專利名稱：新的腫瘤抗原疫苗及其制備方法和疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種新的腫瘤抗原疫苗及其制備方法和疫苗組合物。
背景技術(shù)：
腫瘤至今仍是人類的主要死亡原因之一。盡管近年來在腫瘤的診斷和治療方面的水平不斷得到改進和提高，化療和放療的方案也在不斷地改進，但最終大部分病人仍難以逃脫死亡的厄運。近年來，分子生物學(xué)的進展和對免疫系統(tǒng)功能的進一步的了解使得的研制和開發(fā)生物治療方法進入了一個飛速發(fā)展的階段。腫瘤疫苗的研制是目前腫瘤生物治療的最主要的方向之一[1-3]。
盡管體液免疫系統(tǒng)可能產(chǎn)生一定的抗腫瘤免疫反應(yīng)，但研究表明細胞毒(CD8+)和輔助(CD4+)T-細胞在腫瘤排斥反應(yīng)中起了關(guān)鍵的作用[4，5]。因此，大多數(shù)腫瘤疫苗的目標(biāo)都致力于誘導(dǎo)細胞的特異性的T-細胞反應(yīng)。T-細胞抗原受體(TCR)識別抗原的方式僅僅涉及到位于靶細胞表面并嵌于主要組織相容復(fù)合物(MHC)I類和II類分子的多肽片斷[6]。I類MHC分子提呈內(nèi)源性蛋白分解所產(chǎn)生的多肽。腫瘤細胞在合成腫瘤抗原的過程中，分解的多肽通過MHC I類分子被提呈致腫瘤細胞表面激活CD8+T-細胞。II類分子為CD4+T-細胞所識別，主要位于特殊的抗原提呈細胞(APCs)表面，包括樹突狀細胞，B-細胞和巨噬細胞。腫瘤細胞分泌或腫瘤溶解釋放外源性蛋白被APCs俘獲。在APC內(nèi)，抗原被加工成多肽片斷并由II類MHC提呈給CD4+細胞。CD4+T-細胞與體液的細胞的免疫反應(yīng)密切相關(guān)，通過與B-細胞的直接相互作用刺激抗體的產(chǎn)生并通過分泌的細胞因子刺激擴增CD8+T-細胞反應(yīng)。激活的抗原特異性CD8+細胞最終成為細胞毒T細胞并溶解腫瘤細胞[7]。APCs也能加工多肽并通過MHCI類分子提呈給CD8+T-細胞。
理想的腫瘤-特異的抗原應(yīng)具有免疫原性，為腫瘤細胞所表達但不表達于正常的細胞。不幸的是，大多數(shù)腫瘤抗原都沒有足夠的免疫原性以誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)，而且，許多腫瘤抗原在某種程度上表達于正常的組織，因此，這些抗原只是腫瘤相關(guān)的而不是真正的腫瘤特異的抗原。所設(shè)計的腫瘤疫苗就必須要克服機體的免疫耐受障礙。
腫瘤疫苗主要分為全細胞疫苗、蛋白分子疫苗、多肽疫苗、重組分子疫苗和樹突狀細胞疫苗。而DNA疫苗和RNA疫苗實際上仍屬于分子疫苗，只是采用了不同的表達系統(tǒng)。
細胞疫苗過去，對腫瘤抗原與其臨床的相關(guān)性方面并不十分清楚，采用全細胞作為腫瘤疫苗，可以提供那些未知的腫瘤抗原來激活免疫系統(tǒng)腫瘤抗原。小鼠腫瘤模型中，通常使用照射的腫瘤細胞免疫小鼠，以保護小鼠免受接種的腫瘤的侵襲[8]。但當(dāng)腫瘤細胞疫苗使用的時間推遲到接種腫瘤細胞后一周時，疫苗就失去了保護小鼠的能力。腫瘤細胞疫苗的臨床治療反應(yīng)比較差，僅僅適用于無特殊腫瘤抗原的腫瘤病人的預(yù)防復(fù)發(fā)。對于進展期病人在臨床研究方面很少獲得良好效果[9]。近年來，由于在識別分析腫瘤抗原方面的進展，特別是T細胞識別抗原的機制的深入了解，腫瘤抗原疫苗已基本取代細胞疫苗被用于腫瘤的免疫治療。
多肽和蛋白疫苗T-細胞識別MHC分子表面的抗原多肽表位一般為7-12個氨基酸，因此，抗原多肽可以與免疫佐劑混合應(yīng)用以達到在體內(nèi)裝載于空虛的MHC分子的目的。到目前為止，幾乎所有的以多肽為基礎(chǔ)的疫苗都是MHC I類抗原限制性多肽。當(dāng)小鼠研究證實了其有效性后[10，11]，多肽疫苗開始進入了臨床研究。Marchandetal[12]進行了I臨床試驗，12例表達MAGE-3，III或IV期黑色素細胞瘤病人，連續(xù)三個月給予合成的MAGE-3多肽。雖然有三例病人有部分腫瘤退縮，但沒有檢測到細胞毒T-細胞反應(yīng)的證據(jù)[13]。Rosenberg等[14]用合成的A2-限制性gp100多肽免疫黑色素細胞瘤病人，11個接受了福氏完全佐劑的病人中有10例病人對多肽產(chǎn)生了反應(yīng)，部分病人出現(xiàn)了腫瘤反應(yīng)的T-細胞，但未發(fā)現(xiàn)明顯臨床效果。19例聯(lián)合全身應(yīng)用IL-2的病人，3例病人出現(xiàn)多肽-反應(yīng)性T-細胞反應(yīng)，7例病人有明顯的臨床效應(yīng)，包括一例完全退縮，而單獨應(yīng)用IL-2的臨床反應(yīng)率為17％[8]。多肽疫苗應(yīng)用有一些限制。所應(yīng)用的多肽疫苗必需與病人的MHC I類抗原分子相匹配，即所謂的個體化，不同的病人MHC I類分子的亞型不同，所使用的腫瘤抗原多肽的序列也不同，這給腫瘤抗原多肽的臨床應(yīng)用帶來很大的困難。
重組分子疫苗腫瘤抗原蛋白疫苗的應(yīng)用可以克服這種困難，但是單純使用蛋白并不能激活機體的免疫反應(yīng)。靈長類動物試驗研究證實最佳的免疫效果需要將腫瘤蛋白與強免疫原性蛋白相絞聯(lián)[15]。弱抗原要誘導(dǎo)出有效的免疫反應(yīng)，就必須聯(lián)合使用免疫佐劑，提供一個非特異性的信號以激活免疫系統(tǒng)，許多免疫佐劑都有一定的毒性而不能應(yīng)用于臨床，所以抗原蛋白疫苗大都是以重組形式出現(xiàn)的。
用重組形式增強腫瘤蛋白的免疫原性的方法就是將腫瘤抗原與細胞因子，如GM-CSF，白細胞介素等重組形成融合蛋白[16，17]。腫瘤弱抗原與細菌或病毒抗原、毒素如白喉毒素、假單胞菌毒素等的重組可以明顯提高腫瘤抗原的抗原性，促進DC對腫瘤抗原的吞噬提呈，取得了一定的效果。但腫瘤抗原與毒素的單獨重組的方法到目前為止仍然還沒有達到理想的效果。
