專利名稱：具有動態(tài)膨脹現象的肺表面活性組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分散于含電解質的介質中時能夠形成動態(tài)膨脹相的肺表面活性物組合物。這種動態(tài)膨脹過程通過偏振顯微鏡可以觀察到并且導致在氣/液界面形成雙折射的網狀物或細管。這樣動態(tài)膨脹過程造成該肺表面活性物分布在比非動態(tài)膨脹相中分布肺表面活性物的更大的表面積上。這種分布是在肺表面活性物分散于例如生理電解溶液后特殊階段的時間內發(fā)生的。因此，在肺部給藥后肺表面活性物進入肺泡能夠獲得更加有效的分布，它從而使得使用這種組合物作為難于進入的肺部或其它器官或身體區(qū)域的治療性、預防性和/或診斷性活性物質的載體成為可能。
本發(fā)明還涉及含有肺表面活性組合物的藥物組合物和藥物試劑盒以及治療、預防和/或診斷呼吸窘迫綜合癥(IRDS或ARDS)或其它與肺表面活性物缺乏有關的其它肺病的方法。
背景技術：
肺表面活性物(LS)是由脂類和蛋白組成的絡合物和較高表面活性的物質，它可以在肺部肺泡表面的液體層中發(fā)現。它們的主要特性是減小肺的表面張力，這是通過在肺泡氣-液界面作為器官結構的脂類的存在來實現。LS能夠在低肺容量時預防肺泡萎陷并且在正常和強迫呼吸(生物物理功能)過程中減少呼吸負擔。此外，它還涉及保護肺不受由吸入顆粒和微生物引起的損害和感染(免疫學、非生理物理功能)。LS可以合成和由肺泡II型細胞分泌。(作為回顧，請參見Robertson和Taeusch，1995)肺表面活性物的組分可以隨著各種因素如種類、年齡和受體總體健康狀況的不同而變化。各種天然和合成組分能夠在表面活性物中相互替代。所以，肺表面活性物是什么和用于治療的肺表面活性物中應當包括什么的非完全嚴密的定義是取決于條件的。從健康哺乳動物的肺灌洗液中分離到的表面活性物包括大約10％蛋白(它們一半對表面活性物是特異的)和大約90％脂質，其中大約80％是磷脂類和大約20％是中性脂質，包括大約10％未酯化的膽固醇。該磷脂部分大多數包含(大約76％)卵磷脂(PC)，大約三分之二是二棕櫚?；蚜字?DPPC)，并且剩余的是不飽和的。大約11％的磷脂類是由磷脂酰甘油(PG)、大約4％磷脂酰肌醇、大約3％的磷脂酰乙醇胺、大約2％磷脂酰絲氨酸、大約1.5％的鞘磷脂和大約0.2％溶血磷脂膽堿構成。按照目前估計，表面活性蛋白A(SP-A)表示4％的表面活性物和SP-B和SP-C和SP-D各占小于1％。
SP-A和SP-D屬于C-型植物凝血素總科的集合(collectin)亞族。SP-A能夠結合二棕櫚酰卵磷酯而SP-D能夠結合磷脂酰肌醇。SP-A也能夠與肺泡II型細胞反應，在表面活性物質磷脂體內平衡中涉及SP-A。從所分泌的板層體物質中形成細管狀髓磷脂中需要SP-A。
表面活性物的缺乏存在于最普通和嚴重的早產兒的肺病中。表面活性物的缺乏是引起新生兒呼吸窘迫綜合癥(ARDS)和成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)的主要因素。從二十世紀六十年代開始，已經研究了將肺表面活性物外部給藥來治療這些綜合癥。
在患有呼吸窘迫綜合癥(IRDS)和透明膜疾病的早產兒中人們首先認識到了表面活性物的病理生理的作用。在臨床和射線照相術的過程中使用外源性肺表面活性物和皮質類固醇給藥已經在提高存活和降低這些隨后改變的疾病的發(fā)病率方面起到主要作用。
在二十世紀六十年代中用肺表面活性物替代物提高RDS治療的最初目的的失敗(Chu等，1967)，主要是因為缺少有關肺表面活性物的組分和分布的知識。Liggins和同事(Liggins等，1972)首次使用皮質類固醇類改善胎兒肺成熟，由此減少了出生后RDS的風險和并發(fā)癥。將皮質類固醇類與甲狀腺釋放激素組合會提高產前的對RDS的預防，并且在RDS早期還對嬰兒給予肌醇作為肺表面活性物產生的底物。
為了在RDS中設計和使用肺表面活性替代物，已經嘗試過許多方法。最直接的方法是用人肺表面活性物替代。人肺表面活性物只能通過灌洗方法獲得，盡管這種步驟會破壞預先存在的生理和生物化學微小組織。正如Hallman及其同事在試驗中(Hallman等，1983)所看到的，這種制劑在臨床試驗中是成功的，但是因為獲得大量的人肺表面活性物十分困難，所以無法商業(yè)生產。
這些局限使得需要合成肺表面活性物的生產。所以，第二種方法是了解肺表面活性物的各種組分的功能，然后比分離天然產物更容易獲得或更便宜地構建肺表面活性物。
Exosurf是商業(yè)上可以獲得的含DPPC、十六烷醇和四丁酚醛的制劑。十六烷醇和四丁酚醛在某種程度上模仿了天然肺表面活性物中表面活性蛋白、PG和其它脂質的功能。好幾組已經將表面活性蛋白加入脂質中，使蛋白質設計成模仿天然表面活性蛋白的結構和功能。
而且，新方法是重新使用肽合成或重組DNA技術(Yao等，1990)將表面活性蛋白加入包括配制蛋白的脂質混合物中。
理想的治療肺表面活性物應當具有許多任何理想治療的屬性。它應當是穩(wěn)定的、容易獲得的、容易制備的、便宜的和具有容易的給藥途徑、在該疾病過程中有一致的半衰期，并且完全明白作用、新陳代謝和分解代謝機理。它應該對該疾病有最大功效，沒有毒性、不耐性、免疫性或副作用。它具有類似于天然肺表面活性物的作用，改善肺的氣體交換、改善肺的機理、改善有效余氣量、抵抗失活、具有理想的分布特性并且具有已知的廓清機理。它的使用應當完全逆轉最初的疾病過程并修復或使身體修理最初疾病的繼發(fā)性損害。
可獲得的治療性肺表面活性物有兩種類型從哺乳動物肺中制備的那些和從合成化合物中制得的那些。牛和豬的表面活性物包括SP-B和SP-C，與磷脂有關，但SP-A和SP-D只存在于完全天然的表面活性物中。目前商業(yè)上可得到的合成肺表面活性物的例子是Exosurf和ALEC。
商業(yè)上可獲得的肺表面活性物大多數是以容易混合的液體形式存在的，但Exosurf和Alveofact是以冷凍干燥粉提供的，在使用前必需用鹽水重新配制。
目前表面活性物療法是患有IRDS新生兒常規(guī)臨床治療的固定的部分。一般初始劑量需要大約100mg/kg來補償這些嬰兒肺泡表面活性物(肺表面活性物)的缺乏，并且在許多時候需要反復治療。最近的試驗和臨床數據表明大劑量的外源性肺表面活性物也對特征為由例如吸入鴉片、感染或血漿蛋白滲漏到氣道而致肺泡透過性障礙而引起的肺表面活性物的失活的狀況有益。
對肺表面活性物治療的急性反應取決于外源性物質的質量(改良的天然肺表面活性物通常比不含蛋白的合成表面活性物更有效)、與臨床進程相關的治療時間的選擇(疾病的早期治療比后期療法更好并且可以減少隨后機械通氣的需求)和運送方式(氣管快速灌注會導致更均勻的分布并且比緩慢的氣道灌注更有效)。用氣霧化表面活性物治療能夠改善表面活性物缺乏的動物模型的肺功能，但通常在運送系統中引起大量的霧化物質損失。而且，對未完全發(fā)育的新生兒的實驗數據表明該治療反應會取決于出生時的復蘇方式，并且用一些較大呼吸的人工換氣會抵銷隨后表面活性物療法的作用。肺表面活性物的臨床廣泛使用已經降低了新生兒的死亡率并減少了發(fā)達國家中加強護理的費用。
