一種利用血紅蛋白提高發(fā)酵細(xì)胞密度的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用血紅蛋白提高發(fā)酵細(xì)胞密度的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 高密度發(fā)酵技術(shù)一直是工業(yè)生產(chǎn)中要求的高效技術(shù)。對(duì)于很多需氧微生物，在發(fā) 酵過(guò)程中限制細(xì)胞密度的最為重要的因素是氧氣的利用。因此需要開發(fā)出了多種針對(duì)提高 需氧微生物氧氣利用率的技術(shù)。
[0003]目前已知的提高細(xì)胞密度的方法主要分為兩類，其中一類是改變微生物的發(fā)酵條 件來(lái)提高氧氣的利用。例如在發(fā)酵過(guò)程中增大發(fā)酵罐中的通氣量，增大發(fā)酵罐的壓力，增大 發(fā)酵罐攪拌槳轉(zhuǎn)速，降低發(fā)酵罐中培養(yǎng)溫度，提高輸入空氣中的氧氣含量等方法。另外一類 是利用微生物菌種改造，發(fā)明多種能夠高效利用氧氣的基因工程重組菌株。
[0004] 現(xiàn)有的重組菌株大多是利用表達(dá)血紅蛋白來(lái)吸收更多的氧氣供給微生物本身使 用。血紅蛋白是一種氧結(jié)合蛋白，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中。血紅蛋白的表達(dá)能夠促 進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)。然而目前的重組菌株大多利用血紅蛋白的過(guò)表達(dá)，天然的低氧啟動(dòng)子啟動(dòng) 等。由于血紅蛋白在細(xì)胞質(zhì)里面，細(xì)胞外膜、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜把血紅蛋白和氧氣充分隔開， 限制了血紅蛋白與氧氣的接觸，氧氣利用效率因此下降，不利于細(xì)胞的高密度生長(zhǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種提高微生物發(fā)酵細(xì)胞密度的方法。
[0006] 本發(fā)明提供的方法，為通過(guò)如下1)_4)中至少一種方法構(gòu)建重組微生物，促進(jìn)重 組微生物中的血紅蛋白分子與氧氣的接觸，提高氧氣的利用率，實(shí)現(xiàn)提高微生物發(fā)酵細(xì)胞 密度：
[0007] 1)在微生物細(xì)胞周質(zhì)空間表達(dá)血紅蛋白；使得氧氣在周質(zhì)空間內(nèi)即可和血紅蛋 白發(fā)生結(jié)合，減少氧氣進(jìn)入細(xì)胞過(guò)程中的損失，提高利用率，從而提高細(xì)胞的生長(zhǎng)數(shù)量和密 度；
[0008] 2)利用細(xì)胞表面展示將血紅蛋白呈遞微生物細(xì)胞外膜表面；使得血紅蛋白在外 膜直接與氧氣發(fā)生結(jié)合，減少氧氣在傳入細(xì)胞內(nèi)部過(guò)程的損失；
[0009] 3)去除或重塑微生物細(xì)胞外膜；使表達(dá)在胞內(nèi)或細(xì)胞周質(zhì)空間的血紅蛋白吸收 更多的氧氣，供給更多細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，從而提高細(xì)胞的生長(zhǎng)數(shù)量和密度；
[0010] 4)在微生物細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)血紅蛋白；血紅蛋白可以吸收更多的細(xì)胞周圍的氧氣 分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，供給細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所使用，從而提高細(xì)胞的生長(zhǎng)數(shù)量和密度。
[0011] 上述方法中，
[0012] 所述提高微生物發(fā)酵細(xì)胞密度的方法為如下1) _4)中任一種：
[0013]1)在微生物細(xì)胞周質(zhì)空間表達(dá)血紅蛋白，
[0014] 2)在微生物細(xì)胞周質(zhì)空間表達(dá)血紅蛋白，且利用細(xì)胞表面展示將血紅蛋白呈遞所 述微生物細(xì)胞外膜表面；
[0015] 3)在微生物細(xì)胞周質(zhì)空間表達(dá)血紅蛋白，且去除或重塑所述微生物細(xì)胞外膜；
[0016] 4)在微生物細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)血紅蛋白。
[0017] 上述方法中，
[0018] 所述在微生物細(xì)胞周質(zhì)空間表達(dá)血紅蛋白為利用雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將血紅蛋白 定位到微生物細(xì)胞周質(zhì)空間表達(dá)；
[0019] 所述細(xì)胞表面展示為膜蛋白展示技術(shù)，所述膜蛋白展示技術(shù)包括但不限于冰晶核 蛋白、自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和S層蛋白，所述膜蛋白展示技術(shù)包括冰晶核蛋白、自體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和S 層蛋白中至少一種；
