專利名稱：長的正五聚蛋白ptx3在制備預(yù)防和治療自身免疫性疾病的藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及長的正五聚蛋白(pentraxin)PTX3(PTX3)或其功能性衍生物在制備預(yù)防和治療自身免疫性疾病的藥物中的用途。
接觸炎性細胞因子白細胞介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)后，在多種細胞類型中表達PTX3(Bottazzi等人，J.，Biol.Chem.1997，27232817-32823)，尤其是單核吞噬細胞和內(nèi)皮細胞。
迄今尚未了解PTX3的生物學(xué)功能。
PTX3由兩個結(jié)構(gòu)域組成，N端結(jié)構(gòu)域與任何已知分子無關(guān)，C端結(jié)構(gòu)域類似于短的正五聚蛋白，例如C-反應(yīng)蛋白(CRP)(BreviarioF.等人，J.Biol.Chem.26722190，1992)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人PTX3(hPTX3)和動物PTX3之間的高度相似性。特別是小鼠PTX3(mPTX3)，其DNA序列以及基因組織和定位與hPTX3非常相似。人和小鼠PTX3基因的一致性程度為82％，如果考慮保守性置換則達到90％(Introna M.等人，Blood 87(1996)1862-1872)。小鼠PTX3基因位于小鼠染色體3上的類似于人3q(q24-28)的區(qū)域，與文獻記載的hPTX3在3q 25區(qū)的位置相一致(Introna M.等人，Blood87(1996)1862-1872)。
hPTX3和mPTX3序列的高度相似性表明正五聚蛋白在進化過程中高度保守(Pepys M.B.，Baltz M.L.Adv.Immunol.34141，1983)。
有關(guān)正五聚蛋白的綜述參見H.Gewurz等人，Current Opinionin Immunology，1995，754-64。
在接觸由細胞因子和脂多糖(LPS)提供的促炎信號的組織中產(chǎn)生長的正五聚蛋白PTX3。
這些促炎化合物促進炎癥過程涉及的細胞凋亡，并促進樹突細胞(DC)生理成熟。
細胞死亡通常在體內(nèi)炎癥過程中發(fā)生。
生物體從活組織中去除凋亡細胞。在過度、混亂的凋亡過程中，大量死細胞阻礙了生物體清除細胞群的能力。這些細胞聚集在組織中，經(jīng)由非常規(guī)吞噬細胞(例如不成熟的DC)的吞噬作用，增加了促進自身免疫過程的可能性(Cell Death Diff.1998；5563-568)。
自身免疫過程的發(fā)展和維持需要將不成熟DC呈遞的自身抗原(自我抗原)識別為對該生物體有害(外來或非我)的抗原。在不成熟DC去除凋亡細胞群的過程中發(fā)生這種識別錯誤。
胞內(nèi)的自身抗原在凋亡過程中修飾，以及因凋亡壓力所致激酶活化引起的蛋白質(zhì)酯化作用，產(chǎn)生新的構(gòu)象表位(1998 J.Exp.Med.187547-560)。
細胞死亡并且細胞核破裂，隨之自身抗原被特異性蛋白酶(天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，caspases)破壞1996 J.Exp.Med.184765-770；1996 J.Exp.Med.1831957-1964，并產(chǎn)生核小體，是原型系統(tǒng)性自身免疫性疾病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的主要抗原(1993 J.Exp.Med 1771367-1381；1999；1999 ArthritisRheum.42833-843。
一些自身抗原通常與細胞骨架的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜關(guān)聯(lián)；這些抗原在凋亡早期分離。
