專利名稱：一種異亞丙基莽草酸的制備方法及新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種莽草酸衍生物的制備方法及新用途，特別是涉及一種異亞丙基莽草酸的制備方法及新用途。
莽草酸(Shikmicacid，SA-1)，為中草藥木蘭科八角屬多種植物果實(shí)中含有的藥效成分，其來源由八角科多蕊紅茴香Illicium henrvivar.multistamineum的果實(shí)及角屬其它植物的成熟果實(shí)經(jīng)甲醇等溶劑提取，精制而成。其分子式為C7H10O5，分子量為174.15。近年來，對(duì)血栓形成機(jī)制的研究及抗血栓藥物的開發(fā)深受各國醫(yī)藥界的關(guān)注，并已有部分有效化合物處于臨床和臨床前研究階段。
抗血栓藥物根據(jù)其作用機(jī)理分為三類抗凝藥物、抗血小板藥物和溶栓藥物?？鼓幬镏?，除了天然和重組。人類抗凝血酶-III外，還有凝血酶的直接抑制劑水蛭素、阿加曲班以及中藥花椒、丹參、赤芍的粗提物；抗血小板藥物目前取得不少新的進(jìn)展，有抑制花生四烯酸代謝的藥物鉤藤堿、毛冬青甲素、芍藥酚，抑制血小板激活因子的粉防已堿，銀杏內(nèi)脂B和海風(fēng)藤酮，也發(fā)現(xiàn)有些中藥或成分通過提高血小板內(nèi)cAMP水平，降低血小板內(nèi)Ca2+濃度從而抑制血小板聚集。隨著血栓性疾病病理機(jī)制及體內(nèi)纖溶機(jī)制的進(jìn)一步闡明?？顾ê腿芩ㄋ幬锏难芯吭絹碓蕉?，該類藥物在急性心肌梗塞的溶栓治療中占有重要的地位。已發(fā)現(xiàn)中藥蒲黃的水溶液具有不依賴?yán)w溶酶系的直接促纖溶作用。大蒜可明顯降低血漿纖維蛋白原，并可直接激活纖溶酶、使分解纖維蛋白產(chǎn)生的片斷顯著增多，赤芍和蚯蚓水提物也均可在不同環(huán)節(jié)產(chǎn)生溶栓作用，總之，抗血栓藥物的研究開發(fā)工作十分活躍，對(duì)藥物作用機(jī)理的研究已深入到分子和受體水平；盡管目前的工作取得不少成績，但存在問題也較多，主要問題是中藥的研究制劑純度不夠，粗制劑中雜質(zhì)多，對(duì)藥效、作用機(jī)理及臨床給藥途徑帶來很大的局限性。因此，純的單體藥物是今后開發(fā)的主要方面。
腦卒中是中老年人的常見病，尤其缺血性腦卒中往往由于后遺癥等原因，嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量，增加家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)。因此，研制和開發(fā)臨床療效較好的防治腦缺血的藥物是目前亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種3，4-O-異亞丙基莽草酸及其制備方法；本發(fā)明目的在于提供一種3，4-O-異亞丙基莽草酸的藥物用途。本發(fā)明目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
異亞丙基莽草酸(3，4-oxo-isopropylidene-shikimic acid，ISA)是從中藥木蘭科植物八角茴香(Fructus Anisi stellati)中提取的有效成分莽草酸的活性衍生物之一，中文名3，4-O-異亞丙基莽草酸，分子式及分子量C10H14O5214，化學(xué)名3，4-O-異亞丙基莽草酸英文化學(xué)名3，4-oxo-isopropylidene-shikimic acid。本發(fā)明3，4-O-異亞丙基莽草酸的結(jié)構(gòu)式為 本發(fā)明異亞丙基莽草酸的制備方法取莽草酸1重量份，加80體積份丙酮，再加0.05重量份對(duì)甲苯磺酸，水浴回流2小時(shí)，回收丙酮至干，加水40體積份，乙酸乙酯40體積份分配，水層再用20體積份乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯，用20體積份水洗滌2次，20重量份Na2SO4脫水，回收乙酸乙酯，得異亞丙基莽草酸1重量份。
本發(fā)明異亞丙基莽草酸的純度測(cè)定方法為采用硅膠TLCS法及HPLC法，吸附劑，硅膠G預(yù)制板；展開劑為，8-12∶0.5-1.5∶2-5滴氯仿-甲醇-甲酸；顯色劑為3-6％硫酸乙醇溶液，噴后加熱顯色，T＝28℃，RH＝80％，點(diǎn)樣量從左至右依次為8-12μg、18-22μg、μg、28-32、38-42μg、58-62μg、78-82μg、98-102μg，測(cè)定純度可達(dá)98％以上。
本發(fā)明3，4-O-異亞丙基莽草酸定量方法為儀器及測(cè)定條件，色譜柱luna C184.6×250mm，5μm，移動(dòng)相50％MeOH-冰HAC(1000∶3)，測(cè)定波長220nm，流速1ml/min，室溫；標(biāo)準(zhǔn)曲線制備，精密稱取3，4-O-異亞丙基莽草酸對(duì)照品1.15mg，5.14mg，10.83mg，20.45mg，30.65mg，50.52mg于50.0ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻液，搖勻，為標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別吸取10.0μl進(jìn)樣測(cè)定，并進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程為A＝20934C+235，r為0.9996，線性范圍為0.23～10.10μg；對(duì)照品溶液的制備，精密稱取3，4-O-異亞丙基莽草酸對(duì)照品約20mg于50.0ml容量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，做為對(duì)照品溶液；3，4-O-異亞丙基莽草酸原料藥含量測(cè)定，精密稱取3，4-O-異亞丙基莽草酸原料20mg于50.0ml容量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，取少量以微孔濾膜濾過，濾液做為樣品供試液；精密吸取樣品供試液、對(duì)照品溶液各10μ1注入HPLC儀測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含量。
實(shí)驗(yàn)例1異亞丙基莽草酸對(duì)大腦中動(dòng)脈栓塞大鼠腦組織自由基代謝的影響材料與方法動(dòng)物 體重180～200g，♂，Wistar大鼠，由醫(yī)科院動(dòng)物研究所提供，合格證號(hào)SCXK11-00-0006。
藥品與試劑 異亞丙基莽草酸(ISA，純度＞98％)，無色片狀結(jié)晶，由北京中醫(yī)藥大學(xué)植化教研室郭亞建教授提供；尼莫地平(Nim)片劑，天津中央藥業(yè)有限公司，批號(hào)20000903；SOD、MDA和GSH-PX測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，批號(hào)分別為20011109、20011106、20011108。
實(shí)驗(yàn)儀器 XTT實(shí)體顯微鏡云南光學(xué)儀器廠；722型光柵分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠。
大腦中動(dòng)脈血栓模型的制備 大鼠隨機(jī)分為6組，(1)假手術(shù)組(2)MCAT組(3)ISA50mg·kg-1組(4)ISA100mg·kg-1組(5)ISA200mg·kg-1組(6)NIM5mg·kg-1組，3～6組大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液0.4mL·kg-1麻醉。按Tamura等[3]的方法，稍加改進(jìn)。大鼠右側(cè)臥位固定，在眼外眥和外耳道連線中點(diǎn)作一弧形切口，長約1.5cm，夾斷顳肌并切除，暴露顳骨，用牙科鉆在顴骨與顳鱗骨接合處靠近口側(cè)1mm處作一直徑2.5mm骨窗，清理殘?jiān)?，暴露大腦中動(dòng)脈(位于嗅束及大腦下靜脈之間)。置一小片塑料薄膜保護(hù)血管周圍組織。將吸有50％氯化鐵溶液10μL的小片定量濾紙敷在此段大腦中動(dòng)脈上，30min后取下濾紙，用生理鹽水沖洗局部組織，逐層縫合，回籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組，除不滴加氯化鐵溶液外，其余手術(shù)步驟同模型組。造模后立即灌胃給藥一次，60min后再給藥1次。
腦組織T-SOD、Cu-Zn-SOD、MDA和GSH-PX的測(cè)定 動(dòng)物手術(shù)后24h，斷頭取腦。去除嗅球、小腦和低位腦干，取手術(shù)側(cè)(右側(cè))半腦，在4℃下沿冠狀面去掉腦前端約2mm，取隨后約4mm(大腦中動(dòng)脈區(qū)域)稱重，制成10％勻漿。按試劑盒說明測(cè)定T-SOD、GSH-PX活力和MDA含量。腦組織勻漿按樣品∶SDS＝4∶1容積比，混勻，37℃水浴30min，4℃冷卻，加10％KCl充分混勻，置4℃冰箱30min，取出，3000r·min-1離心，取上清液200μL，按T-SOD測(cè)定法測(cè)定Cu-Zn-SOD含量。
結(jié)果1 ISA對(duì)MCAT大鼠腦組織T-SOD和Cu-Zn-SOD的影響腦組織缺血缺氧后，組織氧化和抗氧化平衡被打破，表1結(jié)果顯示模型組T-SOD和Cu-Zn-SOD活力明顯降低，表明機(jī)體清除超氧陰離子自由基的能力降低。給予ISA后，200，100mg·kg-1可明顯升高腦組織T-SOD活力；200，100，50mg·kg-1對(duì)Cu-Zn-SOD活力均有增高。NIM對(duì)Cu-Zn-SOD表現(xiàn)出較明顯的升高作用。
