專利名稱：Rel蛋白和類固醇受體對調(diào)節(jié)元件的協(xié)同激活作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒定在最近揭示出的由類固醇受體和Rel蛋白協(xié)同作用激活調(diào)節(jié)元件的新機制中起調(diào)節(jié)作用的化合物的方法。本發(fā)明還涉及用核酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，和這些細(xì)胞在鑒定能調(diào)節(jié)在調(diào)節(jié)元件控制下的基因表達水平的化合物的分析中的應(yīng)用，以及由上述分析鑒定出的化合物的醫(yī)藥用途。
轉(zhuǎn)錄激活蛋白核因子-κB(NF-κB)/Rel家族的成員與其抑制蛋白(I-κB)密切相關(guān)，并駐留于細(xì)胞質(zhì)中。它們可以由促炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)，并在免疫和炎癥過程中起重要作用，因為它們指導(dǎo)化學(xué)引誘物、細(xì)胞因子(包括NF-κB誘導(dǎo)的細(xì)胞因子本身)、細(xì)胞因子受體和細(xì)胞粘附分子的轉(zhuǎn)錄。誘導(dǎo)時，rel蛋白二聚體化、遷移到核，并在那里它們通過其靶基因啟動子中的NF-κB結(jié)合基元激活這些基因。對不同NF-κB二聚體識別的DNA序列的檢測顯示對于現(xiàn)有的rel蛋白二聚體結(jié)合物優(yōu)選的靶位點略有不同(Chen et al.，-Nature Struct.Biol.567-73，1998；Kunsch et al.，Mol.Cell Biol.124412-4421，1992；Parry和Mackman，J.Biol.Chem.26920823-20825，‘94)，也解釋了在多種啟動子中鑒定出的NFκB應(yīng)答元件的廣泛變異。
Rel蛋白的二聚體化和核轉(zhuǎn)位受許多試劑的誘導(dǎo)，包括細(xì)菌和病毒病原體，免疫和炎癥細(xì)胞因子和多種可損害細(xì)胞的試劑。已發(fā)現(xiàn)這一轉(zhuǎn)錄因子家族與類固醇受體，如雌激素和糖皮質(zhì)激素相互作用導(dǎo)致靶基因的抑制，因此甚至更多的基因呈現(xiàn)為Rel蛋白激活作用的靶子。
雌激素和其他類固醇激素對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有強烈的作用(1)。具體地說，雌激素調(diào)節(jié)腦5-羥色胺系統(tǒng)的能力表明雌激素在與抑郁及其治療相關(guān)的機制中起作用(2，3)。但是，由于ER表達分布廣泛，雌激素還具有幾種其他的有益作用，包括防止動脈粥樣硬化、早老性癡呆和骨質(zhì)疏松并不令人奇怪。為了限制副作用，如用雌激素進行治療提高了患乳腺和子宮內(nèi)膜癌的危險性，人們投入了相當(dāng)?shù)呐θふ医M織選擇性的ER-結(jié)合化合物。
除了雌激素，人們對于其他類固醇受體的組織選擇性作用同樣感興趣。同樣對那些類固醇受體，對于唯一靶向一組組織或器官(如腦，對精神病)的化合物的研究由于大多數(shù)類固醇受體廣泛的組織分布而受到阻礙。因此，人們對以組織選擇性的方式篩選類固醇受體-介導(dǎo)的作用的試驗相當(dāng)感興趣。
已知雌激素作用是由兩個屬于核激素受體超家族的雌激素受體(ERα和β)介導(dǎo)的(15-18)。這兩個ERs共有一種非常保守的模塊化的結(jié)構(gòu)。雖然DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域在ERα和β之間是非常保守的(96％同一性)，且配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域相對也很保守(58％同一性)，但上述兩受體的A/B區(qū)域之間保守性很低(20％同一性)。配體結(jié)合時，經(jīng)激活的受體二聚體化并與定位于靶基因調(diào)節(jié)區(qū)的稱為雌激素應(yīng)答元件(EREs)的特定DNA序列相互作用。所述的DNA結(jié)合受體即可對轉(zhuǎn)錄進行正或負(fù)的調(diào)節(jié)。已知對于ERα，所述的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)是通過兩個反式激活區(qū)域定位于A/B結(jié)構(gòu)域的AF-1和定位于配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的AF-2介導(dǎo)的。上述兩個反式激活區(qū)域根據(jù)細(xì)胞和啟動子鄰近序列的不同可以獨立地或協(xié)同地行使功能(19，20)。最近發(fā)現(xiàn)了一些雌激素調(diào)節(jié)靶基因的其它機制。這包括利用調(diào)節(jié)元件作為ER作用靶序列的基因(21)，或ER通過與相結(jié)于它們各自的DNA結(jié)合位點，如AP-1和Sp 1的其它轉(zhuǎn)錄因子相互作用進行調(diào)節(jié)的基因(22-23，36-38)。
我們在這里報道所發(fā)現(xiàn)的一種機制，其中NF-κB和類固醇受體家族的成員通過與多種調(diào)節(jié)元件相互作用協(xié)同激活基因表達。這種協(xié)同激活到目前尚未見報道，但是有許多報道涉及Rel蛋白和類固醇受體的相互抑制作用。這一新發(fā)現(xiàn)的機制為研究調(diào)控調(diào)節(jié)元件表達的化合物提供了必要的工具。取決于所述的調(diào)節(jié)元件，此種化合物可以通過普遍存在的類固醇受體發(fā)揮作用，以及提供一種組織選擇性的應(yīng)答。
作為第一個實例，我們研究了雌激素調(diào)節(jié)5-羥色胺系統(tǒng)的分子機制。更具體地說，我們研究了雌激素對5-HT1A受體基因的作用。5-羥色胺(5-羥色胺，5-HT)參與對多種行為的控制作用(4)。據(jù)認(rèn)為5-羥色胺系統(tǒng)的調(diào)節(jié)異常在神經(jīng)精神病，如憂郁和焦慮中起重要作用(5，6)。5-羥色胺的復(fù)雜活動是由相關(guān)受體大家族介導(dǎo)的(7)。其中特別的關(guān)注集中于5-HT1A受體，其是一種對腺苷酸環(huán)化酶進行負(fù)調(diào)節(jié)的G蛋白偶聯(lián)受體(8)。所述的5-HT1A受體以限制性的方式在腦中表達，在腦的邊緣區(qū)、小腦皮層和核縫區(qū)域觀察到了高水平的受體(9-11)。這里我們示出ERα與NF-κB協(xié)同作用激活5-HTA受體啟動子。此種激活在無激素存在下已經(jīng)存在，可進一步通過添加17β-雌二醇(E2)或4-羥三苯氧胺(OH-T)進行誘導(dǎo)，但ICI 164384不起作用。ERβ也能夠介導(dǎo)這種作用，但在這一實例中ERα的作用更為突出。而且我們發(fā)現(xiàn)這種協(xié)同激活依靠NF-κB的p65亞基的反式激活結(jié)構(gòu)域和ERα包含AF-1的A/B結(jié)構(gòu)域。我們的發(fā)現(xiàn)表明雌激素可以通過包括NF-κB與ER協(xié)同激活作用的新機制調(diào)節(jié)5-HT1A受體的表達。
