專利名稱：用于紅細(xì)胞代用品的交聯(lián)血紅蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種制備用于紅細(xì)胞代用品的交聯(lián)血紅蛋白的方法。具體講是以血紅蛋白，特別是以人血紅蛋白為基礎(chǔ)，為使其在特性上能更適宜用作紅細(xì)胞代用品而進(jìn)行的化學(xué)交聯(lián)處理方法。
背景技術(shù)：
血紅蛋白作為血液中的天然氧氣運(yùn)輸成分，是目前制備紅細(xì)胞代用品的主要目標(biāo)?，F(xiàn)已了解，血紅蛋白是一種由四個(gè)亞基組成的四聚體形式的結(jié)構(gòu)，其中包括了兩個(gè)α亞基和兩個(gè)β亞基，每個(gè)亞基有一個(gè)球蛋白肽鏈，四聚體物的分子量約為64,000道爾頓，其中每個(gè)亞基的分子量相近。研究發(fā)現(xiàn)，四聚體的血紅蛋白脫離了紅細(xì)胞后極易離解為αβ二聚體，在某些情況下，甚至還會(huì)進(jìn)一步離解為α亞基和β亞基的單體。由于離解后的血紅蛋白分子量太小，使其不能在身體的循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)保留而迅速被腎臟過濾，隨尿排出體外。因其半衰期太短，且易引起腎損傷，故達(dá)不到作為紅細(xì)胞代用品的作用。另外，由于未交聯(lián)聚合的血紅蛋白分子能穿過血管壁而與血管舒張因子NO結(jié)合，導(dǎo)致血管收縮，使血壓升高。因此，使上述血紅蛋白亞單位之間和在兩個(gè)和多個(gè)四聚體之間進(jìn)行交聯(lián)聚合，使之形成分子量大于64,000道爾頓的血紅蛋白寡聚物和多聚物，以延長(zhǎng)其半衰期，并消除腎毒性等副作用是非常必要的。
文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)顯示，科學(xué)家們已為此進(jìn)行了大量的研究工作，以期制備出一種令人滿意的以血紅蛋白為基礎(chǔ)、并能克服血紅蛋白在血紅細(xì)胞之外在化學(xué)性質(zhì)上的不利因素的紅細(xì)胞代用品。在使血紅蛋白分子進(jìn)行交聯(lián)聚合，形成分子量大于64,000道爾頓的血紅蛋白寡聚物和多聚物的過程中，這些工作的目的主要是尋找適當(dāng)?shù)慕宦?lián)劑，以及適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件。在交聯(lián)劑的選擇中，目前一般多是以開環(huán)棉子糖、三糖棉子糖等糖類，或是以戊二醛為交聯(lián)劑。在采用糖類化合物作為交聯(lián)劑的方法中，如，4,857,636號(hào)的美國(guó)專利文獻(xiàn)提出了一種以糖類作為交聯(lián)劑，在20∶1摩爾比的條件下進(jìn)行反應(yīng)，對(duì)得到穩(wěn)定的聯(lián)分子是有益的。第5,770,727號(hào)美國(guó)專利報(bào)導(dǎo)了采用開環(huán)棉子糖為交聯(lián)劑的方法，在pH5.0-7.0的緩沖體系下，以交聯(lián)劑與血紅蛋白摩爾比為1～4∶1反應(yīng)24小時(shí)，得到的交聯(lián)血紅蛋白中四聚體的含量為40％，二聚體含量小于5％。公開號(hào)為CN 1105800A的中國(guó)專利文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)了一種以由環(huán)開放氧化的雙/三糖如棉子糖為交聯(lián)劑，在pH5.0-7.0的條件下，以摩爾比為1∶1～4∶1的bis-tris緩沖體系中反應(yīng)，所得的交聯(lián)產(chǎn)物中無大于600K道爾頓的分子，脫氧血紅蛋白含量在1％-15％。由于以糖類化合物為交聯(lián)劑進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，血紅蛋白易發(fā)生分子內(nèi)的交聯(lián)，因此所得交聯(lián)產(chǎn)物中的四聚體等不需要的小分子血紅蛋白的比例較大，因此，在交聯(lián)反應(yīng)中使用較多的另一種交聯(lián)劑是戊二醛。