目前最有效的肺表面活性物是從哺乳動物肺制得的。得率非常低并且因此這種療法非常昂貴。所以對改善它們有效性和使其應用標準化有急迫的需求。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了含有肺表面活性物的肺表面活性組合物，當室溫下以粉末或顆粒形式以10％w/w濃度分散于0.9％w/w氯化鈉時，它在大約0.5到大約120分鐘如大約3到大約60分鐘時間內能夠在膨脹過程中在氣-液-固體界面形成偏振顯微鏡所觀察到的雙折射的網狀物或細管。
雙折射網狀物或細管是在從肺表面活性物分散于含電解質介質起到達到膨脹穩(wěn)定狀態(tài)(就是平衡)的時間內發(fā)生動態(tài)膨脹過程中所形成的。
這樣，另一方面，本發(fā)明涉及肺表面活性組合物，當以粉末或顆粒分散于離子強度至少大約5mM如至少大約10mM、至少大約15mM、至少大約20mM、至少大約25mM、至少大約50mM、至少大約75mM、至少大約100mM、或至少大約125mM或相應于生理條件的離子強度的電解溶液時，這樣得到的分散液的水濃度至少大約55％w/w例如至少大約60％w/w、至少大約65％w/w、至少大約70％w/w、至少大約75％w/w、至少大約80％w/w、至少大約85％w/w、至少大約90％w/w、至少大約95％w/w或至少大約98％w/w，它可以產生動態(tài)膨脹過程，在該過程中形成正如通過偏振顯微鏡所觀察到的雙折射的網狀物或細管，并且在達到穩(wěn)定態(tài)時該動態(tài)膨脹過程就結束。
當分散于電解溶液時，會形成磷脂類的液晶層狀相。已經發(fā)現脂質-蛋白雙層結構可趨于主動建立一平衡組合物，用顯微鏡可以覺察到雙折射絡合網狀物的形成。本發(fā)明提供了例如在預定時間點或完全規(guī)定好的時期給藥的LS組合物以及測定對肺表面活性組合物理想的時間點或時期的方法。
當將在含電解質的介質中具有動態(tài)膨脹現象的肺表面活性物用于肺或其它呼吸系統部分時，能夠實現更為有效地將肺表面活性物分布于肺泡。以這種方式能夠實現對療效、預防或診斷的改善。
而且，本發(fā)明肺表面活性組合物可以用作治療性、預防性和/或診斷性活性物質的載體，例如肺藥運送的載體。
本發(fā)明還提供了改善呼吸窘迫綜合癥(RDS)或其它與表面活性物缺乏有關的呼吸或肺病治療的藥物組合物、藥物試劑盒和方法。
在另外一個方面，本發(fā)明提供了測試各批當將其分散于電解溶液中時它有動態(tài)膨脹現象的肺表面活性組合物的體外檢驗法，該方法包括a)測定本文所述的最大動態(tài)膨脹t1/2，b)用如本文所述的體內-體外校正曲線比較這樣獲得的t1/2，并且c)評價這批是否可以接受或不能接受。
本發(fā)明也涉及了體外評價分散于電解溶液中有動態(tài)膨脹現象的肺表面活性組合物的治療、預防和/或診斷作用的方法，該方法包括測定穩(wěn)定狀態(tài)膨脹的半衰期并用體內-體外校正曲線比較這樣得到的半衰期從而預測治療、預防和/或診斷的作用。


圖1顯示了混合5分鐘后在偏振顯微鏡下所看到的10％w/wPLS和90％w/w Ringer溶液的樣本。
圖2顯示了混合15分鐘后圖1所示樣本。“生長”的細管形成了象樹狀結構的支氣管。
圖3顯示了混合30分鐘后圖1和2所示的相同樣本。上面照片是在正常光線下拍攝的而下面照片是在偏振光下拍攝的。
圖4顯示了本文實施例2所述的動物試驗結果。
詳細描述本發(fā)明是基于這樣的意外發(fā)現，即在肺表面活性物分散于介質的早期過程中含介質如Ringer溶液或氯化鈉溶液而不是純水的電解液能夠誘導明顯動態(tài)膨脹現象。在這一膨脹期，構成了趨于主動形成平衡構造的脂質-蛋白雙層結構。這種過程包括在界面的分布并且能夠在偏振顯微鏡下追蹤觀察到的雙折射網狀物的形成，就象圖1-3中所詳細描述的(本文下面進一步詳細描述)。雙折射是由于在樣本的不同方向出現不同折射指數的緣故，并且它表明在樣本內出現了晶體或液晶序列。類似肺表面活性物中那些極性脂質在水溶液中可以形成液晶相是公知的。所以這是通過它們的雙折射可觀察到的這些相的光學特性。
肺表面活性組合物所以，本發(fā)明涉及含肺表面活性物的肺表面活性組合物，當在室溫和/或在體溫以粉末或顆粒形式以10％濃度分散于0.9％w/w的氯化鈉時，它能夠在膨脹過程中在大約0.5到大約120分鐘，如大約3到大約60分鐘的時間內在氣-液-固體界面形成如偏振顯微鏡下所觀察到的雙折射網狀物或細管。相對于本發(fā)明的肺表面活性組合物，已知的和市售的肺表面活性組合物在電解溶液中分散時不具有這種動態(tài)膨脹現象(參見本文的實施例4)。
其中出現動態(tài)膨脹的含電解質的介質，一般是含有一個或多個溶劑或稀釋劑的含水介質。溶劑的最好例子是水，當對肺給予肺表面活性組合物時，優(yōu)選是水，但有存在少量其它溶劑如乙醇、異丙醇或聚乙二醇的情況。
觀察到的動態(tài)變化與離子如分別是陽離子和/或陰離子的存在有關。含電解質的介質如電解質溶液可以含有至少一種下列陽離子Na+、K+、Li+、Ca2+、Mg2+和/或NH4+和/或至少一種下列陰離子氯離子、醋酸根離子、碳酸根離子、碳酸氫根離子、磷酸二氫根離子(H2PO4-)、磷酸氫根離子(HPO42-)、磷酸根離子(PO43-)、酒石酸根、檸檬酸根離子、硼酸根離子、延胡索酸根離子等。電解質介質一般具有生理可接受的組分，即它不能損害或傷害身體，尤其是在給藥部位。換句話說，該介質一般具有相應于生理可接受的條件的鹽濃度和pH。就pH而言，它是指pH在大約5到大約8的范圍并且鹽濃度相應于0.9％氯化鈉溶液或Ringer或Ringer-醋酸鹽溶液。電解溶液也可以是0.9％w/w氯化鈉溶液、Ringer溶液或Ringer-醋酸鹽溶液。
含電解質的適當介質也可以含有一種或多種無機或有機鹽，當分散于含水介質如水時它賦予該組合物離子強度。本發(fā)明肺表面活性組合物中所用的適當無機鹽可以選自于由堿金屬鹽如氯化鈉、氯化鉀、氯化鋰和堿土金屬鹽如氯化鈣、氯化鎂等構成的組。
按照本發(fā)明使用的適當有機鹽的例子可以選自于由醋酸鹽類如醋酸鈉。醋酸鉀、醋酸鋰、檸檬酸類、酒石酸鹽類、延胡索酸鹽類、硼酸鹽類、磷酸鹽類、銨鹽類如氯化銨等構成的組。
為了獲得肺表面活性組合物的動態(tài)膨脹現象，用作肺表面活性組合物分散介質使用的適當介質的離子強度也是重要的?？紤]到離子強度應當至少大約5mM，如至少大約10mM、至少大約15mM、至少大約20mM、至少大約25mM、至少大約50mM、至少大約75mM、至少大約100mM或至少大約125mM。從下列方程式計算離子強度I＝0.5∑cizi2其中cI是介質中各個離子的摩爾濃度并且zI是各個離子的荷載量。這樣，0.9％w/w氯化鈉溶液相應于大約0.0156M(15.6mM)的離子強度并且Ringer-醋酸鹽溶液的離子強度為大約0.138M(138mM)。
本發(fā)明的肺表面活性組合物也含有上述提到的離子種類或鹽類。特別是在這些情況下，肺表面活性組合物是粉末或顆粒形式時，它可能適當地加入離子種類或鹽類的具體量從而肺表面活性組合物只應當分散于水中從而達到動態(tài)膨脹現象。