表1、ISA對(duì)MCAT大鼠腦組織T-SOD和Cu-Zn-SOD活力的影響組別劑量 T-SOD Cu-Zn-SOD/mg·kg-1NU·mg prot-1NU·mg prot-1假手術(shù) - 3.12±0.17 2.48±0.11模型 - 2.51±0.49ΔΔ1.74±0.48ΔΔ尼莫西 5 3.04±0.41 2.65±0.35**平ISA 2003.30±0.45**2.56±0.25**1003.13±0.46*2.53±0.23**50 2.92±0.36 2.45±0.24**與模型組比較.*P＜0.05，**P＜0.01與假手術(shù)組比較ΔΔP＜0.012 ISA對(duì)MCAT大鼠腦組織MDA的影響腦組織缺血缺氧后產(chǎn)生大量的自由基，攻擊生物膜中的多種不飽和脂肪酸，生成MDA等脂質(zhì)過氧化物，表2顯示模型組腦組織MDA明顯升高，給予ISA200，100，50mg·kg-1后均有不同程度的降低，表明ISA對(duì)腦組織缺血后自由基的生成有一定抑制作用。NIM5mg·kg-1也表現(xiàn)出相似的作用。
表2、ISA對(duì)MCAT大鼠腦組織MDA的影響組別 劑量 MDA/mg·kg-1/nmol·mg prot-1假手術(shù) - 1.37±0.07模型- 1.67±0.11ΔΔ尼莫地平5 1.45±0.25*ISA 200 1.36±0.13**100 1.45±0.12**501.46±0.22*與模型組比較.*P＜0.05，**P＜0.01與假手術(shù)組比較ΔΔP＜0.013 ISA對(duì)MCAT大鼠腦組織GXH-PX的影響腦缺血缺氧后通過CoQ途徑產(chǎn)生H2O2等過氧化物，GXH-PX可催化過氧化物分解，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整。表3表明模型組GXH-PX活力降低，NIM5mg·kg-1和ISA200，100，50mg·kg-1均可明顯提高GXH-PX活力。
表3、ISA對(duì)MCAT大鼠腦組織GXH-PX的影響組別劑量GXH-PX/mg·kg-1U·mg prot-1假手術(shù) -1.11±0.66ΔΔ模型 -0.80±0.10尼莫地平 51.16±0.26**ISA 200 3.37±0.51**100 3.24±0.49**50 2.95±0.34**與模型組比較.*P＜0.05，**P＜0.01與假手術(shù)組比較ΔΔP＜0.01實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示異亞丙基莽草酸(ISA)對(duì)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成有明顯的抑制作用，對(duì)抗氧化系統(tǒng)T-SOD、Cu-Zn-SOD和GSH-PX的活性有明顯的升高，因此ISA可通過調(diào)節(jié)自由基的代謝保護(hù)局灶性腦缺血損傷。實(shí)驗(yàn)例2ISA對(duì)大鼠原代神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷的保護(hù)作用材料和方法動(dòng)物 新生Wistar大鼠(24小時(shí))，雌雄兼用，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。
藥品和試劑 異亞丙基莽草酸(ISA，純度＞98％)，無色片狀結(jié)晶，由本校植物化學(xué)教研室郭亞健教授提供；尼莫地平注射液山東新華制藥廠產(chǎn)品批號(hào)00090399；乳酸脫氫酶試劑盒南京建成生物工程研究所，批號(hào)20010614；DMEM高糖培養(yǎng)基Gibco公司產(chǎn)品；馬血清 Hyclone公司產(chǎn)品；胎牛血清 Gibco公司產(chǎn)品；胰蛋白酶 Gibco公司產(chǎn)品；HEPES 德國B.M公司產(chǎn)品；胰島素 上海生物化學(xué)制藥廠；阿糖胞苷 北京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)藥廠；多聚賴氨酸 美國Sigma公司產(chǎn)品。蘇木精-伊紅染液。
其它試液的配制DMEM培養(yǎng)液 DMEM高糖培養(yǎng)基1袋，NaHCO33.7g，HEPES5g。
解剖液A液glucose/sucrose＝3g/7.5g，加蒸餾水50ml；B液HEPES 2.3464g加水100ml，調(diào)pH至7.3～7.4；C液NaCl8g，Na2HPO4·7H2O0.18g，KCI0.4g，KH2PO40.03g，加水50ml。A、B、C三液混合后加水至1000ml，過濾除菌，4℃貯存?zhèn)溆谩?br> 接種培養(yǎng)液79.5％DMEM培養(yǎng)液，10％馬血清，10％胎牛血清，0.5％青霉素(2u/ml)維持培養(yǎng)液88.5％DMEM培養(yǎng)液，10％馬血清，1％N3，0.5％青霉素，N3牛血清白蛋白0.15μM，亞硒酸鈉0.06μM，黃體酮0.04μM，氫化可地松0.1μM，胰島素237.6IU/L。
無糖Earle`s液NaCl116.4mM，KCl5.4mM，CaCl21.8mM，MgSO40.8mM，NaH2OP42.6mM，NaHCO326.2mM，HEPES20.1mM，含糖Earle`s液再加5.5mM葡萄糖。
儀器 CJT型超凈工作臺(tái) 北京昌平長城空氣凈化工程公司；DMIL HC倒置顯微鏡德國徠卡公司；Olympus生物顯微鏡 日本；X5Z-H型生物顯微鏡，重慶光學(xué)儀器廠RCO-3000T-5V型CO2培養(yǎng)箱 美國N.C公司；細(xì)胞培養(yǎng)板 丹麥NUNC公司；缺氧罐 北京科普儀器廠。
神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)[1]取新生的Wistar大鼠，75％酒精消毒，在無菌條件下解剖分離大鼠雙側(cè)大腦皮層，切碎后0.25％胰蛋白酶37℃消化30分鐘，終止后吹打，制備成1～2×106個(gè)細(xì)胞/ml的單細(xì)胞懸液，接種于12孔培養(yǎng)板(經(jīng)0.01％多聚賴氨酸處理)中，0.5ml/孔，37℃、6％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，更換為維持培養(yǎng)液，以后隔日更換維持培養(yǎng)液，在培養(yǎng)4～5天時(shí)，加入濃度為8μM的細(xì)胞分裂抑制劑阿糖胞苷，作用48小時(shí)。培養(yǎng)9天后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。
缺糖缺氧擬神經(jīng)細(xì)胞再灌注損傷模型 取培養(yǎng)9天的細(xì)胞，撤去原培養(yǎng)液，用無糖Earle`s液洗兩次，加入無糖Earle`s液，置缺氧罐中通入6％CO2和94％N2，30分鐘后夾閉通氣，并將缺氧罐置37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)，然后取出培養(yǎng)板，換高糖DMEM和血清等，恢復(fù)供氧，模擬缺血再灌注狀態(tài)。正常對(duì)照組用含糖Earle`s液孵育，藥物分別于換Earle`s液和高糖DMEM時(shí)加入，體積為10μl/1ml培養(yǎng)液。
細(xì)胞正常形態(tài)觀察 在相差顯微鏡下觀察不同處理后的細(xì)胞胞體、胞核及突觸形態(tài)和生長情況，并進(jìn)行定性比較。
HE染色 按常規(guī)方法采用伊紅-蘇木精染色觀察不同處理后細(xì)胞突觸、胞體及胞核形態(tài)的差別進(jìn)行定性比較。
乳酸脫氫酶漏出率的測(cè)定 分別于缺糖/缺氧3h，復(fù)糖復(fù)氧3h、6h、18h取上清液測(cè)定LDH活力，然后將細(xì)胞置-20℃冰箱中過夜，凍融后同法測(cè)定LDH活力。細(xì)胞損傷程度以培養(yǎng)細(xì)胞釋放的LDH和總LDH活力的百分比(LDH％)表示，LDH釋放率越高表示細(xì)胞受損傷程度越嚴(yán)重。在缺糖缺氧3h和缺糖缺氧3h/復(fù)糖復(fù)氧18h時(shí)，通過組間比較觀察藥物作用。
LDH的測(cè)定原理在波長440nm處比色，測(cè)定丙酮酸二硝基苯腙的含量，推算出乳酸脫氫酶(LDH)的活力(u/100ml)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以X±S表示，用t檢驗(yàn)判斷差異的顯著性。
結(jié)果1異亞丙基莽草酸對(duì)細(xì)胞缺糖缺氧后形態(tài)的影響 正常培養(yǎng)9天后，相差顯微鏡下直接觀察可見神經(jīng)細(xì)胞胞體呈錐體、卵圓形或梭形，周圍光暈明顯，核及核仁清楚，突觸豐富并交織成網(wǎng)狀。缺糖缺氧3h后復(fù)糖復(fù)氧18h，神經(jīng)細(xì)胞胞體變大，突觸減少，光暈變暗，出現(xiàn)腫脹等損傷征象。給予ISA10-5、10-6、10-7mol·L-1，細(xì)胞形態(tài)均出現(xiàn)相應(yīng)改善，且大劑量最為明顯。Nim10-5mol·L-1亦表現(xiàn)出明顯保護(hù)作用2HE染色 正常組細(xì)胞呈錐體，突觸豐富，細(xì)胞核膜清晰，核染色質(zhì)細(xì)致，核仁明顯，胞漿呈淡紅色；模型組細(xì)胞突觸減少，細(xì)胞核固縮，濃染出現(xiàn)明顯的損傷，ISA治療后各組細(xì)胞細(xì)胞核固縮濃染等損傷明顯減輕，Nim也表現(xiàn)出同樣的作用。