在采用戊二醛為交聯(lián)劑的方法中，第5,194,590號(hào)和第6,323,320號(hào)美國(guó)專利采用的反應(yīng)體系均為pH8.0的偏堿性，底物的血紅蛋白的濃度為14-15克/100毫升，以戊二醛為血紅蛋白分子摩爾比14.8-18.1倍的方式反應(yīng)3.5-4小時(shí)，可得到70％的聚合物，反應(yīng)7小時(shí)的聚合轉(zhuǎn)化率可達(dá)80-90％，但高分子部分的量顯著增加；第5,753,616號(hào)美國(guó)專利報(bào)導(dǎo)了以巰基化合物作為穩(wěn)定劑，底物血紅蛋白濃度為40克/升，在pH7.6-7.9的條件下，以交聯(lián)劑為血紅蛋白20-40倍摩爾比和42℃條件下反應(yīng)5小時(shí)；第5,895,810號(hào)美國(guó)專利報(bào)導(dǎo)了一種采用類似方式的制備方法。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，交聯(lián)反應(yīng)中生成的超大分子，例如分子量＞600,000道爾頓的交聯(lián)產(chǎn)物，對(duì)于后期的純化、終產(chǎn)品的粘度、穩(wěn)定性等均有極為不利的影響?，F(xiàn)已有試驗(yàn)結(jié)果顯示，在采用戊二醛為交聯(lián)劑的方法中，影響交聯(lián)反應(yīng)，尤其是影響其交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物分子量分布的不均勻、以及超大分子量產(chǎn)物形成的因素較多，例如，僅反應(yīng)環(huán)境的pH高低就可以有較大的影響，特別是在偏堿性的反應(yīng)環(huán)境中，由于易使血紅蛋白分子中的胺基的活性過高，是形成超大分子產(chǎn)物的重要原因之一。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述情況，本發(fā)明提供的是一種以戊二醛為交聯(lián)劑使血紅蛋白進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，以制備可用作紅細(xì)胞代用品的交聯(lián)聚合血紅蛋白的更為理想的方法。該方法能在更為簡(jiǎn)化的反應(yīng)條件和縮短反應(yīng)時(shí)間的前提下，制備出對(duì)高鐵血紅蛋白的控制較好，交聯(lián)產(chǎn)物的分子量分布也更為滿意的交聯(lián)聚合血紅蛋白。
本發(fā)明用于紅細(xì)胞代用品的交聯(lián)血紅蛋白的制備方法，采用的是以戊二醛為交聯(lián)劑對(duì)血紅蛋白的水溶液進(jìn)行處理。具體處理方法，是使已作脫氧處理后的血紅蛋白溶液在pH6.0-7.5，以及混合有為血紅蛋白分子1-10倍摩爾比的多氨基化合物作為交聯(lián)競(jìng)爭(zhēng)抑制劑的條件下，以充分分散的形式加入為血紅蛋白分子7-14倍摩爾比的戊二醛反應(yīng)，反應(yīng)完畢再次加入多于為封閉殘留戊二醛的醛基所需量的競(jìng)爭(zhēng)抑制劑后，按常規(guī)方式進(jìn)行還原劑反應(yīng)并作常規(guī)過濾和超濾后，即得到分子量分布合適的交聯(lián)血紅蛋白溶液。其中，作為反應(yīng)底物的血紅蛋白溶液的重量/體積濃度一般可以在8％-14％的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的上述方法中，可以作為原料使用的血紅蛋白，雖并不排除如上述文獻(xiàn)所報(bào)導(dǎo)的使用由牛血細(xì)胞分離得到的牛血紅蛋白，但為避免如瘋牛病等人與動(dòng)物間可能發(fā)生的一些交叉感染性疾病，以及避免因異源性蛋白可能帶來的免疫問題和隨外源性基因而可能引發(fā)的更深層次的問題，特別建議的是采用人血紅蛋白，其中可以包括由人的外周血和/或胎盤血中分離得到的人血紅蛋白。在按本發(fā)明方法進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)時(shí)，所用的血紅蛋白溶液，既可以是由人紅細(xì)胞中直接分離并經(jīng)純化的天然人血紅蛋白溶液，也可以是按常規(guī)方式以5-磷酸吡哆醛對(duì)該血紅蛋白又進(jìn)行了PLP修飾所得到的吡哆醛血紅蛋白溶液。