樹突狀細胞疫苗對于有效的T-細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，T-細胞需要抗原被提呈并致敏原始T-細胞，致敏的T-淋巴細胞獲得再刺激。要啟動有效的T-細胞介導(dǎo)的腫瘤免疫，來源于體內(nèi)任何部位的腫瘤抗原多肽必須被循環(huán)的T-細胞所識別。腫瘤細胞表面缺乏MHC分子和共刺激分子，無法激活T-細胞免疫。因此，抗原的提呈是獲得有效免疫反應(yīng)的關(guān)鍵性步驟。疫苗刺激的免疫反應(yīng)主要依賴于有效的APC對抗原的初加工和進一步的提呈。樹突狀細胞(DC)是最有效的APC[19]?，F(xiàn)在，越來越多的證據(jù)表明，DCs能夠使免疫系統(tǒng)克服這一障礙。DCs目前可以從CD34+造血干細胞的或外周血單個核淋巴細胞的分離中大量獲得。DCs在大多數(shù)組織內(nèi)以未成熟狀態(tài)存在，不能直接刺激T-細胞但具有特殊的俘獲和加工抗原的能力。這些被俘獲的抗原在DCs細胞內(nèi)通過I類和II類MHC分子被有效地提呈致細胞表面。抗原的俘獲作為刺激信號促進細胞成熟并向局部淋巴結(jié)遷移。這些成熟的DCs的細胞表面還高表達共刺激分子和粘附分子，具有強大的激活T-淋巴細胞的功能[20-22]。在體外大量產(chǎn)生的DCs用腫瘤抗原進行沖擊制備的疫苗已經(jīng)進入臨床試驗[23]，采用腫瘤細胞溶解物，腫瘤抗原蛋白，腫瘤抗原多肽等沖擊的樹突狀細胞疫苗的臨床研究獲得了比較理想的效果[24]。采用自身的腫瘤細胞與DCs融合的細胞疫苗治療轉(zhuǎn)移性腎癌也取得了一定的效果，17例病人中有7例有確切的臨床反應(yīng)，其中包括4例完全退縮[25]。
因此，就目前的研究結(jié)果看，DCs為基礎(chǔ)的疫苗是所有方案中最理想的疫苗。但是，DC的體外分離和培養(yǎng)需要很高的技術(shù)要求和費用，如果能在體內(nèi)有效地完成向DC遞送腫瘤抗原并激活DC則可大大降低治療費用。
通過抗原抗體復(fù)合物向DC遞送抗原是一個可行的方案，因為免疫球蛋白的Fc段與DC細胞表面的Fc受體結(jié)合可以促進DC對抗原抗體復(fù)合物的吞噬[26，27]。用重組DNA疫苗的方式也證實免疫球蛋白的Fc段可以促進對B型肝炎病毒的免疫反應(yīng)，可以提高免疫活性細胞干擾素的產(chǎn)生水平，并在一定程度上提高CD8+的活性[27]，這種DNA疫苗是否能在動物試驗中得到滿意的治療肝炎的效果至今未有相關(guān)報道。由于肝炎病人的大部分肝細胞都不同程度被感染，如果這種DNA疫苗有很好的效果的話，將會導(dǎo)致免疫細胞對所有受感染的肝細胞的攻擊，最終導(dǎo)致肝壞死，因此，此方法并不可取?？傮w來說，采用抗原抗體復(fù)合物的方式激活DC可以獲得有效地免疫預(yù)防作用[28，29]。但抗原抗體復(fù)合物的方式激活DC也有其缺陷，首先要分別實行抗原的制備和抗體的制備，特別是人源性抗體的制備目前仍是相當(dāng)困難。第二，DC的激活同時需要炎癥因子的參與(即危險信號)，在缺乏炎癥因子的情況下，DC的激活就會受到很大的影響。第三，抗原與抗體的結(jié)合是不牢固的，在一定因素的影響下，抗原會脫離抗體從而影響抗原遞送效果。
因此，為了改進腫瘤抗原的遞送方式，提高腫瘤抗原的遞送水平，克服機體的免疫抑制狀態(tài)，從根本上治愈腫瘤，本領(lǐng)域中需要開發(fā)出新的腫瘤抗原疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供新的腫瘤抗原疫苗。
本發(fā)明的另一個目的是提供編碼該腫瘤抗原疫苗的核苷酸序列。
本發(fā)明還有一個目的是提供含有該腫瘤抗原疫苗的疫苗組合物。
本發(fā)明還有一個目的是提供該腫瘤抗原疫苗的制備方法。
為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明第一方面涉及一種分離的腫瘤抗原疫苗，該腫瘤抗原疫苗包含來自腫瘤抗原的7個或7個以上氨基酸的序列和含有免疫球蛋白的CH3部分的氨基酸序列，上述兩個序列相互連接。
本發(fā)明第二方面涉及一種DNA分子，該DNA分子含有編碼上述腫瘤抗原疫苗的核苷酸序列。
本發(fā)明第三方面涉及一種疫苗組合物，該疫苗組合物包含腫瘤抗原疫苗和藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明第四方面涉及一種制備上述腫瘤抗原疫苗的方法，該方法包括a)提供一表達載體，該表達載體含有編碼上述腫瘤抗原疫苗的核苷酸序列以及與該核苷酸序列操作性相連的表達調(diào)控序列；b)用步驟a)中的表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞；c)在適合表達所述腫瘤抗原疫苗的條件下培養(yǎng)步驟b)所得的宿主細胞；和d)分離純化獲得所表達出的腫瘤抗原疫苗。
本發(fā)明的腫瘤抗原疫苗是通過將腫瘤抗原或其多肽與免疫球蛋白CH3部分在DNA水平重組而表達獲得的。該腫瘤抗原疫苗能通過其CH3部分與DC表面的Fc受體結(jié)合，從而促進融合蛋白所攜帶的腫瘤抗原的內(nèi)源化并刺激DC成熟，刺激DC對該抗原的提呈并激活T淋巴細胞。由于CH3介導(dǎo)的抗原內(nèi)源化所提呈的多肽主要與I類MHC分子相結(jié)合，激活CD8+細胞毒T細胞，因此能夠針對表達該抗原的腫瘤細胞產(chǎn)生強大的免疫攻擊，并殺滅這類腫瘤細胞。
