專利名稱：抗原致敏的人樹突狀細胞的制備及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物學和醫(yī)學領域，更具體地涉及一種腫瘤抗原的制備方法以及用該方法制得的抗原來制備抗原致敏的人樹突狀細胞的方法。
背景技術：
樹突狀細胞(Dendritic Cells，DC)是正常人體內存在的一種具有特殊功能的抗原提呈細胞，被喻為機體的“天然佐劑”，能夠直接攝取、加工、呈遞抗原，刺激體內的初始型T細胞活化，是機體免疫應答的“啟動者”。此外DC還可以通過直接或間接方式促進B細胞的增殖與活化，調控體液免疫應答；刺激記憶T細胞活化誘發(fā)再次免疫應答；與NK相互作用影響非特異性的、天然免疫應答，因此DC可以說是機體內免疫應答反應的“始作俑者”。DC處于腫瘤免疫的關鍵環(huán)節(jié)，能攝取和加工處理腫瘤抗原并調動機體主動特異性抗腫瘤免疫反應殺傷腫瘤細胞。在眾多腫瘤的生物療法中，基于DC的免疫治療由于能發(fā)揮患者機體自主的抗腫瘤免疫功能而備受重視。
利用DC進行腫瘤的免疫治療，主要目的是誘導患者機體產生腫瘤特異性的、持久的免疫應答。在這些療法中，報道最多、研究最深入、應用最廣泛、療效最確切的是應用腫瘤抗原致敏的樹突狀細胞對腫瘤的治療。已報導的臨床觀察資料表明，該療法的療效超過以往所報道的各種生物療法，也是最具希望的一種，該療法的應用前景被廣為看好。
腫瘤免疫治療的關鍵原理就是充分調動機體的免疫功能以殺滅腫瘤細胞。由于DC處于腫瘤免疫的關鍵環(huán)節(jié)，即能攝取和加工處理腫瘤抗原并調動機體主動特異性抗腫瘤免疫反應，因此，利用DC的功能特點，在DC成熟之前，充分發(fā)揮其攝取抗原的功能，給以腫瘤抗原刺激，再將攝取了腫瘤抗原的DC回輸至體內，攜帶腫瘤抗原的DC在將抗原信息提呈給T細胞時，活化了T細胞，從而誘導機體產生了具有特異性殺傷腫瘤細胞的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，因而對患者產生一定的治療作用。
采用腫瘤抗原直接致敏樹突狀細胞，回輸體內后可以誘導機體產生腫瘤抗特異性的細胞免疫應答，但是如何高效、快速地獲得腫瘤抗原并用于樹突狀細胞的致敏仍然是腫瘤免疫治療領域研究的重要課題。盡管目前對于某些腫瘤抗原有一定的了解，但是但絕大多數(shù)腫瘤的腫瘤抗原仍是未知的；已知的抗原多肽并不一定能誘導最佳的抗腫瘤免疫反應，如從黑色素瘤患者外周血中誘導出的CTL細胞并不能認別目前所克隆的腫瘤的抗原如gp100、MART1等，提示可能存在其他未知的腫瘤抗原能有效誘導抗腫瘤免疫應答；針對單一抗原決定族的CTL克隆未必能有效誘導抗腫瘤免疫排斥反應，針對多個抗原決定族共同作用可能發(fā)揮最佳的抗腫瘤作用。
熱休克蛋白(Heat shock protein，HSP)是一類在生物進化中高度保守、廣泛存在于原核及真核生物中的一類蛋白質，是生物細胞應激反應的誘導產物，HSP在機體的免疫反應過程中發(fā)揮著重要作用，通過參與抗原加工遞呈、T細胞活化等重要的生理過程，與機體的抗腫瘤免疫、抗感染免疫、自身免疫性疾病等生理及病理機制密切相關，是一類重要的免疫分子。熱休克蛋白家族按照分子量可以分為四類HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族和小分子HSP家族。其中HSP70家族是HSP中最保守和最主要的一類。
Armold的實驗表明，用轉染了β-Gal的細胞來源的HSP90家族分子gp96免疫小鼠，可以產生針對β-Gal特異性的CD8+的CTL。Blachere等在體外重構了HSP70和gp96的多肽復合物，結果表明HSP本身是沒有誘導出特異性的免疫，而HSP結合的多肽能誘導出抗原特異性的CTL，但將肽結合在其它的肽結合蛋白如小鼠的清蛋白，則無免疫原性。