[0020] 所述去除或重塑微生物細(xì)胞外膜為敲除或抑制細(xì)胞外膜的合成基因的表達(dá)，所述 細(xì)胞外膜的合成基因包括LpxA、LpxC、LptDl、LptD2、LpxH、LpxB、LpxK、LpxL和LpxF中至少 一種，所述細(xì)胞外膜的合成基因包括但不限于LpxA、LpxC、LptDl、LptD2、LpxH、LpxB、LpxK、 LpxL 和 LpxF〇
[0021] 上述提高微生物發(fā)酵細(xì)胞密度的方法為如下A)或B)或C)或D):
[0022] A)所示的方法包括如下步驟：將tat信號(hào)肽編碼基因、驅(qū)動(dòng)血紅蛋白表達(dá)的啟動(dòng) 子、血紅蛋白編碼基因?qū)氤霭l(fā)微生物細(xì)胞中，得到重組微生物，發(fā)酵所述重組微生物，使 血紅蛋白通過(guò)tat信號(hào)肽定位到所述重組微生物細(xì)胞周質(zhì)空間表達(dá)，實(shí)現(xiàn)提高微生物發(fā)酵 細(xì)胞密度；
[0023] B)所示的方法包括如下步驟：將tat信號(hào)肽編碼基因、驅(qū)動(dòng)血紅蛋白表達(dá)的啟動(dòng) 子、血紅蛋白編碼基因和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因?qū)氤霭l(fā)微生物細(xì)胞中，得到重組微生物，發(fā)酵 所述重組微生物，使血紅蛋白通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和tat信號(hào)肽展示到所述重組微生物細(xì)胞膜外 并在細(xì)胞周質(zhì)空間表達(dá)，實(shí)現(xiàn)提高微生物發(fā)酵細(xì)胞密度；
[0024] C)所示的方法包括如下步驟：敲除出發(fā)微生物基因組中的LpxA和LptD基因，且 將tat信號(hào)肽編碼基因、驅(qū)動(dòng)血紅蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子和血紅蛋白編碼基因?qū)胨龀霭l(fā)微 生物中，得到重組微生物，發(fā)酵所述重組微生物，促進(jìn)所述重組微生物細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間質(zhì)的 血紅蛋白吸收氧分子，實(shí)現(xiàn)提高微生物發(fā)酵細(xì)胞密度；
[0025] D)所示的方法包括如下步驟：將驅(qū)動(dòng)血紅蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子、血紅蛋白編碼基因 導(dǎo)入出發(fā)微生物細(xì)胞中，得到重組微生物，發(fā)酵所述重組微生物，使血紅蛋白在所述重組微 生物細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)，實(shí)現(xiàn)提高微生物發(fā)酵細(xì)胞密度。
[0026] 上述方法中，
[0027] 所述出發(fā)微生物為革蘭氏陽(yáng)性或陰性細(xì)菌，但不限于大腸桿菌、嗜鹽菌、假單胞菌 或芽孢桿菌；
[0028] 所述出發(fā)微生物包括大腸桿菌、嗜鹽菌、假單胞菌或芽孢桿菌；
[0029] 所述提高微生物發(fā)酵細(xì)胞密度為所述重組微生物發(fā)酵后的細(xì)胞干重大于所述出 發(fā)微生物發(fā)酵后的細(xì)胞干重。
[0030] 上述方法中，
[0031] A)所示的方法中，所述tat信號(hào)肽編碼基因、所述驅(qū)動(dòng)血紅蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子和 所述血紅蛋白編碼基因通過(guò)重組載體導(dǎo)入所述出發(fā)微生物；
[0032] B)所示的方法中，所述tat信號(hào)肽編碼基因、所述驅(qū)動(dòng)血紅蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子、所 述血紅蛋白編碼基因和所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因通過(guò)重組載體導(dǎo)入所述出發(fā)微生物；
[0033] C)所示的方法包括如下步驟：敲除出發(fā)微生物基因組中的LpxA和LptD基因，得 到中間出發(fā)菌，再將所述tat信號(hào)肽編碼基因、所述驅(qū)動(dòng)血紅蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子和所述血 紅蛋白編碼基因通過(guò)重組載體導(dǎo)入所述中間出發(fā)菌中，得到重組微生物；
[0034] 所述敲除出發(fā)微生物基因組中的LpxA的方法為向所述出發(fā)微生物導(dǎo)入LpxA同源 重組片段；所述LpxA同源重組片段由LpxA上游同源臂、標(biāo)記基因和LpxA下游同源臂組成；
[0035] 所述敲除微生物細(xì)胞基因組中的LptD為向所述出發(fā)微生物導(dǎo)入LptD同源重組片 段；所述同源重組片段LptD由LptD上游同源臂、標(biāo)記基因和LptD下游同源臂組成；