與抗原抗體復(fù)合物相比較，本發(fā)明方法簡便，省略了制備特殊抗體這一非常復(fù)雜的步驟，抗原與CH3為重組的蛋白，結(jié)合牢固。而抗原抗體復(fù)合物易脫離。本發(fā)明疫苗的分子量比抗原抗體復(fù)合物小許多倍，易被樹突狀細胞吞噬，產(chǎn)生很強的免疫反應(yīng)。尤其是在另外連入毒素后，可使腫瘤抗原的抗原性有更明顯的提高，T細胞激活效應(yīng)可進一步提高2倍。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種分離的腫瘤抗原疫苗，該腫瘤抗原疫苗包含來自腫瘤抗原的7個或7個以上氨基酸的序列和含有免疫球蛋白的CH3部分的氨基酸序列，上述兩個序列相互連接。
本文所用的術(shù)語“分離的”在用于蛋白質(zhì)時，表示該蛋白質(zhì)基本上不含其它在天然狀態(tài)下相關(guān)的細胞成分，其最好呈均質(zhì)狀態(tài)，但也可以是干的或水溶液。純度和均一性通常可用分析化學(xué)方法如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法來測定。
本發(fā)明的腫瘤抗原疫苗含有兩個氨基酸序列。第一個氨基酸序列是來自腫瘤抗原的7個或7個以上氨基酸的多肽序列。本文所用的術(shù)語“多肽”和“蛋白”可以互換，其包括7個或7個以上具有任何長度的氨基酸鏈，包括全長蛋白(即腫瘤抗原本身)，其中氨基酸殘基間通過共價肽鍵連接。在這里，術(shù)語“腫瘤抗原”的含義是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。在本發(fā)明的一個較佳實施方案中，所述腫瘤抗原宜選自任意能被T細胞識別的與腫瘤有關(guān)的抗原。在一個更佳的實施方案中，所述腫瘤抗原宜選自707-AP、AFP、ART-4、BAGE B、β-catenin/m、bcr-abl、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、ETS、G250、GAGE、GnT-V、GP100、HAGE、HER-2/NEU、HLA-A*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT、iCE、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、GDP-Lfucose、MAGE、MART-1/Melan-A、MC1R、Myosin/m、MUC1、MUM-1，-2，-3、NA88-A、NY-ESO-1、P15、p190、P53、Pml/RARα、PRAME、PSA、PSM、RAGE、PAS、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、gp75、TRP-2、TRP-2/INT2、WT1。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，腫瘤抗原僅需7個或7個以上氨基酸多肽序列就能為抗原遞呈細胞所遞呈(CAP-1為來源于CEA的氨基酸序列為YLSGANLNL[30]，VISNDVCAQV為來源于PSA的氨基酸序列[31]，KIFGSLAFL為來源于HER2/neu的氨基酸序列[32])。另外，上述腫瘤抗原多肽序列中可有一個或多個氨基酸缺失、置換或增加，如此產(chǎn)生的變體也包括在本發(fā)明的術(shù)語“腫瘤抗原”范圍內(nèi)，只要所述變體保留了該腫瘤抗原多肽序列的抗原性。
本發(fā)明的腫瘤抗原疫苗中所含的第二個氨基酸序列是含有免疫球蛋白CH3部分的氨基酸序列。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，免疫球蛋白Fc片段中的CH3部分是導(dǎo)致免疫球蛋白Fc片段與DC細胞表面Fc受體結(jié)合的關(guān)鍵序列。因此，預(yù)計含有免疫球蛋白CH3部分的任何氨基酸序列均能與DC細胞表面Fc受體結(jié)合。CH3的氨基酸序列和DNA序列分別示于序列表SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中。然而，CH3氨基酸序列中一個或多個氨基酸缺失、置換或增加而產(chǎn)生的CH3變體也包括在本發(fā)明的術(shù)語“CH3部分”范圍內(nèi)，只要該變體保留了與DC細胞表面Fc受體結(jié)合的能力。所述“CH3變體”與CH3序列的相同性宜在約80％以上，更佳的約95％以上。其中常見的置換是保守性氨基酸置換，例如脂族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile之間的相互置換；羥基殘基Ser和Thr的互換；酸性殘基Asp和Glu的交換；酰胺殘基Asn和Gln之間的置換；堿性殘基Lys和Arg的交換；以及芳族殘基Phe和Tyr之間的置換。缺失或增加包括對CH3結(jié)合DC細胞表面Fc受體能力影響很小的氨基酸缺失或增加。所述“含有免疫球蛋白CH3部分的氨基酸序列”可以單單是CH3氨基酸序列。在另一個實施方案中，它可以是含有該CH3氨基酸序列的免疫球蛋白Fc片段。
上述兩個氨基酸序列只需相連即可，而無前后順序。所述連接可以直接連接(即其中沒有介入的氨基酸)或可通過不會顯著影響的腫瘤抗原多肽序列抗原性的接頭序列連接。
在本發(fā)明的一個較佳實施方案中，本發(fā)明的腫瘤抗原疫苗中還包括毒素。所述毒素可以是任意細菌或病毒及其它生物毒素，例如白喉菌毒素、百日咳菌毒素、假單胞菌毒素、炭疽菌毒素、破傷風(fēng)毒素等。所述毒素可以以任意30個氨基酸以上的毒素片段與腫瘤抗原疫苗串聯(lián)連接，其中毒素片段可以連接在上述腫瘤抗原多肽片段和CH3片段前后以及之間的任何位置。
本發(fā)明還提供了一種DNA分子，該DNA分子含有編碼本發(fā)明腫瘤抗原疫苗的核苷酸序列。例如，編碼各種腫瘤抗原多肽序列的核苷酸序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可從基因庫中檢索得到。編碼CH3部分的核苷酸序列例如顯示在SEQ ID NO2中。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可利用本領(lǐng)域中熟知的遺傳密碼的簡并性獲得編碼上述氨基酸序列的所有其它核酸序列。