3缺糖缺氧及缺糖缺氧后復(fù)糖復(fù)氧不同時(shí)間神經(jīng)細(xì)胞LDH漏出率的影響缺糖缺氧后神經(jīng)細(xì)胞受損，膜通透性增加，LDH漏出到培養(yǎng)液中。從及表4可以看出，神經(jīng)細(xì)胞缺血缺氧3h時(shí)，LDH漏出率開始增加，復(fù)糖復(fù)氧3h、6h、18h時(shí)，LDH漏出率繼續(xù)升高，這表明復(fù)糖復(fù)氧較單純?nèi)碧侨毖鯇?duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷更嚴(yán)重。
表4、缺糖缺氧及缺糖缺氧后復(fù)糖復(fù)氧不同時(shí)間神經(jīng)細(xì)胞LDH漏出率的影響LDH％組別 缺血缺氧3h 缺血缺氧3h 缺血缺氧3h缺血缺氧3h再灌注3h 再灌注6h再灌注18h對(duì)照21.4±7.428.0±5.729.0±4.2 35.0±8.0模型28.8±3.8ΔΔ43.0±5.0ΔΔ62.0±9.0ΔΔ66.0±5.0ΔΔ與對(duì)照組比較.ΔΔP＜0.014ISA對(duì)缺糖缺氧和缺糖缺氧后復(fù)糖復(fù)氧神經(jīng)細(xì)胞LDH漏出率的影響如表5所示，神經(jīng)細(xì)胞缺糖缺氧3h和復(fù)糖復(fù)氧18h，溶劑對(duì)照組 漏出率明顯高于正對(duì)照組，而ISA10-5、10-6mol·L-1表現(xiàn)出明顯的降低作用。尼莫地平10-5mol·L-1對(duì)缺糖缺氧及復(fù)糖復(fù)氧后LDH升高也有明顯降低作用。表5、ISA對(duì)缺糖缺氧和缺糖缺氧后復(fù)糖復(fù)氧神經(jīng)細(xì)胞LDH漏出率的影響劑量 LDH漏出百分率％組別 Nmol·L-1缺糖缺氧3h 缺糖缺氧3h-再灌注18h對(duì)照 - 12 14.51±8.7629.13±6.93模型 - 12 21.16±4.43Δ39.78±6.50ΔΔ尼莫地平10-512 11.50±4.22**14.08±8.59**ISA 10-512 13.22±3.94**16.89±7.09**10-612 12.91±3.93**29.32±5.82**10-712 19.73±4.8641.65±5.52
與模型組比較**P＜0.01與對(duì)照組比較ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01實(shí)驗(yàn)例3異亞丙基莽草酸對(duì)皮層原代神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響材料與方法動(dòng)物 24小時(shí)內(nèi)的新生Wistar大鼠，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供藥品與試劑 ISA無色片狀結(jié)晶，由本校植物化學(xué)教研室郭亞健教授提供；尼莫地平(Nimodipine，NIM)注射液 山東新華制藥股份有限責(zé)任公司產(chǎn)品批號(hào)00090399；碘化丙啶RNA酶 美國Sigma公司產(chǎn)品；TDT，末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶 美國Promega公司；地高辛標(biāo)記的dUTP 德國B.M公司；FLUO-3，AM Ester Biotium公司產(chǎn)品；SABC，鏈酶親和素-過氧化物酶，中國Boster公司產(chǎn)品；Anti-DIG-Biotin，美國Sigma公司產(chǎn)品；Caspase-3兔源多抗為Santa Cruz公司產(chǎn)品。
儀器 FACS-420型流式細(xì)胞儀 美國B.D公司；Leica TCS-NT型激光共聚焦顯微鏡 德國徠卡公司；Olympus生物顯微鏡 日本；X5Z-H型生物顯微鏡，重慶光學(xué)儀器廠；Meta Morph圖像軟件分析系統(tǒng) 美國Universal Imaging corporation產(chǎn)品。
皮層原代神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)[2]取新生的Wistar大鼠，75％酒精消毒，再無菌條件下解剖分離大鼠雙側(cè)皮層，切碎后0.25％胰蛋白酶37℃消化30分鐘，終止后吹打，制備成1-2×106個(gè)細(xì)胞/mL的單細(xì)胞懸液，接種于50ml培養(yǎng)瓶(經(jīng)0.01％多聚賴氨酸處理)中，10mL/瓶，37℃，6％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，更換為維持培養(yǎng)液，以后隔日更換維持培養(yǎng)液，在培養(yǎng)4-5天時(shí)，加入濃度為8μM的細(xì)胞分裂抑制劑阿糖胞苷，作用48小時(shí)。培養(yǎng)9天后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。
缺糖缺氧擬神經(jīng)細(xì)胞再灌注損傷模型的建立 取培養(yǎng)9天的細(xì)胞，撤去原培養(yǎng)液，用無糖Earle`s液洗兩次，加入無糖Earle`s液，置一缺氧罐中通入5％CO2和95％N2，30分鐘后夾閉通氣，并將缺氧罐置37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，然后取出培養(yǎng)瓶，換高糖DMEM和血清等，恢復(fù)供氧，模擬缺血再灌注狀態(tài)。正常對(duì)照組用含糖Earle`s液孵育，藥物分別于換Earle`s液和高糖DMEM時(shí)加入，體積為10μl·mL-1培養(yǎng)液。
凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)[3]神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)9天后，分別于缺糖/缺氧3h，缺糖缺氧3h再灌3h、再灌18h、再灌24h。收集細(xì)胞懸液，1000rpm離心5分鐘，PBS洗兩次，70％乙醇4℃固定24小時(shí)。固定后的細(xì)胞用PBS洗兩次，懸浮，加入終濃度20mg·L-1的RNAaseA，37℃恒浴45分鐘，再加入PI染色劑終濃度為50mg·L-1，混勻后4℃避光1小時(shí)，經(jīng)300目細(xì)胞篩過濾，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)10,000個(gè)細(xì)胞，測(cè)定各期DNA含量并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。
TUNEL法檢測(cè)[4]神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)9天后，分別于缺糖/缺氧3h，缺糖缺氧3h再灌2h、再灌18h、再灌24h。按照試劑盒方法略作調(diào)整去掉細(xì)胞培養(yǎng)液，4％多聚甲醛/0.1PBS室溫固定30分鐘。PBS洗2分鐘×2次，蒸餾水洗2分鐘×2次；新鮮配制3％H2O2，室溫處理7分鐘，蒸餾水洗2分鐘×3次；標(biāo)本片加TBS1∶100新鮮稀釋Proteinase K 37℃消化3分鐘，TBS洗2分鐘×3次。；按每張片取TDT和DIG-d-UTP各1μl，加入18μl標(biāo)記緩沖液，混勻。甩去切片上多余液體后加標(biāo)記液，20μl每片。置濕盒中4℃標(biāo)記過夜，再加37℃標(biāo)記2小時(shí)；TBS洗2分鐘×3次；加封閉液50μl/片，室溫30分鐘，甩掉封閉液，不洗；用封閉液1∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體，50μl加至標(biāo)本片上。置樣品于濕盒中，37℃反應(yīng)30分鐘。TBS洗2分鐘×3次；用封閉液1∶100稀釋SABC，混勻加至標(biāo)本片，37℃反應(yīng)30分鐘。TBS洗5分鐘×4次；DAB顯色取1ml蒸餾水，分別加入DAB試劑盒中A、B、C試劑各1滴，混勻后加至標(biāo)本上，顯色30分鐘。水洗；脫水，透明，封片。顯微鏡計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)。
一般形態(tài)學(xué)觀察觀察陽性細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量和陽性反應(yīng)部位等。
陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)在光鏡200×下，以每張蓋玻片中央為中心視野，再取其上下左右相鄰視野各個(gè)，共5個(gè)視野，計(jì)數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)。每組取4張蓋玻片，以一個(gè)視野為樣本，共計(jì)20個(gè)樣本。
Caspase-3的免疫組織化學(xué)檢測(cè) 切片制作同。組織切片PBS洗5min×3，0.3％H2O2溶液阻斷內(nèi)源性過氧化酶5min；PBS洗5min×3；1.5％正常羊血清封閉30min；滴加一抗(抗Caspase-3抗體)，4℃過夜；PBS洗5min×3；加生物素化二抗，室溫反應(yīng)1.5h；PBS洗5min×3；加SABC室溫反應(yīng)2小時(shí)；PBS洗5min×3；DAB顯色15min，蒸餾水漂洗，脫水，透明，封片。
