專利名稱：一種增強(qiáng)免疫力的藥物組合物及制備方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明屬生物制劑技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種增強(qiáng)對(duì)抗原特異的免度力的藥物組合物，制備方法和用途。
以乙型肝炎為例，乙型肝炎是人類所面臨的最大的病毒感染，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界帶乙肝病毒的病人高達(dá)3億多，接近世界人口的5％(Maynard et a1.InZuckerman AJ ed.Viral Hepatitis andLiver Diseases.New York，Alan R Liss Inc.，pp967-9699，1988)。乙型肝炎在東南亞地區(qū)尤其盛行，而中國(guó)就有一億多乙肝病毒長(zhǎng)期攜帶病人(Chen et al.J.Gastroenterol.Hepatol.15E3-E6，2000)，這些長(zhǎng)期病毒攜帶者，約25-40％的病人會(huì)死于肝硬化或肝癌等肝臟相關(guān)的疾病(Lok.B.J.Viral Hepatitis，1105-124，1994)。
乙型肝炎的控制，需要從疫苗預(yù)防和藥物治療兩個(gè)方面入手。乙肝疫苗經(jīng)過(guò)多年臨床應(yīng)用，已被證明可有效降低乙型肝炎的感染率。例如，經(jīng)過(guò)大規(guī)模接種，臺(tái)灣地區(qū)的六歲兒童乙肝長(zhǎng)期帶病毒人數(shù)比例已由1984年前的10％降低到1990年后的1％以下(Chen et al.J.Gastroenterol.Hepatol.15E3-E6，2000)。目前使用的乙肝疫苗，接種新生兒的保護(hù)效率幾乎可達(dá)到100％，但對(duì)于年齡較大的成人以及一些乙肝高危人群，如母親乙肝E抗原陽(yáng)性的新生兒，艾滋病毒陽(yáng)性，腎衰病人等，保護(hù)比例明顯不足(Hollinger.InFields et al.eds.Virology.New York，Raven Press Ltd.，pp2171-2234，1990；Andre&Path，Am.J.Med.，8714S-20S，1989；Bruguera et al.Am.J.Med.，8730S-35S，1989)。
此外，現(xiàn)行的乙肝疫苗需要注射三針后抗體滴度才能達(dá)到保護(hù)水平，這對(duì)于病人的醫(yī)從性以及大規(guī)模免疫均帶來(lái)不便，并不利于降低乙肝感染的風(fēng)險(xiǎn)，并增加了免疫成本。
因此，新一代的乙肝疫苗，如果能達(dá)到高效保護(hù)成人和高危人群的結(jié)果，或者能夠減少注射次數(shù)，將對(duì)控制乙型肝炎的傳播有著重要的意義。
雖然乙肝可以通過(guò)乙肝疫苗有效預(yù)防，乙型肝炎的治療目前仍面臨很多困難。得到美國(guó)食物藥品署批準(zhǔn)的治療乙型肝炎的藥物只有干擾素和拉米呋啶，在亞洲人群中，干擾素療法能夠清除表面抗原的病人不到5％(Lok et al.Gastroenterol.，1051833-1838，1993)，而清除e抗原的病人也只有15-20％(Lok et al.Gastroenterol.，1022091-2097，1992；Guan，J. Gastroenterol.Hepatol.，15E34-E40，2000)。最近進(jìn)入市場(chǎng)的長(zhǎng)效干擾素對(duì)于丙型肝炎的治療效果有明顯改善(Zeuzem et al.，New England J.Med.3431666-1672，2000)，但對(duì)于乙型肝炎的療效尚待確定。胸腺肽是治療乙型肝炎的另一種免疫療法，目前尚未得到FDA批準(zhǔn)，其有效率在25-40％之間(Lau，J.Gastroenterol.Hepatol.，15E46-E52，2000)。
拉米呋啶代表了能抑制病毒復(fù)制的核苷酸衍生物，這種治療方法雖然能夠?qū)⒀褐械牟《緮?shù)目大大減少，卻很難達(dá)到根除病毒的效果，且長(zhǎng)期使用會(huì)有耐藥性產(chǎn)生(Leung，J.Gastroenterol.Hepatol.，15E53-E60，2000)。
其他治療方法還包括中藥，但由于缺乏具有信服力的臨床數(shù)據(jù)，中藥對(duì)乙型肝炎的確切療效仍然不能肯定。