令人驚訝的是發(fā)現(xiàn)了，相同的協(xié)同作用在由NF-κB和類固醇受體例如鹽皮質(zhì)激素受體(MR)對E-selectin啟動子的激活作用中起重要作用。這在圖7和下文中進行詳細(xì)描述。鑒于與NF-κB通過調(diào)節(jié)元件的協(xié)同作用并不僅限于ER，對于MR也觀察到了類似的作用，則可以預(yù)期對于其它類固醇受體也有相似的結(jié)果。
本發(fā)明為設(shè)計用于鑒定對新發(fā)現(xiàn)的機制具有調(diào)節(jié)作用的化合物的篩選試驗提供了可能。例如，由于5HT1A受體僅存在于腦組織，E-Selectin僅由內(nèi)皮細(xì)胞表達，在這些試驗中所發(fā)現(xiàn)的配體可特定性地用于治療CNS疾病和/或心血管疾病，而且允許對以組織選擇性的方式起作用化合物進行鑒定。除去那些靶向其它組織的配體的試驗是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
在本研究中，我們還顯示出5-HT1A受體的順式調(diào)節(jié)區(qū)含兩個推定的NF-κB結(jié)合位點并且NF-κB蛋白的存在是通過ER協(xié)同誘導(dǎo)所必須的。這表明NF-κB復(fù)合物與ER一起協(xié)同調(diào)節(jié)5-HT1A受體基因表達。在到目前為止所研究的大多數(shù)系統(tǒng)中，雌激素和NF-κB信號途徑是相互拮抗的。例如，IL-6啟動子的調(diào)節(jié)已被詳細(xì)研究過，雌激素可以明顯地抑制由NF-κB-誘導(dǎo)的這一基因的激活(33，34)。與這些發(fā)現(xiàn)一致，我們已經(jīng)示出雌激素在人工的NF-κB報道構(gòu)建體和E-selectin啟動子上(圖7)抑制NF-κB活性。但是在5-HT1A受體啟動子上雌激素進一步提高NF-κB誘導(dǎo)的活性，表明雌激素的正負(fù)調(diào)節(jié)依啟動子鄰近序列的不同而不同。
ERα和ERβ的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出很高的同源性，兩者的配體-結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有中等程度的同源性，而這兩個受體的A/B區(qū)域間同源性很低。通過幾種不同方法的研究表明，NF-κB和ER對5-HT1A受體啟動子的協(xié)同激活作用依賴于ERα包含AF-1的N-末端區(qū)域。首先用ERα的A/B區(qū)域替代ERβ的A/B區(qū)域(ERα/β)形成嵌合受體，其比野生型的ERα對5-HT1A受體啟動子的激活作用更強。但是用ERβ的A/B區(qū)域替代ERα的A/B區(qū)域(ERβ/α)幾乎完全破壞了上述受體對啟動子的協(xié)同激活能力。第二，將ERα1-339(一種AF-2缺陷突變體)的協(xié)同激活作用可與野生型的ERα相比，同時將ERα121-599(一種AF-1缺陷突變體)的作用可與野生型ERβ相比較。第三，與ERα相比，ERβ介導(dǎo)這種協(xié)同作用的效果要小得多。第四，僅封閉AF-2的部分抗-雌激素OH-T與E2在對5-HT1A受體啟動子的激活能力相同。最近報道AF-1-介導(dǎo)的抗-雌激素拮抗作用是由ERα的A/B區(qū)域而非ERβ的A/B區(qū)域介導(dǎo)的(28)。ERα和ERβ的這些差異表明這兩種ER亞型的調(diào)節(jié)功能是不同的?？偟目磥?，這些資料表明顯然是ERαAF-1參與5-HT1A受體啟動子的調(diào)節(jié)作用。
我們的發(fā)現(xiàn)清楚地表明NF-κB復(fù)合物和NF-κB結(jié)合位點在由ER對5-HT1A受體啟動子協(xié)同激活中的關(guān)鍵作用。但是，所述的兩NF-κB元件在-901luc構(gòu)建體中的突變破壞了NF-κB的作用而ER的作用仍然存在。一種可能的解釋是NF-κB蛋白以單體的形式與這些突變的κB元件相結(jié)合。這一NF-κB-DNA復(fù)合物以此種構(gòu)象不能激活轉(zhuǎn)錄，該復(fù)合物可能被ER穩(wěn)定，并可能是與其它在5-HT1A受體基因啟動子中的有關(guān)基因序列一起進一步導(dǎo)致激活作用。而且，通過使用突變體和嵌合體說明，盡管需要ERα的功能性的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，ERα對ERE報告基因和5-HT1A受體啟動子的活性之間并沒有明顯的相關(guān)性。因此，對5-HT1A受體啟動子的協(xié)同激活作用最有可能的解釋是ER對這一啟動子的激活并不是通過直接與DNA相結(jié)合，而是通過蛋白-蛋白之間的相互作用進行的。這一模型得到下述事實的支持協(xié)同激活作用既需要ERα的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，同時也需要p65完整的RHD，由于如上所述ERα直接與p65相互作用，涉及ERα的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和p65的RHD(34)。而且，p65的反式激活結(jié)構(gòu)域和ERα的AF-1對于這一應(yīng)答都是至關(guān)重要的。因此，這一結(jié)果表明ER與NF-κB復(fù)合物協(xié)作通過AF-1將共同激活劑補充到復(fù)合物中，進而協(xié)同激活5-HT1A受體啟動子。
除了這種經(jīng)典的激素激活途徑之外，也有報道其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對多種類固醇受體，包括ERα，進行調(diào)節(jié)而不依賴于激素配體。已顯示核受體通過磷酸化作用被非類固醇試劑如，多巴胺，生長因子和PKA激活劑所激活(39)。ERα的磷酸化作用可以提高受體的活性，主要的磷酸化位點位于受體的A/B區(qū)域(40，41)。最近證明ERB AF-1的磷酸化作用調(diào)節(jié)輔因子的募集和通過非類固醇激活劑對基因的激活作用(42)，過氧化物酶體增殖劑激活的受體γA/B結(jié)構(gòu)域的磷酸化作用降低了其轉(zhuǎn)錄活性(43)。在ERα和ERβ的A/B區(qū)域內(nèi)的幾個激酶位點的存在表明由不同的激活劑對AF-1結(jié)構(gòu)域的不同磷酸化作用可能引起多種的受體應(yīng)答。該附加途徑的存在強調(diào)了AF-1在不依賴激素的受體激活作用中的重要性。
幾項證據(jù)表明雌激素還可能在CNS中調(diào)節(jié)5-HT1A受體的表達。例如，分娩前和絕經(jīng)開始時雌激素的下降與負(fù)作用相關(guān)(44)，有時雌激素的替代治療可減輕婦女的憂郁和焦慮(45，46)。而且卵巢切除術(shù)引起5-HT結(jié)合和5-HT轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)合位點的減少(12-14)，而對卵巢切除的大鼠補充雌激素可以逆轉(zhuǎn)這種下降。在腦的多個區(qū)域包括皮層，海馬和縫核檢測到了ERα和ERβ(47)。另外，已有NF-κB在腦，特別是皮層和海馬中具有活性的描述(48)。同時有證據(jù)表明NF-κB不僅在免疫細(xì)胞中有功能，在如神經(jīng)原塑性，神經(jīng)變性和神經(jīng)發(fā)育過程中也有獨特的作用(49)。因此，這些轉(zhuǎn)錄因子和途徑在調(diào)節(jié)腦中5-HT1A受體基因表達起重要作用。雌激素調(diào)節(jié)5-羥色胺受體功能的能力至少部分構(gòu)成該激素對心境和精神狀態(tài)的突出作用的基礎(chǔ)。