在動物試驗中已經驗證本發(fā)明表面活性組合物的動態(tài)膨脹現象的生理相關的作用，顯示了顯著臨床作用(參見本文的實施例2)。
為了測定肺表面活性物是否具有動態(tài)膨脹能力和/或為了測定動態(tài)膨脹相達到最大時的時間點和/或為了測定本發(fā)明肺表面活性組合物的最佳給藥時間點，制備含有分散于生理電解液的LS的樣本并且在偏振顯微鏡下固定檢測該混合物的樣本。一般，肺表面活性物的濃度應當從大約0.5到大約45％w/w并且水的濃度應當超過大約55％w/w。通常水含量應當大約80％w/w，如大約90％w/w。首先，獲得均勻的外觀并混合具有類似水粘性的樣本。在這個階段偏振顯微鏡中樣本的圖像類似于圖1。在液相與水的外界面上可以看到累積了被電解溶液包圍的雙折射較弱的小顆粒。然后在液相和氣相的接觸面顯著增加后，會觀察到這種雙折射的增加。細管的形成從液體前生長并逐漸分支形成樹狀結構，連續(xù)形成雙折射，相當于圖2和3所示的那些。在將肺表面活性組合物加到電解生理溶液后大約60分鐘(在0.5-120分鐘如3-60分鐘)，給予的樣本將不具有上述動態(tài)膨脹現象。
本文所用的術語“雙折射”是指光通過晶體分成兩條折射不等的平面-偏振射線(垂直偏振的射線)。
這種作用出現在晶體或液晶中，其中光的速度在各個方向不同；也就是說，折射指數是不均衡的。
術語“網狀物或細管”是指液相與空氣的接觸面積顯著增加，造成有分枝的細管，用偏振顯微鏡觀察時這些細管逐漸成為雙折射的。該液面可以形成樹狀結構并且表面區(qū)會發(fā)展成雙折射復合網狀物(參見圖3)。
據估計最大動態(tài)膨脹的時間會隨著肺表面活性組合物的組分濃度和性質(例如哺乳動物提取物或半合成或全合成肺表面活性組合物；甚至相同肺表面活性組合物的每批之間也有差異)、制備方法和所用分散介質的組成(離子強度、離子種類性質、離子種類的濃度、pH等)的不同而變化，所以必需通過標準步驟來測定動態(tài)膨脹過程和最大動態(tài)膨脹的時間點或時期。而且，肺表面活性組合物的粒徑也很重要。所以，據估計粒徑的減小將會帶來更快的動態(tài)膨脹，即達到穩(wěn)定狀態(tài)的時間以及達到最大動態(tài)膨脹的時間將會減小。當需要具體的和規(guī)定好的時期以獲得最大動態(tài)膨脹時，可以使用這種特性。
本發(fā)明中所用的肺表面活性物最好來源于豬肺，即豬肺表面活性物(PLS)，但作為本領域普通技術人員會很容易理解，它們還能夠從其它哺乳動物源衍生或者甚至合成產生。在本發(fā)明的一個實施方案中，PLS是從剛宰殺的豬中制得的。將豬肺切碎并用鹽水溶液沖洗，然后過濾蛋白質和脂類混合物并離心分離。接著，將上清液離心分離并如所描述提取粗表面活性物小團(Bligh等，1959)。蒸發(fā)有機溶劑相并用丙酮除去中性脂類。最后為了得到冷凍干燥粉將制備物冷凍干燥。
在本發(fā)明的又一個實施方案中，肺表面活性組合物是從豬肺(Leo藥用產品，Ballerup，丹麥)獲得的，但該表面活性物也能夠從肺泡細胞培養(yǎng)中獲得，或者，另外一種方法，例如使用重組技術化學或合成獲得。
通過本領域普通技術人員公知的方法培養(yǎng)肺細胞并收獲所分泌的脂類和/或蛋白質可獲得肺表面活性物脂類和/或蛋白質。使用可獲得的例如來源于人肺的腺癌的ATCC細胞系A549(ATCC，10801Boulevard大學，Manassas，VA20110-2209，美國)進行肺表面活性物的細胞培養(yǎng)是可行的。所以，本發(fā)明的一個實施方案涉及來源于細胞系的肺表面活性物的用途。
上述提取物含有親水蛋白和磷脂。它還可以含有膽固醇、游離脂肪酸和脂肪酸甘油酯。在本發(fā)明的一個實施方案中，肺表面活性組合物可含有表面活性蛋白和選自于磷脂、DPPC、PG、脂肪酸、SP-B和SP-C組中的脂類。在本發(fā)明的又一個實施方案中，肺表面活性組合物還含有合成磷脂和至少一種親水性蛋白SP-B或SP-C。所述的蛋白也可以重組蛋白形式獲得。
本發(fā)明所用的LS提取物中存在的SP-B和SP-C都是生理pH值下的基礎蛋白，象那些神經髓磷脂。脂類是可與陽離子蛋白形成靜電的絡合物的陰離子和兩性離子(PC)。
如上所述，本發(fā)明的肺表面活性組合物含有磷脂類如飽和的和不飽和的磷脂類或其混合物。磷脂的濃度是干粉形式組合物的大約80到大約99.5％w/w，例如大約85到大約98％w/w或大約90到大約98％w/w。磷脂類可以含有二棕櫚酰卵磷酯(DPPC)。本發(fā)明肺表面活性組合物還含有表面活性蛋白如SP-A、SP-B、SP-C和/或SP-D，優(yōu)選SP-B和/或SP-C。表面活性蛋白的總濃度是干粉形式組合物的大約0.5到大約10％w/w，例如大約0.5到大約7.5％w/w或大約0.5到大約5％w/w、大約0.5％w/w到大約2.5％w/w或大約0.5％w/w到大約2％w/w。
在將本發(fā)明肺表面活性組合物給藥前，可以將其分散于電解水溶液中。這可以通過向玻璃試管中的預定量的肺表面活性組合物中加入電解介質例如Ringer溶液來完成。在大約0.5分鐘內用注射器反復將該分散液吸取并排出，從而促使混合和相互作用直到平衡。在本發(fā)明的具體實施方案中，使用Pharmacia & Upjohn(瑞典)的Ringer-醋酸鹽，它含有130mmol的Na+、4mmol的K+、2mmol的Ca2+、1mmol的Mg2+、30mmol的Ac-和100mmol的Cl-。在另外的實施方案中，該生理電解溶液還含有SP-A。
本發(fā)明肺表面活性組合物的動態(tài)膨脹過程的顯微鏡觀察顯示顯著形成如圖2和3所示的表面網狀組織需要存在離子和出現氣/固體/液體界面。該過程反應了肺表面活性物的動態(tài)活性狀態(tài)。不受任何理論的限制，可以估計到本發(fā)明所用的LS提取物或制劑用有機溶劑提取和蒸發(fā)是指將極性區(qū)倒轉在里并用烴區(qū)隱藏。因此，假設PG/SP-B和PG/SP-C離子絡合物劇烈地改變了它們的構型從而在暴露于水時形成雙層。該過程需要一些時間。當存在例如鹽水或Ringer溶液的離子時，它們會對這些絡合物離解起作用。這些機理也解釋了為什么在蒸餾水中膨脹的肺表面活性物樣本中沒有觀察到網狀物。
在雙層中的任何改動都希望是用來誘導增加了的動態(tài)。這可能是LS粉末或顆粒分散于Ringer溶液后精致的雙折射網狀物形成的原因。在暴露的界面似乎有減少表面自由能的驅動力，并且改變過程應當利于向固體表面、液體和氣體間低能量界面的形成。在本發(fā)明的實施方案中，它適合使用生理電解溶液時，電解溶液選自于由鹽水(生理氯化鈉)溶液、Ringer和/或Ringer-醋酸鹽溶液。
上述意外的生理作用為具有動態(tài)膨脹現象的肺表面活性組合物的臨床使用提供了新的改進方法。按照本發(fā)明，肺表面活性組合物應當與含有生理電解質溶液以控制時間的方式一起給予肺中。另外一方面，肺表面活性組合物能夠以粉末或顆粒形式用例如粉末吸入器給藥，在使用后原地出現動態(tài)膨脹過程。如果必要的話，可以通過將氣霧化的(neubulised)液體形式的適當介質隨后給藥來補充給藥，從而使肺表面活性組合物的動態(tài)膨脹現象限制于局部。在治療或預防哮喘、支氣管炎或相關呼吸疾病時，使用粉末吸入器是非常有用的。