與凋亡晚期產(chǎn)生的凋亡細胞群分離的細胞核自身抗原從凋亡細胞中排除1994 J.Exp.Med.1791317-1330；1997 Exp.Cell Res.234512-520。
相反，加工內(nèi)在化死亡(凋亡)細胞產(chǎn)生T細胞表位1997 J.Immunol.1595391-5399。
缺乏引發(fā)免疫應(yīng)答能力的特異性或半特異性清除吞噬細胞，清除體內(nèi)大部分的死亡細胞1998 Cell Death Diff.5563-568。然而，最有效力的抗原遞呈細胞(APC)是DC 1997 Curr.Opin.Immunol.910-16；1998 Nature 392245-252，這些細胞使死亡細胞內(nèi)在化，并將其加工的表位呈遞給MHC I類和II類限制性T淋巴細胞1998 Nature 39286-89；1998 J.Immunol.1595391-5399；1998J.Exp.Med.1882163-2173；1999 Nat Med 51249-1255；1999Nat Med 51232-1233。
DC來源于骨髓CD34+祖細胞1992 Nature.360258-261。
DC前體進入血液，到達外周的器官，在那里發(fā)育為不成熟的DC。
不成熟的DC通過巨胞飲作用(macropinocytosis)捕獲可溶性抗原1994 J.Exp.Med.1791109-1118，通過吞噬作用捕獲微粒1993 J.Exp.Med.178479-488。
基本促炎信號，如IL-β和TNF-α，促進DC生理性成熟以及抗原呈遞功能1999 Curr.Opin.Immunol.11308-313。
因為細胞(定義為″自身″抗原儲庫)在發(fā)育和正常組織更新過程中連續(xù)死亡，DC呈遞死亡細胞抗原為嚴謹性調(diào)節(jié)的。
在缺少導(dǎo)致DC成熟的炎癥信號時發(fā)生經(jīng)由凋亡而致的正常細胞死亡。
因此死亡細胞和成熟DC共存，影響對外周抗原的耐受1999 Nat.Med.51232-1233。但是自身免疫通常與炎癥無關(guān)。
在生理情況下，只有少數(shù)凋亡細胞被不成熟的DC細胞吞噬。
環(huán)境因子(可能由炎癥信號自身補充)，必定會阻止不成熟DC吞噬死亡細胞。
只有在嚴重失調(diào)的炎癥過程中，細胞死亡增加，非常規(guī)吞噬細胞增強其吞噬活性，這種增強的吞噬作用增加了生物體將自身抗原識別為非自身抗原的可能性。
免疫活性細胞具有的識別自身抗原為對生物體有害或外來抗原的這種機制，是很多自身免疫性疾病發(fā)病的基礎(chǔ)，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、多發(fā)性硬化癥(MS)、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、甲狀腺炎、溶血性貧血、萎縮性睪丸炎、古德帕斯徹病(Goodpasture’s disease)、自身免疫性視網(wǎng)膜病、自身免疫性血小板減少癥、重癥肌無力、原發(fā)性膽汁性肝硬變(primary biliary cirrhosis)、侵襲性慢性肝炎、潰瘍性結(jié)腸炎、皮炎、慢性腎小球腎炎、斯耶格倫綜合癥(Sjogrensyndrome)、萊特爾綜合癥(Reiter syndrome)、肌炎(miositis)、系統(tǒng)性硬化癥以及多關(guān)節(jié)炎。
系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種炎癥性的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其特征在于從T細胞產(chǎn)生高親合力的自身免疫性抗體。