對于E-selectin啟動子也發(fā)現(xiàn)了類固醇受體和Rel蛋白之間的協(xié)同激活作用。為確定鹽皮質(zhì)激素對E-selectin啟動子活性的作用，我們用含部分E-selectin啟動子的蟲熒光素酶報告基因構(gòu)建體和編碼MR的表達載體瞬時轉(zhuǎn)染U-2 OS細(xì)胞。如圖7A所示，IL-1β誘導(dǎo)的啟動子活性由MR以協(xié)同的方式激活。這一在MR存在下由NF-κB誘導(dǎo)的E-selectin啟動子活性可通過添加醛固酮(aldosteron)進一步加強。用不含E-selectin啟動子的蟲熒光素酶載體進行重復(fù)實驗證明了這一機制的選擇性。沒有觀察到IL-1β和/或MR的作用(圖7B)。
有趣的是，如果用ERα代替MR進行共轉(zhuǎn)染則沒有觀察到任何對E-selectin啟動子活性的協(xié)同作用。相反，在這樣的條件下，配體不存在時IL-1β誘導(dǎo)的啟動子活性受到ERα的抑制，添加17β-雌二醇可進一步加強這種作用(圖7C)。這一結(jié)果再次表明配體激活的類固醇受體與NF-κB’s的協(xié)同作用依賴特定的啟動子鄰近序列和特定的類固醇受體-啟動子組合的選擇性。
所述的E-selectin啟動子包含多個NF-κB共有位點(Collins，T.，Williams，A.，Johnston，G.I.，Kim，J.，Eddy，R.，Shows，T.，Gimbrone，M.A.，Bevilacqua，M.P.(1991)J.Biol. Chem.2662466-2473)，其很有可能負(fù)責(zé)鹽皮質(zhì)激素對E-selectin啟動子的協(xié)同作用。NF-κB在與MR的上述協(xié)同作用中所起的作用通過下述實驗得到確證，在該實驗中用3*NF-κB-TK報告基因，一種在TK啟動子前包含3個拷貝的共有NF-κB結(jié)合位點的合成構(gòu)建體，檢測了鹽皮質(zhì)激素的作用(圖7D)。圖7D中所示的數(shù)值范圍表明合成的3*NF-κB-TK報告基因?qū)L-1β的刺激和MR的協(xié)同作用都更為敏感。由于這一報告基因包含多個重復(fù)的NF-κB應(yīng)答元件所以這一結(jié)果并不令人驚訝。rel蛋白和MR的協(xié)同作用并沒有通過添加醛固酮(aldosteron)而進一步加強，這可能是由于在缺乏醛固酮(aldosteron)時IL-1β和MR之間存在大的協(xié)同作用。在缺乏IL-1β時MR和ER能夠誘導(dǎo)或抑制啟動子活性的發(fā)現(xiàn)(參見圖7A，C和D第三和第四杠)表明U-2 OS細(xì)胞在缺乏細(xì)胞因子時具有組成型的NF-固κB活性。或者，U-2 OS可能自身產(chǎn)生細(xì)胞因子或在細(xì)胞生長的血清中得到細(xì)胞因子活性。盡管不能排除還有其他類型的轉(zhuǎn)錄因子參與E-selectin啟動子和3*NF-κB-tk報告基因的調(diào)節(jié)(Kaszubska，W.，Hooft van Huijsduijnen，R.，Ghersa，P.，DeRaemy-Schenk，A.-M.，Chen，B.P.，Hai，T.，Delamarter，J.F.，Whelan，J.Mol.Cell.Biol.137180-7190)，上述結(jié)果至少表明NF-κB’s通過鹽皮質(zhì)激素對這些啟動子-報告基因的激活起著至關(guān)重要的作用。如上所述的ERα和MR之間對IL-1β誘導(dǎo)的Rel蛋白協(xié)同或拮抗作用的區(qū)別，可能是由于包含ERα或MR和不同類型的NF-κB’s的復(fù)合物的差異活性造成的。另外，本研究表明不同類型的核受體可與NF-κB’s一起對NF-κB應(yīng)答啟動子起協(xié)同作用。這一作用的確切本質(zhì)明顯依賴于類固醇受體類型和啟動子性質(zhì)的組合。
描述了本發(fā)明幾種特定的實施方式后，顯然本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠選擇其它可由Rel蛋白和類固醇受體協(xié)同激活的調(diào)節(jié)元件。簡要地說這最好是通過下述方式進行將待研究的特定的調(diào)節(jié)元件與報告基因功能性偶聯(lián)，與編碼Rel蛋白和類固醇受體的表達載體共轉(zhuǎn)染。具體說來，編碼NF-κB和類固醇受體的表達載體適用于這一目的。所述的類固醇受體可以是ERα或MR，也可以是ERβ或ERα和ERβ的組合。所述的實施例提供了進一步篩選能夠依照本發(fā)明協(xié)同激活的調(diào)節(jié)元件的必要工具。
Rel蛋白和類固醇受體相互作用以協(xié)同激活調(diào)節(jié)元件的新機制的發(fā)現(xiàn)，為篩選與這一新機制相互作用的化合物提供了可能。本發(fā)明的一個方面涉及鑒定能夠調(diào)節(jié)類固醇受體和Rel蛋白對調(diào)節(jié)元件協(xié)同作用的化合物的方法，該方法包括下述步驟提供含能被類固醇受體和Rel蛋白協(xié)同激活的調(diào)節(jié)元件的細(xì)胞，所述的細(xì)胞另外含有足夠水平的所述類固醇受體和所述Rel蛋白或其功能等價物使調(diào)節(jié)元件的協(xié)同激活作用得以進行，
將所述細(xì)胞與至少一種化合物接觸，確定是否所述調(diào)節(jié)元件的激活作用受該化合物的調(diào)節(jié)。
能夠調(diào)節(jié)類固醇受體和Rel蛋白協(xié)同作用的化合物可以是刺激或抑制這一作用的化合物。在實施例部分給出了能夠刺激某些類固醇受體和Rel蛋白對5-羥色胺1A受體啟動子或E-selectin啟動子協(xié)同作用的已知化合物的例子。
在這一方面，Rel蛋白的功能等價物理解為Rel結(jié)構(gòu)域具有同源性且參與基因調(diào)節(jié)作用的Rel家族蛋白復(fù)合物(Liou和Baltimore，Current Opinion in Cell Biology，5477-487，1993)，它們包括但不限于NF-κB1，Lyt-10，cRel RelA和RelB。還包括NF-κB的功能等價物，其保留特定的生物學(xué)功能，優(yōu)選至少含反式激活結(jié)構(gòu)域及NF-κB的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段。
“調(diào)節(jié)元件”或“啟動子”是指在細(xì)胞中能直接或間接與RNA聚合酶相結(jié)合并起始下游(3’方向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA序列。