如上述，戊二醛為交聯(lián)劑對(duì)血紅蛋白進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)環(huán)境的pH對(duì)交聯(lián)反應(yīng)有明顯的影響。例如，以血紅蛋白溶液的濃度為12％(w/v)和戊二醛與血紅蛋白分子的摩爾比為20∶1的同樣條件下，使上述的交聯(lián)反應(yīng)分別在pH＝7.30和pH＝6.80的不同反應(yīng)體系中進(jìn)行的試驗(yàn)結(jié)果顯示，以高壓液相對(duì)兩者的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，前者產(chǎn)物中分子量＞60萬D(道爾頓)的交聯(lián)血紅蛋白的比例可達(dá)33.9％，后者的則只有23.9％。因此本發(fā)明方法將交聯(lián)反應(yīng)的條件控制在中性偏酸、弱酸性及中性生理?xiàng)l件的環(huán)境，即在pH＝6.0-7.5的范圍內(nèi)進(jìn)行，而不是堿性的條件，是使交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物中＞60萬D部分的交聯(lián)血紅蛋白的比例能得到滿意控制的一個(gè)重要因素。
試驗(yàn)結(jié)果還顯示，在上述方法的基礎(chǔ)上，如能適應(yīng)隨交聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)底物逐漸減少和反應(yīng)產(chǎn)物逐漸增多的反應(yīng)進(jìn)程的變化，進(jìn)一步將對(duì)反應(yīng)環(huán)境條件pH的控制方式采用由低向高逐步調(diào)節(jié)的形式，即使反應(yīng)條件中的pH6.0-7.5采用在加入戊二醛之前為pH＝6.0-6.5；加入戊二醛以后，再使反應(yīng)溶液的pH漸升高至7.0-7.5的形式。這樣，可以在使超大分子產(chǎn)物的生成得到有效的控制，并提高交聯(lián)反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率方面能產(chǎn)生更為理想的效果。例如，采取這種調(diào)節(jié)pH形式時(shí)較為簡(jiǎn)單的方式之一，是采取分段方式調(diào)節(jié)pH，即在加入戊二醛之前先將反應(yīng)溶液調(diào)節(jié)成pH＝6.0-6.5；自戊二醛的加入后期起，再將pH調(diào)至7.0-7.5。這里所說的戊二醛的加入后期，則既可以是在戊二醛的加入后期隨戊二醛的加入同時(shí)進(jìn)行pH的調(diào)節(jié)，也可以是在戊二醛全部加入后，再進(jìn)行第二次的pH調(diào)節(jié)。
以戊二醛為交聯(lián)劑進(jìn)行的上述交聯(lián)反應(yīng)如能在無氧環(huán)境中進(jìn)行，對(duì)于控制產(chǎn)物中高鐵血紅蛋白成分的比例是有利的?；谕荒康?，進(jìn)一步，還可以使上述與戊二醛進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)前的含脫氧血紅蛋白的溶液中還加入有醫(yī)學(xué)上可以接受的抗氧劑，例如常用的維生素C、葡萄糖中的至少一種；或是采用如半胱氨酸、谷胱甘肽等目前已有報(bào)導(dǎo)使用的適當(dāng)形式的巰基化合物等抗氧劑，對(duì)于保證反應(yīng)物中血紅蛋白的脫氧狀態(tài)，防止高鐵產(chǎn)物的生成將會(huì)更為有利。上述對(duì)血紅蛋白溶液pH的調(diào)節(jié)，同樣也可以采用維生素C，并且還可以因此而具有一舉兩得的效果。