一般形態(tài)學(xué)觀察觀察陽性細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量和陽性反應(yīng)部位等。
陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)在光鏡200×下，以每張蓋玻片中央為中心視野，再取其上下左右相鄰視野各個(gè)，共5個(gè)視野，計(jì)數(shù)Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)。每組取4張蓋玻片，以一個(gè)視野為樣本，共計(jì)20個(gè)樣本。
神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣的測(cè)定[5]原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)9天后，模擬缺血再灌注損傷造模，再灌注18小時(shí)后，用Hank`s液漂洗各組細(xì)胞2-3次，吸取細(xì)胞表面的殘?jiān)约捌渌s質(zhì)，加入含有5μmol·L-1FLUO-3/AM，ester的維持培養(yǎng)液，37℃溫育40min，再用Hank`s液洗2-3次，充分洗去沒有負(fù)載的熒光探針，上機(jī)檢測(cè)。
將負(fù)載好的神經(jīng)細(xì)胞方在LCSM載物臺(tái)上，先用倒置鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)，再在熒光顯微鏡下調(diào)平面，觀察細(xì)胞負(fù)載情況，用氪氬離子激光預(yù)掃描后設(shè)置各種條件，選擇掃描時(shí)間間隔、掃描時(shí)間，然后正式選擇整個(gè)細(xì)胞，掃描并記錄Ca2+熒光強(qiáng)度。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 X±S表示，用t檢驗(yàn)判斷差異的顯著性。結(jié)果1、缺糖缺氧后不同時(shí)間神經(jīng)細(xì)胞凋亡率 神經(jīng)細(xì)胞凋亡后，染色質(zhì)DNA被核酸內(nèi)切酶切割，形成小分子DNA片段，從細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散出，細(xì)胞內(nèi)DNA含量降低。PI染色后在流式細(xì)胞儀上分析細(xì)胞各期DNA含量，在DNA直方圖中，正常細(xì)胞G1峰前出現(xiàn)一DNA減少的“亞二倍體峰”或“G1亞峰”(Sub-G1-Peak)，該峰的出現(xiàn)被認(rèn)為是凋亡發(fā)生的標(biāo)志之一。
流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明，神經(jīng)細(xì)胞缺糖缺氧3h后神經(jīng)細(xì)胞G1峰前出現(xiàn)一DNA減少的“亞二倍體峰”，既細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，而且復(fù)糖復(fù)氧時(shí)間的延長，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率增加，缺糖缺氧3h后復(fù)糖復(fù)氧18h細(xì)胞凋亡率最高為22.03％，至復(fù)糖復(fù)氧24h細(xì)胞凋亡率有所降低，因此下面的實(shí)驗(yàn)均選擇缺糖缺氧3h后復(fù)糖復(fù)氧18h制備細(xì)胞“缺血再灌注模型”，觀察ISA對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率的影響。
2、ISA對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè) 根據(jù)前面的實(shí)驗(yàn)，溶劑對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞缺糖缺氧3h后復(fù)糖復(fù)氧18h，作為細(xì)胞損傷模型組。結(jié)果表明，溶劑對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞缺糖缺氧3h后復(fù)糖復(fù)氧18h，細(xì)胞凋亡率為22.03％；給予不同濃度的ISA(10-5、10-6、10-7mol·L-1)和尼莫地平(10-5mol·L-1)，細(xì)胞凋亡率分別為9.44％，7.96％，7.94％和9.76％，細(xì)胞凋亡率分別下降了63.87％，63.96％，55.70％和57.15％。結(jié)果見表6。
表6、ISA對(duì)體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡百分率的影響劑量/組別 凋亡百分率/％抑制百分率/％mol·L-1正常 - 7.78±2.79 -模型 - 22.03±3.65ΔΔ-尼莫地平 10-59.44±1.96**57.15**ISA 10-57.96±1.12**63.87**10-67.94±1.44**63.96**10-79.76±1.01**55.70**
與模型組比較**P＜0.01與正常組比較ΔΔP＜0.01.
TUNEL檢測(cè) 神經(jīng)細(xì)胞TUNEL染色后，陽性細(xì)胞(即凋亡細(xì)胞)細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，可見核固縮、裂解，染色質(zhì)呈顆粒狀或塊狀凝集，邊聚于核膜周圍，而胞漿不著色。陰性細(xì)胞(即正常細(xì)胞)胞核形態(tài)正常不著色。溶劑對(duì)照組復(fù)糖復(fù)氧18h，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于正常細(xì)胞；而ISA和NIM組陽性細(xì)胞數(shù)與溶劑對(duì)照組比較明顯減少。結(jié)果見表7。
表7、ISA對(duì)體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡百分率的影響劑量組別 陽性細(xì)胞數(shù)量 抑制百分率/％mol·L-1正常 -1.50±1.36-模型 -13.15±7.83ΔΔ-尼莫地平 lO-56.00±2.05**54.37ISA 10-62.70±1.52**79.47與模型組比**P＜0.01與正常組比較ΔΔP＜0.01.
3、ISA對(duì)神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3表達(dá)的影響免疫細(xì)胞化學(xué)染色，DAB顯色后，陽性細(xì)胞胞漿呈棕黃色，而胞核不著色。正常細(xì)胞胞核、胞漿均不著色，而且細(xì)胞形態(tài)較好。各組陽性細(xì)胞在顯微鏡下計(jì)數(shù)結(jié)果和比較結(jié)果如表8所示，溶劑對(duì)照組缺糖缺氧后復(fù)糖復(fù)氧18h，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于正常細(xì)胞；而給予ISA和NIM干預(yù)后，陽性細(xì)胞數(shù)與溶劑對(duì)照組比較，細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯減少。
表8、ISA對(duì)體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3表達(dá)的影響劑量 組別 陽性細(xì)胞數(shù) 抑制百分率/％mol·L-1- Normal 12.85±4.78ΔΔ-- Vehicle 58.35±9.90 -10-5NIM 25.95±13.88**55.6510-6ISA 27.2±10.29**53.38與模型組比較**P＜O.Ol與正常組比較ΔΔP＜0.014、ISA對(duì)神經(jīng)元[Ca2+]i的影響神經(jīng)細(xì)胞缺糖缺氧3h后復(fù)糖復(fù)氧18h后，加入含有5μmol·L Ca2+探針FLUO-3/AM，ester的維持培養(yǎng)液，37℃溫育40min，即在激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度推測(cè)[Ca2+]i，結(jié)果如附圖
6所示，溶劑對(duì)照組細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯增高，而ISA10-6mol·L-1和尼莫地平10-5mo·L-1細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯降低。圖像分析結(jié)果見表9。
表9、ISA對(duì)體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)細(xì)胞[Ca2+]i的影響組別 劑量/mo·L-1熒光強(qiáng)度正常- 84.99±24.59模型- 144.64±14.70ΔΔ尼莫地 10-553.36±27.74**平ISA10-686.71±34.80**與模型組比較**P＜0.01；與正常組比較ΔΔP＜0.01.