本發(fā)明的腫瘤抗原疫苗可通過以下方法來獲得。
首先，根據(jù)本發(fā)明公開的信息，用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)手段，如人工合成或用PCR法擴增分別得到編碼腫瘤抗原的7個或7個以上氨基酸的序列的核苷酸序列以及編碼含有免疫球蛋白的CH3部分的核苷酸序列。然后，可用本領(lǐng)域熟知的各種方法，如基因工程方法，將上述序列用任選的接頭序列將腫瘤抗原多肽編碼序列、CH3編碼序列連接入合適的表達載體中，并與表達調(diào)控序列操作性相連。在另一任選的操作步驟中，還可利用基因工程方法將毒素(如白喉毒素)的編碼序列也連接入該表達載體中。本文所用的術(shù)語“表達調(diào)控序列”通常指參與控制核苷酸序列表達的序列。表達調(diào)控序列包括與目標(biāo)核苷酸序列操作性相連的啟動子和終止信號。它們通常還包括核苷酸序列適當(dāng)翻譯所需的序列?！安僮餍韵噙B”是指線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果啟動子或增強子增加了編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與編碼序列是操作性相連的。本發(fā)明中所用的表達載體可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種市售的表達載體。
然后，用上述獲得的表達載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細胞。在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。在本發(fā)明的一個較佳實施方案中，宜采用哺乳動物細胞系來作為宿主細胞，更佳的可采用市售的無限增殖細胞系，如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、Vero細胞、海拉細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)等。
本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”是指用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法將含有感興趣的核酸的表達載體直接導(dǎo)入宿主細胞內(nèi)。轉(zhuǎn)化方法因宿主細胞類型而異，通常包括電穿孔；采用氯化鈣、DEAE-葡聚糖或其它物質(zhì)的轉(zhuǎn)染；微粒轟擊；脂轉(zhuǎn)染；感染和其它方法(見Sambrook等人的《分子克隆實驗指南》第2版，1989年)。
最后，在適合本發(fā)明腫瘤抗原疫苗表達的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化所得的宿主細胞。然后用細胞裂解緩沖液裂解細胞，再用離子交換層析、疏水層析、分子篩層析和親和層析等本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)分離純化手段純化得到本發(fā)明的腫瘤抗原疫苗。
本發(fā)明還提供了一種疫苗組合物，它含有藥效上有效量的本發(fā)明腫瘤抗原疫苗和藥學(xué)上可接受的載體。本文所用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指當(dāng)分子本體和組合物適當(dāng)?shù)亟o予動物或人時，它們不會產(chǎn)生不利的、過敏的或其它不良反應(yīng)。本文所用的“藥學(xué)上可接受的載體”應(yīng)當(dāng)與本發(fā)明的腫瘤抗原疫苗相容，即能與其共混而不會在通常情況下大幅度降低疫苗組合物的效果。合適的載體通常是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂質(zhì)凝集物(如油滴或脂質(zhì)體)以及無活性的病毒顆粒。這些載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。
本發(fā)明的疫苗組合物可根據(jù)需要制成各種劑型，并可由醫(yī)師根據(jù)患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對病人有益的劑量進行施用。傳統(tǒng)方法是從腸胃外(皮下、肌內(nèi)、或透皮/經(jīng)皮膚)途徑通過注射給予。治療劑量可以是單劑方案或多劑方案。疫苗可以結(jié)合其它免疫調(diào)節(jié)劑或免疫佐劑一起給予。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，均按照常規(guī)條件如Sambrook等人的《分子克隆實驗室手冊》(第三版)(Cold Spring HarborLaboratory Press)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件進行。
實施例1MUC1腫瘤抗原疫苗MUC1全序列可從基因庫(NM…002456)檢索獲得。用Invitrogene公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商說明書操作，通過mRNA反轉(zhuǎn)錄方法從X-108胃癌細胞株(手術(shù)標(biāo)本來源的胃癌細胞株)合成cDNA，獲得MUC1的DNA。