處于疾病活躍期的SLE病人顯示特別低的C反應(yīng)蛋白CRP的血漿水平。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)罹患SLE的病人先天性缺少補體因子C1q(1998Nature Genetics 1956-59；1998 Nature Genetics 193-4)、由PTX3識別的因子(1997 J.Biol.Chem.27232817-32823)。
此外，PTX3結(jié)合某些SLE非常特征性的自身抗原，例如組蛋白等(1990 J.Exp.Med.17213-18；1997 J.Biol.Chem.27232817-32823)。
PTX3先前的用途已經(jīng)清楚，例如以申請人姓名申請的WO99/32516，描述了長的正五聚蛋白PTX3在治療腫瘤性、炎癥性以及感染性疾病中的用途。
US 5767252描述了屬于正五聚蛋白家族的神經(jīng)元細胞生長因子(也參見引用的出版物)。該專利涉及神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域。
迄今為止，對已知的大部分自身免疫性疾病尚未有滿意的療法。仍然非常需要既能防止將自身抗原識別為外來抗原，又能減輕這些疾病的癥狀而不引起更多副作用的新藥。
這種抑制作用決定了阻斷自身免疫性疾病的發(fā)作，這是上述疾病的基礎(chǔ)。
如今意外發(fā)現(xiàn)，長的正五聚蛋白PTX3可用于防止和減輕自身免疫性疾病的癥狀。
實際上，長的正五聚蛋白PTX3能夠結(jié)合凋亡細胞(而不結(jié)合活細胞)，防止這些細胞在過度或失調(diào)的凋亡過程中被不成熟DC吞噬。
如上所述，在炎癥以及細胞死亡增多的過程中，大量死亡細胞阻斷了生物體去除這些細胞的能力，這些細胞在組織中聚集，可以被非常規(guī)吞噬細胞(例如不成熟DC細胞)吞噬，起始自身免疫過程的可能性增加。
凋亡細胞和PTX3的結(jié)合有助于巨噬細胞清除凋亡細胞，防止凋亡細胞被不成熟的DC細胞吞噬而促進自身免疫性疾病。
本發(fā)明可以治療的自身免疫性疾病選自系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、多發(fā)性硬化癥(MS)、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、甲狀腺炎、溶血性貧血、萎縮性睪丸炎、古德帕斯徹病、自身免疫性視網(wǎng)膜病、自身免疫性血小板減少癥、重癥肌無力、原發(fā)性膽汁性肝硬變、侵襲性慢性肝炎、潰瘍性結(jié)腸炎、皮炎、慢性腎小球腎炎、斯耶格倫綜合癥、萊特爾綜合癥、肌炎、系統(tǒng)性硬化癥以及多關(guān)節(jié)炎。
″長的正五聚蛋白PTX3″是指任何長的正五聚蛋白PTX3或其功能性類似物，分別來自其起源(人或動物)或合成物。
長的正五聚蛋白優(yōu)選人PTX3，其序列描述于WO99/32516。
下文報告一些闡述本發(fā)明的實施例。
實施例1PTX3結(jié)合人凋亡細胞以及調(diào)節(jié)其清除的能力細胞類型1.白血病細胞人白血病Jurkat T細胞購自ATCC(Rockville，MD)，在包含100U/ml青霉素、0.1mg/ml鏈霉素、2mM L-谷氨酰胺和10％FCS(Hyclone，Logan，UT)的RPMI(Gibco BRL，Grand Island，NY)(組織培養(yǎng)基Tissue Culture Medium，TCM)或1％Nutridoma-SP(Boehringer Mannhein，Germany)(TCM-nut)中生長。
2.樹突細胞來源于循環(huán)中的單核細胞的不成熟的人DC，在重組GM-CSF和IL-4[(1999)J.Leuk.Biol.，66345-349；(1997)J.Exp.Med.185317-328]存在下培養(yǎng)，這種處理可以產(chǎn)生不成熟DC細胞的同種群體。