實(shí)驗(yàn)例4、對(duì)實(shí)驗(yàn)性血栓的影響1對(duì)大鼠動(dòng)靜脈環(huán)路血栓形成的影響方法大鼠腹腔注射10％水合氯醛0.32ml/100g麻醉，仰臥位固定，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈和左側(cè)頸外靜脈。在10cm長的聚乙烯管中段放入一根提前稱重的7號(hào)手術(shù)線(長約8cm)并充滿生理鹽水，其兩端連接充滿肝素的插管(長約3cm)，一端插管插入頸靜脈，另一端插入頸總動(dòng)脈，打開動(dòng)脈夾后，血液從右側(cè)頸總動(dòng)脈經(jīng)聚乙烯管流入左側(cè)頸外靜脈，形成體外環(huán)路血流。15分鐘后中斷血流，迅速取出血栓稱重，該重量減去絲線重量即得血栓濕重；血栓60℃干燥45分鐘，稱重，該重量減去絲線重量即得血栓干重。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表10 ISA對(duì)大鼠動(dòng)靜脈旁路血栓的影響(X±SD，n＝10-12)劑量 血栓濕重抑制率 血栓干重 抑制率組別(mg/kg) (mg) (％) (mg) (％)空白組- 182.9±53.2 42.40±11.72ISA 200 107.2±16.92**41.425.34±3.91**40.2ISA 100 119.1±23.17**34.927.87±5.22**34.3ISA 50 129.8±48.34*29.029.38±11.73*30.7ISA 25 136.15±38.88*25.531.59±9.02*25.5ISA 12.5144.05±35.47 21.133.42±8.23 21.0ASA 50 128.35±32.85**29.829.27±7.65**31.0
注*P＜0.05，**P＜0.01表示與空白組比較結(jié)果表明ISA50、100、200mg/kg組，均可明顯降低大鼠體外血栓重量(含濕重和干重)，且有一定量效關(guān)系。阿斯匹林50mg/kg組也顯示明顯的血栓抑制作用。
2對(duì)電刺激大鼠頸總動(dòng)脈血栓形成的影響方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用10％水合氯醛麻醉(0.35ml/100g)，仰位固定，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，分別將血栓形成測(cè)定儀刺激電極放于頸總動(dòng)脈近心端，熱敏溫度計(jì)放于遠(yuǎn)心端，設(shè)定檢測(cè)儀溫度為80℃，刺激電流1.5mA打開電極和計(jì)時(shí)器開關(guān)，刺激7min，7min時(shí)儀器自動(dòng)斷開，屏幕顯示的時(shí)間即為血管阻塞時(shí)間，即為血栓形成時(shí)間(OT)。按下面公式計(jì)算延長率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表11 SA對(duì)電刺激大鼠頸總動(dòng)脈血栓形成時(shí)間的影響(X±SD)劑 量動(dòng)物數(shù) 血栓形成時(shí)間 延長率組別(mg/kg) (n) (s) (％)空白組- 12 535.80±99.2-ISA 20012 796.61±70.7**48.7ISA 10012 701.81±69.1**31.0ISA 50 12 644.31±40.6*20.3ASA 50 12 714.21±70.9**33.3注*P＜0.05，**P＜0.01與空白組比較結(jié)果顯示，ISA50、100、200mg/kg組可顯著延長血栓形成時(shí)間，ASA組也呈現(xiàn)明顯延長作用。
實(shí)驗(yàn)例5異亞丙基莽草酸(ISA)對(duì)大鼠局灶性腦栓塞的影響方法與結(jié)果1 ISA對(duì)大腦中動(dòng)脈血栓模型(MCAO)神經(jīng)癥狀的影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為6組，(1)假手術(shù)組(2)MCAO組(3)ISA50mg/kg組(4)ISA100mg/kg組(5)ISA200mg/kg組(6)NIM5mg/kg組，3-6組造模后立即灌胃給藥一次，60分鐘再給藥一次。
大鼠腹腔注射10％水合氯醛溶液0.4ml/kg，麻醉。按Tamura等的方法，稍加改進(jìn)。大鼠右側(cè)臥位固定，在眼外眥和外耳道連線中點(diǎn)作一弧形切口，長約1.5cm，夾斷顳肌并切除，暴露顳骨，用牙科鉆在顴骨與顳鱗骨接合處靠近口側(cè)1mm處作一直徑2.5mm骨窗，清理殘?jiān)┞洞竽X中動(dòng)脈(位于嗅束及大腦下靜脈之間)。置一小片塑料薄膜保護(hù)血管周圍組織。將吸有50％氯化鐵溶液10μl的小片定量濾紙敷在此段大腦中動(dòng)脈上，30min后取下濾紙，用生理鹽水沖洗局部組織，逐層縫合，回籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組，除不滴加氯化鐵溶液外，其余手術(shù)步驟同模型組。
行為檢測(cè)，在術(shù)后不同時(shí)間(6h，24h)，按Bederson等的方法并加以改進(jìn)，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行行為評(píng)分。滿分為4分，分?jǐn)?shù)越高，動(dòng)物的行為障礙越嚴(yán)重。對(duì)行為檢測(cè)打分值進(jìn)行組間比較，t檢驗(yàn)。結(jié)果見表12。
表12 ISA對(duì)模型大鼠行為學(xué)評(píng)分的影響(X±SD)注*P＜0.05，**P＜0.01與模型組比較劑量 例數(shù) 分值組別(mg/kg) (n) 6h 24h假手術(shù)組-12 0±0**0±0**模型組 -10 3.50±0.71 3.10±0.70ISA200 11 1.82±0.75**1.36±0.48**ISA100 11 1.91±0.70**1.64±0.48**ISA5010 2.40±0.70**2.20±0.75*NIM5 11 2.64±0.67**1.64±0.64**結(jié)果顯示，ISA各劑量組和尼莫地平組對(duì)模型大鼠的行為學(xué)均有顯著的改善(P＜0.05，P＜0.01)。
2、ISA對(duì)MCAO大鼠腦梗塞范圍的影響動(dòng)物經(jīng)末次行為評(píng)分后，斷頭取腦。去掉嗅球、小腦和低位腦干，剩余部分在4℃下冠狀切成5片。迅速將腦片置于TTC染液中(每5ml染液中含4％TTC1.5ml，1MK2HPO40.1ml)，37℃避光溫孵30分鐘，再取出，置于10％甲醛中避光保存。經(jīng)染色后非缺血區(qū)為玫瑰紅色，梗塞區(qū)為白色。將白色組織仔細(xì)挖下稱重，以梗塞組織重量占全腦重量的百分比作為腦梗塞范圍。結(jié)果進(jìn)行組間比較，t檢驗(yàn)。結(jié)果見表13
表13 ISA對(duì)模型大鼠腦梗塞范圍的影響(X±SD)劑量 例數(shù) 梗塞范圍占全腦的重量比組別(mg/kg) (n) (％)假手術(shù)組 - 120±0**模型組 - 103.42±1.08ISA 200 112.34±0.63*ISA 100 112.47±0.88*ISA 50 102.59±0.78NIM 5112.50±0.71*注*P＜0.05，**P＜0.01與模型組比較結(jié)果顯示，ISA大、中劑量及尼莫地平組可明顯減小模型大鼠腦梗塞范圍(P＜0.05)。
3、ISA對(duì)MCAO大鼠腦含水量的影響動(dòng)物分組、給藥、造模方法同前面實(shí)驗(yàn)，造模24小時(shí)后斷頭取腦，用濾紙吸干表面水分，稱量全腦濕重。再置于烘箱中，105℃烘烤48小時(shí)至恒重，精確稱量干重，計(jì)算含水量，組間比較，進(jìn)行t檢驗(yàn)。結(jié)果見表14。
表14 ISA對(duì)模型大鼠腦含水量的影響(X±SD)劑量 例數(shù) 全腦含水量組別(mg/kg) (n) (％)假手術(shù)組 -1280.04±0.34**模型組 -1080.46±0.35ISA 200 1180.09±0.41*ISA 100 1180.15±0.37ISA 501080.3±0.62NIM 5 1180.49±0.54注*P＜0.05，**P＜0.01與模型組比較結(jié)果表明，模型大鼠腦含水量明顯增加，ISA大劑量組可明顯改善模型大鼠腦水腫程度(P＜0.05)。
實(shí)驗(yàn)例6ISA對(duì)血小板聚集功能的影響1 ISA體外實(shí)驗(yàn)對(duì)ADP、膠原誘導(dǎo)的家兔血小板的聚集的影響方法家兔用1.5％戊巴比妥耳緣靜脈注射麻醉。頸總動(dòng)脈取血，3.8％枸櫞酸鈉抗凝(1∶9)，800rpm離心8min，分離PRP，3000rpm離心15min，分離PPP，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，用PPP調(diào)PRP血小板數(shù)約4×108/L。取300μlPRP，加入10μl不同濃度藥物，溫育10min，加入誘導(dǎo)劑ADP5μl或膠原7.5μl，分別檢測(cè)5或10min，記錄最大聚集率，空白組加入10μl蒸餾水，溶媒組加入4％乙醇液10μl，檢測(cè)同上。結(jié)果表15、ISA體外實(shí)驗(yàn)對(duì)ADP誘導(dǎo)的家兔血小板聚集的影響(X±SD)組別 藥物終濃度(mol/L)最大聚集率(％)抑制率(％)空白組 - 62.80±19.21溶媒組4％乙醇 60.43±20.30ISA10-336.72±21.29**41.5ISA10-444.36±15.96**29.4ISA10-547.49±18.70*24.4ISA10-649.69±22.2920.9ISA10-756.48±21.5710.1ASA10-444.05±18.94#27.1注*P＜0.05，**P＜0.01與空白組比較；#P＜0.05與溶媒組比較結(jié)果表明，體外給藥，ISA終濃度10-3-10-5mol/L濃度組對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集均有明顯的抑制作用，且有一定量效關(guān)系。溶媒組與空白組比較無差異。