目前，科研界正在積極研究各種能夠激活對(duì)乙肝病毒特異的細(xì)胞免疫方法，這些方法包括DNA疫苗(Manini et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9312496-12501，1996)，短肽疫苗(Livingston et al.，J.Immunol.，1591383-1392，1997)，抗原抗體復(fù)合物(Wen et al.，Lancet，3451575-1576，1995，病毒載體(Sal lberg et al.，Hum.Gene Ther.，91719-1729，1998)，CPG寡核酸增強(qiáng)劑(Davis et al.，J.Immunol.，160870-876，1998)，疫苗佐劑(Weeratna et al.，Vaccine，181755-1762，2000)，能誘導(dǎo)CTL的抗原(Vitiello et al.，J.Clin.，Invest.，95341-349，1995)等， 這些方法有些在動(dòng)物模型中顯示出較好的效果，但仍需要進(jìn)行漫長(zhǎng)的臨床研究，以確認(rèn)這些方法的有效性和安全性。
卡介菌多糖核酸組份是中國(guó)科技工作者首先開發(fā)出的一種免疫調(diào)節(jié)劑，這種制劑具有能夠激活機(jī)體免疫力，特別是能夠?qū)?xì)胞免疫體系有較好的增強(qiáng)效果，因此被用來(lái)治療免疫低下所造成的感染等，并用來(lái)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的平衡，治療哮喘。此產(chǎn)品經(jīng)過(guò)臨床驗(yàn)證，被證明安全有效，在治療哮喘，老年性慢性支氣管炎，過(guò)敏和感冒等方面得到廣泛的臨床應(yīng)用(馬維勇等，醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，142-4，2001；金一平等，上海免疫學(xué)雜志，145-8，1994)。
本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)針對(duì)某種或某幾種特定抗原免疫力的藥物組合物，該組合物包含一種或幾種特定抗原與卡介菌多糖核酸的有效劑量，和藥物適用的稀釋劑，穩(wěn)定劑，輔劑或載體，其中卡介菌多糖核酸與特定抗原的有效質(zhì)量比例為1∶0.1到1∶10000之間的任何比例。
這些抗原可以是單個(gè)蛋白質(zhì)或多肽，如乙肝表面抗原，乙肝核心抗原，乙肝E抗原，艾滋病毒GPl60抗原，艾滋病毒GAG，乳頭瘤病毒E7抗原，丙肝NS抗原，乙肝短肽抗原，丙肝短肽抗原，艾滋病毒短肽抗原，乳頭瘤病毒短肽抗原等等，這些抗原可以包括但不局限于乙肝病毒的其他抗原，丙肝病毒抗原，艾滋病毒抗原，乳頭瘤病毒抗原，流感病毒抗原，皰疹病毒抗原等等，這些抗原可以是通過(guò)基因工程方法制備，也可以通過(guò)生物化學(xué)方法提取，或者通過(guò)化學(xué)方法合成。這些抗原可以是完整的抗原，也可以是片斷或短肽，可以是單個(gè)的抗原，也可以是任何數(shù)目的抗原的復(fù)合物。也可以是這些抗原中的兩個(gè)或多個(gè)的組合物，也可以是單個(gè)或多個(gè)抗原組成的高聚合物。
以上的抗原或抗原復(fù)合物與卡介菌多糖核酸按照一定比例進(jìn)行混合，這種比例可以是在1∶0.1到1∶10000(質(zhì)量比)范圍內(nèi)的任何比例，在混合過(guò)程中可加入傳統(tǒng)使用的鋁佐劑或其他佐劑，也可以不加任何佐劑。
卡介菌多糖核酸能夠激活機(jī)體免疫反應(yīng)，與特定抗原共同使用時(shí)可以產(chǎn)生或增強(qiáng)針對(duì)特定抗原的免疫反應(yīng)，包括抗體和細(xì)胞免疫.卡介菌多糖核酸的提取是從卡介菌(Mycobacterium bovis Calmette-Guerin bacillus，BCG)提取，但也可以從其他與卡介菌相關(guān)的細(xì)菌中提取。
如采用加熱滅活的結(jié)核桿菌(Mycobacteraium tuberculosis)在礦物油中即用來(lái)作為增強(qiáng)免疫力的佐劑，被稱為弗氏完全佐劑(Freund’s Complete Adjuvant).可以預(yù)計(jì)，從結(jié)核桿菌中提取的多糖核酸組份與卡介菌多糖核酸具有同樣的意義.