[0036] D)所示的方法中，
[0037] 所述驅(qū)動(dòng)血紅蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子和所述血紅蛋白編碼基因通過(guò)重組載體導(dǎo)入所 述出發(fā)微生物。
[0038] 上述方法中，
[0039] 所述tat信號(hào)肽的氨基酸序列為序列表中序列18 ;
[0040] 所述驅(qū)動(dòng)血紅蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子為porin啟動(dòng)子；所述porin啟動(dòng)子的核苷酸序 列為序列表中序列1第33-250位；
[0041] 所述血紅蛋白的氨基酸序列為序列表中序列19 ;
[0042] 所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為Antigen43 β;所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Antigen43 β的氨基酸序列為序列 表中序列20;
[0043] 所述LpxA上游同源臂的核苷酸序列為序列8第1-40位核苷酸；
[0044] 所述LpxA下游同源臂的核苷酸序列為序列8第1364-1403位核苷酸；
[0045] 所述LpxA同源重組片段的核苷酸序列具體為序列8 ;
[0046] 所述LptD上游同源臂的核苷酸序列為序列9第1-40位核苷酸；
[0047] 所述LptD下游同源臂的核苷酸序列為序列9第1364-1403位核苷酸；
[0048] 所述LptD同源重組片段的核苷酸序列具體為序列9 ;
[0049] A和C所示的方法中的所述重組載體的核苷酸序列為序列2 ;
[0050]B所示的方法中的所述重組載體的核苷酸序列為序列7 ;
[0051]D所示的方法中的所述重組載體的核苷酸序列為序列1 ;
[0052] 所述tat信號(hào)肽編碼基因的核苷酸序列為序列2的第277-384位核苷酸；
[0053] 所述血紅蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列1第277-717位；
[0054] 所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Antigen43 β編碼基因的核苷酸序列為序列7第820-2799位。
[0055] 上述方法在提高微生物細(xì)胞生產(chǎn)的化合物產(chǎn)量中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范 圍；
[0056] 所述化合物為大分子化合物、小分子化合物或者蛋白，所述小分子化合物具體為 ALA，所述蛋白具體為phaP;所述大分子化合物具體為ΡΗΒ;
[0057] 或上述方法中的重組微生物也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0058] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種提高微生物細(xì)胞生產(chǎn)化合物產(chǎn)量的方法。
[0059] 本發(fā)明提供的方法，利用上述方法構(gòu)建重組微生物細(xì)胞的同時(shí)，向所述出發(fā)微生 物導(dǎo)入合成化合物基因，得到重組微生物，發(fā)酵所述重組微生物，實(shí)現(xiàn)提高微生物細(xì)胞生產(chǎn) 化合物產(chǎn)量。
[0060] 上述方法中，所述化合物為大分子化合物、小分子化合物或者蛋白，所述小分子化 合物具體為ALA，所述蛋白具體為phaP ;所述大分子化合物具體為PHB ;
[0061] 所述提高微生物細(xì)胞生產(chǎn)化合物產(chǎn)量為所述重組微生物發(fā)酵生產(chǎn)化合物產(chǎn)量大 于所述表達(dá)合成化合物基因的微生物生產(chǎn)化合物產(chǎn)量；
[0062] 所述表達(dá)合成化合物基因的微生物為將所述合成化合物基因?qū)胨龀霭l(fā)微生 物中得到的重組微生物。
[0063] 上述方法為如下a)或b)或c)或d):
[0064] a)所示的方法包括如下步驟：將tat信號(hào)肽編碼基因、驅(qū)動(dòng)血紅蛋白表達(dá)的啟動(dòng) 子、血紅蛋白編碼基因和合成化合物基因?qū)氤霭l(fā)微生物細(xì)胞中，得到重組微生物，發(fā)酵所 述重組微生物，實(shí)現(xiàn)提高微生物細(xì)胞生產(chǎn)化合物產(chǎn)量；b)所示的方法包括如下步驟：將tat 信號(hào)肽編碼基因、驅(qū)動(dòng)血紅蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子、血紅蛋白編碼基因、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因和合 成化合物基因?qū)氤霭l(fā)微生物細(xì)胞中，得到重組微生物，發(fā)酵所述重組微生物，實(shí)現(xiàn)提高微 生物發(fā)酵細(xì)胞密度；