表16 ISA體外實(shí)驗(yàn)對(duì)膠原誘導(dǎo)的家兔血小板聚集的影響(X±SD)組別 藥物終濃度 最大聚集率 抑制率(％)(mol/L) (％)空白組- 68.67±15.97ISA 10-331.80±18.12**53.7ISA 10-438.74±17.70**43.6ISA 10-547.53±20.83**30.8ISA 10-648.02±19.06**30.1ISA 10-755.78±17.5918.8ASA 10-442.40±20.31**38.3
注**P＜0.01與空白組比較結(jié)果表明，體外給藥，ISA10-3-10-6濃度組對(duì)膠原誘導(dǎo)的血小板聚集均有明顯的抑制作用，也有一定的量效關(guān)系。
2 ISA體內(nèi)給藥對(duì)ADP、膠原、AA、凝血酶誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集的影響方法(1)分組與給藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組，即ISA 50、100、200mg/kg組；陽性藥組(阿斯匹林50mg/kg)；空白對(duì)照組。除空白組給予等量蒸餾水外，其余各組均按1ml/100g給藥，每日一次，連續(xù)三天。
(2)方法大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12h(不禁水)，于末次給藥后1.5h頸總動(dòng)脈取血，3.8％枸櫞酸鈉抗凝(1∶9)，800rpm離心10min，分離PRP，2500rpm離心10min，分離PPP，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，用PPP調(diào)PRP血小板數(shù)約6-8×108/L。取300μlPRP，加入誘導(dǎo)劑ADP4μmol/L或膠原7.5μl，或AA200μmol/L及凝血酶50U/L按Born比濁法測(cè)定血小板最大聚集率。
結(jié)果表17體內(nèi)給藥ISA對(duì)膠原、ADP誘導(dǎo)大鼠血小板聚集的影響(X±SD)膠原ADP劑量組別 最大聚集率 抑制率 最大聚集率(％) 抑制率(mg/kg)(％) (％)(％)空白組- 79.02±8.4268.23±14.51ISA 200 40.47±28.88**48.439.68±13.74**43.3ISA 100 54.71±26.76**30.849.82±7.92**27.0ISA 50 67.25±10.72**14.952.23±11.90**23.5ASA 50 32.81±24.32**58.549.13±8.44**28.0注**P＜0.01與空白組比較。
結(jié)果表明，ISA連續(xù)灌胃3天可顯著抑制膠原、ADP、AA、凝血酶誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集，并有一定量效關(guān)系。
表18 ISA體內(nèi)給藥對(duì)AA、凝血酶誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集的影響(X±SD)，n＝9～10劑量 AA凝血酶組別mg/kg 聚集率(％) 抑制率(％) 聚集率(％) 抑制率(％)空白 -- 56.51±9.82 -- 55.21±16.00 --ISA 200 36.21±15.80**35.9 36.99±15.09*33.0ISA 100 41.40±17.80*26.7 38.94±22.54*29.5ISA 50 42.92±17.46*25.8 42.68±20.8522.7ASA 50 32.72±15.40**42.1 41.70±12.7922.5注*、**表示與空白組比較P＜0.05、P＜0.01實(shí)驗(yàn)例7ISA對(duì)凝血系統(tǒng)的影響1 ISA對(duì)正常大鼠凝血因子的作用實(shí)驗(yàn)方法(1)分組與給藥動(dòng)物隨機(jī)分為5組，即空白組，ISA50、100、200mg/kg組和陽性藥ASA50mg/kg組，除空白組給予等量蒸餾水外，其余各組均按1ml/100g體重給藥，每日一次連續(xù)三天，于末次給藥后1h取血測(cè)定。
(2)方法大鼠于末次給藥后1h 10％水合氯醛0.35ml/kg腹腔注射麻醉，頸總動(dòng)脈取血，3.8％枸櫞酸鈉(1∶9)抗凝，3500rpm離心10min，分離PPP，取100μl放于比濁杯中，按試劑盒說明分別加入TT、PT、aPTT試劑，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)。
結(jié)果表19 ISA對(duì)大鼠凝血因子的影響(X±SD)劑量組別 N TT(s)PT(s) APTT(s)(mg/kg)空白組 - 10 34.04±3.17 14.71±1.69 17.76±1.40ISA20010 37.25±3.39 15.55±1.40 19.41±2.28ISA10010 37.14±5.70 15.13±1.08 17.97±1.41ISA50 10 36.95±4.95 15.46±1.36 17.80±1.61ASA50 949.86±9.98**##47.57±17.23**#38.52±15.97**###注*P＜0.05，**P＜0.01與空白組比較；##P＜0.01與ISA200mg/kg組比較。
結(jié)果表明，ISA各劑量組對(duì)大鼠TT、PT、aPTT無明顯影響，ASA組對(duì)TT、PT、aPTT均有明顯延長作用。
實(shí)驗(yàn)例8ISA對(duì)球囊導(dǎo)管所致大鼠內(nèi)皮損傷模型的影響血小板聚集活性的測(cè)定，大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12h(不禁水)，于末次給藥后1.5h頸總動(dòng)脈取血，3.8％枸櫞酸鈉抗凝(1∶9)，800rpm離心10min，分離PRP，2500rpm離心10min，分離PPP，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，用PPP調(diào)PRP血小板數(shù)約6-8×108/L。取300μlPRP，加入誘導(dǎo)劑ADP4μl(終濃度為4μmol/L)或膠原7.5μl，誘導(dǎo)集終濃度為ADP10μmmol/L，膠原40μm/L，按Born比濁法測(cè)定血小板最大聚集率。血小板聚集測(cè)定均在采集血樣后3h完成。
可溶性P-選擇素釋放的測(cè)定，術(shù)后三天收集血液標(biāo)本，大鼠頸總動(dòng)脈取血，2％的EDTA-Na2抗凝，體積比為1∶9，-20度保存，按放免法測(cè)定，雙抗夾心法測(cè)定。
血小板vWF釋放的測(cè)定，大鼠頸總動(dòng)脈取血，2％的EDTANa2抗凝，體積比為1∶10，-20保存，。按試劑盒要求用ELISA法測(cè)定各孔A值，以A492對(duì)vWF標(biāo)準(zhǔn)血漿稀釋度(含量％)在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上做標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測(cè)樣品vWF含量由標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出。
血清中NOS、NO含量的測(cè)定，取全血3mL，室溫放置1h，4℃離心3500rpm，15min，分離血清，放-20℃保存。按試劑盒要求處理樣品，于722分光光度計(jì)上測(cè)定。
血漿中TXB2和6-酮PGF1a含量的測(cè)定，取一次性5ml離心管加入消炎痛-EDTA·Na20.2ml，動(dòng)脈插管取血3Ml，混勻，4℃離心3500rpm，15min，分離血漿，放-20℃保存。用放免法測(cè)定TXB2和6-酮PGF1a的含量。
結(jié)果球囊導(dǎo)管損傷后三天血小板聚集性的變化及ISA的干預(yù)作用球囊剝脫術(shù)后大鼠的血小板聚集明顯高于空白組，空白組的血小板最大聚集率分別為43.7±15.4％和43.4±11.7％，模型組的血小板最大聚集率分別為70.0±20.7％和62.6±17.0％，血小板聚集反應(yīng)性明顯增加，說明血小板處于激活狀態(tài)。ISA連續(xù)給藥三天可明顯抑制膠原和ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板最大聚集率，其中200mg/kg的抑制率分別為38.0％，56.6％。