Srivastava的實驗表明，腫瘤細胞來源的HSP70多肽復合物可以誘導特異的抗腫瘤免疫，并且證實，這種免疫原性是來自于HSP多肽復合物中的小分子物質而不是HSP，經過反相HPLC分析，這些小分子物質的分子量為1-5kD，去除了這些小分子物質，HSP則喪失其免疫原性，但僅用這些小分子物質免疫小鼠并不能得到好的免疫效果，因此HSP在抗原遞呈過程中的佐劑樣作用及小分子肽的免疫原性是HSP介導的免疫治療所不可缺少的兩個重要部分。
Blachere等的研究表明，HSP可以成為CD8+T細胞反應的一種新的佐劑。Moroi等采用OVA257-264 T細胞表位作為抗原肽，在體外與HWDFAWPW這種可以與HSP70蛋白結合的肽結合域交聯(lián)，形成雜合蛋白，結果有效地誘導出針對OVA抗原的特異性的CTL，并且可以明顯抵抗E.G7-OVA腫瘤細胞的攻擊，而單獨使用OVA抗原肽或HSP70則不能誘導CTL反應，表明HSP70分子對T細胞的激活具有明顯的佐劑樣效應。
Amold-Schild等證實了HSP誘導的特異性CTL反應是由于專職抗原遞呈細胞(APC)上存在HSP的受體，可以使APC特異性地通過HSP受體介導抗原肽的內吞，從形態(tài)學上推測了HSP受體的存在。
在2000年6月的J.Exp.Med上，Castellino和Singh-Jasuja等在不同的實驗中分別證實了DC表面存在HSP受體，并推測HSP受體是可飽和的，同時證實了HSP結合的抗原在胞內是通過TAP依賴及TAP非依賴途徑，被遞呈到MHC-I類分子上，并誘導隨后的CTL反應的。這種受體被證明存在于DC、巨噬細胞及B細胞等APC上，而不存在于T細胞上。因此可以認為，HSP通過HSP受體與APC相互作用是HSP作為佐劑的一個重要機理。研究表明，這種受體介導的抗原遞呈方式的效率比吞噬高1000～10000倍。
Asea等發(fā)現(xiàn)，HSP70分子在胞外可以行使類似細胞因子樣作用。HSP70可與單核細胞產生高親和力的結合，誘導其產生IL-6、IL-1等活性細胞因子，并可以誘導DC成熟，上調其MHC-II和CD86分子表達，分泌IL-12和TNF-α，從而增強DC的抗原遞呈能力。因此采用HSP作為免疫佐劑誘導DC，可以靶向性介導抗原的遞呈，增強抗原的遞呈效率，從而誘導更強的CTL反應。
然而，迄今為止，還沒有有效制備引發(fā)針對腫瘤的特異性免疫應答的腫瘤抗原的方法。因此，本領域迫切需要開發(fā)新的可有效引發(fā)針對腫瘤的免疫應答的腫瘤抗原及其制備方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是提供一種可有效引發(fā)針對腫瘤的免疫誘導的腫瘤抗原及其制備方法。
本發(fā)明的另一目的是提供用本發(fā)明的腫瘤抗原致敏的樹突狀細胞及其制備方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種腫瘤抗原的提取方法，包括步驟(a)在42℃加熱處理腫瘤細胞；(b)在55℃加熱處理腫瘤細胞；(c)使步驟(b)的腫瘤細胞裂解；(d)去除細胞碎片，分離獲得含有腫瘤抗原的上清液。
在一優(yōu)選例中，裂解細胞是通過凍融腫瘤細胞1-10次實現(xiàn)的。
在另一優(yōu)選例中，步驟(a)和(b)的處理時間為0.1-100小時。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種腫瘤抗原，它是熱休克蛋白-抗原肽的復合物，該復合物是通過以下步驟制備的(a)在42℃加熱處理腫瘤細胞；(b)在55℃加熱處理腫瘤細胞；(c)使步驟(b)的腫瘤細胞裂解；(d)離心去除細胞碎片，獲得含有熱休克蛋白-抗原肽的上清液。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種樹突狀細胞的致敏方法，包括步驟(a)在42℃加熱處理腫瘤細胞；(b)在55℃加熱處理腫瘤細胞；(c)使步驟(b)的腫瘤細胞裂解；(d)離心去除細胞碎片，獲得含有腫瘤抗原的上清液。
(e)將步驟(d)中的腫瘤抗原與樹突狀細胞共孵育，從而獲得致敏的樹突狀細胞。
