用于酶固定化的改性磁性殼聚糖微球、其制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及殼聚糖微球制備及應(yīng)用研究領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種用于酶固定化的改性 磁性殼聚糖微球、其制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素是分布最廣泛的、含量最豐富的、可再生的天然有機(jī)物質(zhì)，可W源源不斷地 為人類提供能源。但在自然界中，絕大部分纖維素會(huì)被各類微生物分解轉(zhuǎn)化，僅有約11 %的 纖維素原料用于農(nóng)作物產(chǎn)品、飼料、制藥、紡織、造紙和建筑等方面，不僅造成資源的巨大浪 費(fèi)，而且污染環(huán)境，危害是相當(dāng)大的。
[0003] 酶對(duì)環(huán)境條件要求極為敏感，對(duì)酸、堿、熱、金屬離子、部分有機(jī)溶劑等都不穩(wěn)定。 一般情況下酶是W溶于水的狀態(tài)作用于底物的，存在反應(yīng)結(jié)束后難W回收利用、生產(chǎn)成本 較高、終產(chǎn)物分離提純較難等問題。比如，生物質(zhì)經(jīng)纖維素酶處理轉(zhuǎn)化為燃料乙醇的過程 中，纖維素酶的價(jià)格就占到生產(chǎn)總成本的20%左右，限制了酶在生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用。因此， 游離酶并非工業(yè)催化中一種理想的催化劑，還需要對(duì)酶進(jìn)行修飾和處理，W改善其性能。
[0004] 固定化酶（Immobi 1 ized enzyme)是通過物理或化學(xué)的方法，將酶結(jié)合于水不溶性 大分子載體上，或?qū)⒚赴裨谄渲?，使得酶在一定空間內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)，酶分子的流動(dòng)性降 低，但酶可W充分發(fā)揮應(yīng)有的催化作用，反應(yīng)結(jié)束后酶可與底物、產(chǎn)物分開，并能重復(fù)使用。 目前，酶固定化的方法按傳統(tǒng)可分為4大類，即吸附法、包埋法、交聯(lián)法和共價(jià)結(jié)合法。
[0005] 作為固定化酶的重要組成部分，載體材料的結(jié)構(gòu)和性能直接影響固定化酶的活 性，所W對(duì)載體材料的物理和化學(xué)性能有一定的要求，如多孔或疏松的結(jié)構(gòu)、有較大的比表 面積;適當(dāng)?shù)挠H水性、抗化學(xué)或微生物侵蝕及良好的穩(wěn)定性;此外還可通過物理或化學(xué)方法 進(jìn)行改性，使得表面連接必要的反應(yīng)基團(tuán)；工業(yè)應(yīng)用時(shí)，載體材料應(yīng)具有一定的機(jī)械強(qiáng)度， 可W承受一定強(qiáng)度的攬拌和壓縮，同時(shí)還應(yīng)具有無(wú)毒、來源廣泛、價(jià)格低廉等特點(diǎn)。因此，設(shè) 計(jì)、開發(fā)和制備性能較為優(yōu)越的載體材料已成為近年來固定化酶研究的重點(diǎn)之一。
[0006] 甲殼素是一種僅次于纖維素的來源及其豐富的天然有機(jī)化合物，廣泛存在于甲殼 綱動(dòng)物（郵、蟹等)的甲殼、昆蟲的甲殼、真菌(酵母、霉菌）的細(xì)胞壁W及某些植物的細(xì)胞壁 中。殼聚糖(化itosan，簡(jiǎn)稱CTS)是甲殼素的N-脫乙酷基產(chǎn)物，是一種二元線性共聚物，化學(xué) 名稱是e-2-氨基-2-脫氧-(1，4)-D葡聚糖，相對(duì)分子質(zhì)量在幾十萬(wàn)到上百萬(wàn)左右。殼聚糖不 溶于水、堿、稀的硫酸和憐酸，但可溶于部分稀的無(wú)機(jī)酸（如鹽酸）和大多數(shù)有機(jī)酸（如醋 酸）。殼聚糖有多糖結(jié)構(gòu)和氨基功能基團(tuán)，具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如吸濕性、通透性、抗菌性、良好的 生物相容性、無(wú)毒無(wú)害、對(duì)環(huán)境無(wú)污染等，可W作為固定化酶載體。因此，采用殼聚糖改善傳 統(tǒng)的固定化方法、開發(fā)新型的固定化技術(shù)和注重天然高分子載體材料的改性成為了酶固定 化研究的主要趨勢(shì)。