表20球囊導(dǎo)管損傷后三天血小板聚集性的變化及ISA的干預(yù)作用組別劑量 聚集率(％) 抑制(％)(mg/kg) ADP Col ADPCol對(duì)照 - 43.7±15.4 43.4±11.7 -- --模型 - 70.0±20.7#62.6±17.0##-- --ISA 200 30.4±16.7**38.8±14.8*56.6 38.0ISA 100 38.1±19.3*42.1±16.2*45.6 32.7ISA 50 45.0±13.5 46.1±15.7**35.7 26.4阿司匹林 50 41.7±11.8*41.4±12.3**40.4 33.9由表20可知，球囊導(dǎo)管所致大鼠主動(dòng)脈壁損傷后三天血小板對(duì)ADP、膠原誘導(dǎo)的聚集性明顯增高，表明該模型中血小板的活性增強(qiáng)，ISA200mg/kg連續(xù)給藥三天可顯著降低ADP、膠原誘導(dǎo)的血小板聚集性。
球囊導(dǎo)管損傷后三天血漿中GMP-140和vWF含量的變化及ISA的影響。
鼠后第三天取血檢測(cè)血漿中GMP-140水平，模型組血漿中GMP-140含量水平為41.6±16.7ng/ml，ISA50mg/kg有降低血漿中GMP-140含量水平的趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ISA200mg/kg和100mg/kg能顯著降低血漿中GMP-140含量水平，提示ISA了明顯抑制球囊括中術(shù)后早期血小板的活化，ASA也表現(xiàn)出了明顯的抑制作用。
結(jié)果顯示，球囊導(dǎo)管損傷內(nèi)皮后血漿中vWF的含量高于空白組(Control)，但無明顯差異(P＞0.05)。灌胃給藥ISA200、100、50mg/kg組血漿中vWF的含量與誘導(dǎo)組相比均有所降低，其中200mg/kg組差異顯著(P＜0.05)。說明TSA體外給藥可部分抑制血小板激活時(shí)血漿中vWF含量的升高。ISA200mg/kg可明顯降低血漿中GMP140含量，ASA液表現(xiàn)出了明顯的抑制作用。結(jié)果見表21。
表21 ISA對(duì)血漿vWF和P-選擇素的影響(x±SD，n＝8～10)濃度組別劑量(mol/L) nVWF(％) P-選擇素(ng/ml)對(duì)照 - 422.95±0.95---模型 - 423.77±0.99 41.6±16.7ISA 200 421.74±1.38**20.9±9.8**ISA 100 422.60±1.35*30.0±13.0ISA 50 422.86±1.24 33.2±12.8阿司匹林50 421.92±2.14 27.0±8.1*
4.1 ISA連續(xù)三天給藥對(duì)內(nèi)皮模型血清中NO、NOS的影響結(jié)果表明，球囊導(dǎo)管所致內(nèi)皮損傷的第三天血清中所測(cè)的NOS活性較空白組明顯降低，血清中NO含量也有一定的減少。本實(shí)驗(yàn)中觀察到ISA連續(xù)三天給藥可以明顯的增加血清中NOS的活性，升高血清中NO的含量。NO可以活化可溶性含血紅素的鳥苷酸環(huán)化酶，使血管平滑肌和血小板中的cGMP水平升高，促進(jìn)血管平滑肌松弛，抑制血小板凝聚和粘附到內(nèi)皮細(xì)胞上。在球囊導(dǎo)管損傷血管內(nèi)皮后的早期，血管平滑肌細(xì)胞iNOS產(chǎn)生的大量NO可以抑制血小板粘附與聚集，保持損傷部位的抗血栓特性。本實(shí)驗(yàn)中阿司匹林也可以明顯增加血清中NO的含量，但對(duì)NOS活性影響不明顯。
表22 ISA連續(xù)三天給藥對(duì)內(nèi)皮損傷模型血清中NO、NOS的影響組別 NO含量(umol/L)NOS活性(U/mL)空白組 24.81±18.61 22.85±2.17模型組 21.42±12.40 19.91±2.85#ISA200mg/kg 36.06±13.32*20.40±3.55ISA100mg/kg 37.18±21.17 22.52±3.57ISA50mg/kg 26.64±10.55 23.21±3.85*ASA50mg/kg 34.46±14.01*21.31±2.10注*P＜0.05表示同模型組比較，#P＜0.05表示同空白組比較。
5.ISA連續(xù)給藥對(duì)球囊導(dǎo)管損傷內(nèi)皮模型血漿中TXB2、6-PGF1α含量的影響結(jié)果表明正常大鼠血漿中TXB2為222.9±87.45pg/ml，實(shí)施大鼠胸、腹主動(dòng)脈內(nèi)皮剝脫術(shù)后三天血漿中TXB2含量明顯增高(502.9±295.1，p＜0.05vsmormal)，ISA200mg/kg、100mg/kg灌胃給藥能明顯降低血漿中TXB2的水平(P＜0.05)，抑制率為47.4％，45.5％，ISA50mg/kg對(duì)模型血漿中TXB2含量無明顯影響，但同空白組相比較沒有顯著性差異(p＞0.05)，環(huán)氧化酶抑制劑ASA能顯著降低血漿中TXB2的含量(P＜0.01)，抑制率達(dá)76.2％。
表23 ISA連續(xù)3天給藥對(duì)內(nèi)皮損傷模型血漿中TXB2、6-PGF1α含量的影響(x±SD)(n＝8～10)組別 TXB2(pg/ml) 6-PGF1α(pg/ml) TXB2/6-PGF1aratio空白組222.9±87.45 717.9±405.2 0.80±0.44模型組502.9±295.1#428.1±316.5 1.89±1.21##ISA200mg/kg 264.3±90.3*594.4±247.8 0.88±0.36*ISA100mg/kg 274.2±130.2*612.2±558.2 0.97±0.47*ISA50mg/kg467.4±324.4 681.1±461.9 1.19±0.65ASA50mg/kg119.6±104.1**139.3±50.54*1.38±0.30另外，正常大鼠血漿中6-keto-PGF1a含量為717.9±405.2pg/ml，實(shí)施大鼠胸、腹主動(dòng)脈內(nèi)皮剝脫術(shù)后三天血漿中6-PGF1α含量明顯降低(428.1±3 16.5，P＞0.05vs mormal)，給予ISA200、100、50mg/kg三天后對(duì)血漿中6-keto-PGF1a含量水平桶模型比較有一定的增加趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05 vs model)。ASA則能顯著降低血漿中6-keto-PGF1a的含量(139.3±50.54，P＜0.01)，抑制率達(dá)80.6％。
正常大鼠血漿中TXB2/6-keto-PGF1a的比值為0.80±0.44，實(shí)施大鼠胸、腹主動(dòng)脈內(nèi)皮剝脫術(shù)后三天血漿中TXB2/6-keto-PGF1a的比值明顯增高(1.89±1.21，p＜0.01vsmodel)ISA200、100mg/kg能明顯降低血漿中TXB2/6-keto-PGF1a的比值(p＜0.05)，50mg/kg雖然有降低血漿中TXB2/6-keto-PGF1a幣值的趨勢(shì)，但同模型組相比較無顯著差異(P＞0.05)，ASA顯著降低血漿中TXB2、6-keto-PGF1a的含量，但對(duì)血漿中TXB2/6-keto-PGF1a的比值無明顯影響。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常大鼠血漿中6-keto-PGF1a含量為553.3±507pg/ml，實(shí)施大鼠胸、腹主動(dòng)脈內(nèi)皮剝脫術(shù)后三天血漿中6-PGF1α含量明顯降低(275.7±239.1，p＜0.05vsmormal)，給予ISA200、100、50mg/kg三天后對(duì)血漿中6-keto-PGF1a含量水平桶模型比較有一定的增加趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05 vs model)。ASA則能顯著降低血漿中6-keto-PGF1a的含量(P＜0.01)。
實(shí)驗(yàn)例9異亞丙基莽草酸對(duì)第二信使的影響血小板環(huán)核苷酸cAMP、cGMP的測(cè)定 大鼠10％水合氯醛腹腔注射麻醉，頸總動(dòng)脈放血，2％EDTA·Na219抗凝，以100×g離心5min制備PRP，PRP繼續(xù)以500×g離心5min，所得沉淀物為所需血小板樣品。沉淀物中加入0.3％NaCl溶液1.5mL，保存2min，使殘存的紅細(xì)胞溶解，再加入4.5％NaCl溶液0.25mL恢復(fù)等滲，1800×g離心10min，棄上清液，沉淀物加入雙蒸水0.5mL和10％三氯醋酸0.25mL，用硅化玻璃棒輕輕攪拌，置冰浴中15min，1800×g離心15min，上清液用水飽和乙醚6mL分三次提取上清液中三氯醋酸，將水層置60℃水浴10min，蒸去殘余乙醚，-20℃保存。按放免法測(cè)定血小板環(huán)核苷酸cAMP、cGMP的含量。
結(jié)果ISA連續(xù)三天灌胃給藥對(duì)大鼠血小板cAMP和cGMP生成的影響用放射免疫法測(cè)定正常大鼠血小板內(nèi)cAMP的含量為11.55±3.69pg/4×108platelet，ISA100、200mg/kg連續(xù)灌胃給藥三天均明顯升高血小板內(nèi)cAMP的含量，分別為15.98±5.01、18.36±5.85pg/4×108platelet(p＜0.05，p＜0.01，vs control)，但對(duì)血小板內(nèi)cGMP無明顯影響。見表24。表24 ISA連續(xù)三天灌胃給藥對(duì)大鼠血小板cAMP和cGMP生成的影響(X±SD)n＝9～12.