在一優(yōu)選例中，步驟(e)中的樹突狀細胞來源于外周血單核細胞，且所述的樹突狀細胞是用下列方法制備的采用含50ng/ml的rhGM-CSF，10ng/ml的重組人白細胞介素-4的新鮮完全培養(yǎng)基，置5％二氧化碳，37℃，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)外周血單核細胞至第3天，往培養(yǎng)瓶中補充20ml含10％胎牛血清、rhGM-CSF50ng/ml、rhIL-410ng/ml的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至第6天。
在另一優(yōu)選例中，還包括步驟(f)將獲得的致敏的樹突狀細胞保存于體外保存液中，所述保存液的配方如下42.5％的RPMI-1640培養(yǎng)基，7.5％的DMSO，50％的濃度為20％人血漿白蛋白，按保存液的總體積計。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(e)中，腫瘤抗原與樹突狀細胞的混合比例為1微克抗原1×108個細胞至100微克抗原105個細胞。
在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤細胞是選自下組癌癥的腫瘤細胞結腸癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、宮頸癌、鼻咽癌、腦膠質瘤。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種藥物組合物或免疫組合物，它含有藥學上可接受的載體載體，以及本發(fā)明上述的腫瘤抗原或用所述腫瘤抗原致敏的樹突狀細胞。


圖1四個結腸癌患者腫瘤組織加熱前后，HSP70表達水平的比較(westernblot)，其中加熱后HSP70表達水平明顯升高圖2.誘導第6天的人樹突狀細胞的形態(tài)學觀察。
圖3.誘導前的單核細胞與誘導后樹突狀細胞的表型變化。
具體實施例方式
本發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)通過二步法熱誘導腫瘤細胞，可以使腫瘤細胞內HSP的表達明顯升高，通過反復凍融后，HSP攜帶腫瘤抗原大量地釋放于上清中，從而獲得大量的HSP-抗原肽的復合物，將這些復合物作為腫瘤抗原，可以更為高效地激活樹突狀細胞。在此基礎上完成了本發(fā)明。
首先，本發(fā)明的腫瘤抗原的提取方法，包括以下步驟(a)在較低的高溫下加熱處理腫瘤細胞(第一加熱階段)將分離的腫瘤細胞或組織，在比正常溫度稍高的溫度即第一加熱溫度(例如約42℃)下放置約一段時間，例如約0.1-100小時，較佳地0.2-10小時，更佳地0.5-5小時。
(b)在較高的高溫下加熱處理腫瘤細胞(第二加熱階段)將分離的腫瘤細胞或組織，在比正常溫度更稍高的溫度即第二加熱溫度(例如約55℃℃)下放置約一段時間，例如約0.1-100小時，較佳地約0.2-10小時，更佳地約0.5-5小時。
通常，第二加熱溫度比第一加熱溫度高約15-25℃。
(c)使步驟(b)的腫瘤細胞裂解可以采用本領域已知的各種方法來裂解腫瘤細胞，例如機械裂解或化學裂解。一種優(yōu)選的方法是凍融法，即通過反復凍融使細胞裂解。
(d)去除細胞碎片等雜質，分離獲得含有腫瘤抗原的上清液。
由于裂解后HSP-抗原多肽復合物存在于上清液中，因此可以用各種常規(guī)方法(例如，離心、超濾等)將細胞碎片等雜質去除，獲得含有HSP-抗原多肽復合物(即腫瘤抗原)的上清液。
可用于本發(fā)明的腫瘤細胞沒有特別限制，可以是任何一種腫瘤細胞，代表性例子包括(但并不限于)選自下組癌癥的腫瘤細胞結腸癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、宮頸癌、鼻咽癌、腦膠質瘤。
用本發(fā)明方法制備的腫瘤抗原，其成分主要是熱休克蛋白-抗原肽的復合物。實驗已表明，經過本發(fā)明的二步加熱處理后，上清液中HSP(例如HSP70)的表達明顯上升。