[0065] c)所示的方法包括如下步驟：敲除出發(fā)微生物基因組中的LpxA和LptD基因，且 將tat信號(hào)肽編碼基因、驅(qū)動(dòng)血紅蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子、血紅蛋白編碼基因和合成化合物基 因?qū)胨龀霭l(fā)微生物中，得到重組微生物，發(fā)酵所述重組微生物，實(shí)現(xiàn)提高微生物發(fā)酵細(xì) 胞密度；
[0066] d)所示的方法包括如下步驟：將驅(qū)動(dòng)血紅蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子、血紅蛋白編碼基因 和合成化合物基因?qū)氤霭l(fā)微生物細(xì)胞中，得到重組微生物，發(fā)酵所述重組微生物，實(shí)現(xiàn)提 高微生物發(fā)酵細(xì)胞密度。
[0067] 上述出發(fā)微生物細(xì)胞為革蘭氏陽(yáng)性或陰性細(xì)菌，但不限于大腸桿菌、嗜鹽菌、假單 胞菌或芽孢桿菌；大腸桿菌具體為E. coli TranslTl;嗜鹽菌具體為鹽單胞菌TD 01。
[0068] 以生產(chǎn)聚羥基丁酸酯PHB為例，上述合成化合物基因來(lái)源于pBHR68,通過(guò)質(zhì)粒 pBHR68導(dǎo)入出發(fā)微生物細(xì)胞E. coli TranslTl。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明通過(guò)基于tat 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的膜間質(zhì)血紅蛋白蛋白表達(dá)提高細(xì)胞密度的方法，可以通過(guò)分子（基因）操作來(lái) 實(shí)現(xiàn)，比如膜間質(zhì)血紅蛋白的基因操作，包括分別在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周質(zhì)空間過(guò)表達(dá)細(xì)胞血 紅蛋白基因等；本發(fā)明構(gòu)建提高細(xì)胞密度的工程菌，已實(shí)例證明包括可以提高單位體積細(xì) 胞積累量、單位體積PHB積累量等的產(chǎn)量，有的工程菌細(xì)胞干重提高了 120%。且本發(fā)明的 生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，應(yīng)用前景廣闊。
【附圖說(shuō)明】
[0069] 圖 1 為質(zhì)粒 pSEVA331_vgb (左）和 pSEVA331_tat_vgb (右）的結(jié)果示意圖。
[0070] 圖 2 為質(zhì)粒 pSEVA331-gfp (左）和 pSEVA331-tat-gfp (右）的結(jié)果示意圖。
[0071] 圖 3 為質(zhì)粒 pSEVA33l-vgb_meos (左）和 pSEVA33l-tat-vgb_meos (右）的結(jié)果不 意圖。
[0072] 圖4為共聚焦顯微鏡觀察Tat轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)GFP熒光蛋白定位示意圖。
[0073] 圖5為超分辨顯微鏡觀察VHb蛋白定位不意圖。
[0074] 圖 6 為質(zhì)粒 pSEVA331_Pporin Tat_vgb_Ag43 的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0075] 圖 7 為質(zhì)粒 pRE112-6ISceI-LpxA(左）和 pRE112-6ISceI-LptD 右）的結(jié)構(gòu)示意 圖。
[0076] 圖8為質(zhì)粒pSEVA331_Pporin+ala的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0077]圖 9 為質(zhì)粒 pSEVA331_Pporin + vgb + ala(左）和 pSEVA331-Pporin+tat_vgb+ala(右）的結(jié)構(gòu)不意圖。
[0078] 圖10為質(zhì)粒pSEVA331_Pporin+phaP的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0079]圖 11 為質(zhì)粒 pSEVA331_Pporin + vgb + phaP(左)和 pSEVA331-Pporin+tat_vgb+phaP(右）的結(jié)構(gòu)不意圖。
[0080] 圖12為ALA標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0081] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0082] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0083] 圖1為大腸桿菌重組菌構(gòu)建示意圖。
[0084] 所用酶試劑均購(gòu)自ThermoScientific Fermentas公司，提取質(zhì)粒所用的試劑盒購(gòu) 自北京博邁德科技發(fā)展公司，回收DNA片段所用的試劑盒購(gòu)自美國(guó)omega公司，相應(yīng)的操作 步驟按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行；所有培養(yǎng)基如無(wú)特別說(shuō)明均用去離子水配制。