又比如，活的BCG，加熱滅活的BCG或者加熱滅活的短棒狀桿菌Propionibacerium parvum可以用來(lái)作膀胱灌注來(lái)治療膀胱癌，是目前最有效的方法之一，其機(jī)理便是激發(fā)了局部的免疫反應(yīng)，采用同一類細(xì)菌來(lái)提取多糖核酸組份，即可達(dá)到與卡介菌多糖核酸類似效果。
又例如，與卡介菌相關(guān)的紅色諾卡氏菌Norcardia rubra的細(xì)胞壁骨架或者卡介菌的細(xì)胞壁骨架可以激發(fā)免疫反應(yīng)，被應(yīng)用作為免疫治療的重要藥物，這類細(xì)胞壁骨架的主要組份包含多糖組份，可以達(dá)到卡介菌多糖核酸類似的效果。
因此，卡介菌多糖核酸的應(yīng)用也包括從這些相關(guān)的細(xì)菌提取的多糖核酸組份或細(xì)胞壁骨架組份，統(tǒng)稱為卡介菌多糖核酸類似物。
抗原和卡介菌多糖核酸混合后，以肌肉，皮下，腹腔或靜脈等常規(guī)用藥方法使用，在產(chǎn)生抗體反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)的觀察期內(nèi)，可以在血清中檢測(cè)到與特異抗原反應(yīng)的抗體，并可以檢測(cè)得到對(duì)抗原特異的能夠殺傷表達(dá)該抗原細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。
對(duì)某種或某幾種抗原達(dá)到一定程度的抗體反應(yīng)，在很多情況下，可以防止表達(dá)該種抗原的致病微生物所導(dǎo)致的疾病。如乙型肝炎病毒表面抗原的使用，可以作為疫苗誘導(dǎo)抗表面抗原的抗體產(chǎn)生，此抗體水平達(dá)到一定程度時(shí)，即可達(dá)到防止乙肝病毒對(duì)機(jī)體產(chǎn)生侵襲的危害。
對(duì)某種或某幾種抗原所形成的細(xì)胞免疫反應(yīng)，在很多情況下，可以使機(jī)體有效地防止受表達(dá)該種抗原的致病微生物感染，并可能在感染后將致病微生物從機(jī)體清除，因此有效誘導(dǎo)針對(duì)特異抗原的細(xì)胞免疫制劑，可用于預(yù)防被致病微生物感染，并治療已被感染的病人。
本發(fā)明將乙肝表明抗原與卡介菌多糖核酸組份共同使用以大幅度增加乙肝表面抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的能力，可使同樣劑量的乙肝表面抗原產(chǎn)生更強(qiáng)的抗體反應(yīng)，機(jī)體產(chǎn)生的針對(duì)乙肝表面抗原的抗體(表面抗體)可以通過(guò)商業(yè)化的酶聯(lián)或放免試劑盒進(jìn)行測(cè)定，也可以采用如在Antibody一書中所描述的方法測(cè)定抗體滴度，通過(guò)這些方法測(cè)定的抗體滴度結(jié)果表明，采用乙肝表面抗原與卡介菌多糖核酸混合免疫的表面抗體滴度要顯著高于常規(guī)的乙肝疫苗，這種新的藥物組份可對(duì)乙肝疫苗低應(yīng)答人群提供保護(hù)，或者在減少注射次數(shù)的前提下，即可達(dá)到保護(hù)水平的抗體反應(yīng)，以增加醫(yī)從性。
同時(shí)，本發(fā)明將乙肝表面抗原與卡介菌多糖核酸組份共同使用以激活對(duì)乙肝表面抗原特異的細(xì)胞免疫力可激活對(duì)乙肝表面抗原特異的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，為機(jī)體提供常規(guī)乙肝表面抗原疫苗所不能提供的細(xì)胞免疫保護(hù)機(jī)制，更可以作為治療手段，治療被乙肝病毒感染而成為長(zhǎng)期病毒攜帶者的病人。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的測(cè)定方法是在進(jìn)行免疫注射后設(shè)定時(shí)間，將小鼠殺死，取脾臟細(xì)胞，并按不同比例與表達(dá)表面抗原的靶細(xì)胞在二氧化碳培養(yǎng)箱共同培養(yǎng)一定時(shí)間后，計(jì)算或測(cè)定存活靶細(xì)胞的數(shù)目。存活靶細(xì)胞數(shù)目越少，則證明激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的免疫能力越強(qiáng)。常規(guī)乙肝疫苗已在動(dòng)物和臨床試驗(yàn)中證實(shí)基本不能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的形成，而經(jīng)過(guò)乙肝表面抗原與卡介菌多糖核酸混合物免疫的小鼠脾臟細(xì)胞可有效殺傷表達(dá)乙肝表面抗原的靶細(xì)胞，使共培養(yǎng)后的靶細(xì)胞存活率大大降低，證明了針對(duì)乙肝表面抗原細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的激活。