[0007] 然而，對(duì)于殼聚糖作為載體固定化酶的應(yīng)用，存在著必須離屯、操作，樣品不得不稀 釋及載體回收損失大等問題。因此，尋求更好的固定化酶載體成為了人們研究的熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種用于酶固定化的改性磁性殼聚糖微球、 其制備方法及應(yīng)用，能夠提供固定化酶的良好載體，并制備具有良好穩(wěn)定性和重復(fù)利用性 的固定化纖維素酶。
[0009] 為了達(dá)到上述技術(shù)目的，本發(fā)明提供一種用于酶固定化的改性磁性殼聚糖微球的 制備方法，包括：
[0010] (1)在0.5g殼聚糖粉末和0.125g納米四氧化=鐵中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的乙酸溶 液，待殼聚糖粉末充分溶解后，加入液體石蠟，250r/min轉(zhuǎn)速下攬拌10分鐘；
[0011] (2)將步驟(1)的所得物升溫至50°C，滴加乳化劑SpanSO，乳化10分鐘；
[0012] (3化步驟(2)的所得物中加入1.OmL的甲醒溶液，攬拌反應(yīng)1.5小時(shí)；
[001引（4)將步驟(3)的所得物升溫至70°C，滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的化OH溶液，在溶液pH 值保持為堿性條件下，緩慢滴加2. OmL的環(huán)氧氯丙烷，反應(yīng)5小時(shí)；
[0014] (5)將步驟(4)的所得物過濾，用蒸饋水洗涂，再依次用石油酸、無(wú)水乙醇洗涂、水 洗涂，直至洗涂液的pH值達(dá)到中性；
[001引（6)將50mg步驟(5)的所得物加入50mL反應(yīng)溶劑N，N-二甲基甲酯胺(DMF)中浸泡；
[0016] (7)在步驟(6)的所得物中加入200mgTAP及催化劑，在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下于100°C下 攬拌反應(yīng)12小時(shí)；
[0017] (8)將步驟(7)的所得物用反應(yīng)溶劑浸泡洗涂至洗涂液為無(wú)色，再依次用蒸饋水、 無(wú)水乙醇洗涂后，干燥至恒重，得到用于酶固定化的改性磁性殼聚糖微球(MCTS-TAP)。
[0018] 本發(fā)明還提供一種用于酶固定化的改性磁性殼聚糖微球，由上述方法制備。
[0019] 本發(fā)明還提供一種纖維素酶固定化的方法，包括：
[0020] (1)將IOmg權(quán)利要求2所述的改性磁性殼聚糖微球用pH值為4.0~7.0的IOmL的憐 酸緩沖液溶脹24小時(shí)后分離；
[0021] (2)在步驟（1)的所得物中加入IOmL的5%戊二醒溶液，于25°C下振蕩活化5小時(shí)并 過濾，用蒸饋水洗去多余的戊二醒；
[0022] (3)在步驟(2)的所得物中加入1.5mg酶液，于25~30°C下恒溫振蕩固定2~6小時(shí) 后，過濾，濾渣用憐酸緩沖液進(jìn)行反復(fù)沖洗后得固定化酶。
[0023 ]較佳地，步驟(3)中固定時(shí)間為5小時(shí)。
[0024] 較佳地，步驟(1)中憐酸緩沖液的抑值為7.0。
[0025] 較佳地，步驟(3)中固定溫度為30r。
[0026] 本發(fā)明還提供一種由上述纖維素酶固定化方法得到的固定化酶。
[0027] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0028] (1)本發(fā)明提供的改性磁性殼聚糖微球安全無(wú)毒，具有良好的機(jī)械性能，耐熱性 好，分子中存在大量氨基，易改性，是極具利用價(jià)值的固定化酶的良好載體；
[0029] (2)本發(fā)明提供的酶固定化方法延續(xù)了傳統(tǒng)共價(jià)結(jié)合法固定化酶的優(yōu)點(diǎn)，且酶活 力回收率較高，具有較高的應(yīng)用價(jià)值；