在上述方法中所說的對(duì)血紅蛋白溶液進(jìn)行的脫氧處理，一般可以采用目前已有采用的常用脫氧方法。例如，可以采用在真空條件下使被處理的血紅蛋白溶液釋放其所含的氧的方法，或者是采用向被處理的血紅蛋白溶液中通入無氧的氮?dú)夂?或其它惰性氣體將氧攜帶走等方法。試驗(yàn)表明，如能將此兩種或多種方法以適當(dāng)?shù)姆绞铰?lián)合使用，脫氧的效果會(huì)更為理想。
試驗(yàn)結(jié)果表明，在血紅蛋白與戊二醛交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)之前，預(yù)先向血紅蛋白溶液中加入多氨基化合物形式的交聯(lián)競(jìng)爭(zhēng)抑制劑，可以有效地減少和避免在交聯(lián)反應(yīng)中超大分子產(chǎn)物大量生成，是本發(fā)明方法中控制超大分子產(chǎn)物比例和保證產(chǎn)物分子量分布均勻的又一重要和有效的措施。例如，在反應(yīng)底物的血紅蛋白濃度為8.0％、戊二醛與血紅蛋白分子摩爾比為14∶1的同樣情況下，未加入任何交聯(lián)抑制劑進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)后，＞60萬D部分的交聯(lián)血紅蛋白比例可高達(dá)46.％；而在血紅蛋白溶液中預(yù)先加入了為血紅蛋白5倍摩爾比的量的賴氨酸后，再加入戊二醛進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，則產(chǎn)物中＞60萬D部分的交聯(lián)血紅蛋白比例則可降低至13.7％，差別十分顯著?？稍诒景l(fā)明上述方法中作為交聯(lián)競(jìng)爭(zhēng)抑制劑的多氨基化合物，一般可以采用乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺等醇胺類化合物，或者是如甘氨酸、賴氨酸、精氨酸等多種中性氨基酸中的至少一種。據(jù)研究，由于血紅蛋白的表面約有40個(gè)賴氨酸側(cè)鏈氨基，以及四個(gè)鏈端氨基可以參與反應(yīng)，其與戊二醛之間進(jìn)行的交聯(lián)反應(yīng)，特別是在避免形成超大分子產(chǎn)物時(shí)較難控制，致使交聯(lián)反應(yīng)的終產(chǎn)物必然是一種非均一分子量的混合物形式。本發(fā)明的方法中，在血紅蛋白與戊二醛進(jìn)行的交聯(lián)反應(yīng)前，采取了預(yù)先加入適當(dāng)量的多氨基化合物作為競(jìng)爭(zhēng)性交聯(lián)抑制劑，使其中所含的氨基在交聯(lián)反應(yīng)過程中可以與血紅蛋白分子形成競(jìng)爭(zhēng)，因而對(duì)于防止血紅蛋白分子在交聯(lián)反應(yīng)中形成不需要的超大分子產(chǎn)物是極為有利的，并且已如上述及更多的試驗(yàn)結(jié)果所證實(shí)。
試驗(yàn)顯示，上述所說加入的交聯(lián)競(jìng)爭(zhēng)抑制劑的量一般控制在血紅蛋白分子1-10倍摩爾比的范圍內(nèi)即可。加入過多量的交聯(lián)競(jìng)爭(zhēng)抑制劑，雖有利于減少超大分子結(jié)構(gòu)產(chǎn)物的形成，但有會(huì)影響所需的正常分子量部分的血紅蛋白產(chǎn)物的收率，因此可根據(jù)反應(yīng)環(huán)境、所用交聯(lián)競(jìng)爭(zhēng)抑制劑的種類等具體條件，由試驗(yàn)確定其適宜或最佳的使用量。