本發(fā)明所的藥物組合物，可以用來(lái)制備更為有效的新型疫苗，包括乙型肝炎疫苗，乳頭瘤病毒疫苗，艾滋病毒疫苗等，這種有效性體現(xiàn)在使用同樣的抗原劑量而產(chǎn)生更為強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)，或者減少免疫次數(shù)，依然達(dá)到能夠具保護(hù)水平的抗體水平，并能治療被微生物特別是被病毒感染的人群。很多被微生物感染的人群，包括乙型肝炎，結(jié)核桿菌，乳頭瘤病毒等，由于缺乏有效的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞免疫系統(tǒng)激活，而成為病菌長(zhǎng)期攜帶者，不僅危害自身健康，還繼續(xù)提供了疾病傳播的源泉。使用本發(fā)明所闡述的激活針對(duì)特異抗原的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞等細(xì)胞免疫體系的方法以及相應(yīng)的藥物組份，可以有效誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)某種微生物特異抗原的細(xì)胞免疫力，從而使機(jī)體有可能將已經(jīng)寄居在機(jī)體內(nèi)部的微生物清除，達(dá)到治療微生物感染的目的。
本發(fā)明的另一目的是提供了上述一種增強(qiáng)免疫力的藥物組合物的制備方法，該方法包括下列步驟(1)乙肝表面抗原疫苗的制備由基因工程乙肝表面抗原溶液制備乙肝表面抗原疫苗，該乙肝疫苗的成分為生理氯化鈉溶液，乙肝表面抗原5.9微克/毫升，鋁含量為0.35-0.62mg/ml；(2)卡介菌多糖核酸的制備由精制卡介菌多糖核酸用生理氯化鈉溶液溶解，360微克/毫升，121℃20分鐘滅菌，即為卡介菌多糖核酸溶液；(3)乙肝疫苗與卡介菌多糖核酸混合物制備將制備好的乙肝疫苗溶液于250g離心5分鐘，用連接了真空裝置的玻璃吸管盡量地除去上清液。加入上述的卡介菌多糖核酸溶液，使最終體積達(dá)到原乙肝疫苗溶液體積，混和后于2-8℃振蕩12小時(shí)，即為乙肝疫苗與卡介菌多糖核酸混合物，其成分為生理氯化鈉溶液，乙肝表面抗原5.9微克/毫升，鋁含量為0.35-0.62毫克/毫升，卡介菌多糖核酸324微克/毫升；將該混合物保存于2-8℃?zhèn)溆?，使用前搖勻。
本發(fā)明以乙肝表面抗原為實(shí)例，公開了將卡介菌多糖核酸或其類似物與特定抗原聯(lián)合使用，從而有效產(chǎn)生或增強(qiáng)針對(duì)特定抗原的體液(抗體)免疫力，并誘導(dǎo)產(chǎn)生或增強(qiáng)針對(duì)特定抗原的細(xì)胞免疫能力的方法以及相應(yīng)的藥物組合物和生產(chǎn)這種藥物組合物的方法。此方法可廣泛使用于需要增強(qiáng)抗體免疫能力或需要誘導(dǎo)細(xì)胞免疫力才能夠得到預(yù)防和治療的微生物感染。HSV，HIV，HCV，HBV，HPV，H.pylori；tumors，
2、佐劑的制備取250毫升磷酸緩沖鹽水(PBS)，置于磁力攪拌器上進(jìn)行攪拌，然后邊攪拌邊加入22.325克硫酸鉀鋁[KAl(SO4)2]，溶解后加入10.6克氫氧化鈉，待其溶解后，用1.0M氫氧化鈉水溶液將溶液的pH值調(diào)整至7.1。于室溫持續(xù)攪拌2小時(shí)，然后于2-8℃靜置沉降12小時(shí)。用連接了真空裝置的玻璃吸管盡量地除去上清液。加入生理氯化鈉溶液，使終體積為300毫升，于2-8℃攪拌2小時(shí)后，于2-8℃靜置沉降12小時(shí)。用連接了真空裝置的玻璃吸管盡量地除去上清液。加入生理氯化鈉溶液(0.15M NaCl)，使終體積為300毫升，于2-8℃攪拌2小時(shí)后，于2-8℃靜置沉降12小時(shí)。用連接了真空裝置的玻璃吸管盡量地除去上清液。加入生理氯化鈉溶液，使終體積為250毫升，于2-8℃攪拌30分鐘后，于121℃滅菌30分鐘，室溫冷卻后即為佐劑。將佐劑置于2-8℃保存，臨使用前搖勻，在層流凈化工作臺(tái)中取出需要使用的體積。該佐劑的鋁含量為0.35-0.62mg/ml，pH為5.5至7.0，實(shí)測(cè)pH值為6.7。