啟動子可以與能夠顯示調(diào)節(jié)元件激活的異源報告基因相連接。在這樣的構(gòu)建體中啟動子影響自異源基因的轉(zhuǎn)錄。合適的報告基因例如蟲熒光素酶，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，β半乳糖苷酶和分泌的胎盤堿性磷酸酶。
在此方面ER的功能等價物理解為至少含ERα的AF-1反式激活區(qū)域與ERα的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的ER片段。
所用術(shù)語“功能等價物”一般理解為能夠行使與所述分子相同生物學(xué)功能的分子。
細(xì)胞中類固醇受體和Rel蛋白的水平要足以執(zhí)行對調(diào)節(jié)元件的協(xié)同激活作用。這可以通過選擇能夠組成型表達足夠水平的類固醇受體和Rel蛋白，或在其中通過添加合適的因子誘導(dǎo)類固醇受體和Rel蛋白表達的合適細(xì)胞實現(xiàn)?；蛘?，所述的類固醇受體和Rel蛋白可以用合適的重組DNA載體和本領(lǐng)域已知的方法轉(zhuǎn)染到所述細(xì)胞中。
在一優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及上述的方法，其中，所述的類固醇受體選自雌激素受體α，雌激素受體β和/或鹽皮質(zhì)激素受體或其功能等價物。
在另一優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及上述的方法，其中，所述的Rel蛋白選自NF-κB，Lyt-10，cRel，RelA和RelB或其功能等價物。
在另一優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及上述的方法，其中，所述的調(diào)節(jié)元件是5HT1-A受體基因的啟動子或其功能等價物。
在再一優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及上述的方法，其中，所述的調(diào)節(jié)元件是E-selectin基因的啟動子或其功能等價物。
在又一優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及上述方法，其中，所述的細(xì)胞被能夠顯示調(diào)節(jié)元件激活的報告基因轉(zhuǎn)染。
本發(fā)明還涉及被含5HT1A受體基因啟動子的核酸或其功能等價物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，所述細(xì)胞進一步包括能夠在所述細(xì)胞中功能性表達類固醇受體或其功能等價物的編碼類固醇受體的核酸，還包含能在所述細(xì)胞中功能性表達所述Rel蛋白的編碼Rel蛋白或功能等價物的核酸。
本發(fā)明進一步涉及依照本發(fā)明產(chǎn)生的細(xì)胞，其中，所述的類固醇受體選自雌激素受體α，雌激素受體β和/或鹽皮質(zhì)激素受體或其功能等價物。
本發(fā)明進一步涉及依照本發(fā)明產(chǎn)生的細(xì)胞，其中，所述的Rel蛋白選自NF-κB，Lyt-10，cRel，RelA和RelB或其功能等價物。
本發(fā)明進一步涉及依照本發(fā)明產(chǎn)生的細(xì)胞，其中，所述的細(xì)胞被能夠顯示5HT1A受體基因啟動子激活的報告基因轉(zhuǎn)染。
本發(fā)明進一步涉及依照本發(fā)明產(chǎn)生的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞被含5HT1A受體基因啟動子的核酸和/或編碼類固醇受體的核酸和/或編碼Rel蛋白的核酸或其功能等價物所轉(zhuǎn)染。
本發(fā)明進一步涉及被含E-selectin基因啟動子的核酸或其功能等價物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，所述的細(xì)胞進一步包含能夠在所述細(xì)胞中功能性表達所述類固醇受體或其功能等價物的編碼類固醇受體的核酸，還包含能在所述細(xì)胞中功能性表達Rel蛋白的編碼Rel蛋白或功能等價物的核酸。
本發(fā)明進一步涉及依照本發(fā)明產(chǎn)生的細(xì)胞，其中，所述的類固醇受體選自雌激素受體α，雌激素受體β和/或鹽皮質(zhì)激素受體或其功能等價物。
本發(fā)明進一步涉及依照本發(fā)明產(chǎn)生的細(xì)胞，其中所述的Rel蛋白選自NF-κB，Lyt-10，cRel，RelA和RelB或其功能等價物。
本發(fā)明進一步涉及依照本發(fā)明產(chǎn)生的細(xì)胞，其中，所述的細(xì)胞被能夠顯示E-selectin基因受體啟動子激活的報告基因轉(zhuǎn)染。
本發(fā)明進一步涉及依照本發(fā)明產(chǎn)生的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞被含E-selectin基因啟動子的核酸和/或編碼類固醇受體的核酸和/或編碼Rel蛋白的核酸或其功能等價物所轉(zhuǎn)染。
本發(fā)明進一步涉及上述細(xì)胞在鑒定在腦中調(diào)節(jié)5-羥色胺受體水平的化合物中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及用上述方法鑒定的化合物用作藥物。
本發(fā)明還涉及用上述方法鑒定的化合物在制備治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
在一優(yōu)選的實施方式中，調(diào)節(jié)類固醇受體和Rel協(xié)同作用的化合物不影響那些Rel蛋白或類固醇受體獨立影響調(diào)節(jié)元件的機制。這些化合物提供了一種選擇性，這種選擇性是所述化合物在臨床應(yīng)用中非常希望的。
圖2.κB元件在由NF-κB和人ERα對5-HT1A受體啟動子的調(diào)節(jié)中的重要性。(A)圖解表示所用的含大鼠5-HT1A受體(5-HT1AR)啟動子缺失的蟲熒光素酶(luc)報告基因構(gòu)建體。兩個空心的圓圈(0)代表NF-κB結(jié)合位點。(B)用所示的不同報告基因構(gòu)建體連同空表達載體或編碼NF-κB p50和p65亞基的表達載體(白杠)混和編碼ERα的表達載體(陰影杠)瞬時轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞并用10-8M E2處理24小時(黑杠)。描述了由NF-κB對用空表達載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞引起蟲熒光素酶活性的誘導(dǎo)。杠代表至少三次獨立實驗的平均值±S.D。
圖3.OH-T，而非ICI能夠通過NF-κB和人ERα提高5-HT1A受體啟動子的活性。(A)用-901luc報告基因構(gòu)建體連同空表達載體或編碼NF-κB p50和p65亞基的表達載體混和編碼ERα的表達載體瞬時轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞，并用E2、OH-T或ICI處理細(xì)胞24h。描述了由NF-κB對用空表達載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞引起蟲熒光素酶活性的誘導(dǎo)。杠代表至少三次獨立實驗的平均值±S.D。