同樣，用Invitrogene公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒根據(jù)生產(chǎn)商說明書操作，從人B淋巴細胞mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA獲得CH3的DNA。CH3的DNA序列如序列表中SEQ IDNO2所示。
以上述獲得的MUC1的DNA為模板PCR方法合成MUC1(5′PCR引物序列AACCCGGTACCACAGGTTCTGGTCATGCAAGC(SEQ ID NO3)，3′PCR引物序列AACCCCTCGAGGGGGGCGGTGGAGCCCGGGGCC(SEQ ID NO4))。用限制性內(nèi)切酶Kpn I/Xho I將MUC1克隆入pcDNA3.1載體(購自Invitrogene公司)內(nèi)的多克隆位點內(nèi)。同樣，以上述獲得的CH3的DNA為模板用PCR方法合成免疫球蛋白Fc的CH3片段(5′PCR引物序列AACCCCTCGAGGGCAGCCCCGAGAACCAC(SEQ IDNO5)，3′PCR引物序列AACCCTCTAGATCATTTACCCGGGGACAG(SEQ ID NO6))。用限制性內(nèi)切酶Xho I/Xba I將CH3片段克隆入pcDNA3.1載體內(nèi)相應(yīng)的位點內(nèi)，使之與MUC1串聯(lián)連接。
pcDNA3.1在DH-5α(購自Invitragene公司)內(nèi)擴增后用Miniprep試劑盒純化質(zhì)粒DNA。取5-10ug消化后的DNA，用Superfectine試劑盒(Qiagene公司)將其轉(zhuǎn)導(dǎo)入CHO細胞(購自美國ATCC)中，經(jīng)G418篩選，單克隆化。
擴增克隆化的細胞，用溶解細胞緩沖液(20mM Tris pH7.5，150mM NaCl，10mMDTT，1mM苯甲基磺酰氟PMSF，10微克/毫升抑酶肽，10微克/毫升亮抑酶肽，5微克/毫升胃抑酶肽)收獲溶解CHO細胞。
用Western印跡法檢測融合蛋白的表達，一抗為鼠抗人MUC1單克隆抗體，二抗為兔抗鼠IgG，試劑盒為美國vector公司產(chǎn)品。結(jié)果提示在大約23000分子量處可測出融合蛋白。
如下所述檢測融合蛋白功能。用2毫克純化的融合蛋白免疫C57/BL6小鼠，每周一次共三次，取小鼠脾細胞1×107以20∶1的比例與照射過(8000鈷源拉得)的MC38細胞(來源于美國NIH)混合培養(yǎng)5天，再以不同效靶比的濃度與野生型MC38混合培養(yǎng)測定脾細胞對MC38的殺傷活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以1∶20效靶比在四小時內(nèi)可殺滅80％的MC38細胞。而用以上方法免疫過的小鼠可得到100％的免疫保護，排斥高達1×106的MC38腫瘤細胞的攻擊。其治療效果與普通的抗原抗體復(fù)合物相比高5-10倍。
實施例2CEA腫瘤抗原疫苗(CAP-1)首先，用Invitrogene公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒根據(jù)生產(chǎn)商說明書操作，從人B淋巴細胞mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA獲得Fc段的DNA。Fc段的DNA序列如序列表SEQ IDNO7所示。
CAP-1的DNA編碼序列已知為TACCTTTCGGGAGCGAACCTCAACCTCTCC(SEQ ID NO8)，以上述獲得的Fc段cDNA為模板用PCR方法合成CAP-1-Fc重組蛋白的DNA(5′PCR引物序列AACCCGGTACCATGTACCTTTCGGGAGCGAACCTCAACCTCTCCGCAGAGCCCAAATCTTGTGA(SEQ ID NO9)，3′PCR引物序列AACCCTCTAGATTATCATTTACCCGGAGA(SEQ ID NO10))。用限制性內(nèi)切酶Xho I/Xba I將CAP-1-Fc克隆入pcDNA3.1載體內(nèi)相應(yīng)的位點內(nèi)，使CAP-1與Fc串聯(lián)連接。
pcDNA3.1在DH-5α(購自Invitragene公司)內(nèi)擴增后用Miniprep試劑盒純化質(zhì)粒DNA。取5-10ug消化后的DNA，用Superfectine試劑盒(Qiagene公司)轉(zhuǎn)導(dǎo)入CHO細胞(購自美國ATCC)，經(jīng)G418篩選，單克隆化。
擴增克隆化的細胞，用溶解細胞緩沖液(20mM Tris pH7.5，150mM NaCl，10mMDTT，1mM苯甲基磺酰氟PMSF，10微克/毫升抑酶肽，10微克/毫升亮抑酶肽，5微克/毫升胃抑酶肽)收獲溶解CHO細胞。
Western印跡法檢測融合蛋白的表達，一抗為鼠抗人CH3單克隆抗體，二抗為兔抗鼠IgG，試劑盒為美國vector公司產(chǎn)品。結(jié)果提示在大約30000分子量處可測出融合蛋白單體。
分離純化該融合蛋白，凍干、分裝。
實施例3P53腫瘤抗原疫苗人P53全序列可從基因庫(M14695)檢索獲得。含有P53基因的質(zhì)?？梢詮拿绹鳤TCC購得，其氨基酸的全序列如SEQ ID NO11所示。同樣，用Invitrogene公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒根據(jù)生產(chǎn)商說明書操作，從人B淋巴細胞mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA獲得CH3的DNA。