凋亡誘導(dǎo)在TCM-nut中傳代增殖Jurkat細胞，以避免非典型的血清輔因子干擾，在TCM-nut中，于37℃利用抗CD95 moAb(CH-11，100ng/106細胞)或者U.V.源下照射20″，使其凋亡。如(ArthritisRheum.1998；41205-214)所述，利用流式細胞術(shù)以及形態(tài)特征確證凋亡，在兩種處理之后，大多數(shù)Jurkat T細胞(＞95％)凋亡。
在包含0.1mM MgC12和0.1mM CaC12的PBS(PBS++)中，利用FITC標記的Annexin V(Bender MedSystems，Prodotti Gianni，Milano，Italy)(0.5ml)室溫10分鐘染色后，通過流式細胞術(shù)和聚焦顯微鏡術(shù)(參見下文)確定暴露的磷脂酰絲氨酸(PS)。
利用流式細胞術(shù)檢測DNA含量。
一些實驗利用不同的藥物處理(5μM BAPTA-AM，10μg/ml放線菌酮，20μM星形孢菌素，100μM和50mM二硫代氨基甲酸吡咯烷PDTC，100nM地塞米松)，使細胞凋亡。
通過加熱細胞(95℃ 5分鐘)、凍融或高滲休克(hyperhosmoticshock)(在150mM NaP，pH7.5，1.4M NaCl緩沖液中10分鐘)使細胞壞死。
蛋白質(zhì)如J.Biol.Chem.1997；27232817-32823中所述，人PTX3純化自穩(wěn)定持續(xù)表達該蛋白質(zhì)的CHO細胞。如EMBO J.1992；11813-89所述，進行PTX3的生物素化；隨后如J.Biol.Chem.1997；27232817-32823所述，在天然狀態(tài)下，于5-10％梯度PAGE中分析生物素化的PTX3。
純化的人C反應(yīng)蛋白(CRP)、血清淀粉狀蛋白P組分(SAP)以及牛血清白蛋白(BSA)購自Sigma(St.Louis，MO)。
PTX3結(jié)合凋亡細胞用生物素化的PTX3(測試范圍0.1-500μg/ml)在室溫下攻擊細胞30分鐘。
加入FITC偶聯(lián)的鏈親和素(Pierce，Rockford，IL)以后，利用流式細胞術(shù)顯示細胞結(jié)合輔因子。在只存在FITC偶聯(lián)的鏈親和素的情況下，計算熒光本底。
提高生物素化PTX3的使用濃度，觀察到結(jié)合按線性增強，在大約100μg/ml達到平臺期。
在加入生物素化PTX3(10μg/ml)、FITC鏈親和素以及FACS分析之前，凋亡細胞與PTX3、SAP、CRP和BSA(500g/ml)預(yù)溫育，驗證結(jié)合的特異性。
同樣利用聚焦成像術(shù)表征PTX3與死亡細胞的結(jié)合在這種情況下，染色的細胞種在聚賴氨酸包被的蓋片上，室溫20分鐘，在4％(重量/體積)多聚甲醛中室溫固定15分鐘，并封固在Mowiol介質(zhì)中。
利用配備氬/氪激光、75mW多線的Leica TCS-NT(LeicaMicrosystems，Heidelberg，Germany)聚焦激光掃描顯微鏡，進行聚焦激光掃描顯微鏡術(shù)。
根據(jù)細胞核特征，例如染色質(zhì)邊緣化、凝聚和片斷化，容易識別經(jīng)CD95(FAS)觸發(fā)凋亡的Jurkat細胞。
吞噬作用通過U.V.照射使擴增對數(shù)期的Jurkat細胞凋亡，利用綠色熒光脂肪族染料PKH2-GL(Sigma)標記。
洗滌后，細胞與或不與PTX3(100μg/ml室溫30分鐘)溫育，然后37℃或4℃與DC共同溫育90分鐘。
既使用不成熟DC，也使用經(jīng)TNF-α(1997 J.Exp.Med.185317-328)處理后成熟的DC。作為對照，在存在或不存在PTX3的情況下，確定由不成熟以及成熟DC內(nèi)在化的FITC標記的卵清蛋白(Sigma)或綠色熒光膠乳珠(2μm直徑，Polysciences，Warrington，PA)。吞噬之后，DC在包含EDTA和胰蛋白酶的PBS中37℃溫育15分鐘，利用流式細胞術(shù)(FACS Scan，Becton and Dickinson，SanJose，CA)分析。
在獨立樣本中比較結(jié)合或內(nèi)在化凋亡細胞的細胞百分比。