[0085] 培養(yǎng)基配方：
[0086] LB培養(yǎng)基含：5g/L酵母提取物（購(gòu)自英國(guó)0XID公司，產(chǎn)品目錄號(hào)LP0021)，10g/ L蛋白胨（購(gòu)自英國(guó)0XID公司，產(chǎn)品目錄號(hào)LP0042)，10g/L NaCl，其余為水。調(diào)pH值至 7.0-7. 2,高壓蒸汽滅菌。
[0087] MM培養(yǎng)基配置方法：2g/L酵母提取物（購(gòu)自英國(guó)0XID公司，產(chǎn)品目錄號(hào)LP0021)， 其余為水。溶解后高壓滅菌。冷卻后每50ml加入lml組分I (10g(NH4)2S(VfP 2gMgS04加水 定容至200ml，高壓蒸汽滅菌）和組分II (96. 5g Na2HP04. 12H20和15g ΚΗ2Ρ04，加水定容至 200ml，高壓蒸汽滅菌）。（NH4) 2S04, MgS04, Na2HP04. 12Η20, ΚΗ2Ρ04購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有 限公司，目錄號(hào)分別為 10002992,10034998,10020392,1017628。
[0088] 在實(shí)際培養(yǎng)過(guò)程中，可向上述培養(yǎng)基中再添加一定濃度的抗生素以維持質(zhì)粒的穩(wěn) 定性，如50 μ g/mL氯霉素。
[0089] pBHR68 載體記載在如下文獻(xiàn)中：Spiekermann P，Rehm BHA，Kalscheuer R，Baumeister D，Steinbilchel A (1999) A sensitive, viable-colony staining method using Nile red for direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other storage corn-pounds. Arch Microbiol 171 ： 73-80，該質(zhì)粒中含有來(lái)源于羅氏真養(yǎng)桿菌Ral stonia eutropha的PHB合成基因phaC基因、 β -酮基硫解酶PhaA和NADPH依賴的乙酰乙酰輔酶A還原酶phaB。
[0090] 實(shí)施例1、通過(guò)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)VHb血紅蛋白基因提高發(fā)酵單位細(xì)胞密度
[0091] 一、工程菌的構(gòu)建
[0092] 1、表達(dá)載體 pSEVA331_Pporin+vgb 的構(gòu)建
[0093] 1)、目的啟動(dòng)子Pporin的獲得
[0094] 提取鹽單胞菌TD01(Hal〇m〇nas TD01，現(xiàn)保存于中科院微生物研究所菌種保藏中 心，保藏號(hào)CGMCC4353 ;專利的公開號(hào)CN102816729A)的基因組為模板，以G-Pporin-ITF和 G-Pporin-2TR為引物，用pfu酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0095] 引物為：
[0096] G-Pporin-ITF :5' gataacaatttcacacaggacggccgctgagacctgccag 3'
[0097] G-Pporin-2TR :5' ctcctctttctctagtaaagtctgcagctggcttgc 3'
[0098] PCR反應(yīng)條件：
[0099] 先95°C預(yù)變性5分鐘；再95°C變性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸30秒，30次 循環(huán)；然后72°C后延伸10分鐘。
[0100] PCR擴(kuò)增目的片斷（50 μ L體系）：
[0101]
[0102] PCR擴(kuò)增體系配制時(shí)，DNA聚合酶最后加入。
[0103] 得到218bp的PCR產(chǎn)物，為目的基因Pporin，其核苷酸序列為序列表中序列1自 5'末端第33-250位。
[0104] 2)、目的基因vgb的獲得
[0105] 提取透明顫菌（Vitreoscilla)的基因組為模板，以G-vgb-lTF和G-vgb-2TR為引 物，用pfu酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0106] 引物為：
[0107] G-vgb-lTF :5' gagaaagaggagaaatactagatgttagaccagcaaacc 3'
[0108] G-vgb-2TR :5' gggttttcccagtcacgacttattcaaccgcttgagcg 3'
[0109] 得到441bp的PCR產(chǎn)物，為目的基因vgb，其核苷酸序列為序列表中序列1自5'末 端第277-717位。
[0110] 3)、載體骨架的擴(kuò)增
[0111] 以PSEVA331標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，以G-V-1TF和G-V-2TR為引物，用pfu酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。