所以，在另外一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的肺表面活性組合物在制備治療或預防新生兒呼吸窘迫綜合癥(IRDS)、成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)、先天性橫隔膜疝、急性肺損傷、用體外的隔膜氧合作用治療過的患者和/或胎糞吸入性肺炎或治療或預防慢性阻塞性肺病、哮喘、急性支氣管炎、慢性支氣管炎、支氣管肺發(fā)育不良、肺部感染、頑固性肺高壓、肺發(fā)育不全、癌癥、胞囊纖維化、肺泡蛋白沉積癥和/或先天性SP-B缺乏癥的藥物的用途。
可以將粉末或顆粒形式的肺表面活性物分散于適當分散介質中以制備適當的藥劑，在足以確保動態(tài)膨脹并形成網狀物或細管的時間內進行分散。足夠的時間是從大約如1到大約100分鐘、從大約2到大約90分鐘、從大約2到大約80分鐘、從大約2到大約70分鐘、從大約3到大約60分鐘、從大約3到大約50分鐘、從大約3到大約45分鐘、從大約5到大約40分鐘、從大約5到大約35分鐘、從大約10到大約35分鐘、從大約15到大約35分鐘或從大約20到大約35分鐘。
藥物組合物和藥物試劑盒本發(fā)明還涉及含本發(fā)明肺表面活性組合物的藥物組合物。藥物組合物可以是固體(如粉末、顆粒、細粒、小藥囊、片劑、膠囊等)、半固體(凝膠、糊劑等)或液體(溶液、分散液、懸浮液、乳化液、混合物等)形式并適合于通過呼吸器官給藥。所以，藥物組合物可以是使用前適合于分散在含水介質中的粉末或顆粒形式。
液體形式的藥用組合物可以是含有肺表面活性組合物和電解溶液的分散液形式如適合于生理條件的組合物，例如生理可接受的溶液。
本發(fā)明的藥用組合物還可含有其它治療性、預防性和/或診斷性活性物質。
另一方面，本發(fā)明涉及含有第一個和第二個容器的藥物試劑盒，第一個容器含有本發(fā)明的肺表面活性組合物而第二個容器含有用于肺表面活性組合物的分散介質，附有使用前將肺表面活性組合物分散于該分散介質中的說明書。
試劑盒中所含的肺表面活性組合物可以是粉末或顆粒形式。
本發(fā)明的藥物試劑盒可以包括推薦肺表面活性組合物分散于分散介質后給藥的時間的說明書。
本發(fā)明藥用試劑盒中的分散介質可以是電解溶液，例如生理上可接受的電解溶液，如0.9％w/w氯化鈉溶液、Ringer溶液或Ringer-醋酸鹽溶液。
而且，本發(fā)明藥用試劑盒也可含有其它治療性、預防性和/或診斷性活性物質。
在一個具體實施方案中，本發(fā)明涉及含有第一個和第二個容器的藥物試劑盒，第一個容器以含有本發(fā)明的藥物組合物的吸入器等形式，而第二個容器是含有適當介質的霧化劑等形式，當給藥時給予第一個容器的藥物組合物后它確保原位形成適合動態(tài)膨脹過程的微環(huán)境。
為了臨床使用給藥容易，本發(fā)明也涉及時間控制肺表面活性組合物給藥的三組件試劑盒，其中在給藥的組合物中形成生理電解溶液，它包括a)含肺表面活性組合物的第一組件，b)含鹽并任選分散介質的第二組件，以及c)含包括有關肺表面活性組合物含水膨脹的時間和怎樣使用該試劑盒的信息的說明書。
如上所述，該肺表面活性組合物可以含有各種磷脂類和蛋白SP-B和/或SP-C混合物。在本發(fā)明具體實施方案中，在使用肺表面活性組合物前，將其分散于Ringer溶液。
肺表面活性組合物在藥用組合物中或在從試劑盒配制的準備使用的藥用組合物中的濃度一般在0.5-300mg/ml的LS的范圍內，如至少1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、至少100mg/ml、至少125mg/ml、至少150mg/ml、至少175mg/ml或至少200mg/ml。
本領域普通技術人員可以采用公知方法制備該藥用組合物。
本發(fā)明肺表面活性組合物的治療、預防和/或診斷用途本發(fā)明還涉及肺表面活性組合物(它含有來自肺提取物的脂質和蛋白混合物或半合成或甚至全合成的肺表面活性物，該混合物可以分散于電解溶液如生理溶液)在制備在向電解溶液中加入含脂質和蛋白的該混合物后預定時間點或預定時間段內給藥的組合物的用途。
這樣，本發(fā)明涉及肺表面活性組合物在制備在將該組合物加入所述電解溶液后的適當預定時間點或預定時間段內給藥的組合物的用途，其中肺表面活性物源自哺乳動物提取物或來自半合成或全合成方法，該組合物可分散于電解溶液中，其中給藥的時間點或時間段已經用顯微鏡檢查法按照分散液膨脹現象達到穩(wěn)定狀態(tài)的最早時間點的一半時間來決定的。在這個時間給予肺泡，最大用途是由在水中由離子反應所誘導的表面活性分子重新構造的動態(tài)分布構成的。
本發(fā)明還涉及測定和標準化肺表面活性物在電解介質中發(fā)生動態(tài)膨脹時期的方法，該方法包括將肺表面活性組合物加入電解介質中并在偏振顯微鏡中觀察如上和實施例1中所述的動態(tài)膨脹動力學。
本發(fā)明肺表面活性組合物可以在任何時間點對需要的患者給藥。這樣，該肺表面活性組合物可以是在電解介質(如生理電解溶液)中的分散液形式并且它可以在進行分散后任何適當時間給藥。如本文實施例2中所示，為了達到改進功效(即該功效更大或另一方面，達到相同治療作用但劑量減小)使用本發(fā)明肺表面活性組合物的動態(tài)膨脹現象是有利的。
在適合于最大動態(tài)膨脹時給予肺表面活性組合物的情況中，認為在生理電解溶液中混合粉末或顆粒(例如冷凍干燥形式或干燥形式)的肺表面活性物和將該組合物給予肺部達到理想作用之間的時間是在大約0.5-120分鐘，例如從大約1到大約100分鐘、從大約2到大約90分鐘、從大約2到大約80分鐘、從大約2到大約70分鐘、從大約3到大約60分鐘、從大約3到大約50分鐘、從大約3到大約45分鐘、從大約5到大約40分鐘、從大約5到大約35分鐘、從大約10到大約35分鐘、從大約15到大約35分鐘或從大約20到大約35分鐘。因此本發(fā)明也涉及在將含肺表面活性組合物和蛋白的混合物加入到所述生理電解溶液后至少3分鐘和至多60分鐘的時間點給予肺表面活性組合物，例如在加入該混合物后至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、75、90、100或120分鐘，或者在加入該混合物后至多3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、75、90、100或120分鐘。如上所述，給予該組合物的理想時間點將隨著干粉質量和所用的電解溶液的選擇的不同而改變，甚至長于60分鐘如60和75分鐘之間，或在某種情況下更長。
在鹽水和Ringer溶液之間，時間最優(yōu)值也會有點不同。在大鼠試驗中可以發(fā)現在生物法測定的時間最優(yōu)值和達到正如在偏振顯微鏡中所看到的該制劑的穩(wěn)定狀態(tài)的雙折射面所需的時間半數值之間存在很好的一致性，并形成了本發(fā)明的基礎。從ARDS的肺表面活性物療法的其它研究中知道大鼠的試驗結果能夠用于人的治療。所以，結論是從大鼠試驗得出的數據也相關于人。以前沒有觀察到給藥時的這種時間作用。