本發(fā)明的上述方法中，為防止血紅蛋白分子在交聯(lián)反應(yīng)中形成超大分子產(chǎn)物，另一個(gè)同樣應(yīng)當(dāng)注意的重要因素，是對(duì)交聯(lián)劑的加入方式，即，應(yīng)采取以充分分散的形式加入，盡量避免使在所加入的戊二醛交聯(lián)劑的局部濃度過大。例如，試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)采用血紅蛋白濃度為4-5％、pH＝6.4和戊二醛與血紅蛋白摩爾比為9-10∶1的同樣反應(yīng)條件下，采用常規(guī)表面滴加和采用充分分散的不同方式加入戊二醛時(shí)，前者產(chǎn)物中分子量＞60萬D部分的比例有18.8％，后者則甚至可為零。為此，在可以采取的措施中，一方面可以通過控制所使用的戊二醛交聯(lián)劑的濃度。例如，試驗(yàn)結(jié)果顯示，一般將所使用的戊二醛交聯(lián)劑的重量/體積濃度控制為0.5-5％范圍內(nèi)是適宜的。另一方面，是控制加入戊二醛方式和/或速度。同樣由試驗(yàn)結(jié)果顯示，在加入交聯(lián)劑時(shí)，一般將戊二醛的加入速度控制在0.1-0.5毫升/分鐘·100毫升范圍內(nèi)也是適宜的。再一方面是充分的攪拌。在化學(xué)反應(yīng)中，充分?jǐn)嚢璧闹匾允菬o庸置疑的。但應(yīng)注意的是，由于此類反應(yīng)中血紅蛋白的特殊性，在防止和避免引起血紅蛋白的變性等不利影響的前提下，充分的攪拌也是可以采取的措施之一。此外，在實(shí)現(xiàn)上述所說的以充分分散的形式加入交聯(lián)劑時(shí)可以采用的具體加入方式和/或所使用的設(shè)備中，例如除可以采用前述文獻(xiàn)中已有報(bào)導(dǎo)的采用半透膜形式的加料設(shè)備和方式，使戊二醛均勻進(jìn)入并分散于反應(yīng)物中的形式，還可以采用也能使物料以充分分散的形式被加入和混合的其它結(jié)構(gòu)形式的加料設(shè)備和/或加料方式，例如可以采用具有砂芯結(jié)構(gòu)的加料設(shè)備或可具有類似均勻分散作用和效果的其它加料裝置。采用前述文獻(xiàn)中半透膜形式的加料裝置時(shí)，特別應(yīng)注意防止其半透膜孔的易被堵塞，以及受擠壓泵的反復(fù)擠壓易引致血紅蛋白變性的情況。試驗(yàn)結(jié)果證明，在加入交聯(lián)劑時(shí)，如能將上述的兩種或幾種有助于充分分散和混合的加料形式相互配合使用，對(duì)于防止在交聯(lián)反應(yīng)中超大分子產(chǎn)物的形成將會(huì)有更為理想的效果。
上述方法中所說的在交聯(lián)反應(yīng)完畢后，再次加入多于封閉殘留戊二醛的醛基所需量的競(jìng)爭(zhēng)抑制劑，對(duì)于及時(shí)終止反應(yīng)，防止超大分子產(chǎn)物的生成而言，又是另一個(gè)重要的措施。反應(yīng)終點(diǎn)的控制，一般可以通過對(duì)反應(yīng)進(jìn)程隨時(shí)進(jìn)行的檢測(cè)監(jiān)控實(shí)現(xiàn)。當(dāng)反應(yīng)物中寡聚物結(jié)構(gòu)形式血紅蛋白的量達(dá)到所需的要求后，應(yīng)盡快終止反應(yīng)，此時(shí)可以向反應(yīng)物中再次加入交聯(lián)競(jìng)爭(zhēng)抑制劑，將進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)后的殘留戊二醛分子中的活性醛基全部封閉。此時(shí)所加入的交聯(lián)競(jìng)爭(zhēng)抑制劑，既可以為與第一次加入的競(jìng)爭(zhēng)抑制劑相同，也可以與第一次加入的不同。所說的加入多于封閉全部殘留的戊二醛中的醛基所需量的競(jìng)爭(zhēng)抑制劑的量，試驗(yàn)結(jié)果提示，一般可以采用為血紅蛋白分子摩爾量的5-20倍。
血紅蛋白與戊二醛進(jìn)行的交聯(lián)反應(yīng)，根據(jù)化學(xué)反應(yīng)的一般規(guī)律，提高反應(yīng)溫度將有利于提高反應(yīng)速度，縮短反應(yīng)時(shí)間。因此，在保持反應(yīng)物中的血紅蛋白分子和/或反應(yīng)后的交聯(lián)聚合血紅蛋白產(chǎn)物的活性不變形和受影響的前提下，可以使交聯(lián)反應(yīng)在相對(duì)較高的溫度下進(jìn)行，例如采用文獻(xiàn)中已有報(bào)導(dǎo)的40℃以上的溫度。但是另一方面，反應(yīng)溫度的提高，同樣也會(huì)導(dǎo)致不希望的高鐵血紅蛋白等成分的增加。試驗(yàn)結(jié)果顯示，一般情況下，將交聯(lián)反應(yīng)控制在0℃-4℃的溫度條件下進(jìn)行，效果將是更令人滿意的。而且，此時(shí)的交聯(lián)反應(yīng)一般都可以在2-5小時(shí)的時(shí)間內(nèi)完成。