用本發(fā)明方法制備的腫瘤抗原，可以由多種應用。例如，作為免疫原來致敏樹突狀細胞，從而獲得致敏的樹突狀細胞，或者直接作為免疫原制備免疫組合物或藥物組合物。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物或免疫組合物。在所述組合物中，含有藥學上可接受的載體(包括稀釋劑、賦形劑等)以及有效量的本發(fā)明腫瘤抗原或者致敏的樹突狀細胞。腫瘤抗原的數(shù)量通常為10微克-100毫克/劑，較佳地為100-1000微克/劑。致敏的樹突狀細胞的數(shù)量通常為約105-108個細胞/劑。
本文所用的術語“有效量”指治療劑治療、緩解或預防目標疾病或狀況的量，或是表現(xiàn)出可檢測的治療或預防效果的量。對于某一對象的精確有效量取決于該對象的體型和健康狀況、病癥的性質和程度、以及選擇給予的治療劑和/或治療劑的組合。因此，預先指定準確的有效量是沒用的。然而，對于某給定的狀況而言，可以用常規(guī)實驗來確定該有效量，臨床醫(yī)師是能夠判斷出來的。
為了本發(fā)明的目的，有效的劑量為給予個體約0.01毫克/千克至50毫克/千克，較佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克的腫瘤抗原。對于致敏的樹突狀細胞而言，有效量通常為約105-108個細胞/個對象。
藥物組合物還可含有藥學上可接受的載體。術語“藥學上可接受的載體”指用于治療劑(例如腫瘤抗原)給藥的載體。該術語指這樣一些藥劑載體它們本身不誘導產生對接受該組合物的個體有害的抗體，且給藥后沒有過分的毒性。合適的載體可能是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物以及無活性的病毒顆粒。這些載體是本領域普通技術人員所熟知的。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到關于藥學上可接受的賦形劑的充分討論。
治療性組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質等。此外，免疫組合物中還可以含有免疫佐劑。
通常，可將治療性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液中、液體載體的固體形式。
一旦配成本發(fā)明的組合物，可將其直接給予對象。待預防或治療的對象可以是動物；尤其是人。
直接輸送該組合物通?？赏ㄟ^皮下、腹膜內、靜脈內或肌內注射或輸送至組織間隙來實現(xiàn)。組合物也可輸送至病灶區(qū)。其它給藥方式包括口服、和透皮施用等。治療劑量方案可以是單劑方案或多劑方案。
本發(fā)明還提供了用本發(fā)明的腫瘤抗原來致敏樹突狀細胞的方法，即將腫瘤抗原與樹突狀細胞共孵育，從而獲得致敏的樹突狀細胞。孵育時，腫瘤抗原與樹突狀細胞的混合比例為1微克抗原1×108個細胞至100微克抗原105個細胞，即1-100微克抗原1×105-1×108個細胞。較佳地混合比例為1微克抗原1×107個細胞至100微克抗原106個細胞孵育溫度和時間沒有特別限制，通常為35-37.5℃的溫度下孵育0.1-100小時(較佳地1-48小時)。
可用于本發(fā)明的樹突狀細胞沒有特別限制，可以采用各種來源的樹突狀細胞。尤其是人的樹突狀細胞。一種優(yōu)選的的樹突狀細胞來源于外周血單核細胞。
本發(fā)明還提供了一種制備樹突狀細胞的方法制備采用含25-100ng/ml的rhGM-CSF，5-20ng/ml的重組人白細胞介素-4的新鮮完全培養(yǎng)基，置5％二氧化碳，37℃，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)外周血單核細胞至第3天，往培養(yǎng)瓶中補充含10％胎牛血清、rhGM-CSF 25-100ng/ml、rhIL-4 5-20ng/ml的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至第6天。