圖4.由NF-κB和人ERα對5-HT1A受體啟動子的協(xié)同激活作用需要p65的反式激活功能。用-901luc報告基因構(gòu)建體連同空表達載體或如所示編碼p50，p65，p65RHD或p65Nsi的表達載體(白杠)混和編碼ERα的表達載體(陰影杠)瞬時轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞，并用10-8M E2處理24小時的(黑杠)。描述了由NF-κB亞基對用空表達載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞引起蟲熒光素酶活性的誘導(dǎo)。杠代表至少三次獨立實驗的平均值±S.D。
圖5.由小鼠ERα對5-HT1A受體啟動子的協(xié)同激活作用以不依賴AF-2的方式出現(xiàn)。(A)用-901luc報告基因構(gòu)建體連同空表達載體或編碼NF-κB p50和p65亞基的表達載體混合編碼小鼠ERα，ERβ，ERα121-599，ERα 1-339或ERα C241/244A的表達載體瞬時轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞。所述細(xì)胞或未經(jīng)處理(陰影杠)或由10-8M E2處理24小時(黑杠)。描述了由NF-κB對用空表達載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞引起蟲熒光素酶活性的誘導(dǎo)。杠代表至少三次獨立實驗的平均值±S.D。(B)用3xERE-TATAluc連同空表達載體或編碼小鼠ERα，ERβ，ERα 121-599，ERα 1-339或ERα C241/244A的表達載體瞬時轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞。所述細(xì)胞或未經(jīng)處理(陰影杠)或由10-8M E2處理24小時(黑杠)。描述了由ER對用空表達載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞引起蟲熒光素酶活性的誘導(dǎo)。杠代表至少三次獨立實驗的平均值±S.D。
圖6.ERα的A/B結(jié)構(gòu)域?qū)?-HT1A受體啟動子的協(xié)同激活至關(guān)重要。(A)用-901luc報告基因構(gòu)建體連同空表達載體或編碼NF-κB p50和p65亞基的表達載體混和編碼人ERα，ERβ，ERα/β或ERβ/α的表達載體瞬時轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞。所述細(xì)胞或未經(jīng)處理(陰影杠)或由10-8M E2處理24小時(黑杠)。描述了由NF-κB對用空表達載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞引起蟲熒光素酶活性的誘導(dǎo)。杠代表至少三次獨立實驗的平均值±S.D。(B)用3xERE-TATAluc混合空表達載體或編碼人ERα，ERβ，ERα/β或ERβ/α的表達載體瞬時轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞。所述細(xì)胞或未經(jīng)處理(陰影杠)或由10-8M E2處理24小時(黑杠)。描述了由ER對用空表達載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞引起蟲熒光素酶活性的誘導(dǎo)。杠代表至少三次獨立實驗的平均值±S.D。
圖7由NF-κB’s分別與MR或ERα協(xié)同激活或反式抑制E-selectin啟動子。(A)用E-selectin啟動子-報告基因瞬時共轉(zhuǎn)染U-2 OS細(xì)胞，并測定了IL-1β，共轉(zhuǎn)染MR或IL-1β與MR的結(jié)合在0.1μM醛固酮(aldosteron)存在或不存在時的效果。(B)用不含ELAM啟動子的蟲熒光素酶-報告基因瞬時轉(zhuǎn)染U-2 OS細(xì)胞，并測定了IL-1β，共表達MR或IL-1β與MR的結(jié)合在0.1μM醛固酮(aldosteron)存在或不存在時的效果。(C)用E-selectin啟動子-報告基因瞬時轉(zhuǎn)染U-2 OS細(xì)胞，并測定了IL-1β，共轉(zhuǎn)染ERα或IL-1β與ERα的結(jié)合在0.1μM 17β-雌二醇存在或不存在時的效果。(D)用合成的3*NF-κB-tk啟動子報告基因瞬時共轉(zhuǎn)染U-2 OS細(xì)胞，并測定了IL-1β，共轉(zhuǎn)染MR或IL-1β與MR的結(jié)合在0.1μM醛固酮(aldosteron)存在或不存在時的效果。結(jié)果用與未經(jīng)處理的細(xì)胞(每圖中的第一杠)相比的誘導(dǎo)倍數(shù)表示。所有的值用二次重復(fù)±S.D表示。注意A，B，C與D相比標(biāo)度上的區(qū)別。
細(xì)胞培養(yǎng)物。猴COS-1細(xì)胞和人293胚胎腎細(xì)胞得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC；Rockville，MD)用以1∶1混合的DMEM和Ham’sF-12培養(yǎng)基(DF；Life Technologies Inc.)培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基用碳酸氫鹽緩沖并添加了7.5％FCS。如先前所述，用葡聚糖包被的炭處理FCS去除類固醇以制備葡聚糖包被的炭(DCC)-FCS(25)。
質(zhì)粒。-901luc是通過下述步驟獲得的用StyI部分酶切由Dr.O.Meijer(Leiden，the Netherlands)惠贈的-1588luc，補平并連接到用SmaI消化的pGL3中，用HindIII再消化并再連接；-81luc是通過下述方式獲得的用StyI部分酶切-1588luc，補平，再用BglII消化后連接到用SmaI/BglII消化的pGL3中；-901 365Mluc和-90164Mluc是通過向原始的啟動子構(gòu)建體中通過分別用寡核苷酸5’-gagccgaattctacagactaa-3’和5’-aactgcaaggagatctacatcgcccctcg-3’進行定點誘變引入點突變構(gòu)建的。-901 365/64Mluc是通過用SacII/HindIII消化-901 64Mluc再連接到用SacII/HindIII消化的-901 365Mluc中而構(gòu)建的；-81 64Mluc是通過用StyI部分酶切-90164Mluc后再連接構(gòu)建的。CMV4表達載體包含編碼人p65(RelA)，p50(NF-κB)和p65RHD(1-305)，p65Nsi(1-551E39I)的全長cDNAs，先前已有描述(26，27)。編碼人ERα(pSG5-HEGO)和人ERβ(pSG5-ERβ530)的表達載體分別由Dr.Chambon(Strasbourg，法國)和Dr.Gustafsson(Stockholm，瑞典)惠贈。嵌合的人ERα/ERβ和ERβ/ERα受體已有描述(28)，在ERα/ERβ嵌合體中含ERα的A/B結(jié)構(gòu)域和ERβ的結(jié)構(gòu)域C，D，E，F(xiàn)，在ERβ/ERα嵌合體中含ERβ的A/B結(jié)構(gòu)域和ERα的結(jié)構(gòu)域C，D，E，F(xiàn)。小鼠ERα(pMT2MOR)，ERα 1-339，ERα 121-599和ERα C241/244A(29)是由Dr.Parker(Londen，UK)惠贈的。所用的報告基因質(zhì)粒4xNF-κB(HIV)tkluc和3xERE-TATA-luc原先已有描述(30，31)。