交聯(lián)反應(yīng)完畢并再次加入多于封閉殘留戊二醛的醛基所需量的競(jìng)爭(zhēng)抑制劑，并以還原劑使通過交聯(lián)反應(yīng)所形成的希夫堿中不穩(wěn)定的雙鍵還原為穩(wěn)定的單鍵，是目前對(duì)血紅蛋白進(jìn)行交聯(lián)處理后的一種常規(guī)操作。因而，可以采用以硼氫化鈉或甲硼烷類化合物等為還原劑的常規(guī)方式進(jìn)行還原反應(yīng)。對(duì)還原反應(yīng)后的產(chǎn)物，同樣也可以按常規(guī)方式進(jìn)行后續(xù)的過濾和超濾等后處理。
由于在采用以戊二醛為交聯(lián)劑對(duì)血紅蛋白進(jìn)行的交聯(lián)反應(yīng)中，控制交聯(lián)產(chǎn)物的分子量及其分布狀態(tài)一直是一個(gè)難點(diǎn)。由于交聯(lián)反應(yīng)后的交聯(lián)血紅蛋白產(chǎn)物是一種非均一分子量的混合物形式，其中過低分子量產(chǎn)物的穩(wěn)定性差，容易離解并造成腎毒性，且攜氧效率低；過大分子量的產(chǎn)物又會(huì)使血液的粘度增加，不利于血液的流動(dòng)，而且會(huì)沉積在血管內(nèi)壁及肝、脾中。體外實(shí)驗(yàn)表明，分子量在13萬D和60萬D之間的中等分子量的交聯(lián)血紅蛋白產(chǎn)物的穩(wěn)定性較好，攜氧效率接近人的全血，有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值和前景。大量試驗(yàn)結(jié)果顯示，采用本發(fā)明上述的制備方法，除反應(yīng)條件溫和外，由于使交聯(lián)反應(yīng)控制在較低pH的條件下進(jìn)行，顯著降低了血紅蛋白分子中的胺基的活性；同時(shí)又在交聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)物中預(yù)先加入了競(jìng)爭(zhēng)性的交聯(lián)抑制劑，進(jìn)一步減低了交聯(lián)劑戊二醛對(duì)血紅蛋白的反應(yīng)活性，再通過調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度和交聯(lián)劑加入方式等多種措施的進(jìn)一步配合，可以使血紅蛋白產(chǎn)物的分子量分布達(dá)到使＞60萬D部分的所占比例被嚴(yán)格控制在較為理想的5％范圍內(nèi)，交聯(lián)反應(yīng)前后的高鐵產(chǎn)物可控制在5％以內(nèi)，半飽和時(shí)氧的氧分壓(P50)僅降低1-3毫米汞柱。
根據(jù)上述內(nèi)容，在不背離本發(fā)明上述技術(shù)思想的情況下，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，對(duì)上述內(nèi)容還可以作出多種形式的修改、替換或變更。
以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1以按常規(guī)方式經(jīng)5-磷酸吡哆醛進(jìn)行PLP修飾后的吡哆醛血紅蛋白溶液為原料，血紅蛋白濃度為11.26％(w/v)，高鐵血紅蛋白含量為3.59％(w/w)，反應(yīng)容器置4℃冰浴中，用10％C維生素溶液調(diào)節(jié)pH至6.70，此時(shí)血紅蛋白的濃度為10.6％，體積約為755毫升。通入濕潤(rùn)的高純度N20.5-1小時(shí)，使血紅蛋白轉(zhuǎn)化為脫氧血紅蛋白，溶液中加入0.1％谷胱甘肽作為抗氧劑，并預(yù)加為血紅蛋白摩爾量5倍的賴氨酸。