3、乙肝疫苗的配制和保存無(wú)菌操作，取60微克乙肝表面抗原(0.5毫升)和10.2毫升佐劑，混和后于2-8℃振蕩至少12小時(shí)。250g離心5分鐘，用連接了真空裝置的玻璃吸管盡量地除去上清液。加入12.0毫升經(jīng)121℃30分鐘滅菌的生理氯化鈉溶液(0.15M NaCl)，于2-8℃振蕩30分鐘，250g離心5分鐘，用連接了真空裝置的玻璃吸管盡量地除去上清液。加入12.0毫升經(jīng)121℃30分鐘滅菌的生理氯化鈉溶液(0.15M NaCl)，混和后于2-8℃振蕩30分鐘，250g離心5分鐘。用連接了真空裝置的玻璃吸管盡量地除去上清液。加入12.0毫升經(jīng)121℃30分鐘滅菌的生理氯化鈉溶液(0.15M NaCl)， 混和后于2-8℃振蕩30分鐘，250g離心5分鐘，用連接了真空裝置的玻璃吸管盡量地除去上清液。加入經(jīng)121℃30分鐘滅菌的生理氯化鈉溶液(0.15M NaCl)，使最終體積為10.2毫升，混和后于2-8℃振蕩30分鐘， 即為乙肝疫苗。該乙肝疫苗的成分為生理氯化鈉溶液，乙肝表面抗原5.9微克/毫升，鋁含量為0.35-0.62mg/ml。將該乙肝疫苗保存于2-8℃?zhèn)溆茫褂们皳u勻。實(shí)施例2乙肝表面抗原與卡介菌多糖核酸組份的混合物1、精制卡介菌多糖核酸的獲得、預(yù)處理和保存精制卡介菌多糖核酸由成都生物制品研究所提供，系按照《中國(guó)生物制品規(guī)程》用卡介菌經(jīng)熱酚法提取多糖、核酸并經(jīng)干燥得到，于25℃密封干燥保存。其多糖含量為76％，核酸含量為13％，蛋白質(zhì)含量0.1％。
在與乙肝疫苗混和之前，用生理氯化鈉溶液溶解精制卡介菌多糖核酸(360微克/毫升)，121℃20分鐘滅菌，即為卡介菌多糖核酸溶液。
2、乙肝疫苗與卡介菌多糖核酸混合物的制備與保存將在本發(fā)明實(shí)施例1中制備的乙肝疫苗3.0毫升于250g離心5分鐘，用連接了真空裝置的玻璃吸管盡量地除去上清液。加入本實(shí)施例步驟1中制備的卡介菌多糖核酸溶液，使最終體積為3.0毫升， 混和后于2-8℃振蕩12小時(shí)，即為乙肝疫苗與卡介菌多糖核酸混合物，其成分為生理氯化鈉溶液，乙肝表面抗原5.9微克/毫升，鋁含量為0.35-0.62毫克/毫升，卡介菌多糖核酸324微克/毫升。
將該混合物保存于2-8℃?zhèn)溆?，使用前搖勻。實(shí)施例3乙肝疫苗，乙肝疫苗和卡介菌多糖核酸組份混合物一次性免疫小鼠1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6-8周齡BALB/C小鼠(雌性70％，雄性30％)購(gòu)自HARLAN公司。
2、藥物及劑量(1)待測(cè)藥物為在本發(fā)明實(shí)施例2中制備的乙肝疫苗與卡介菌多糖核酸混合物，每劑含卡介菌多糖核酸55微克，乙肝表面抗原1微克，每劑體積170微升。
(2)陽(yáng)性對(duì)照為在本發(fā)明實(shí)施例1中制備的乙肝疫苗，每劑含乙肝表面抗原1微克，每劑體積170微升。
3、給藥取20只小鼠，按每組7只雌性、3只雄性隨機(jī)分成2組，一組命名為治療組，另一組命名為對(duì)照組。從眼眶內(nèi)取血100至200微升后，在治療組小鼠的后大腿肌內(nèi)注射一劑待測(cè)藥物，在對(duì)照組小鼠的后大腿肌內(nèi)注射一劑陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)施例4血樣的采集和抗體滴度測(cè)定1、采血方法與時(shí)間用肝素預(yù)處理過(guò)的毛細(xì)管(SUREPREP，BECTON-DICKINSON)，分別于給藥之前0日、給藥后3周、7周和12周時(shí)從治療組和對(duì)照組小鼠眼眶內(nèi)取血100至200微升，將血樣置于1.5毫升微離心管中。
2、血清的分離與保存將血樣于37℃溫育30分鐘后，于2-8℃靜置過(guò)夜。14000轉(zhuǎn)離心10分鐘后(EPPENDORF CENTRIFUGE 5415C)，取出血清，保存于2-8℃待測(cè)。
3、用ELISA法測(cè)定抗乙肝表面抗原抗體滴度本發(fā)明用終點(diǎn)稀釋度ELISA法檢測(cè)抗乙肝表面抗原抗體滴度。終點(diǎn)滴度的定義是在閾值為0.05時(shí)，光吸收值(OD 450)是未免疫血清光吸收值的2倍的最高血清稀釋度?？挂腋伪砻婵乖贵w滴度以組平均滴度±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。治療組與對(duì)照組之間抗體滴度差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性用Student t檢驗(yàn)確定。具體測(cè)定步驟如下(1)用磷酸緩沖鹽水(PBS)稀釋本發(fā)明實(shí)施例1中的乙肝表面抗原溶液，使乙肝表面抗原終濃度為1微克/毫升，以每孔100微升的量加入微滴定板(EIA/RIA 8 Well Strip Flat Bottom，CostarCat#2580)，于室溫以50RPM在搖床上過(guò)夜。
用含有0.02％吐溫20的磷酸緩沖鹽水(PBS)清洗各孔2次，甩干。加入200微升含有10％牛血清或3％牛血清白蛋白的磷酸緩沖鹽水，于室溫以50RPM在搖床上過(guò)夜。用含有0.02％吐溫20的磷酸緩沖鹽水(PBS)清洗各孔2次，甩干并立即用于本實(shí)施例步驟3(2)中。