[0112] 引物為：
[0113] G-V-2TF :5' ggcaggtctcagcggccgtcctgtgtgaaattgttatc 3'
[0114] G-V-2TR :5' gtacgctcaagcggttgaataagtcgtgactgggaaaacc 3'
[0115] 得到2880bp的PCR產(chǎn)物，為載體骨架片段，其核苷酸序列為序列表中序列1自5' 末端第 717-(3565)-33 位。
[0116]將上述（1)、（2)、（3)的DNA片段通過(guò)Gibson assembly同源重組方法連接，得到 連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TranslTl中，得到轉(zhuǎn)化子。
[0117] 使用驗(yàn)證引物F24、R24驗(yàn)證引物用pfu酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到跑膠條帶，挑選條帶 685b大小的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，送去測(cè)序，結(jié)果為獲得含有上述（1)、（2) 個(gè)片段，該質(zhì)粒記作pSEVA331-Pporin+vgb，其核苷酸序列為序列表中的序列1，質(zhì)粒的結(jié) 構(gòu)示意圖見圖1的左圖。
[0118] 驗(yàn)證引物為：
[0119] F24 :5' agcggataacaatttcacacagga 3'
[0120] R24 :5' cgccagggttttcccagtcacgac 3'
[0121] 2、工程菌 Ε· co 1 i Trans 1T1 (pSEVA33 1-Ppor in + vgb)、Ε· co 1 i TranslTl(pSEVA331_Pporin+vgb，pBHR68)和鹽單胞菌 TD01(pSEVA331_Pporin+vgb)的構(gòu) 建
[0122] 將上述1制備的表達(dá)載體pSEVA331_Pporin+vgb用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入到 E.coli TranslTl (北京全式金生物科技有限公司⑶501-01)中，獲得重組菌A E.coli TranslTl(pSEVA331_Pporin+vgb)(提取質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證正確）；
[0123] 將 pSEVA331 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒（The Standard European Vector Architecture 惠贈(zèng)， http://seva. cnb. csic. es)用電擊轉(zhuǎn)化法同時(shí)轉(zhuǎn)入到E. coli TranslTl中，獲得對(duì)照菌B E.coli TranslTl (pSEVA331)；
[0124] 將上述1制備的表達(dá)載體pSEVA331-Pporin+vgb和pBHR68用電擊轉(zhuǎn)化法同時(shí)轉(zhuǎn) 入到E.coli TranslTl 中，獲得重組菌C E.coli TranslTl(pSEVA331_Pporin+vgb，pBHR68) (提取質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證正確）；
[0125] 將pSEVA331標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒和pBHR68用電擊轉(zhuǎn)化法同時(shí)轉(zhuǎn)入到E. coli TranslTl中， 獲得對(duì)照菌 D E.coli TranslTl (pSEVA331，pBHR68);
[0126] 將上述1獲得的pSEVA331_Pporin+vgb接合轉(zhuǎn)化入鹽單胞菌TD01 (Fu, X. -Z. et al.Development of Halomonas TDOlas a host for open production of chemicals. Metabolic engineering 23,78-91(2014).公眾可從清華大學(xué)獲得），得到重組菌株 TD01 (pSEVA331_Pporin+vgb)(提取質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證正確）。
[0127] 將pSEVA331標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)化入鹽單胞菌TD01，得到對(duì)照菌株TD01 (pSEVA331)。
[0128] 二、工程菌 E. co 1 i Trans 1T 1 (pSEVA33 1-Pporin + vgb)、E. co 1 i TranslTl (pSEVA331)、E.coli TranslTl (pSEVA331-Pporin+vgb，pBHR68)、E.coli TranslTl (pSEVA331，pBHR68)、TD01(pSEV