[0030] (3)本發(fā)明制備出的固定化纖維素酶具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)利用性，由于改性 磁性殼聚糖微球載體呈微球狀態(tài)，使得產(chǎn)物與酶易于分離回收。
【附圖說明】
[00川圖1為化304的磁化曲線；
[0032] 圖2為磁性殼聚糖、2,4,6-改性磁性殼聚糖微球的磁化曲線；
[0033] 圖3為磁性殼聚糖微球(MCTS)、2,4,6-S氨基喀晚（TAP)和改性磁性殼聚糖微球 (MCTS-TAP)的熱重分析圖；
[0034] 圖4為吸光值與葡萄糖濃度的關(guān)系(標(biāo)準(zhǔn)曲線）；
[0035] 圖5為時(shí)間對(duì)纖維素酶固定化的影響；
[0036] 圖6為pH值對(duì)纖維素酶固定化的影響；
[0037] 圖7為給酶量對(duì)纖維素酶固定化的影響；
[0038] 圖8為溫度對(duì)纖維素酶固定化的影響；
[0039] 圖9為pH對(duì)游離酶和固定化酶相對(duì)活力的影響；
[0040] 圖10為溫度對(duì)游離酶和固定化酶相對(duì)活力的影響；
[0041] 圖11為50°C下游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性；
[0042] 圖12為70°C下游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性；
[0043] 圖13為固定化酶和游離酶的Lincwaver-Burk曲線；
[0044] 圖14為游離酶和固定化酶的膽藏穩(wěn)定性；
[0045] 圖15為固定化纖維素酶的重復(fù)使用性能。
【具體實(shí)施方式】
[0046] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0047] 實(shí)施例1
[004引（1)稱取0.5g殼聚糖粉末和0.125g納米四氧化S鐵于1 OOmLS頸瓶中，加入30mL質(zhì) 量分?jǐn)?shù)為4 %的乙酸溶液，室溫下攬拌，待殼聚糖充分溶解后，加入30mL液體石蠟，250r/min 轉(zhuǎn)速下攬拌10分鐘；
[0049] (2)將步驟(1)的所得物升溫至50°C，滴加2-3滴乳化劑SpanSO，乳化10分鐘；
[0050] (3)在步驟(2)的所得物中加入1.OmL的甲醒溶液，攬拌反應(yīng)1.5小時(shí)；
[00川 （4)將步驟(3)的所得物升溫至70°C，滴力日5-6滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的化0田容液，使溶 液的pH值保持為堿性，緩慢滴加2. OmL的環(huán)氧氯丙烷，反應(yīng)5小時(shí)；
[0052] (5)將步驟(4)的所得物過濾，用蒸饋水洗涂，再依次用石油酸、無(wú)水乙醇洗涂、水 洗涂，直至洗涂液的抑值達(dá)到中性，得到磁性殼聚糖微球(MCTS);
[0053] (6)將50mg步驟（5)的所得物加入50mL反應(yīng)溶劑N，N-二甲基甲酯胺(DMF)中浸泡 1化；
[0054] (7)在步驟(6)的所得物中加入改性試劑200mgTAP及催化劑金屬鋼化，在氮?dú)獗Ｗo(hù) 條件下于l〇〇°C下攬拌反應(yīng)12小時(shí)；
[0055] (8)將步驟(7)的所得物用反應(yīng)溶劑浸泡洗涂至洗涂液為無(wú)色，再依次用蒸饋水、 無(wú)水乙醇洗涂后，再置于50°C的真空干燥器中恒重后，得到用于酶固定化的改性磁性殼聚 糖微球(MCTS-TAP)。
[0056] 實(shí)驗(yàn) 1-1
[0化7] 將實(shí)施例1中，分別W邸A、DETA、MEL、TAP、TBM、ATZ為改性試劑，分析改性磁性殼聚 糖微球的反應(yīng)條件，如表1所示。
[0化引 表1 [0化9]
[0060]從上述修飾后的五種新型改性磁性殼聚糖微球中選取改性試劑含量較高的MCTS-TAP微球載體用于固定化酶處理。
[0061 ]實(shí)驗(yàn) 1-2
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