以上述獲得的P53的DNA為模板用PCR方法合成P53(5′PCR引物序列AACCCGGTACCATGGAGGAGCCGCAGTCAGAT(SEQ ID NO12)，3′PCR引物序列AACCCCTCGAGGTCTGAGTCAGGCCCTTC(SEQ ID NO13))。用限制性內(nèi)切酶Kpn I/Xho I將P53克隆入pcDNA3.1載體(購自Invitrogene公司)內(nèi)的多克隆位點內(nèi)。同樣，以上述獲得的CH3的DNA為模板用PCR方法合成免疫球蛋白Fc的CH3片段(5′PCR引物序列AACCCCTCGAGGGCAGCCCCGAGAACCAC(SEQ ID NO5)，3′PCR引物序列AACCCTCTAGATCATTTACCCGGGGACAG(SEQ ID NO6))。用限制性內(nèi)切酶Xho I/Xba I將CH3片段克隆入pcDNA3.1載體內(nèi)相應(yīng)的位點內(nèi)，使之與P53串聯(lián)連接。
用PCR方法合成白喉毒素的部分DNA序列(可從基因庫檢索其全長序列A04646)(SEQ ID NO14)(5′PCR引物序列為AACCCGGTACCAACTTTTCTTCGTACCACG(SEQ ID NO15)，3′PCR引物序列為AACCCGGTACCACTATAAAACCCTTTCCAA(SEQ ID NO16))。利用限制性內(nèi)切酶Kpn I將毒素序列串聯(lián)連接于P53的前端，排列順序為毒素-P53-CH3。
pcDNA3.1在DH-5α(購自Invitragene公司)內(nèi)擴增后用Miniprep試劑盒純化質(zhì)粒DNA。取5-10ug消化后的DNA，用Superfectine試劑盒(Qiagene公司)轉(zhuǎn)導(dǎo)入CHO細胞(購自美國ATCC)，經(jīng)G418篩選，單克隆化。
擴增克隆化的細胞，用溶解細胞緩沖液(20mM Tris pH7.5，150mM NaCl，10mMDTT，1mM苯甲基磺酰氟PMSF，10微克/毫升抑酶肽，10微克/毫升亮抑酶肽，5微克/毫升胃抑酶肽)收獲溶解CHO細胞。
Western印跡法檢測融合蛋白的表達，一抗為鼠抗人P53單克隆抗體，二抗為兔抗鼠IgG，試劑盒為美國vector公司產(chǎn)品。結(jié)果提示在大約60000分子量處可測出融合蛋白。
如下所述檢測本實施例制得的融合蛋白功能。用2毫克純化的融合蛋白免疫C57/BL6小鼠，每周一次共三次，取小鼠脾細胞1×107以20∶1的比例與照射過(8000鈷源拉得)的L002細胞(人P53轉(zhuǎn)基因細胞)混合培養(yǎng)5天，再以不同效靶比的濃度與野生型L002混合培養(yǎng)測定脾細胞對L002的殺傷活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以1∶20效靶比在四小時內(nèi)可殺滅95％的L002細胞，比未加入毒素的P53-CH3疫苗高約20％。
實施例4Her2/neu腫瘤抗原疫苗
Her2/neu全序列可從基因庫(M11730)檢索獲得。含有該基因的質(zhì)粒可從美國ATCC獲得。以上述獲得的Her2/neu DNA為模板用PCR方法合成Her2/neu的部分DNA(5′PCR引物序列 AACCCGGTACCAGCACCCAAGTGTGCACC(SEQ ID NO17)，3′PCR引物序列 AACCCCTCGAGTTGGTTGTGCAGGGGGCA(SEQ ID NO18))。用限制性內(nèi)切酶Kpn I/Xho I將Her2/neu的部分DNA克隆入pcDNA3.1載體(購自Invitrogene公司)內(nèi)的多克隆位點內(nèi)。同樣，用Invitrogene公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒根據(jù)生產(chǎn)商說明書操作，從人B淋巴細胞mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA獲得Fc段的DNA(SEQID NO7)。
同樣，以上述獲得的Fc的DNA為模板用PCR方法合成免疫球蛋白Fc的片段(5′PCR引物序列 AACCCCTCGAGGCAGAGCCCAAATCTTGTGA(SEQ ID NO8)，3′引物序列 AACCCTCTAGATCATTTACCCGGAGACAG(SEQ ID NO9))。用限制性內(nèi)切酶Xho I/Xba I將Fc段克隆入pcDNA3.1載體內(nèi)相應(yīng)的位點內(nèi)，使之與Her2/neu串聯(lián)連接。
用PCR方法合成假單胞菌毒素的部分DNA序列GCCGCCGGTGAATGCGCGGGCCCGGCGGACAGCGGCGACGCCCTGCTGGAGCGCAACTATCCCACTGGCGCGGAGTTCCTCGGCGACGGCGGCGACGTCAGCTTCAGCACCCGCGGCACGCAGAACTGGACGGTGGAGCGGCTGCTCCAGGCGCAC(SEQ ID NO19)(其全長序列可從基因庫檢索到M23348)(5′PCR引物序列為AACCCGGTACCGCCGCCGGTGAATGCGCG(SEQ ID NO20)，3′PCR引物序列為AACCCGGTACCGTGCGCCTGGAGCAGCCG(SEQ ID NO21))。用限制性內(nèi)切酶Kpn I將毒素序列串聯(lián)連接于P53的前端，排列順序為毒素-Her2/neu-Fc。
pcDNA3.1在DH-5α(購自Invitragene公司)內(nèi)擴增后用Miniprep試劑盒純化質(zhì)粒DNA。取5-10ug消化后的DNA，用Superfectine試劑盒(Qiagene公司)轉(zhuǎn)導(dǎo)入CHO細胞(購自美國ATCC)，經(jīng)G418篩選，單克隆化。
擴增克隆化的細胞，用溶解細胞緩沖液(20mM Tris pH7.5，150mM NaCl，10mMDTT，1mM苯甲基磺酰氟PMSF，10微克/毫升抑酶肽，10微克/毫升亮抑酶肽，5微克/毫升胃抑酶肽)收獲溶解CHO細胞。