(2)用含有3％牛血清白蛋白的磷酸緩沖鹽水稀釋治療組和對(duì)照組血清，可以采用倍比連續(xù)稀釋或1比10連續(xù)稀釋。將各個(gè)稀釋度的樣品各50微升加入本實(shí)施例步驟3(1)中的微滴定板孔中，記錄每孔中的樣品名稱和稀釋度，空白對(duì)照為含有3％牛血清白蛋白的磷酸緩沖鹽水。于室溫以50RPM在搖床上放置1小時(shí)。甩干，用含有0.02％吐溫20的磷酸緩沖鹽水(PBS)清洗各孔4次，甩干。每孔加入50微升綴聯(lián)了辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠抗體(已用含有0.02％吐溫20、10％牛血清或3％牛血清白蛋白的磷酸緩沖鹽水稀釋15000倍)。于室溫以50RPM在搖床上放置1小時(shí)。甩干，用含有0.02％吐溫20的磷酸緩沖鹽水(PBS)清洗各孔4次，甩干。每孔加入50微升TMB底物溶液(3，3’，5’5-Tetramethyl benzidine LiquidSubstrate System，Sigma)，于暗處室溫放置5-30分鐘，向每孔加入50微升1.0M硫酸溶液。用微滴定板讀數(shù)儀(Softmax軟件；Precision microplate reader，Molecular Devices)測(cè)定450納米的光吸收值。
(3)測(cè)定結(jié)果(表1)對(duì)血清中抗乙肝表面抗體滴度測(cè)定結(jié)果如表I所示.
表1抗乙肝表面抗原抗體(HBsAb)滴度

以上結(jié)果表明，小鼠后腿肌內(nèi)給藥一次，免疫7周后卡介菌多糖核酸與乙肝疫苗混合物誘導(dǎo)的表面抗體滴度是常規(guī)乙肝疫苗的7倍，免疫12周后卡介菌多糖核酸與乙肝疫苗混合物誘導(dǎo)的表面抗體滴度是常規(guī)乙肝疫苗的2.6倍，但是p值均大于0.05。實(shí)施例5小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)及與表達(dá)乙肝表面抗原的靶細(xì)胞共培養(yǎng)(1)配制裂解緩沖液在總體積1000毫升中，溶解89.9克氯化銨，10克碳酸氫鉀，370毫克EDTA四鈉鹽，調(diào)整pH至7.3。使用前用超純水稀釋10倍并除菌過(guò)濾。
(2)靶細(xì)胞培養(yǎng)與照射靶細(xì)胞為表達(dá)乙肝病毒表面抗原的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO-C28(成都生物制品研究所)，將靶細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)(DME High Glucose，Irvine Scientific)至80-90％密度時(shí)，用胰酶消化1分鐘，再用DME培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，用鈷60射線照射，照射劑量8Gy。1000轉(zhuǎn)離心5分鐘后，去除原培養(yǎng)液，用RPMI1640培養(yǎng)液(Irvine Scientific)懸浮細(xì)胞，使細(xì)胞密度為1.5×106/5ml。
(3)分離脾細(xì)胞給藥后第8周時(shí)每組各處死2只雌性和3只雄性小鼠，取脾臟。將脾臟研磨勻漿，用RPMI1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，于1500轉(zhuǎn)離心5分鐘。用裂解緩沖液懸浮沉淀的細(xì)胞，于室溫放置5分鐘以裂解紅細(xì)胞。1000轉(zhuǎn)離心5分鐘后，用PBS懸浮脾細(xì)胞，使其密度為3×107細(xì)胞/5mL。
(4)脾細(xì)胞與靶細(xì)胞共培養(yǎng)將本實(shí)施例步驟(2)與(3)中的靶細(xì)胞與脾細(xì)胞等體積混和成10毫升脾細(xì)胞和靶細(xì)胞混懸液，于37℃(5％CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。
(5)存活靶細(xì)胞計(jì)數(shù)將本實(shí)施例步驟(4)中的靶細(xì)胞與脾細(xì)胞混懸液1000轉(zhuǎn)離心5分鐘，用RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮清洗細(xì)胞一次，將密度調(diào)整為5×105細(xì)胞/50微升，鋪于96孔板(MicrotestTM96，Becton Dickinson Labware)中，4小時(shí)后吸去上清液，用PBS清洗貼壁靶細(xì)胞一次，照相、計(jì)數(shù)貼壁的靶細(xì)胞。
(6)結(jié)果(表2)經(jīng)與免疫后小鼠脾細(xì)胞共培養(yǎng)的靶細(xì)胞存活數(shù)量如表2所示.