本發(fā)明也提到了肺表面活性組合物的動態(tài)膨脹現象在測定LS組合物質量的用途。通過體外方法驗證質量是非常有價值的并且可以替代消耗時間的動物試驗。而且，肺表面活性組合物的功效似乎與動態(tài)膨脹現象中所看到的性能質量相關。
對肺給予肺表面活性組合物在鹽水或Ringer溶液中的理想濃度被認為是在大約4到大約10％w/v的范圍內。為了用于本發(fā)明，就通過氣管給藥和給予太大體積的限制而言，認為5％w/v的濃度是合適的。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案因此涉及含有如至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％或至少10％w/v的肺表面活性物的組合物。具體實施方案涉及含有至少5％w/v肺表面活性物的組合物。
本發(fā)明的一個實施方案涉及使用含肺表面活性物的肺表面活性組合物的分布的動態(tài)過程來提高該組合物向患者肺泡給藥，其特征在于在將肺表面活性組合物加入電解介質如生理電解溶液后適當的預定時間點或預定時間段內給予該肺表面活性組合物。所述患者可以是包括人的動物。
本發(fā)明肺表面活性組合物的動態(tài)膨脹現象暗示了在臨床使用上該肺表面活性組合物應當與生理電解溶液以時間控制方式一起給予肺部。所以，治療需要的患者的方法包括在分散液呈現活性動態(tài)分布過程的預定時間段內向該患者的肺泡給予分散于(可能再配制的)生理電解溶液的肺表面活性組合物。
上述的這種方法能夠用于治療、預防或診斷嬰兒呼吸窘迫綜合癥(IRDS)、成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)、先天性膈疝、急性肺損傷、用體外的膜氧合治療的患者和胎糞吸入性肺炎，或治療或預防慢性阻塞性肺病、哮喘、急性支氣管炎、慢性支氣管炎、支氣管肺的發(fā)育不良、肺部感染、頑固性肺高壓、肺發(fā)育不全、癌癥、胞囊的纖維化、肺泡蛋白沉積癥和/或先天性SP-B缺乏。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案中，向肺部的給藥是通過氣管進行的。
肺藥的運送本發(fā)明的肺表面活性組合物、藥用組合物或藥物試劑盒也可以用作其它難于進入的身體區(qū)域的治療性、預防性和/或診斷性活性物質的載體并因此提供這些物質改善的運送，例如穿過肺泡壁。
所以，本文所述的概念能夠用作釋放(例如控制釋放)的治療性、預防性和/或診斷性活性物質的肺藥運送系統。肺表面活性物能夠作為運送其它活性物質的載體或賦形劑，其中所述的活性物質如支氣管擴張藥、抗炎劑、組胺-受體拮抗劑、包括皮質類固醇的吸入甾體類、DNA-酶、包括抗體的免疫治療劑、血管舒張藥、抗生素類、生長因子類、促進上皮完整性的藥、加速肺成熟的因子、包括乙酰半胱氨酸的粘膜溶解的藥劑、抗腫瘤藥、視黃醛衍生物類、血管靶向化合物、抗血管生成素物質、肽類、多肽類、蛋白類和/或包括病毒媒介物和裸露DNA的基因療法。肺表面活性組合物用作肺藥運送的這些潛在用途尤其適合于下列疾病慢性阻塞性肺病、哮喘、支氣管肺的發(fā)育不良、肺部感染、頑固性肺高壓、肺部感染、肺發(fā)育不全、支氣管肺的發(fā)育不良(包括維生素A的視網膜癥)、呼吸窘迫綜合癥、癌癥、胞囊的纖維化、肺泡蛋白沉積癥和/或先天性SP-B缺乏。
另外一方面，本發(fā)明所提供的藥物運送系統當然能夠適合于給需要這種治療的患者運送藥物，甚至該患者不患有與肺有關的疾病或與肺缺乏有關的疾病。這類疾病僅僅為了詳細說明而不是限定，例如癌癥和/或糖尿病。
在本發(fā)明肺表面活性組合物用作運送活性物質到呼吸器官的載體時，為了獲得例如對患者改良地運送活性物質，肺表面活性組合物的動態(tài)膨脹的時間可以有目的地改變(例如通過粒徑、肺表面活性組合物的濃度、電解質的濃度、所包含的離子種類性質等的變化)。改良的釋放可以是超過到預定時間段釋放(它能夠從大約4小時到大約3-5天)。
用于本發(fā)明的其它可能領域是治療手術后的患者，其中為了預防和避免組織間相互接觸中的粘連使用該組合物。
目前肺藥運送的領域非?；钴S。主要運送途徑是經口運送途徑，已經報道過在肺運送中不存在的許多并發(fā)癥如藥物被胃腸道的低pH或任何酶所降解。表面活性物的生理性質決定了它是大多數全身使用的藥物運送到肺的理想載體。
此外，基于本發(fā)明的治療藥劑可以含有用膠囊包裹在表面活性物脂質體中的藥用物質。
本發(fā)明在下列非限定性實施例中進一步詳細說明。
實施例實施例1豬肺表面活性組合物(PLS)及其膨脹現象-動態(tài)膨脹過程的體外觀察PLS組合物的制備所有試驗都是用從剛宰殺的豬制備的豬肺表面活性物提取物(Leo藥用產物，Ballerup，丹麥)(PLS)進行的。PLS是按照Bligh和Dyer的方法從切碎的豬肺中提取的(Can.J.Biochem.Physiolol.1959，37，911-917)。蒸發(fā)有機溶劑相并用丙酮除去中性脂質。最后冷凍干燥所得到的制劑。得到粉狀組合物，它由飽和的和不飽和的磷脂類(90-98％w/w的粉狀組合物)、表面活性蛋白SP-B和SP-C(0.5-2.0％w/w)和其它脂質(高達10％w/w)的混合物組成。將該組合物用于下列試驗。
PLS含水樣本的制備在玻璃試管中將PLS加入水或各種比例的鹽水溶液或Ringer溶液來制備豬肺表面活性物的含水樣本(Leo藥用產物，Ballerup，丹麥)(PLS)。在所用的電解溶液中的PLS濃度在所有試驗中都是10％w/w，而在電解溶液中電解質的濃度是不同的(如0.9％w/w或1.8％w/w氯化鈉溶液)。為了達到混合用注射器反復將分散液吸取和排出約0.5分鐘。
在第一次試驗中，用Pharmacia & Upjohn的Ringer-醋酸鹽作溶劑(Na+130mmol、K+4mmol、Ca2+2mmol、Mg2+1mmol、Ac-30mmol、Cl-100mmol)。在PLS干粉膨脹過程中或達到平衡后將一滴平衡的或剛制備的樣本轉移到顯微鏡玻片上檢查。在這滴上非常輕地放上蓋玻片從而避免摻有氣泡。
在25℃和/或42℃下進行顯微鏡觀察。使用配有Sony CD照相機和彩色打印機的Leitz偏振顯微鏡。
在偏振顯微鏡中研究含10％(w/w)PLS和90％Ringer溶液的樣本的膨脹現象。在不同時間點從大批溶液中取樣本并放在有蓋玻片的玻片上。大約5分鐘后得到均勻外觀，樣本混濁，并且由Ringer溶液包圍的弱雙折射顆粒聚集在液相的外邊界(圖1)?？梢钥吹较蚩諝獾囊合嘟佑|表面顯著增加。在液體前形成細管?！吧L”的細管形成分支，隨后變成在樣本混合后大約15分鐘記錄的如圖2所示的雙折射。圖3(上面和下面)顯示了普通光(上面)和偏振光(下面)下大約30分鐘后的表面圖像。該表面區(qū)域已經發(fā)展成雙折射絡合網狀物。在大約40-60分鐘后這種分支現象結束，一批與另一批有一點不同。