實施例1/1如上所述，用生物素化PTX3和FITC-鏈親和素攻擊Jurkat細胞，然后利用流式細胞術(shù)確定其結(jié)合。
結(jié)果(代表4次獨立實驗)如下表1所示，表示為除在存在PTX3和FITC-鏈親和素以及只存在FITC-鏈親和素時的平均熒光強度而計算的相對熒光強度(RFI)。
表1
*＝Jurkat細胞；**＝相對熒光強度。
這些結(jié)果表明，PTX3具有結(jié)合晚期凋亡細胞的能力，PTX3的識別不依賴于觸發(fā)凋亡所用的啟始刺激。此外，PTX3不能結(jié)合向凋亡后期演化的細胞。
表1所示結(jié)果表明，只有凋亡細胞能夠結(jié)合生物素化PTX3，這證明了PTX3結(jié)合的特異性。
實施例1/2上述由PTX3結(jié)合的凋亡細胞逃脫了不成熟DC的內(nèi)在化。
本實驗使用不成熟DC或者經(jīng)TNF-α處理后成熟的DC。
作為對照，在存在或不存在PTX3的情況下，確定由不成熟以及成熟DC內(nèi)在化FITC標記的卵清蛋白或綠色熒光膠乳珠。
表2
表2所示結(jié)果(3次獨立實驗的平均)表明，PTX3不影響不成熟DC對惰性底物的吞噬作用。
權(quán)利要求
1.長的正五聚蛋白PTX3(PTX3)或其衍生物的用途，用于制備預(yù)防和治療自身免疫性疾病的藥物。
2.權(quán)利要求1的用途，其中自身免疫性疾病選自系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、多發(fā)性硬化癥(MS)、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、甲狀腺炎、溶血性貧血、萎縮性睪丸炎、古德帕斯徹病、自身免疫性視網(wǎng)膜病、自身免疫性血小板減少癥、重癥肌無力、原發(fā)性膽汁性肝硬變、侵襲性慢性肝炎、潰瘍性結(jié)腸炎、皮炎、慢性腎小球腎炎、斯耶格倫綜合癥、萊特爾綜合癥、肌炎、系統(tǒng)性硬化癥或多關(guān)節(jié)炎。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中長的正五聚蛋白PTX3是天然存在的PTX3。
4.權(quán)利要求3的用途，其中長的正五聚蛋白PTX3是人的正五聚蛋白。
5.權(quán)利要求1-4的用途，其中長的正五聚蛋白PTX3是合成獲得的PTX3。
6.自身免疫性疾病的治療方法，包含給予罹患自身免疫性疾病的病人治療量的長的正五聚蛋白PTX3、或其衍生物。
7.權(quán)利要求6的方法，其中自身免疫性疾病選自系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、多發(fā)性硬化癥(MS)、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、甲狀腺炎、溶血性貧血、萎縮性睪丸炎、古德帕斯徹病、自身免疫性視網(wǎng)膜病、自身免疫性血小板減少癥、重癥肌無力、原發(fā)性膽汁性肝硬變、侵襲性慢性肝炎、潰瘍性結(jié)腸炎、皮炎、慢性腎小球腎炎、斯耶格倫綜合癥、萊特爾綜合癥、肌炎、系統(tǒng)性硬化癥或多關(guān)節(jié)炎。
8.權(quán)利要求6或7的方法，其中長的正五聚蛋白PTX3是天然存在的PTX3。
9.權(quán)利要求8的方法，其中長的正五聚蛋白PTX8是人的正五聚蛋白。
10.權(quán)利要求6-9的方法，其中長的正五聚蛋白PTX3是合成獲得的PTX3。
全文摘要
本發(fā)明公開了長的正五聚蛋白PTX3(PTX3)或其功能性衍生物在制備預(yù)防和治療自身免疫性疾病的藥物中的用途。
文檔編號A61P25/00GK1561226SQ01818298
公開日2005年1月5日 申請日期2001年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月3日
發(fā)明者A·曼托沃尼, B·博塔茲, G·佩利, A·曼弗雷迪 申請人:希格馬托制藥工業(yè)公司