致敏的樹突狀細胞可以常規(guī)方法保存。一種優(yōu)選的方法是將獲得的致敏的樹突狀細胞保存于體外保存液中，所述保存液的配方如下42.5％的RPMI-1640培養(yǎng)基，7.5％的DMSO，50％的濃度為20％人血漿白蛋白，按保存液的總體積計。該配方具有復蘇后樹突狀細胞存活率高，配方中成分毒性低、適用于應用于臨床的樹突狀細胞的保存及復蘇。此外，保存宜在液氮或超低溫冰箱中低溫保存。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)從腫瘤細胞中直接分離腫瘤抗原。這樣制備的腫瘤抗原包含了腫瘤中存在的所有抗原。目前的理論認為，腫瘤中的抗原是以“抗原指紋”的形式存在，而不是某個單獨的抗原，按照該理論，每個人的腫瘤抗原均存在個體差異，因此，從腫瘤細胞中分離的腫瘤抗原應是較為理想的途徑。
(2)工藝簡便，致敏效率高，使用安全。從熱誘導后的腫瘤細胞凍融上清中純化出腫瘤抗原，用于致敏樹突狀細胞，具有致敏效率高，所需抗原量少，使用安全，防止微生物污染等效果。
(3)結合本發(fā)明的樹突狀細胞專用凍存液，具有臨床使用安全、復蘇效率高的特點，從而解決了樹突狀細胞臨床治療的關鍵性問題。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1腫瘤抗原的制備取手術切除的無菌結腸癌腫瘤組織(4個病例)，用0.05％醋酸洗必泰溶液浸泡30分鐘，無菌生理鹽水沖洗3遍，用無菌的組織剪將腫瘤組織剪碎，加入5ml RPMI 1640培養(yǎng)基研磨，經200目鋼網(wǎng)過濾后收取單細胞懸液，然后用RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞(1×107/ml)，裝入5ml無菌凍存管，經42℃水浴加熱1小時后，60℃水浴繼續(xù)加熱1小時，將凍存管迅速浸入液氮速凍，10分鐘后取出，放入室溫融化；如此反復凍融5次，將腫瘤細胞裂解物加入15ml Falcon離心管，400×g離心20分鐘，收取上清。腫瘤細胞凍融上清經0.2μm的一次性無菌濾器過濾除菌，即為腫瘤抗原。
采用HSP70單抗作為一抗對加熱后及為加熱的腫瘤組織中分離的腫瘤抗原作Western-blot分析，結果如圖1所示，加熱后腫瘤抗原中HSP70的表達明顯增高。
實施例2樹突狀細胞的制備將收取的單個核細胞(約50-100ml)緩慢加入數(shù)個預加20ml淋巴細胞分離液的50ml Falcon離心管(細胞懸液體積與分離液體積相等)，離心管經嚴格配平后400×g室溫離心30分鐘，離心后用平口巴氏滴管吸取界面細胞，加入到30mlRPMI1640培養(yǎng)基中，200×g離心10分鐘，洗滌3遍，收取細胞，將經離心洗滌的單個核細胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基配成4×106/ml的細胞懸液，種入750ml無菌Falcon培養(yǎng)瓶，接種體積25ml，將盛有細胞的培養(yǎng)瓶置37℃、5％二氧化碳，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)貼壁2小時，將培養(yǎng)瓶取出，輕輕搖晃十數(shù)次，使非貼壁細胞懸起，棄去懸浮細胞，再緩慢往瓶中加入10mlRPMI1640培養(yǎng)基，輕輕晃動洗去殘留非貼壁細胞，往保留貼壁細胞的培養(yǎng)瓶中加入30ml含10％胎牛血清，rhGM-CSF50ng/ml，重組人白細胞介素-4(rhIL-4)10ng/ml的新鮮完全培養(yǎng)基置5％二氧化碳，37℃，飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至第3天，往培養(yǎng)瓶中補充20ml含10％胎牛血清、rhGM-CSF 50ng/ml、rhIL-410ng/ml的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2-3天，培養(yǎng)過程中每天2次觀察細胞的形態(tài)，在培養(yǎng)的第5，6天，可見細胞變?yōu)槊虪?，并聚集成團，終止培養(yǎng)。用10ml吸管輕輕吹打培養(yǎng)瓶底部，使部分半貼壁的樹突狀細胞懸起，將培養(yǎng)液吸入50ml離心管，200×g離心10分鐘，收取樹突狀細胞。