表2靶細(xì)胞存活數(shù)量

以上結(jié)果表明，小鼠后腿肌內(nèi)給藥一次，用給藥8周后的小鼠脾細(xì)胞與靶細(xì)胞共培養(yǎng)，與乙肝疫苗與卡介菌多糖核酸混合物免疫組脾細(xì)胞共培養(yǎng)存活的靶細(xì)胞數(shù)量是與對(duì)照組(常規(guī)乙肝疫苗免疫)脾細(xì)胞共培養(yǎng)存活的靶細(xì)胞數(shù)量的22.5％。說(shuō)明乙肝疫苗與卡介菌多糖核酸混合物誘導(dǎo)抗乙肝的細(xì)胞免疫能力顯著高于乙肝疫苗。實(shí)施例6 乙肝疫苗，乙肝疫苗和卡介菌多糖核酸組份混合物多次性免疫小鼠1、乙肝疫苗的配制方法同實(shí)施例1，成分為生理氯化鈉溶液，乙肝表面抗原10微克/毫升，鋁含量為0.35-0.62mg/ml。
2、乙肝疫苗與卡介菌多糖核酸混合物的制備同實(shí)施例2，將制備的乙肝疫苗3.0毫升于250g離心5分鐘，用連接了真空裝置的玻璃吸管盡量地除去上清液。加入卡介菌多糖核酸溶液，使最終體積為3.0毫升，混和后于2-8℃振蕩12小時(shí)，即為乙肝疫苗與卡介菌多糖核酸混合物，其成分為生理氯化鈉溶液，乙肝表面抗原10微克/毫升，鋁含量為0.35-0.62毫克/毫升，卡介菌多糖核酸940微克/毫升。將該混合物保存于2-8℃?zhèn)溆?，使用前搖勻。
3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6-8周齡雌性BALB/C小鼠購(gòu)自HARLAN。
4、藥物及劑量(1)待測(cè)藥物為在本實(shí)施例步驟2中制備的乙肝疫苗與卡介菌多糖核酸混合物，每劑含卡介菌多糖核酸94微克，乙肝表面抗原1微克，每劑體積100微升。
(2)陽(yáng)性對(duì)照為在本實(shí)施例步驟1中制備的乙肝疫苗，每劑含乙肝表面抗原1微克，每劑體積100微升。
(3)給藥取小鼠10只，按每組5只隨機(jī)分組，一組命名為治療組，另一組命名為對(duì)照組。從眼眶內(nèi)取血100至200微升后，在治療組小鼠的后大腿肌內(nèi)注射一劑待測(cè)藥物，在對(duì)照組小鼠的后大腿肌內(nèi)注射一劑陽(yáng)性對(duì)照。一周后在治療組小鼠的后大腿肌內(nèi)再注射一劑待測(cè)藥物，在對(duì)照組小鼠的后大腿肌內(nèi)再注射一劑陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)施例7多次免疫后血樣的采集及抗體滴度測(cè)定采血方法，血清的分離，抗乙肝表面抗原抗體滴度的測(cè)定與實(shí)施例4相同，第一次免疫后第4周小鼠血清中表面抗體滴度的測(cè)定結(jié)果如表3所示。
表3抗乙肝表面抗原抗體滴度

以上結(jié)果表明，小鼠后腿肌內(nèi)給藥二次，首次給藥4周后乙肝疫苗與卡介菌多糖核酸混合物誘導(dǎo)的表面抗體滴度是常規(guī)乙肝疫苗的56倍，存在顯著性差異。乙肝疫苗與卡介菌多糖核酸混合物誘導(dǎo)表面抗體的能力顯著高于常規(guī)乙肝疫苗。實(shí)施例8卡介菌多糖核酸增強(qiáng)抗體反應(yīng)的量效關(guān)系1、乙肝疫苗的配制方法同實(shí)施例1，成分為生理氯化鈉溶液，乙肝表面抗原10微克/毫升，鋁含量為0.35-0.62mg/ml。
2、乙肝疫苗與卡介菌多糖核酸混合物的制備同實(shí)施例2，將制備的乙肝疫苗3.0毫升于250g離心5分鐘，用連接了真空裝置的玻璃吸管盡量地除去上清液。加入按實(shí)施例2方法制備的卡介菌多糖核酸溶液(濃度分別為200微克/毫升，1000微克/毫升，2000微克/毫升)，使最終體積為3.0毫升，混和后于2-8℃振蕩12小時(shí)，即為乙肝疫苗與卡介菌多糖核酸混合物，其成分為生理氯化鈉溶液，乙肝表面抗原10微克/毫升，鋁含量為0.35-0.62毫克/毫升，卡介菌多糖核酸200，1000，或2000微克/毫升。將該混合物保存于2-8℃?zhèn)溆茫褂们皳u勻。
3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6-8周齡雌性BALB/C小鼠購(gòu)自HARLAN。
4、藥物及劑量(1)待測(cè)藥物為在本實(shí)施例步驟2中制備的乙肝疫苗與卡介菌多糖核酸混合物，每劑含卡介菌多糖核酸20，100或200微克，乙肝表面抗原1微克，每劑體積100微升。
(2)陽(yáng)性對(duì)照為在本實(shí)施例步驟1中制備的乙肝疫苗，每劑含乙肝表面抗原1微克，每劑體積100微升。
(3)給藥取小鼠40只，按每組10只隨機(jī)分為四組，一組命名為對(duì)照組，用1微克常規(guī)乙肝疫苗免疫，另三組為治療組，用1微克乙肝疫苗分別與20微克，100微克或200微克卡介菌多糖核酸混合物免疫小鼠。從眼眶內(nèi)取血100至200微升后，在治療組小鼠的后大腿肌內(nèi)注射一劑待測(cè)藥物，在對(duì)照組小鼠的后大腿肌內(nèi)注射一劑陽(yáng)性對(duì)照。