Western印跡法檢測融合蛋白的表達，一抗為鼠抗人Her2/neu單克隆抗體，二抗為兔抗鼠IgG，試劑盒為美國vector公司產(chǎn)品。結(jié)果提示在大約66000分子量處可測出該融合蛋白。
用人Her2/neu轉(zhuǎn)基因的小鼠腫瘤細胞接種于C57/BL小鼠，七天后，皮下注射純化的融合蛋白2mg，每三天一次，共五次。Her2/neu-Fc與毒素-Her2/neu-Fc均有明顯的抗腫瘤作用，而以毒素-Her2/neu-Fc融合蛋白最明顯，二十天后，可清除所有腫瘤。
盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對本發(fā)明作各種變化和改動。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動。
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序列表<110>李進<120>新的腫瘤抗原疫苗及其制備方法和疫苗組合物<130>025214<160>21<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>106<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu1 5 10 15Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr20 25 30Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn35 40 45Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe50 55 60Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn65 70 75 80Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr85 90 95Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys100 105<210>2<211>321<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>2cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 60caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 120gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 180ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 240gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 300tccctgtccc cgggtaaatg a321<210>3<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>3aacccggtac cacaggttct ggtcatgcaa gc32<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>4aacccctcga ggggggcggt ggagcccggg gcc 33<210>5<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>5aacccctcga gggcagcccc gagaaccac29<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>6aaccctctag atcatttacc cggggacag29<210>7<211>705<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>7gcagagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 60ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc120cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag180ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag240cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg300aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa360accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc420cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc 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Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr290 295 300Lys Arg Ala Leu Pro Asn Ash Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys305 310 315 320Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu325 