用流式細胞儀檢測誘導第6天的人樹突狀細胞的形態(tài)和表型變化，圖2和圖3顯示了樹突狀細胞的形態(tài)和表型變化。同時，采用混合淋巴細胞反應檢測其生物學功能。結果證實了獲得的細胞是樹突狀細胞。
實施例3樹突狀細胞的致敏將收取的樹突狀細胞用含10％胎牛血清、rhGM-CSF 50ng/ml、rhIL-410ng/ml的新鮮完全培養(yǎng)基配成2×106/ml的細胞懸液，加入實施例1中制備的腫瘤抗原至終濃度50μg/ml，過夜培養(yǎng)，用50ml離心管收取經與腫瘤抗原孵育過夜的樹突狀細胞懸液，200×g離心10分鐘，收取細胞；再加入40ml無菌生理鹽水，200×g離心10分鐘洗滌，連續(xù)3次。收集細胞即為抗原致敏的人樹突狀細胞(APDC)。
實施例4樹突狀細胞的凍存與復蘇將抗原致敏的人樹突狀細胞(APDC)半成品用預先配好的凍存液(RPMI-1640培養(yǎng)基占42.5％，DMSO占7.5％，20％的人血漿白蛋白占50％)配成1×107/ml的懸液，分裝入2ml凍存管中，1ml/管，放入專用的凍存盒(每分鐘1℃緩慢降溫)，置-80℃冰箱中冷凍保存，于輸注當天復蘇細胞。用潔凈的塑料杯加入200ml 40℃純凈水，將凍存的細胞從超低溫冰箱中取出后迅速放入溫水中完全解凍，然后將復蘇的細胞加入到50ml離心管中(離心管中預置37℃預熱的無菌生理鹽水40ml)，200×g離心10分鐘，洗滌3遍；用10ml含1％人血漿白蛋白的無菌生理鹽水配成細胞懸液，1×106個/ml，分10管，2-8℃保存。
實施例5抗原致敏的人樹突狀細胞刺激異體T淋巴細胞的增殖反應分離正常人外周血單個核細胞，置37℃培養(yǎng)2小時后去除貼壁細胞，非貼壁細胞用5％胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液懸浮，過尼龍毛柱(37℃孵育1小時)，制備的T淋巴細胞加入96孔板(2×105/孔)；APDC經絲裂霉素(25μg/ml)于37℃處理1小時后，懸于含10％胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，按不同劑量(1×104～1×105/孔)加入96孔板中與同種異體T淋巴細胞混合，每組設3個復孔，終體積為200μl；陰性對照組為在T淋巴細胞中加入等體積RPMI1640培養(yǎng)基，陽性對照組為在T淋巴細胞中加入終濃度為5μg/ml的PHA。置37℃、5％CO2孵箱中孵育96小時，于培養(yǎng)終止前4小時，每孔加入5mg/ml的MTT10μl，在37℃條件下繼續(xù)孵育4小時，將培養(yǎng)板200×g離心10分鐘，每孔吸出100ul上清，然后每孔加入10％SDS溶液100μl，在37℃放置8小時待甲臢結晶完全溶解后，用酶標儀測定光密度值(570nm)。采用Student t檢驗比較對照組及試驗組OD值。
結果如表1所示，經抗原致敏的人樹突狀細胞具有明顯刺激異體T淋巴細胞增殖的特性(p＜0.05)。