當PLS在生理鹽水溶液中膨脹時，在界面上有類似的網狀物生長。分別使用兩種不同濃度的氯化鈉0.9％w/w和1.8％w/w。不管所用的鈉濃度是多少，都可以觀察到象圖3中所看到的網狀結構。
只有當PLS在鹽水或Ringer溶液而不是水中膨脹時，才觀察到明顯表面擴大向雙折射網狀物形成的動態(tài)現象。當加入甘油使水等滲時，在該溶液中PLS膨脹也還缺少在電解溶液中所顯示的動態(tài)膨脹現象。
進一步的試驗已經證實如果分散介質中存在某一電解質最小濃度時，PLS才形成雙折射網狀物或細管結構。換句話說，雙折射網狀物或細管結構的形成依賴于分散介質中電解質的濃度和/或離子強度。
如上所述，在兩個不同溫度進行一些試驗。在兩種溫度上都可以看到導致雙折射網狀物或細管結構形成的動態(tài)膨脹現象。
實施例2動物試驗-具有不同膨脹度的PLS組合物的體內現象動物記錄由Rotterdam的Erasmus大學的當地動物委員會批準該方案。按照NIH指南照料和處理動物。用一氧化氮、氧氣和異氟醚(65/33/2％)麻醉16只體重(BW)240-320g的Sprague-DAWLEY大鼠(Harlan，CPH，Zeist，the Netherlands)，切開氣管并向頸動脈插入導管。用60mg/kg/小時腹膜內注射戊巴比妥鈉(Nembutal；AlginBV，Maaassluis，the Netherlands)維持麻醉；用2.0mg/kg/小時肌肉內注射泮庫溴銨產生神經肌肉的阻斷。用加熱墊將體溫保持在正常范圍內。
將大鼠連接到通風機上(Servo通風機300，Siemens-Elema，Solna，瑞典)并以壓力控制模式用純氧、30bpm的頻率、1∶2的I/E比、12cm水柱的峰氣道壓力(PIP)和2cm水柱的陽性呼氣結束的壓力(PEEP)通風。開始，將PIP增加到20cm水柱1分鐘來補充肺膨脹不全區(qū)域。接著，通過反復的全肺灌洗(BAL)誘導表面活性物的缺乏以達到PaO2＜85mmHg。在第一次灌洗前，分別將PIP和PEEP升高到26和6cm水柱。
治療是外源性表面活性物(35mg/kg體重分散于0.9％w/w鹽水25mg/ml)。在0.5分鐘內將PLS鹽水混合物反復抽取和排出注射器。確定所用的PLS批的最大動態(tài)膨脹時間(相應于t1/2)為20分鐘。一組8只大鼠在配制表面活性組合物后20分鐘接受表面活性物，另外一組8只大鼠在配制表面活性組合物后60分鐘接受表面活性物。在一團空氣(14ml/kg)(通風機的設置不變)后直接將表面活性組合物(4ml/kg BW±0.4ml)給予氣管內管。
在BAL之前和在最后灌洗(緊接著治療)之后和在表面活性物給藥(ABL505，放射測量計A/S，Copenhagen，丹麥)后5、15、30、60、90和120分鐘從頸動脈取血樣來測定PaO2和PaCO2。
試驗后，用過量的戊巴比妥鈉殺死動物。
統計分析用SPSS10.0統計軟件包(SPSS公司，芝加哥，IL)進行統計分析。用ANOVA分析組內對比。用ANOVA的反復測定分析組間對比。如果ANOVA結果是p＜0.05，進行Tukey post-hoc檢驗。p＜0.05為統計學顯著性。
結果如上所述，40分鐘后，PLS鹽水溶液樣本已經達到膨脹的穩(wěn)定態(tài)并且在該過程的一半時間(即大約20分鐘)在有關網狀物形成的動態(tài)學中有最大值。所以選擇兩個時間窗口(與鹽水混合后20和60分鐘)來觀察是否體外界面動態(tài)學與體內表面活性功能相關。
為了使體內表面活性功能對膨脹現象的任何作用的測定理想化，使用低劑量的PLS。這種低劑量本身不足以完全恢復誘發(fā)性肺損傷，正如下文所討論的PaO2數據所示。
圖10顯示了在接受給藥前20分鐘或60分鐘分散的PLS的兩組中隨時間PaO2的水平。PLS給藥后，兩組中PaO2都改善了，但在120分鐘的試驗期內從沒有達到灌洗前水平。在給藥后5分鐘和在試驗結束時(120分鐘)PaO2的含量沒有差異。但是，在給藥前60分鐘混合的PLS組中PLS滴注后5到120分鐘之間PaO2顯著下降(p＜0.001)。而且，在120分鐘時兩組間的PaO2有顯著性差異(p＜0.01)。
結論是最大膨脹條件的動脈氧合所代表的表面活性功能優(yōu)于PLS穩(wěn)定態(tài)的條件。對表面活性取代物在動態(tài)膨脹相過程中作用更好的解釋可能是這種動態(tài)膨脹提供了滴注的表面活性物更好的分布。當在體外條件下檢測動態(tài)膨脹時所看到的樹狀突起能夠延伸到毫米即好幾個肺泡直徑。
該試驗非常重要的結果是證實了與含水混合時間有關的給藥產生的生理作用不同；時間似乎直接與體外所觀察到的膨脹動態(tài)學有關。這說明應該相關于動態(tài)膨脹來分析肺表面活性提取物組合物從而測定動力學的最大值。一般可以發(fā)現這個時間大約是達到穩(wěn)定狀態(tài)的時間的一半。這種預定時間在生產PLS的一批與另一批之間可以不同，在給藥后能夠提高治療作用。
用Ringer溶液替代鹽水溶液作一些另外的大鼠試驗，它們同樣在動態(tài)膨脹的最大值過程給藥時比膨脹終止時給藥在氧合作用方面顯示出了相同提高。
當在PLS組合物中只用甘油水時，給藥后的治療作用比含電解溶液相比會戲劇性地下降。
實施例3PLS的動態(tài)膨脹現象作為質量控制分析的參數該試驗的目的是開發(fā)測定具體批PLS(或具有本文所述的動態(tài)膨脹現象的任何其它肺表面活性物)是否符合預定要求從而適合治療性、預防性和/或診斷性用途的體外適當試驗方法。一般，在動物試驗如實施例2中所述的那些動物試驗進行這類試驗，但這種試驗很昂貴并包括使用試驗動物?？偟膩碚f，如果可能的話，對用體外試驗替換包括試驗動物的試驗有一種需求。在實施例1和2中所示的結果表示在體內治療作用和最大動態(tài)膨脹時間之間能夠建立起體內-體外關系。
一般基于至少10批不同PLS的結果進行這種體內-體外關系的建立。下面描述了測定體內-體外關系的步驟。
將實施例1中所述制備的不同批的PLS的樣本進行實施例1所述的步驟從而研究PLS在分散液中動態(tài)膨脹現象。將10％w/w的PLS粉末或顆粒分散于90％w/w的0.9％w/w的氯化鈉溶液中。在實施例1所述的偏振顯微鏡下觀察PLS分散液的樣本，并注意到每個樣本出現的雙折射細管、分支或網狀物的形成就是膨脹達到穩(wěn)定狀態(tài)的時間。同時，可記錄界面長度增加的程度和雙折射的強度。基于顯微鏡觀察，將達到穩(wěn)定狀態(tài)膨脹所需時間的大約一半設定為每批樣本的最大動態(tài)膨脹。動態(tài)膨脹現象的質量也可以加以分類。
顯微鏡下測試的每批PLS分散液的樣本也在實施例2中所述的動物模型中進行測試從而建立體外膨脹動態(tài)學與體內表面活性功能之間的關系。在配制每批分散液后不同時間點將PLS樣本滴注給動物，按照實施例2的方法測定PaO2含量來測定PLS滴注的作用。注意到配制PLS分散液的時間與滴注給動物的時間之間的間隔會導致PaO2含量的顯著改善。
基于該間隔和對所觀察到的產生體外最大動態(tài)膨脹的時期的比較，考慮到確定PLS分散液動態(tài)膨脹產生最大表面活性作用的限定時間建立體外現象和體內作用之間的關系。也可以考慮動態(tài)膨脹現象的質量。