330 335Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp340 345 350Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His355 360 365Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met370 375 380Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp385 390<210>12<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>12aacccggtac catggaggag ccgcagtcag at 32<210>13<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>13aacccctcga ggtctgagtc aggcccttc 29<210>14<211>120<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>合成的DNA<400>14aacttttctt cgtaccacgg gactaaacct ggttatgtag attccattca aaaaggtata 60caaaagccaa aatctggtac acaacgaaat tatgacgatg attggaaagg gttttatagt120<210>15<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>15aacccggtac caacttttct tcgtaccacg 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權(quán)利要求
1.一種分離的腫瘤抗原疫苗，其特征在于，它包含來自腫瘤抗原的7個或7個以上氨基酸的序列和免疫球蛋白的CH3部分的氨基酸序列，上述兩個序列相互連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤抗原疫苗，其特征在于，所述腫瘤抗原選自707-AP、AFP、ART-4、BAGE B、β-catenin/m、bcr-abl、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、ETS、G250、GAGE、GnT-V、GP100、HAGE、HER-2/NEU、HLA-A*0201-R170I、HPV-E6、HPV-E7、EBNA、HSP70-2M、HST-2、hTERT、iCE、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、GDP-Lfucose、MAGE、MART-1/Melan-A、MC1R、Myosin/m、MUC1、MUM-1，-2，-3、NA88-A、NY-ESO-1、P15、p190、P53、Pml/RARα、PRAME、PSA、PSM、RAGE、RAS、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、gp75、TRP-2、TRP-2/INT2、和WT1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤抗原疫苗，其特征在于，它含有免疫球蛋白Fc片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤抗原疫苗，其特征在于，它還含有毒素片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的腫瘤抗原疫苗，其特征在于，所述毒素片段是選自白喉菌毒素、百日咳菌毒素、假單胞菌毒素、炭疽菌毒素和破傷風(fēng)毒素的毒素片段。
6.一種DNA分子，其特征在于，它含有編碼權(quán)利要求1所述的腫瘤抗原疫苗的核苷酸序列。
7.一種疫苗組合物，它含有藥效上有效量的權(quán)利要求1所述的腫瘤抗原疫苗和藥學(xué)上可接受的載體。
8.一種表達載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的DNA分子。
9.一種宿主細胞，其特征在于，它被權(quán)利要求8所述的表達載體轉(zhuǎn)化。
10.一種制備權(quán)利要求1所述的腫瘤抗原疫苗的方法，其特征在于，該方法包括a)提供一表達載體，該表達載體含有編碼權(quán)利要求1所述的腫瘤抗原疫苗的核苷酸序列以及與該核苷酸序列操作性相連的表達調(diào)控序列；b)用步驟a)中的表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞；c)在適合表達所述腫瘤抗原疫苗的條件下培養(yǎng)步驟b)所得的宿主細胞；和d)分離純化獲得所表達出的腫瘤抗原疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的腫瘤抗原疫苗，它包含來自腫瘤抗原的7個或7個以上氨基酸的序列和免疫球蛋白的CH3部分的氨基酸序列，上述兩個序列相互連接。本發(fā)明還公開了編碼該腫瘤抗原疫苗的DNA序列，其制備方法和含有該腫瘤抗原疫苗的疫苗組合物。本發(fā)明疫苗分子量比抗原抗體復(fù)合物小許多倍，易被樹突狀細胞吞噬，產(chǎn)生很強的免疫反應(yīng)。
文檔編號A61K39/00GK1481899SQ0213696
公開日2004年3月17日 申請日期2002年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月13日
發(fā)明者李進, 李 進 申請人:李進, 李 進