在充分而溫和的攪拌狀態(tài)下，用恒流泵經(jīng)砂芯加樣裝置以0.1毫升/分鐘·100毫升的速度加入1％(w/v)的戊二醛溶液，戊二醛與血紅蛋白分子的摩爾比為13∶1，分二次加入，第一次加入11份，反應(yīng)～0.5小時(shí)后，再加入剩余量的戊二醛并繼續(xù)反應(yīng)～1小時(shí)，反應(yīng)完畢。之后，加入血紅蛋白分子摩爾比11倍量的賴氨酸溶液，反應(yīng)2小時(shí)后，加入為血紅蛋白分子摩爾比20倍的硼氫化鈉溶液按常規(guī)方式進(jìn)行還原反應(yīng)。整個(gè)交聯(lián)反應(yīng)過程均以高壓液相跟蹤檢測(cè)反應(yīng)物中交聯(lián)血紅蛋白的分子量分布狀況。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)過濾和超濾處理，即得到所需要的交聯(lián)血紅蛋白溶液產(chǎn)品。經(jīng)檢測(cè)，所得產(chǎn)品的高鐵血紅蛋白為3.4％(w/w)，分子量＞60萬D的超大分子部分占2.9％，分子量為12萬D～60萬D的占47.1％，其中四聚體血紅蛋白的比例為30.8％，二聚體血紅蛋白的比例為19.2％。
實(shí)施例2交聯(lián)反應(yīng)的操作方式同上例。其中，血紅蛋白溶液為對(duì)血紅蛋白經(jīng)過純化處理但未作PLP修飾的血紅蛋白溶液650毫升，血紅蛋白濃度為12％，用維生素C調(diào)節(jié)pH6.70。在4℃冰浴下用濕潤(rùn)N2流脫氧0.5-1小時(shí)。交聯(lián)反應(yīng)前加入2％的維生素C或谷胱甘肽，以及血紅蛋白摩爾量5倍的甘氨酸或乙醇胺作為交聯(lián)競(jìng)爭(zhēng)抑制劑后，加入作脫氧處理后的1％戊二醛，加入量為血紅蛋白摩爾量的15倍，加入速度為0.2毫升/分鐘·100毫升，并不斷攪拌。4小時(shí)后，用血紅蛋白摩爾量11倍的賴氨酸作為終止劑，反應(yīng)2小時(shí)。然后加入59毫升的1.56％硼氫化鈉溶液進(jìn)行還原反應(yīng)4小時(shí)，進(jìn)行常規(guī)過濾和超濾。高壓液相檢測(cè)的結(jié)果表明產(chǎn)物中分子量＞60萬D的超大分子部分的交聯(lián)血紅蛋白占6.8％，分子量為12萬D～60萬D的占32.2％，其中四聚體血紅蛋白的比例為21.4％，二聚體血紅蛋白的比例為39.7％。
實(shí)施例3操作過程同實(shí)施例1。
以經(jīng)過PLP修飾后的吡哆醛血紅蛋白溶液為原料，血紅蛋白濃度為8％，體積600毫升，用維生素C調(diào)節(jié)pH＝6.40。在預(yù)加為血紅蛋白摩爾量2倍的精氨酸溶液后，加入濃度為1％的戊二醛52.5毫升，加入量為血紅蛋白摩爾量的7倍。加入速度為0.3毫升/分鐘·100毫升，反應(yīng)30分鐘。然后，用20％磷酸氫二鈉調(diào)節(jié)pH＝6.90，并在再次預(yù)加4倍量的精氨酸溶液后，再加入3.5倍量的1％戊二醛26毫升，加入速度同前。第二次反應(yīng)完后，再用同樣的磷酸氫二鈉調(diào)節(jié)pH＝7.40，并再加入4倍量的精氨酸溶液，然后第三次加入3.5倍量的同樣戊二醛溶液，加入速度不變。整個(gè)反應(yīng)過程中不斷攪拌。第三次加完戊二醛并反應(yīng)0.5小時(shí)后，加入血紅蛋白摩爾量11倍的精氨酸終止反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間2小時(shí)。然后用1.56％硼氫化鈉36毫升(20倍量)進(jìn)行還原反應(yīng)4小時(shí)后，進(jìn)行過濾和超濾。通過S-300中效柱對(duì)所得產(chǎn)品的檢測(cè)，結(jié)果顯示產(chǎn)物中分子量＞60萬D的超大分子部分的交聯(lián)血紅蛋白占5％，分子量為12萬D～60萬D的占36.9％，其中四聚體血紅蛋白的比例為20％，二聚體血紅蛋白的比例為38.1％。
權(quán)利要求