瞬時轉(zhuǎn)染。在24-孔培養(yǎng)板中添加了5％DCC-FCS的DF+中培養(yǎng)COS-1細(xì)胞和293細(xì)胞以進行瞬時轉(zhuǎn)染。0.4ug蟲熒光素酶報告基因，0.6ug PDMlacZ和0.2ug指明的表達質(zhì)粒與磷酸鈣共沉淀對細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染。添加pBluescript SK-達到總量1.8ug DNA/孔。16小時后，更新培養(yǎng)基并添加指示激素。24小時后收獲細(xì)胞，依生產(chǎn)商提供的方法用Luclite蟲熒光素酶報告基因基因分析試劑盒(PackardInstruments，CT)和Topcount液閃記數(shù)器(Packard Instruments，CT)分析蟲熒光素酶活性。通過測定β-半乳糖苷酶活性校正數(shù)值確定轉(zhuǎn)染效率(32)。
實施例2由NF-κB和ER對5-HT1A受體啟動子的協(xié)同激活作用。
為確定雌激素對5-HT1A受體啟動子活性的作用，我們用含5-HT1A受體啟動子的報告基因構(gòu)建體混合編碼ERα或ERβ的表達載體瞬時轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞。如

圖1A所示，ERα或ERβ的共轉(zhuǎn)染和用17β-雌二醇(E2)處理細(xì)胞都幾乎對5-HT1A啟動子的活性不起作用。但是，除了直接調(diào)節(jié)之外，還可以通過ER與其它轉(zhuǎn)錄因子的相互作用對ER靶基因進行間接調(diào)節(jié)。已表明推定的NF-κB結(jié)合位點存在于-901luc 5-HT1A受體啟動子構(gòu)建體中(參見圖2A)，且用這一報告基因構(gòu)建體與編碼NF-κB的p50和p65亞基的表達載體轉(zhuǎn)染可導(dǎo)致該報告基因10倍的誘導(dǎo)。有趣的是，ERα混合NF-κB的共轉(zhuǎn)染目前導(dǎo)致啟動子活性很大程度的誘導(dǎo)，且可以通過添加E2進一步提高(圖1A)。與ERα相反，當(dāng)ERβ與NF-κB共轉(zhuǎn)染時表現(xiàn)很小的誘導(dǎo)性，且沒有觀察到任何E2的作用。雖然與COS-1細(xì)胞相比由ERα的激活水平略低，但對293細(xì)胞也觀察到了類似的結(jié)果(結(jié)果未示出)。這些結(jié)果表明5-HT1A受體啟動子可由NF-κB和ER協(xié)同激活。過去已有幾個研究組報道了雌激素對NE-κB活性的抑制作用(33-35)。因此我們也研究了雌激素對包含在與蟲熒光素酶偶聯(lián)的胸苷激酶啟動子前的四個來自HIV-LTR的NF-κB元件的報告基因構(gòu)建體混合編碼ERα或ERβ及NF-κB p50和p65亞基的表達構(gòu)建體的作用。對于這一報告基因構(gòu)建體，在已缺乏激素的情況下，ERα的共轉(zhuǎn)染導(dǎo)致NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的抑制，而添加激素導(dǎo)致進一步地抑制(圖1B)。ERβ的共轉(zhuǎn)染也表現(xiàn)出對NF-κB活性一定程度的抑制。在293細(xì)胞中也觀察到類似的結(jié)果(結(jié)果未示出)。這些結(jié)果表明ER在基于ICAM啟動子的共有應(yīng)答元件的合成的NF-κB報告基因構(gòu)建體上作為NF-κB的轉(zhuǎn)錄抑制劑，而ER與NF-κB作為5-HT1A受體啟動子的激活劑。
實施例3NF-κB元件參與NF-κB和ER對5-HT1A受體啟動子的調(diào)節(jié)為對ER對5-HT1A受體啟動子的作用進行定位，使用了幾種啟動子缺失構(gòu)建體(圖2A)。
兩種NF-κB元件(-901 365/64Mluc)的突變完全破壞了NF-κB對5-HT1A受體啟動子的作用(圖2B)。但是ERα僅與NF-κB結(jié)合時仍能與以對野生型啟動子(-901luc)一樣的效率誘導(dǎo)啟動子的活性。同樣，盡管啟動子構(gòu)建體-81luc仍含有一個NF-κB元件也不能被NF-κB誘導(dǎo)。但是，也是在這一啟動子上，保留了ERα與NF-κB的作用。當(dāng)這一單個存在于-81luc構(gòu)建體上的NF-κB元件突變后(-81 64Mluc)，ERα的作用幾乎被完全破壞了。
因此，5-HT1A受體啟動子的協(xié)同激活涉及NF-κB結(jié)合位點，盡管由NF-κB本身對該啟動子的激活似乎不是ER的作用所需要的。這些結(jié)果表明ER的協(xié)同啟動子激活作用不依賴于DNA結(jié)合，而涉及蛋白-蛋白相互作用。
實施例4抗-雌激素對5-HT1A受體啟動子的作用已描述了抗-雌激素依啟動子鄰近序列和受體亞型的不同有著不同的作用。在反式激活實驗中，OH-T抑制通過典型的ERE調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄，但象E2一樣，其激活受AP-1元件與ERα控制的基因的轉(zhuǎn)錄(22)。我們用可以封閉AF-2的部分拮抗劑OH-T和可封閉AF-1和AF-2的“純”拮抗劑ICI 164384(ICI)檢測了抗-雌激素對5-HT1A受體啟動子的作用。如圖3所示，ICI的處理沒有加強ERα和NF-κB對5-HT1A受體啟動子的活性，而OH-T與E2一樣在轉(zhuǎn)錄激活方面有效。這些數(shù)據(jù)表明部分拮抗劑OH-T仍能激活A(yù)F-1，與E2一樣在ERα對5-HT1A受體啟動子協(xié)同激活方面有效。
實施例5在對5-HT1A受體啟動子的協(xié)同激活作用中涉及的NF-κB和ER的結(jié)構(gòu)域為確定NF-κB的反式激活功能的重要性，我們檢測了缺失NF-κB的p65亞基的反式激活結(jié)構(gòu)域或損壞DNA-結(jié)合功能，對其與ER在瞬時轉(zhuǎn)染實驗中對5-HT1A受體啟動子協(xié)同激活能力的影響。p50和p65或單獨的p65混和ERα和E2共轉(zhuǎn)染可強烈地激活啟動子，而單獨的沒有反式激活功能的p50共轉(zhuǎn)染，幾乎沒有什么作用。p65反式激活結(jié)構(gòu)域的缺失形成僅包含Rel同源結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體(p65RHD)。P65RHD仍能與DNA結(jié)合(27)，但無論ERα和E2存在或不存在均不能激活該啟動子。DNA-結(jié)合缺失突變體(p65Nsi)仍包含完整的反式激活結(jié)構(gòu)域，但也不能協(xié)同激活該啟動子。綜合起來看，這些數(shù)據(jù)表明p65的反式激活功能和DNA結(jié)合功能對于ER協(xié)同激活5-HT1A受體啟動子均是至關(guān)重要的。