一旦對典型數量的樣本確定，就可以將這類時間用作以后生產的PLS批的檢驗和/或質量控制的標準。在驗證各批PLS中使用體內-體外關系(相關性)來替換使用消耗時間的動物試驗，并且如果這批可以接受的話對出現最大動態(tài)膨脹的時間點設定某些限制。一般在t1/2±15％、t1/2±10％、t1/2±7.5％或t1/2±5％設定這些限制。這暗示將PLS批樣本進行上述體外試驗步驟，并且特征為在預定標準時期形成雙折射細管或網狀物的具有所需動態(tài)膨脹現象的批可以接受，而丟掉不具有這種現象的批。
基于至今用PLS分散液所得到的數據，可以顯示出給予PLS分散液有益的時期是在PLS粉分散于鹽水起大約15-30分鐘。
實施例4市售肺表面活性組合物的膨脹現象就各種市售肺表面活性組合物的膨脹現象對其測試。測試下列產物Alveofact、Curosurf和Exosurf。Alveofact和Exosurf是干粉形式而Curosurf是分散液形式。下列表1給出了市售肺表面活性制劑的總結。
表1.市售表面活性物制劑(來自D.Gommers.1998年論文，Rotterdam大學，“影響表面活性物響應能力的因素”)

DPPC二棕櫚酰卵磷酯，PG、磷酰甘油，Synth.，合成的，*按重量計。
所用的大多數肺表面活性物是小?；蚺７沃械奶崛∥铩５?，Curosurf含有磷脂類含量相對高(99％w/w)的切碎的豬肺的提取物。
按照實施例1所述將50mg的肺表面活性物分散于1000mg的0.9％w/w氯化鈉測定膨脹現象，在偏振顯微鏡下觀察該分散液。
除Curosurf外的所有產物都是粉末。Curosurf是懸浮液形式并且通過放一滴在有蓋玻片的玻片上檢測Curosurf的膨脹現象。
所有產物在分散于鹽水后都膨脹。但是，在該實施例中所研究的產物中都不具有形成雙折射網狀物的動態(tài)膨脹現象，即該產物不會有象用PLS所看到的動態(tài)膨脹。
權利要求
1.一種肺表面活性物組合物，含有肺表面活性物，在室溫以粉末或顆粒形式、濃度為10％w/w分散于0.9％w/w氯化鈉時，通過偏振顯微鏡觀察到它能夠在膨脹過程中大約0.5分鐘到大約120分鐘的時間內在氣-液-固體界面形成雙折射的網狀物或細管。
2.按照權利要求1的肺表面活性物組合物，其中肺表面活性物含有磷脂。
3.按照權利要求2的肺表面活性物組合物，其中的磷脂是以飽和的和不飽和的磷脂形式存在的。
4.按照權利要求2或3的肺表面活性物組合物，其中磷脂的濃度是干粉形式組合物的大約80到大約99.5％w/w，例如從大約85到大約98％w/w或從大約90到大約98％w/w。
5.按照上述任何一項權利要求的肺表面活性物組合物，它含有二棕櫚酰卵磷酯(DPPC)。
6.按照上述任何一項權利要求的肺表面活性物組合物，它含有表面活性物蛋白如SP-A、SP-B、SP-C和/或SP-D。
7.按照權利要求6的肺表面活性物組合物，其中表面活性蛋白是SP-B和/或SP-C。
8.按照權利要求6或7的肺表面活性組合物，其中表面活性蛋白的總濃度是干粉形式組合物的大約0.5到大約10％w/w，如從大約0.5％到大約7.5％w/w，從大約0.5到大約5％w/w，從大約0.5到大約2.5％w/w或從大約0.5％到大約2％w/w。
9.按照上述任何一項權利要求的肺表面活性組合物，它含有至多到10％w/w的其它非磷脂類的脂類。
10.按照上述任何一項權利要求的肺表面活性物組合物，其中肺表面活性物是從哺乳動物的肺中獲得。
11.按照權利要求10的肺表面活性組合物，其中肺表面活性物是從哺乳動物的肺中提取的。
12.按照權利要求10或11的肺表面活性組合物，其中哺乳動物的肺是家畜的、牛的、豬的、猴子的或人的肺。
13.按照權利要求1-9中任何一項的肺表面活性組合物，其中肺表面活性物是合成或半合成獲得的。
14.按照權利要求1-9中任何一項的肺表面活性組合物，其中肺表面活性物是從哺乳動物肺泡的細胞培養(yǎng)物中獲得的。
15.按照權利要求6的肺表面活性組合物，其中表面活性蛋白是重組蛋白。
16.一種肺表面活性物組合物，當以粉末或顆粒形式分散于離子強度至少大約5mM或相應于生理條件的離子強度的電解溶液中時，這樣得到的分散液的水濃度至少大約55％w/w，正如通過偏振顯微鏡所觀察到的，它可以產生動態(tài)膨脹過程，在該過程中形成雙折射的網狀物或細管，并且在達到穩(wěn)定態(tài)時該動態(tài)膨脹過程結束。
17.按照權利要求16的肺表面活性組合物，其中電解溶液具有至少大約10mM，例如至少大約15mM、至少大約20mM、至少大約25mM、至少大約50mM、至少大約75mM、至少大約100mM或至少大約125mM的離子強度。
18.按照權利要求16或17的肺表面活性組合物，其中所得到的分散液的水濃度至少大約60％，如至少大約65％、至少大約70％、至少大約75％、至少大約80％、至少大約85％、至少大約90％、至少大約95％或至少大約98％w/w。
19.按照權利要求16-18任何一項的肺表面活性組合物，其中肺表面活性物，當分散于電解溶液時，是層狀液晶相。
20.按照權利要求16-19任何一項的肺表面活性組合物，其中電解溶液含有至少下列一種陽離子Na+、K+、Li+、Ca2+、Mg2+和/或NH4+。
21.按照權利要求16-20中任何一項的肺表面活性組合物，其中電解溶液含有至少下列一種陰離子氯離子、醋酸根離子、碳酸根離子、碳酸氫根離子、磷酸二氫根離子(H2PO4-)、磷酸氫根離子(HPO42-)、磷酸根離子(PO43-)、酒石酸根離子、檸檬酸離子、硼酸根離子、延胡索酸根離子等。
22.按照權利要求16-21中任何一項的肺表面活性組合物，其中電解溶液是氯化鈉溶液，0.9％w/w氯化鈉溶液、Ringer溶液或Ringer-醋酸鹽溶液。
23.按照前面任何一項權利要求的肺表面活性組合物，還含有一種或多種無機或有機鹽，當將其分散于含水介質如水中時它可以賦予該組合物離子強度。
24.按照權利要求23的肺表面活性組合物，其中無機鹽選自于以下構成的組堿金屬鹽如氯化鈉、氯化鉀、氯化鋰和堿土金屬鹽如氯化鈣、氯化鎂等。
25.按照權利要求23的肺表面活性組合物，其中無機鹽選自于以下構成的組醋酸鹽類如醋酸鈉、醋酸鉀、醋酸鋰、檸檬酸鹽類、酒石酸鹽類、延胡索酸鹽類、硼酸鹽類、磷酸鹽類、銨鹽類如氯化銨等。
26.按照前面任何一項權利要求的肺表面活性組合物，還含有其它治療性、預防性和/或診斷性活性物質。
27.按照權利要求1-24中任何一項的肺表面活性組合物在制備治療或預防嬰兒呼吸窘迫綜合癥(IRDS)、成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)、先天性膈疝、急性肺損傷、用體外的膜氧合治療的患者和/或胎糞吸入性肺炎的藥劑的用途。
28.權利要求1-26中任何一項的肺表面活性組合物在制備治療或預防慢性阻塞性肺病、哮喘、急性支氣管炎、慢性支氣管炎、支氣管肺的發(fā)育不良、肺部感染、頑固性肺高壓、肺發(fā)育不全、癌癥、胞囊的纖維化、肺泡蛋白沉積癥和/或先天性SP-B缺乏的藥劑的用途。
29.按照權利要求27或82的用途，其中該藥劑是通過將粉狀或顆粒狀的肺表面活性物分散于適當分散介質中制得。