5.采血方法，血清的分離，抗乙肝表面抗原抗體滴度的測(cè)定與實(shí)施例4相同，一次免疫后第4周小鼠血清中表面抗體滴度的測(cè)定結(jié)果如表4所示。
表4抗乙肝表面抗原抗體滴度

以上結(jié)果表明，小鼠后腿肌內(nèi)給藥一次，4周后乙肝疫苗與卡介菌多糖核酸混合物誘導(dǎo)的表面抗體滴度是常規(guī)乙肝疫苗的5-7倍，100微克和200微克卡介菌多糖核酸劑量組與對(duì)照相比有顯著性差異。誘導(dǎo)產(chǎn)生的表面抗體滴度隨卡介菌多糖核酸劑量增加而增加，但缺乏顯著性差異。乙肝疫苗與卡介菌多糖核酸混合物誘導(dǎo)表面抗體的能力顯著高于常規(guī)乙肝疫苗。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，其特征在于該組合物包括一種或幾種特定抗原與卡介菌多糖核酸類似物組成的混合物的有效劑量及稀釋劑，穩(wěn)定劑或載體所組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于其中所述的卡介菌多糖核酸類似物為卡介菌多糖核酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的藥物組合物，其特征在于其中所述的抗原為乙肝表面抗原。
4.一種藥物組合物，其特征在于向?qū)ο筇峁?quán)利要求1-3的藥物組合物后，能夠產(chǎn)生或增強(qiáng)針對(duì)藥物組合物所含抗原的抗體反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其中所述的對(duì)象是包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物。
6.一種藥物組合物，其特征在于向?qū)ο筇峁?quán)利要求1-3的藥物組合物后，能夠產(chǎn)生或增強(qiáng)針對(duì)藥物組合物所含抗原的細(xì)胞免疫反應(yīng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其中所述的對(duì)象是包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物。
8.一種如權(quán)利要求1所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)乙肝表面抗原疫苗的制備由基因工程乙肝表面抗原溶液制備乙肝表面抗原疫苗，該乙肝疫苗的成分為生理氯化鈉溶液，乙肝表面抗原5.9微克/毫升，鋁含量為0.35-0.62mg/ml；(2)卡介菌多糖核酸的制備由精制卡介菌多糖核酸用生理氯化鈉溶液溶解，360微克/毫升，121℃20分鐘滅菌，即為卡介菌多糖核酸溶液；(3)乙肝疫苗與卡介菌多糖核酸混合物制備將制備好的乙肝疫苗溶液于250g離心5分鐘，用連接了真空裝置的玻璃吸管盡量地除去上清液。加入上述的卡介菌多糖核酸溶液，使最終體積達(dá)到原乙肝疫苗溶液體積，混和后于2-8℃振蕩12小時(shí)，即為乙肝疫苗與卡介菌多糖核酸混合物，其成分為生理氯化鈉溶液，乙肝表面抗原5.9微克/毫升，鋁含量為0.35-0.62毫克/毫升，卡介菌多糖核酸324微克/毫升；將該混合物保存于2-8℃?zhèn)溆?，使用前搖勻。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的卡介菌多糖核酸類似物為卡介菌多糖核酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的抗原為乙肝表面抗原。
11.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其特征為此藥物組合物可用于生產(chǎn)預(yù)防乙型肝炎的藥物。
12.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其特征為此藥物組合物可用于生產(chǎn)治療乙型肝炎的藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬生物制劑技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了一種增強(qiáng)免疫力的藥物組合物。本發(fā)明的組合物含有有效量特定抗原和卡介菌多糖核酸類似物以及藥用稀釋劑、輔助劑或載體。本發(fā)明的組合物可廣泛用于需要誘導(dǎo)或增強(qiáng)抗體免疫力或細(xì)胞免疫力才能得到預(yù)防和治療的微生物感染或其他病癥。
文檔編號(hào)A61K31/715GK1470286SQ0213722
公開日2004年1月28日 申請(qǐng)日期2002年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月25日
發(fā)明者李偉華, 葛永紅, 董健 申請(qǐng)人:李偉華