表1.抗原致敏的人樹突狀細胞刺激異體T淋巴細胞增殖的能力(p＜0.05)T∶DCOD1234∶1 0.3240.3260.34620∶10.3880.3760.37740∶10.3700.3670.365200∶1 0.3420.3450.318陽性對照 0.4470.3890.434陰性對 0.2690.2620.268實施例6樹突狀細胞的應用經實施例4凍存復蘇的細胞，通過相關檢定后，將其注入50ml注射用生理鹽水中，用前將細胞懸液搖勻，靜脈滴注，在滴注過程中每5分鐘輕輕晃動輸液袋，避免細胞沉降堆積，直致滴完?；蛘卟捎闷は伦⑸?，每次注射1ml，每周注射1次，連續(xù)3次為一個療程。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種腫瘤抗原的提取方法，其特征在于，包括步驟(a)在42℃加熱處理腫瘤細胞；(b)在55℃加熱處理腫瘤細胞；(c)使步驟(b)的腫瘤細胞裂解；(d)去除細胞碎片，分離獲得含有腫瘤抗原的上清液。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，裂解細胞是通過凍融腫瘤細胞1-10次實現(xiàn)的。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(a)和(b)的處理時間為0.1-100小時。
4.一種腫瘤抗原，其特征在于，它是熱休克蛋白-抗原肽的復合物，該復合物是通過以下步驟制備的(a)在42℃加熱處理腫瘤細胞；(b)在55℃加熱處理腫瘤細胞；(c)使步驟(b)的腫瘤細胞裂解；(d)離心去除細胞碎片，獲得含有熱休克蛋白-抗原肽的上清液。
5.一種樹突狀細胞的致敏方法，其特征在于，包括步驟(a)在42℃加熱處理腫瘤細胞；(b)在55℃加熱處理腫瘤細胞；(c)使步驟(b)的腫瘤細胞裂解；(d)離心去除細胞碎片，獲得含有腫瘤抗原的上清液。(e)將步驟(d)中的腫瘤抗原與樹突狀細胞共孵育，從而獲得致敏的樹突狀細胞。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(e)中的樹突狀細胞來源于外周血單核細胞，且所述的樹突狀細胞是用下列方法制備的采用含50ng/ml的rhGM-CSF，10ng/ml的重組人白細胞介素-4的新鮮完全培養(yǎng)基，置5％二氧化碳，37℃，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)外周血單核細胞至第3天，往培養(yǎng)瓶中補充20ml含10％胎牛血清、rhGM-CSF 50ng/ml、rhIL-4 10ng/ml的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至第6天。
7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，還包括步驟(f)將獲得的致敏的樹突狀細胞保存于體外保存液中，所述保存液的配方如下42.5％的RPMI-1640培養(yǎng)基，7.5％的DMSO，50％的濃度為20％人血漿白蛋白，按保存液的總體積計。
8.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(e)中，腫瘤抗原與樹突狀細胞的混合比例為1微克抗原1×108個細胞至100微克抗原105個細胞。
9.如權利要求5所述的方法，所述的腫瘤細胞是選自下組癌癥的腫瘤細胞結腸癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、宮頸癌、鼻咽癌、腦膠質瘤。
10.一種藥物組合物或免疫組合物，其特征在于，它含有藥學上可接受的載體載體，以及權利要求4所述的腫瘤抗原或用所述腫瘤抗原致敏的樹突狀細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的人樹突狀細胞的致敏方法及制備保存工藝及其在抗腫瘤免疫中的應用，將這種新的樹突狀細胞的致敏方法及制備保存工藝用于臨床，具有致敏效率高，所需抗原量少，細胞保存時間長，凍存后復蘇率高，適用于臨床應用等優(yōu)點，尤其適用于結腸癌等癌癥的治療。
文檔編號A61K45/00GK1475498SQ02136518
公開日2004年2月18日 申請日期2002年8月16日 優(yōu)先權日2002年8月16日
發(fā)明者王建莉 申請人:上海海欣生物技術有限公司