1.用于紅細(xì)胞代用品的交聯(lián)血紅蛋白的制備方法，以戊二醛為交聯(lián)劑對(duì)血紅蛋白溶液進(jìn)行處理，其特征是使已作脫氧處理后的血紅蛋白溶液在pH6.0-7.5，以及混合有為血紅蛋白分子1-10倍摩爾比的多氨基化合物作為交聯(lián)競(jìng)爭(zhēng)抑制劑的條件下，以充分分散的形式加入為血紅蛋白分子7-14倍摩爾比的戊二醛反應(yīng)，反應(yīng)完畢再次加入多于為封閉殘留戊二醛的醛基所需量的競(jìng)爭(zhēng)抑制劑后，按常規(guī)方式進(jìn)行還原反應(yīng)并作常規(guī)過濾和超濾后，即得到分子量分布合適的交聯(lián)血紅蛋白溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的用于紅細(xì)胞代用品的交聯(lián)血紅蛋白的制備方法，其特征是所說反應(yīng)條件中的pH6.0-7.5為加入戊二醛之前的pH＝6.0-6.5，加入戊二醛以后，反應(yīng)溶液的pH漸升高至7.0-7.5。
3.如權(quán)利要求1所述的用于紅細(xì)胞代用品的交聯(lián)血紅蛋白的制備方法，其特征是在與戊二醛進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)前的含脫氧血紅蛋白的溶液中還加入有醫(yī)學(xué)上可以接受的抗氧劑。
4.如權(quán)利要求3所述的用于紅細(xì)胞代用品的交聯(lián)血紅蛋白的制備方法，其特征是所說的醫(yī)學(xué)上可以接受的抗氧劑為維生素C、葡萄糖或巰基化合物中的至少一種。
5.如權(quán)利要求1所述的用于紅細(xì)胞代用品的交聯(lián)血紅蛋白的制備方法，其特征是對(duì)血紅蛋白溶液進(jìn)行脫氧處理采用在真空條件下使被處理的血紅蛋白溶液釋放其所含的氧的方法，或者是向被處理的血紅蛋白溶液中通入無氧的氮?dú)夂?或其它惰性氣體方法中的一種。
6.如權(quán)利要求1所述的用于紅細(xì)胞代用品的交聯(lián)血紅蛋白的制備方法，其特征是將脫氧血紅蛋白溶液調(diào)節(jié)為pH6.0-7.0時(shí)采用的是維生素C。
7.如權(quán)利要求1所述的用于紅細(xì)胞代用品的交聯(lián)血紅蛋白的制備方法，其特征是所說的可作為交聯(lián)競(jìng)爭(zhēng)抑制劑的多氨基化合物為乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺或中性氨基酸中的至少一種。
8.如權(quán)利要求1所述的用于紅細(xì)胞代用品的交聯(lián)血紅蛋白的制備方法，其特征是所用的交聯(lián)劑戊二醛的重量/體積濃度為0.5-5％。
9.如權(quán)利要求8所述的用于紅細(xì)胞代用品的交聯(lián)血紅蛋白的制備方法，其特征是所說的交聯(lián)劑戊二醛的加入速度為0.1-0.5毫升/分鐘·100毫升。
10.如權(quán)利要求1所述的用于紅細(xì)胞代用品的交聯(lián)血紅蛋白的制備方法，其特征是所說的交聯(lián)反應(yīng)完畢后再次加入多于封閉殘留戊二醛的醛基所需量的競(jìng)爭(zhēng)抑制劑為血紅蛋白分子摩爾量的5-20倍。
全文摘要
用于紅細(xì)胞代用品的交聯(lián)血紅蛋白的制備方法，是使已作脫氧處理后的血紅蛋白溶液在pH6.0－7.5，以及混合有為血紅蛋白分子1－10倍摩爾比的多氨基化合物作為交聯(lián)競(jìng)爭(zhēng)抑制劑的條件下，以充分分散的形式加入為血紅蛋白分子7－14倍摩爾比的戊二醛反應(yīng)，反應(yīng)完畢再次加入多于封閉全部戊二醛的醛基所需量的競(jìng)爭(zhēng)抑制劑后，按常規(guī)方式進(jìn)行還原反應(yīng)并作常規(guī)過濾和超濾后，即得到分子量分布合適的交聯(lián)聚合血紅蛋白溶液。
文檔編號(hào)A61P7/00GK1396180SQ0213359
公開日2003年2月12日 申請(qǐng)日期2002年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月9日
發(fā)明者楊成民, 王紅, 楊曉明, 張鴻輝, 王雁峰, 劉嘉馨, 謝成蓮, 李強(qiáng), 余璟 申請(qǐng)人:楊成民