)性克隆細(xì)胞總RNA的提取用Gibico公司的Trizol試劑提取Hela細(xì)胞總RNA，具體操作見試劑說(shuō)明書，甲醛變性電泳分析RNA的完整性。
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在一微量離心管中加入下列試劑Bel7402細(xì)胞總RNA 6μl10mMdNTP 1μlOligo(dT)0.5μg/ml1μlDEPC處理H2O 2μl混勻，于65℃保溫5分鐘，置冰上。再加10×RT buffer 2μl25mM MgCL24μl0.1M DTT 2μlRnase抑制劑 1μl42℃保溫2分鐘。加入1μl SuperScript II RT，42℃，50分鐘。
70℃，15分鐘，立即置于冰上，加1μlRNase H，37℃，20分鐘。
以上述所得的cDNA作為模板，用特異性引物做PCR擴(kuò)增ECRG-2片段。產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳分析。
MTT試驗(yàn)將所篩得的陽(yáng)性克隆細(xì)胞濃度調(diào)至1×104/ml，每孔取100μl接種于96孔培養(yǎng)板，分別于24h，48h，72h，96h，120h進(jìn)行MTT測(cè)定，以Bel7402細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體Bel7402細(xì)胞為對(duì)照組，觀察ECRG2對(duì)Bel7402細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(見圖6A、B、C)。
與對(duì)照組相比，ECRG2明顯抑制Bel7402細(xì)胞的生長(zhǎng)。
凋亡試驗(yàn)將Bel7402細(xì)胞，轉(zhuǎn)染空載體的Bel7402細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-ECRG2的Bel7402細(xì)胞常規(guī)消化，收集細(xì)胞，PBS洗兩次，取適量細(xì)胞PI染色30分鐘后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
序列表<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所<120>食管癌相關(guān)基因-2及其編碼蛋白質(zhì)的用途<130><160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>258<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(1)..(258)<223><400>1atg aag atc act ggg ggt ctc ctt ctg ctc tgt aca gtg gtc tat ttc 48Met Lys Ile Thr Gly Gly Leu Leu Leu Leu Cys Thr Val Val Tyr Phe1 5 10 15tgt agc agc tca gaa gct gct agt ctg tct cca aaa aaa gtg gac tgc 96Cys Ser Ser Ser Glu Ala Ala Ser Leu Ser Pro Lys Lys Val Asp Cys20 25 30agc att tac aag aag tat cca gtg gtg gcc atc ccc tgc ccc atc aca 144Ser Ile Tyr Lys Lys Tyr Pro Val Val Ala Ile Pro Cys Pro Ile Thr35 40 45tac cta cca gtt tgt ggt tct gac tac atc acc tat ggg aat gaa tgt 192Tyr Leu Pro Val Cys Gly Ser Asp Tyr Ile Thr Tyr Gly Asn Glu Cys50 55 60cac ttg tgt acc gag agc ttg aaa agt aat gga aga gtt cag ttt ctt 240His Leu Cys Thr Glu Ser Leu Lys Ser Asn Gly Arg Val Gln Phe Leu65 70 75 80cac gat gga agt tgc taa258His Asp Gly Ser Cys85<210>2<211>85<212>PRT<213>人<400>2Met Lys Ile Thr Gly Gly Leu Leu Leu Leu Cys Thr Val Val Tyr Phe1 5 10 15Cys Ser Ser Ser Glu Ala Ala Ser Leu Ser Pro Lys Lys Val Asp Cys20 25 30Ser Ile Tyr Lys Lys Tyr Pro Val Val Ala Ile Pro Cys Pro Ile Thr35 40 45Tyr Leu Pro Val Cys Gly Ser Asp Tyr Ile Thr Tyr Gly Asn Glu Cys50 55 60His Leu Cys Thr Glu Ser Leu Lys Ser Asn Gly Arg Val Gln Phe Leu65 70 75 80His Asp Gly Ser Cys8權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，選自a)包含SEQ NO1的多核苷酸；b)一種在嚴(yán)緊條件下與SEQ NO1序列或其片斷雜交的多核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求1所述的多核苷酸的重組質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述的重組質(zhì)粒為PGEX-4T-1-ECRG-2質(zhì)粒。
4.含有權(quán)利要求2所述的重組載體的大腸桿菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的大腸桿菌，其特征在于它是BL21菌株。
6.權(quán)利要求1所述的多核苷酸序列在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)藥物中的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于所述的腫瘤為食管癌。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于所述的腫瘤細(xì)胞為Bel7402細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及食管癌相關(guān)基因領(lǐng)域，特別涉及食管癌相關(guān)基因－2(ECRG－2)的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及含有所述的多核苷酸序列的重組載體以及含有該載體的大腸桿菌。本發(fā)明進(jìn)一步涉及食管癌相關(guān)基因－2核苷酸序列編碼蛋白的用途。用該ECRG－2多核苷酸序列轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯下降，凋亡增加。
文檔編號(hào)A61K31/7088GK1483820SQ0214317
公開日2004年3月24日 申請(qǐng)日期2002年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月16日
發(fā)明者陸士新 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所