為鑒定ERα參與激活5-HT1A受體啟動子的區(qū)域，使用了缺少部分A/B區(qū)域而包含AF-1的或缺失部分配體結(jié)合區(qū)域而包含AF-2的小鼠ERα缺失構(gòu)建體。缺失了A/B區(qū)域(ERα 121-599)即完全破壞了對該啟動子的協(xié)同激活功能，而配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ERα 1-339)的缺失形成了一種至少與野生型的ERα具有同等活性的受體(圖5A)。ERα DNA結(jié)合缺失突變體(ERα C241/244A)不能激活5-HT1A受體啟動子，可能是由于對與NF-κB的相互作用而言，需要功能性的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(34)。值得注意的是與人ERα不同，小鼠ERα在對5-HT1A受體啟動子協(xié)同激活作用中沒有觀察到對配體依賴性。盡管在NF-κB不存在時，對于ERα 1-339可以觀察到對啟動子弱的激活作用，一般這一ERα對啟動子的協(xié)同激活作用只有在與NF-κB相結(jié)合時才能觀察到(數(shù)據(jù)未顯示)。在對照實驗中，ERα，ERβ和缺失突變體與含三個拷貝共有ERE及與蟲熒光素酶偶聯(lián)的TATA框的報告基因構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染，以確定其激活從典型的ERE起始的轉(zhuǎn)錄能力。如圖5B所示，盡管先前已描述這一現(xiàn)象ERβ的轉(zhuǎn)錄活性顯著低于ERα，但ERα和ERβ都刺激從3xERE-TATA-luc的轉(zhuǎn)錄(28)。盡管比野生型的ERα弱得多，缺少AF-1或AF-2的缺失突變體也刺激轉(zhuǎn)錄，這表明所述的反式激活結(jié)構(gòu)域能夠?qū)@一啟動子構(gòu)建體起協(xié)同作用。而且顯示，ERα 1-339在配體不存在時已被最大限度地激活，這清楚地表明了AF-1活性的配體非依賴性。正如所預(yù)料的，DNA結(jié)合缺失突變體，ERα C241/244A不能激活這一報告基因構(gòu)建體。
由于觀察到ERα和ERβ激活5-HT1A受體啟動子效力的不同，ERα和ERβ的嵌合構(gòu)建體用于進一步鑒定ERα和ERβ中涉及這一激活作用的區(qū)域。用ERα的A/B區(qū)域替代ERβ的A/B區(qū)域(ERα/β)，形成對5-HT1A受體啟動子的激活能力比野生型ERα更強的嵌合受體(圖6A)。但是，用ERβ的A/B區(qū)域替代ERα的A/B區(qū)域(ERβ/α)幾乎完全破壞了該受體對所述啟動子的協(xié)同激活作用。同樣，盡管在NF-κB不存在時也可以觀察到ERα/β對該啟動子弱的非配體依賴性的激活作用，一般這一ERα和ERα/β對啟動子的協(xié)同激活作用只有在與NF-κB結(jié)合時才能觀察到(結(jié)果未示出)。在對照實驗中，兩種嵌合構(gòu)建體都能夠以與野生型ERα等同的效率激活從3xERE-TATA-luc轉(zhuǎn)錄，而非配體依賴性的一些活性只能在ERα/β中觀察到(圖6B)。這些結(jié)果表明由ERα和NF-κB對5-HT1A受體啟動子的協(xié)同激活依賴于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和ERα包含AF-1的A/B區(qū)域?？傊?，雌激素對情緒和精神狀態(tài)起著非常重要的作用。雌激素調(diào)節(jié)5-羥色胺功能的能力提高了其在與抑郁及其治療相關(guān)的機制中起重要作用的可能性。一種雌激素影響情緒的細(xì)胞機制可能是通過在不同5-羥色胺系統(tǒng)水平有關(guān)基因的調(diào)節(jié)進行的。這里我們報道了雌激素能夠通過一種包括NF-κB與雌激素受體協(xié)同激活的新機制上調(diào)5-羥色胺-1A受體的表達。所述的部分抗雌激素4-羥三苯氧胺與雌激素有相同的作用。另外，突變分析表明p65的反式激活和雌激素受體α激活功能1對于協(xié)同調(diào)節(jié)均至關(guān)重要。因此，我們提出NF-κB復(fù)合物與雌激素受體共同作用以補充輔因子到復(fù)合物中，并由此通過非典型的雌激素應(yīng)答元件，以一種不涉及受體與DNA直接結(jié)合的機制協(xié)同激活5-羥色胺-1A受體啟動子。
實施例6材料和方法特殊試劑。醛固酮(aldosteron)(N.V.Organon)以0.1μM的濃度使用。重組人IL-1β購自Genzyme，使用濃度為100u/ml。
細(xì)胞培養(yǎng)。人骨肉瘤U-2 OS細(xì)胞由美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得(ATCC；Rockville，MD)和在一種將無酚紅的DMEM(DF；LifeTechnologies Inc.)和Ham’s F-12培養(yǎng)基以1∶1相混合的培養(yǎng)基M505中培養(yǎng)，添加10％FCS，用重碳酸鹽緩沖。
質(zhì)粒。
pGL3-ELAM是通過克隆部分E-Selectin啟動子到pGL3-basic(Promega)的Sac I和Xho I位點構(gòu)建的。所述的E-selectin啟動子區(qū)域是通過用寡核苷酸引物5’-ctgcagatctgagtttctgacatcattgta-3’和5’-atcattcgaagaagtcagccaagaacagct-3’對人基因組DNA進行PCR而獲得的。所述的PCR產(chǎn)物亞克隆到pCRTM2.1(TA-Cloning kit，Invitrogen)中，用Sac I和Xho I消化，接下來連接到pGL3-basic中。
所述的蟲熒光素酶報告基因質(zhì)粒3*NF-κB-TK是通過在單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)啟動子前插入來自ICAM啟動子的三個重復(fù)的NF-κB結(jié)合位點(van de Stolpe，A.，Caldenhoven，E.，Stade，B.G.，Koendermans，L.，Raaijmakers，J.A.M.，Johnson，J.P.& van derSaag，P.T.(1994)J.Biol.Chem.2696185-6192.)而構(gòu)建的。所述的TK啟動子克隆到pGL3-basic(Promega)的Bgl II-位點。所述的NF-κB結(jié)合位點三重重復(fù)是通過由引物5’-catacggtaagcttggggtcatcgccctgccaccgccgcccgattgctttagcttggaaattccgga-3’和5’-gtatgccaaagcttctccggaatttccaagctccggaatttccaagctccggaatttccaagctaaa-3’退火，接下來進行PRC擴增并亞克隆到pCRTM2.1載體中而構(gòu)建的。所述的插入片段利用HindIII消化，Klenow DNA聚合酶補平、再連接到pGL3-tk-luc的SmaI位點。
pNGV1-hMR表達載體包含在SV40啟動子控制下的野生型人MR，PKCRE-ERα表達載體包含在SV40啟動子控制下的野生型人MR。