組別 劑量(mg/kg) CAMP(ng/mL)CGMP(ng/mL)空白 -- 11.55±3.690.62±0.36ISA 20015.42±8.970.67±0.40ISA 10015.98±5.01*0.84±0.45ISA 50 18.36±5.85**0.85±0.34ASA 50 14.37±5.030.84±0.41注*、**表示與空白組比較P＜0.05、P＜0.01實(shí)施例1亞丙基莽草酸的制備方法取莽草酸1g，加80ml丙酮，再加0.05g對(duì)甲苯磺酸，水浴回流2小時(shí)，回收丙酮至干，加水40ml，乙酸乙酯40ml分配，水層再分別用20ml乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯，分別用20ml水洗滌2次，20gNa2SO4脫水，回收乙酸乙酯，得異亞丙基莽草酸1g，再用10倍量丙酮重結(jié)晶。
實(shí)施例2異亞丙基莽草酸的測(cè)定方法純度測(cè)定采用硅膠TLCS法及HPLC法測(cè)定3，4-O異亞丙基莽草酸原料的純度，純度可達(dá)98％以上。
純度檢查(TLC法)，吸附劑硅膠G預(yù)制；展開劑10∶1∶4d氯仿-甲醇-甲酸；顯色劑5％硫酸乙醇溶液，噴后加熱顯色。
點(diǎn)樣量從左至右依次為10μg、20μg、30μg、40μg、60μg、80μg、100μg；3，4-O-異亞丙基莽草酸定量方法色譜柱luna C184.6×250mm，5μm，移動(dòng)相1000∶350％MeOH-冰HAC，測(cè)定波長220nm，流速1ml/min，室溫；標(biāo)準(zhǔn)曲線制備，精密稱取3，4-O-異亞丙基莽草酸對(duì)照品1.15mg，5.14mg，10.83mg，20.45mg，30.65mg，50.52mg于50.0ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻液，搖勻，為標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別吸取10.0μl進(jìn)樣測(cè)定，并進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程為A＝20934C+235，r為0.9996，線性范圍為0.23～10.10μg；對(duì)照品溶液的制備精密稱取3，4-O-異亞丙基莽草酸對(duì)照品約20mg于50.0ml容量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，做為對(duì)照品溶液；3，4-O-異亞丙基莽草酸原料藥含量測(cè)定精密稱取3，4-O-異亞丙基莽草酸原料約20mg于50.0ml容量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，取少量以微孔濾膜濾過，濾液做為樣品供試液；精密吸取樣品供試液、對(duì)照品溶液各10μl注入HPLC儀測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含量。
權(quán)利要求
1.一種化合物3，4-O-異亞丙基莽草酸，其特征在于該化合物結(jié)構(gòu)式為
2.一種異亞丙基莽草酸的制備方法，其特征在于該方法為莽草酸1重量份，加丙酮20-80體積份，再加對(duì)甲苯磺酸0.04-0.06重量份，回流1-2小時(shí)，回收丙酮，反應(yīng)物加水約10-40份，乙酸乙酯10-40體積份分配，水層再用乙酸乙酯10-20倍萃取3-5次，或逆流萃取，合并乙酸乙酯液，無水Na2SO4脫水，回收乙酸乙酯至干，即得。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于該方法為取莽草酸1重量份，加80體積份丙酮，再加0.05重量份對(duì)甲苯磺酸，水浴回流2小時(shí)，回收丙酮至干，加水40體積份，乙酸乙酯40體積份分配，水層再用20體積份乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯，用20體積份水洗滌2次，20重量份Na2SO4脫水，回收乙酸乙酯，得異亞丙基莽草酸1重量份。
4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于該方法得到異亞丙基莽草酸后，還可以再用10倍量丙酮重結(jié)晶。
5.異亞丙基莽草酸的測(cè)定方法，其特征在于該方法為儀器及測(cè)定條件，色譜柱luna C184.6×250mm，5μm，移動(dòng)相800-1200∶32-3850％MeOH-冰HAC()，測(cè)定波長220nm，流速1ml/min，室溫；標(biāo)準(zhǔn)曲線制備，精密稱取3，4-O-異亞丙基莽草酸對(duì)照品1.15mg，5.14mg，10.83mg，20.45mg，30.65mg，50.52mg于50.0ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻液，搖勻，為標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別吸取10.0μl進(jìn)樣測(cè)定，并進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程為A＝20934C+235，r為0.9996，線性范圍為0.23～10.10μg；對(duì)照品溶液的制備，精密稱取3，4-O-異亞丙基莽草酸對(duì)照品約20mg于50.0ml容量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，做為對(duì)照品溶液；3，4-O-異亞丙基莽草酸原料藥含量測(cè)定，精密稱取3，4-O-異亞丙基莽草酸原料20mg于50.0ml容量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，取少量以微孔濾膜濾過，濾液做為樣品供試液；精密吸取樣品供試液、對(duì)照品溶液各10μl注入HPLC儀測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算3，4-O-異亞丙基莽草酸含量。
6.如權(quán)利要求5所述的異亞丙基莽草酸的測(cè)定方法，其特征在于該方法移動(dòng)相為50％MeOH-冰HAC1000∶35。
7.異亞丙基莽草酸的純度測(cè)定方法，其特征在于該方法為采用硅膠TLCS法及HPLC法，吸附劑，硅膠G預(yù)制板；展開劑為，8-12∶0.5-1.5∶2-5滴氯仿-甲醇-甲酸；顯色劑為3-6％硫酸乙醇溶液，噴后加熱顯色，點(diǎn)樣量從左至右依次為8-12μg、18-22μg、28-32μg、38-42μg、58-62μg、78-82μg、98-102μg，測(cè)定純度可達(dá)98％以上。
8.如權(quán)利要求7所述的異亞丙基莽草酸的純度測(cè)定方法，其特征在于該方法中展開劑為10∶1∶4d氯仿-甲醇-甲酸；顯色劑5％硫酸乙醇溶液，噴后加熱顯色；點(diǎn)樣量從左至右依次為10μg、20μg、30μg、40μg、60μg、80μg、100μg。
9.異亞丙基莽草酸在制備治療腦血栓的藥物中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，治療腦血栓是指異亞丙基莽草酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)有明顯保護(hù)作用。
11.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，治療腦血栓是指異亞丙基莽草酸對(duì)乳酸脫氫酶升高有降低作用。
12.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，治療腦血栓是指異亞丙基莽草酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡有抑制作用。
13.異亞丙基莽草酸在制備治療腦梗塞的藥物中的應(yīng)用。
14.異亞丙基莽草酸在制備抗血栓形成藥物中的應(yīng)用。
15.如權(quán)利要求14所述的抗血栓形成是指抑制血小板聚集。
16.如權(quán)利要求14所述的抗血栓形成是指增加血清中一氧化氮的含量。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種異亞丙基莽草酸的制備方法及新用途。本發(fā)明異亞丙基莽草酸的制備方法為莽草酸1重量份，加丙酮20－80體積份，再加對(duì)甲苯磺酸，回流1－2小時(shí)，回收丙酮，反應(yīng)物加水約10－40份，乙酸乙酯10－40體積份，分配一次后，水層再用乙酸乙酯10－20倍萃取3－5次，或逆流萃取，合并乙酸乙酯液，無水Na
文檔編號(hào)A61K31/357GK1442415SQ0213077
公開日2003年9月17日 申請(qǐng)日期2002年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月26日
發(fā)明者孫建寧, 郭亞健 申請(qǐng)人:北京中醫(yī)藥大學(xué)