30.按照權利要求29的用途，其中分散是在足以確保動態(tài)膨脹和形成雙折射網狀物或細管的時間內進行的。
31.按照權利要求30的用途，其中足夠的時間是從大約0.5到大約120分鐘，如從大約1到大約100分鐘、從大約2到大約90分鐘、從大約2到大約80分鐘、從大約2到大約70分鐘、從大約3到大約60分鐘、從大約3到大約50分鐘、從大約3到大約45分鐘、從大約5到大約40分鐘、從大約5到大約35分鐘、從大約10到大約35分鐘、從大約15到大約35分鐘或從大約20到大約35分鐘。
32.藥物組合物，含有按照權利要求1-26中任何一項的肺表面活性組合物。
33.按照權利要求32的藥物組合物，為使用前適合分散于含水介質的粉末或顆粒形式。
34.按照權利要求32的藥物組合物，為液體形式。
35.按照權利要求34的藥物組合物，其中液體是含有肺表面活性組合物和電解溶液的分散液。
36.按照權利要求35的藥物組合物，其中該組合物適合于生理條件。
37.按照權利要求35的藥物組合物，其中電解溶液是生理上可接受的溶液。
38.按照權利要求32-37中任何一項的藥物組合物，還含有其它治療性、預防性和/或診斷性的活性物質。
39.按照權利要求32的藥物組合物，為適合于從吸入器等給藥的粉末或顆粒形式。
40.按照權利要求39的藥物組合物，其中平均粒徑和/或粉末或顆粒的電解特性已經被調節(jié)到所需條件從而在通過吸入器等給藥后達到呼吸器官的特定部位。
41.藥物試劑盒，含有第一個和第二個容器，第一個容器含有按照權利要求1-26任一的肺表面活性組合物，而第二個容器含有用于肺表面活性組合物的分散介質，附有使用前將肺表面活性組合物分散于該分散介質中的說明書。
42.按照權利要求41的藥物試劑盒，其中肺表面活性組合物是粉末或顆粒形式。
43.按照權利要求42的藥物試劑盒，其中說明書包括推薦的將肺表面活性組合物分散于分散介質后應當給藥的時間。
44.按照權利要求41-43中任何一項的藥物試劑盒，其中分散介質是電解溶液。
45.按照權利要求44的藥物試劑盒，其中電解溶液是生理上可接受的電解溶液如0.9％w/w氯化鈉溶液、Ringer溶液或Ringer-醋酸鹽溶液。
46.按照權利要求41-45中任何一項的藥物試劑盒，還含有其它治療性、預防性和/或診斷性活性物質。
47.含有第一個和第二個容器的藥物試劑盒，第一個容器是含有按照權利要求39或40的藥物組合物的吸入器等形式，而第二個容器是含有適當介質的霧化劑等形式，當給藥時給予第一個容器的藥物組合物后它確保在原位形成適合動態(tài)膨脹過程的微環(huán)境。
48.治療和/或預防哺乳動物肺病的方法，該方法包括給需要這種治療的哺乳動物有效量的按照權利要求1-26中任何一項的肺表面活性組合物。
49.按照權利要求48的方法，其中肺表面活性組合物是以按照權利要求32-40任何一項藥物組合物的形式給藥。
50.按照權利要求48或49的方法，其中給藥是在肺表面活性組合物動態(tài)膨脹相過程中進行。
51.按照權利要求48-50中任何一項的方法，其中肺病選自于下列構成的組中嬰兒呼吸窘迫綜合癥(IRDS)、成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)、先天性膈疝、急性肺損傷、用體外的膜氧合治療的患者和胎糞吸入性肺炎。
52.按照權利要求48-50中任何一項的方法，其中肺病選自于下列構成的組中慢性阻塞性肺病、哮喘、急性支氣管炎、慢性支氣管炎、支氣管肺的發(fā)育不良、肺部感染、頑固性肺高壓、肺發(fā)育不全、癌癥、胞囊的纖維化、肺泡蛋白沉積癥和先天性SP-B缺乏。
53.按照權利要求1-26中任何一項的肺表面活性組合物在制備藥物組合物中的用途，該制法包括將肺表面活性物分散于離子強度至少大約5mM的電解溶液中從而能夠在大約0.5到大約120分鐘的時間內使該肺表面活性物動態(tài)膨脹，用偏振顯微鏡可以觀察到該動態(tài)膨脹是在氣-液-固體界面形成了雙折射網狀物或細管。
54.按照權利要求1-26中任何一項的肺表面活性組合物在制備液體藥物組合物的用途，該液體藥物組合物在肺表面活性組合物膨脹過程中它具有動態(tài)方式并在大約0.5到大約120分鐘的時間內在氣-液-固體界面形成了雙折射網狀物或細管。
55.按照權利要求53或54制備藥物組合物的用途，在肺表面活性物動態(tài)膨脹相過程中給藥。
56.按照權利要求1-26中任何一項的肺表面活性組合物在制備用于改善治療、預防和/或診斷肺病的藥劑的用途，這種改善與肺表面活性物的動態(tài)膨脹行為有關。
57.按照權利要求1-26中任何一項的肺表面活性組合物在肺藥物運送方面的用途。
58.按照權利要求1-26中任何一項的肺表面活性組合物在治療性、預防性和/或診斷性活性物質運送到肺部的用途。
59.按照權利要求58的用途，其中治療性、預防性和/或診斷性活性物質是肽類、多肽類或蛋白類。
60.按照權利要求1-26中任何一項的肺表面活性組合物在預防組織間相互接觸粘連的用途。
61.測試各批肺表面活性組合物的體外檢驗法，所述肺表面活性組合物當將其分散于電解溶液中時具有動態(tài)膨脹現象，該方法包括a)測定本文所述的最大動態(tài)膨脹t1/2，b)用如本文所述的體內-體外校正曲線比較這樣獲得的t1/2，并且c) 評價這批是否可以接受或不能接受。
62.分散于電解溶液中有動態(tài)膨脹現象的肺表面活性組合物的治療、預防和/或診斷作用的體外評價方法，該方法包括測定穩(wěn)定狀態(tài)膨脹的半衰期并用體內-體外校正曲線比較這樣得到的半衰期從而預測治療、預防和/或診斷的作用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種將其分散于含電解質的介質中時可形成動態(tài)膨脹相的肺表面活性物組合物。這種動態(tài)膨脹過程可以通過偏振顯微鏡觀察到并且最后在氣/液界面形成雙折射的網狀物或細管。這樣的動態(tài)膨脹過程能夠使得該肺表面活性物可以分布在比非動態(tài)膨脹相中分布的更大的表面積上。這種分布是在肺表面活性物分散于例如生理電解溶液后特殊階段的時間內發(fā)生的。這樣，在肺部給藥后肺表面活性物進入肺泡能夠獲得更加有效的分布，它從而使得使用這種組合物作為難于進入的肺部或其它器官或身體區(qū)域的治療性、預防性和/或診斷性活性物質的載體成為可能。本發(fā)明的肺表面活性物含有肺表面活性物，它在室溫以粉末或顆粒形式分散于0.9％w/w氯化鈉時濃度為10％w/w，正如通過偏振顯微鏡所觀察到的，它能夠在膨脹過程中在大約0.5分鐘到大約120分鐘的時間內在氣－液－固體界面形成雙折射的網狀物或細管。
文檔編號A61K47/02GK1449278SQ01814972
公開日2003年10月15日 申請日期2001年8月31日 優(yōu)先權日2000年9月1日
發(fā)明者馬庫斯·拉松, 卡勒·拉松, 佩爾·沃爾默, 布克哈德·拉赫曼, 約翰內斯·雅各布斯·海茨馬 申請人:馬庫斯·拉松, 卡勒·拉松, 佩爾·沃爾默, 布克哈德·拉赫曼, 約翰內斯·雅各布斯·海茨馬