瞬時轉(zhuǎn)染為了瞬時轉(zhuǎn)染，將U-2OS細(xì)胞接種在6-孔培養(yǎng)板上。2或3天后用報告基因，表達載體和β-半乳糖苷酶對照載體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞。使用兩種不同的實驗設(shè)置。為檢驗MR與IL-1β的協(xié)同作用，用1μgpGL3-ELAM或3*NF-κB-TK，1μg pNGV1-hMR或1μg的PKCRE-ERα和0.25μg的β-半乳糖苷酶對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。根據(jù)沒有插入物的表達載體修正不同的轉(zhuǎn)染DNA的量。瞬時轉(zhuǎn)染是利用lipofetin進行的(Life Technologies)。依照制造商的建議進行l(wèi)ipofetin瞬時轉(zhuǎn)染，僅有微小的改變。每μg轉(zhuǎn)染DNA，使用5μl lipofetin和將細(xì)胞和轉(zhuǎn)染混合物一起培養(yǎng)5小時，此后，吸出轉(zhuǎn)染混合物替換為M505+10％DCC-FCS。在細(xì)胞裂解前將經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與測試化合物(例如，IL-1β，地塞米松(dexamethason)和醛固酮(aldosteron)的不同組合)培養(yǎng)過夜。分別用蟲熒光素酶試驗系統(tǒng)(Promega)和Galacto-lightplus(Tropix)依制造商的建議進行蟲熒光素酶和β-半乳糖苷酶活性的檢測，在Victor 1420多重標(biāo)記計數(shù)器(multilabel counter)，Wallac上進行測定。檢測β-半乳糖苷酶活性用作轉(zhuǎn)染效率的對照。
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權(quán)利要求
1.一種鑒定能夠調(diào)節(jié)類固醇受體和Rel蛋白對調(diào)節(jié)元件協(xié)同作用的化合物的方法，該方法包括-提供含有能被類固醇受體和Rel蛋白協(xié)同激活的調(diào)節(jié)元件的細(xì)胞，所述細(xì)胞還含有足夠協(xié)同激活所述調(diào)節(jié)元件的水平的所述類固醇受體和所述Rel蛋白或其功能等價物，-將所述細(xì)胞與至少一種化合物相接觸，-檢測所述調(diào)節(jié)元件的激活是否受該化合物調(diào)節(jié)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的類固醇受體選自雌激素受體α，雌激素受體β和鹽皮質(zhì)激素受體或其功能等價物。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述的Rel蛋白選自NF-κB1，Lyt-10，cRel，RelA和RelB或其功能等價物。
4.如權(quán)利要求1到3所述的方法，其中，所述的調(diào)節(jié)元件是5HT1-A受體基因啟動子或其功能等價物。
5.如權(quán)利要求1到3所述的方法，其中，所述的調(diào)節(jié)元件是E-selectin基因啟動子或其功能等價物。
6.如權(quán)利要求1到5所述的方法，其中，所述的細(xì)胞被能夠顯示所述調(diào)節(jié)元件激活的報告基因轉(zhuǎn)染。
7.被含5HT1A受體基因啟動子或其功能等價物的核酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，所述細(xì)胞進一步包括-能夠在所述細(xì)胞內(nèi)功能性表達類固醇受體的編碼類固醇受體或其功能等價物的核酸，還包括-能夠在所述細(xì)胞內(nèi)功能性表達Rel蛋白的編碼Rel蛋白或其功能等價物的核酸。
8.如權(quán)利要求7所述的細(xì)胞，其中，所述的類固醇受體選自雌激素受體α，雌激素受體β和/或鹽皮質(zhì)激素受體或其功能等價物。
9.如權(quán)利要求7或8所述的細(xì)胞，其中，所述的Rel蛋白選自NF-κB1，Lyt-10，cRel，RelA和RelB或其功能等價物。
10.如權(quán)利要求7到9所述的細(xì)胞，其中，所述的細(xì)胞被能夠顯示所述5HT1A受體基因啟動子激活的報告基因轉(zhuǎn)染。
11.如權(quán)利要求7到10所述的細(xì)胞，其中，所述包含5HT1A受體基因啟動子的核酸和/或編碼類固醇受體的核酸和/或編碼Rel蛋白的核酸或其功能等價物轉(zhuǎn)染到所述細(xì)胞中。
12.被含E-selectin基因啟動子或其功能等價物的核酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，所述的細(xì)胞進一步包括-能夠在所述細(xì)胞內(nèi)功能性表達類固醇受體的編碼類固醇受體或其功能等價物的核酸，還包括-能夠在所述細(xì)胞內(nèi)功能性表達Rel蛋白的編碼Rel蛋白或其功能等價物的核酸。
13.如權(quán)利要求12所述的細(xì)胞，其中，所述的類固醇受體選自雌激素受體α，雌激素受體β和/或鹽皮質(zhì)激素受體或其功能等價物。
14.如權(quán)利要求12或13所述的細(xì)胞，其中，所述的Rel蛋白選自NF-κB1，Lyt-10，cRel，RelA和RelB或其功能等價物。
15.如權(quán)利要求12到14所述的細(xì)胞，其中，所述的細(xì)胞被能夠顯示所述E-selectin基因啟動子激活的報告基因轉(zhuǎn)染。
16.如權(quán)利要求12到15所述的細(xì)胞，其中，所述包含E-selectin基因啟動子的核酸和/或編碼類固醇受體的核酸和/或編碼Rel蛋白的核酸或其功能等價物轉(zhuǎn)染到所述細(xì)胞中。
17.如權(quán)利要求7到16所述的細(xì)胞在鑒定可在腦中調(diào)節(jié)5-羥色胺受體水平的化合物中的應(yīng)用。
18.如權(quán)利要求1到6所述的方法鑒定出的化合物用作藥物。
19.如權(quán)利要求1到4和6中的方法所鑒定出的化合物在制備治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
20.如權(quán)利要求1到3，5或6中的方法所鑒定出的化合物在制備治療心血管疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
已知Rel蛋白和類固醇受體的相互作用能夠?qū)е掳谢虻囊种?。這里公開了一種我們發(fā)現(xiàn)的新機制，其中，Rel蛋白和類固醇受體協(xié)同激活調(diào)節(jié)元件。研究表明這一機制影響腦－特異的5HT1A受體的表達，其中雌激素受體與核因子－
文檔編號A61P9/00GK1411556SQ01806130
公開日2003年4月16日 申請日期2001年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月8日
發(fā)明者C·J·C·伯爾斯瑪, P·T·M·范德薩格, S·維辛克, B·范德伯格 申請人:阿克佐諾貝爾公司